Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Murin bakbensexplantationsmodell för att studera mekanobiologin vid impingement av akillessenan

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65801
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Department of Orthopaedics, Center for Musculoskeletal Research, University of Rochester Medical Center, 3Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester Medical Center

Summary

Vi presenterar en anpassad experimentell plattform och vävnadsodlingsprotokoll som återskapar fibrobroskförändring som drivs av impingement av akillesseninsättningen i murina bakbensexplantor med bibehållen cellviabilitet, vilket ger en modell som är lämplig för att utforska mekanobiologin för senimpingement.

Abstract

Senpåverkan på ben genererar en multiaxiell mekanisk töjningsmiljö med markant förhöjd tvärgående trycktöjning, vilket framkallar en lokaliserad fibrobroskfenotyp som kännetecknas av ackumulering av glykosaminoglykan (GAG)-rik matris och ombyggnad av kollagennätverket. Medan fibrobrosk är ett normalt inslag i inträngda regioner av friska senor, är överskott av GAG-avsättning och desorganisation av kollagennätverket kännetecknande drag för tendinopati. Följaktligen är impingement kliniskt erkänd som en viktig yttre faktor vid initiering och progression av tendinopati. Ändå är den mekanobiologi som ligger till grund för senimpingement fortfarande understuderad. Tidigare försök att klarlägga det cellulära svaret på senimpingement har tillämpat enaxlig kompression på celler och exciderat senexplantation in vitro. Isolerade celler saknar dock en tredimensionell extracellulär miljö som är avgörande för mekanosvaret, och både in vitro - och excuterade explanteringsstudier misslyckas med att rekapitulera den fleraxliga töjningsmiljön som genereras av senimpingement in vivo, vilket beror på anatomiska egenskaper hos den inträngda regionen. Dessutom saknar in vivo-modeller av senimpingement kontroll över den mekaniska töjningsmiljön. För att övervinna dessa begränsningar presenterar vi en ny modell för explantation av bakbenen hos möss som är lämplig för att studera mekanobiologin vid impingement av akillessenor. Denna modell bibehåller akillessenan in situ för att bevara den lokala anatomin och reproducerar den multiaxiella töjningsmiljön som genereras av ingrepp i akillessenan på calcaneus under passivt applicerad fotledsdorsalflexion samtidigt som cellerna behålls i sin ursprungliga miljö. Vi beskriver ett vävnadsodlingsprotokoll som är integrerat i denna modell och presenterar data som fastställer bibehållen explantationsviabilitet under 7 dagar. De representativa resultaten visar förbättrad histologisk GAG-färgning och minskad kollagenfiberinriktning sekundärt till impingement, vilket tyder på förhöjd fibrobroskbildning. Denna modell kan enkelt anpassas för att undersöka olika mekaniska belastningsregimer och möjliggör manipulering av molekylära vägar av intresse för att identifiera mekanismer som medierar fenotypisk förändring i akillessenan som svar på impingement.

Introduction

En mängd senor, inklusive akillessenan och rotatorkuffsenorna, upplever benpåverkan på grund av normal anatomisk positionering1,2,3,4. Klämning av senan genererar trycktöjning riktad tvärs mot den längsgående fiberaxeln5,6,7. Regioner med senpåverkan visar en unik fibrobroskfenotyp där krympta, runda celler (fibrokondrocyter) är inbäddade i ett oorganiserat kollagennätverk med markant ökat innehåll av glykosaminoglykan (GAG)2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Tidigare studier tyder på att den olikartade mekaniska miljön som produceras av senimpingement upprätthåller denna GAG-rika matris genom att driva avsättningen av stora aggregerande proteoglykaner, framför allt aggrekan, även om de underliggande mekanismerna är oklara1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. Medan fibrobrosk är ett normalt inslag i påverkade regioner av friska senor, är avvikande proteoglykanmetabolism i samband med överdriven fibrobroskbildning ett kännetecken för tendinopati, en vanlig och försvagande sjukdom som oproportionerligt uppträder i kroniskt påverkade senor1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Följaktligen är senimpingement kliniskt erkänt som en viktig yttre faktor som driver flera av de vanligaste tendinopatierna, inklusive rotatorkuffsjukdom och insertionell akillestendinopati (IAT)50,51,52. För närvarande är behandlingen av tendinopati ineffektiv. Till exempel behöver cirka 47 % av patienterna med IAT kirurgiskt ingrepp efter misslyckad konservativ behandling, med varierande postoperativa resultat53,54,55,56. Trots det uppenbara sambandet mellan impingement och tendinopati är de mekanobiologiska mekanismerna genom vilka celler i impingerade senor känner av och svarar på sin mekaniska miljö dåligt beskrivna, vilket fördunklar förståelsen av tendinopatipatogenesen och resulterar i otillräcklig behandling.

Explantationsmodeller är användbara verktyg i studiet av senmekanobiologi57,58. Som ett första steg mot att förstå mekanobiologin bakom senimpingement har flera tidigare studier undersökt cellulär respons efter applicering av enkel enaxlig kompression på celler eller exciderade senexplantationer 27,29,30,31,32,33,34,39. Celler in vitro saknar dock extracellulära och pericellulära matriser som underlättar stamöverföring, binder viktiga tillväxtfaktorer och cytokiner som frigörs genom mekanisk deformation och tillhandahåller substrat för fokala adhesionskomplex som spelar en roll i mekanotransduktion57,59. Dessutom misslyckas både in vitro- och excised-explantationsstudier med att rekapitulera den fleraxliga mekaniska töjningsmiljön som genereras av senimpingement in vivo, vilket beror på anatomiska egenskaper hos det inträngda området 5,6. I samband med den inträngda akillesseninsättningen inkluderar detta omgivande vävnader som retrocalcaneal bursa och Kagers fettkudde 60,61,62,63. Omvänt tillåter in vivo-modeller av senpåverkan 25,28,36,37,38,64,65,66 minimal kontroll över storleken och frekvensen av belastning som appliceras direkt på senan, vilket är en välkänd begränsning av in vivo-modeller för att studera senans mekanobiologi57,58,67,68,69,70. Med tanke på utmaningarna med att mäta senbelastning in vivo är den interna töjningsmiljön som genereras i dessa modeller ofta dåligt karakteriserad.

I detta manuskript presenterar vi en anpassad experimentell plattform som återskapar impingement av akillesseninsättningen på calcaneus i hela murina bakbensexplantor som, när de paras ihop med detta vävnadsodlingsprotokoll, bibehåller livskraften under 7 dagar i explanteringskultur och möjliggör studier av de biologiska följderna av senimpingement. Plattformen är byggd på en 3D-printad polymjölksyrabas (PLA) som utgör grunden för fastsättning av handtagen och 3D-printad PLA-volymreduceringsinsats. Greppen används för att klämma fast det övre benet och knäet proximalt mot akillessenan med den kaudala aspekten av bakbenet vänd uppåt, vilket gör att akillessenan kan avbildas ovanifrån med hjälp av en ultraljudssond eller inverterat mikroskop (Figur 1A). Volymreduceringsinsatsen glider längs ett spår på basen och minskar den erforderliga volymen vävnadsodlingsmedia. En flätad lina lindad runt baktassen dras ut ur plattformen med hjälp av basdesignen och en 3D-printad PLA-klämma. Genom att dra i snöret blir baktassen dorsalflexerad och akillessenan stöts mot calcaneus, vilket resulterar i förhöjd tvärgående trycktöjning 5,6 (Figur 1A). Plattformen är innesluten i ett akrylbad som håller bakbensexplantorna nedsänkta i vävnadsodlingsmedia. Genom att fästa det spända snöret på utsidan av badet med tejp bibehålls fotledens dorsalflexion för att producera statisk impingement av akillesseninsättningen. CAD-filer för 3D-utskrivna komponenter tillhandahålls i flera format (tilläggsfil 1), vilket möjliggör import till en rad kommersiella och kostnadsfria CAD-program med öppen källkod för modifiering för att passa experimentella behov. Om tillgång till 3D-skrivare inte är tillgänglig för tillverkning kan CAD-filer tillhandahållas till 3D-utskriftstjänster online som skriver ut och skickar delarna till låg kostnad.

Viktigt är att triceps surae-Achilles muskulotendinösa komplex spänner över både knä- och fotlederna 71,72,73. Följaktligen påverkas dragbelastningen i akillessenan av knäböjningen. Knäförlängning sätter hälsenan under spänning, medan knäböjning minskar spänningen. Genom att först sträcka ut knäet och sedan passivt dorsiflexa fotleden kan kompressionsspänningar vid den inträngande insättningen överlagras på dragspänningar. Omvänt, genom att passivt dorsiflexera fotleden med knäet böjt, minskar dragbelastningen och tryckbelastningen kvarstår. I det nuvarande protokollet undersöks tre sådana villkor. 1) Vid statisk impingement är foten dorsalflexerad till < 110° i förhållande till skenbenet för att påverka insättningen, med knäet böjt för att minska spänningen. 2) För baslinjespänningsgruppen är fotleden utsträckt över 145° dorsalflexion med knäet utsträckt, vilket genererar övervägande dragbelastning vid insättningen. 3) För den obelastade gruppen odlas explantat i en petriskål med knä och fotled i neutrala positioner i frånvaro av externt applicerad belastning. Vinklarna som nämns ovan är fotografiskt uppmätta i förhållande till ett koordinatsystem där foten och skenbenet är parallella i en vinkel på 180° och vinkelräta i en vinkel på 90°.

Viktiga steg i protokollet inkluderar: 1) dissektion av bakbensexplantor och försiktigt avlägsnande av huden och plantarissenan; 2) explanteringsodling efter 48 timmars förbehandling med dexametason, 3) vävnadssnittning och histologisk färgning; och 4) färgbildsanalys för att bedöma fibrobroskbildning. Efter dissektion förbehandlas varje explantat av bakbenen i 48 timmar i odlingssubstrat kompletterat med dexametason74. Kontralaterala lemmar från varje mus tilldelas separata experimentgrupper för parvis jämförelse, vilket hjälper till att kontrollera biologisk variabilitet. Efter förbehandlingen placeras explantaten i plattformar enligt beskrivningen ovan och odlas i ytterligare 7 dagar (figur 1B). Ytterligare jämförelser görs med en förbehandlad grupp (dag 0) där explantat avlägsnas omedelbart efter 48 timmars förbehandling.

Efter explantationsodling trimmas bakbenen ner, formalin fixeras, avkalkas och bäddas in i paraffin. Seriell snittning i sagittal orientering ger visualisering av akillessenan från den myoendentinösa övergången till calcanealinsättningen samtidigt som sektionsdjupet kan spåras genom hela senan. Terminal deoxinukleotidyltransferas (TdT)-medierad dUTP X-nick labeling (TUNEL) används för att visualisera DNA-skador sekundärt till apoptos och bedöma viabilitet. Toluidinblå histologi och anpassad färgbildsanalys utförs för att kvantifiera förändringar i GAG-färgning. Toluidinblåfärgade vävnadssnitt används sedan för SHG-avbildning för att karakterisera förändringar i collagefiberorganisationen (Figur 1B).

De tillhandahållna representativa resultaten tyder på förändrad histologisk färgning av den GAG-rika matrisen och desorganisation av det extracellulära kollagennätverket som genereras av 7 dagars statisk impingement i modellen. Denna modell kan användas för att utforska molekylära mekanismer som ligger till grund för impingement-driven fibrobroskförändring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Allt djurarbete godkändes av University of Rochester Committee on Animal Resources.

1. Beredning av vävnadsodlingsmedier

  1. Odla all explantat i Dulbeccos Modified Eagle Medium (1x DMEM) med 1 % v/v penicillin-streptomycin och 200 μM L-askorbinsyra i en inkubator vid 37 °C och 5 % CO2 . Under den inledande 48 timmar långa förbehandlingen odlas varje explantat i 70 ml odlingssubstrat kompletterat med 100 nM dexametason74. Efter förbehandling, odla lemmar i ytterligare 7 dagar utan dexametason, byt media var 48-72:e timme.
    OBS: Tillsats av serum, såsom fetalt bovint serum, till odlingsmediet rekommenderas inte i enlighet med rekommendationerna från Wunderli, Blache och Snedeker57. Kort sagt, serumfria förhållanden representerar bättre den avaskulära, näringsfattiga senmikromiljön som existerar in vivo. Dessutom kan serumtillskott främja vävnadsnedbrytning under vissa odlingsförhållanden75 och stimulera cellproliferation och migration ut ur vävnad, båda egenskaperna hos senpatologi57.
  2. För den obelastade gruppen, odla varje explantat i 70 ml media. För baslinjespännings- och statiska impingementgrupper kräver varje plattform cirka 125 ml odlingsmedia för att hålla extremiteten nedsänkt. Denna volym kan variera beroende på överbenets placering i handtagen och 3D-utskriftsparametrar, främst fyllnadsdensiteten.

2. Explantationsdissektion och förbehandling med dexametason

  1. Avliva möss via CO2 -inandning och sekundär cervikal dislokation, eller enligt institutionella riktlinjer. Detta protokoll använder C57BL/6-möss som är yngre än 1 år. Bakbenens storlek kommer att öka med åldern och kan bli utmanande att passa in i handtagen.
  2. Före dissektion, överför 70 ml förvärmda (37 °C) odlingsmedier till en petriskål med 100 mm (diameter) x 25 mm (höjd) i ett sterilt biologiskt säkerhetsskåp (BSC). Tillsätt dexametason för att uppnå 100 nM arbetskoncentration.
  3. Dissektioner kan utföras på bänkskivan med hjälp av absorberande underlägg, som arbetar sig snabbt igenom dissektionen innan bakbensexplantorna överförs till BSC. Montera de kirurgiska verktyg som krävs för denna dissektion som inkluderar slät, rak, fin spetspincett; rak, fin spetspincett med tandade tänder; och rak, vass, fin sax.
  4. För dissektion av bakbensexplantationen, placera musen i ryggläge och identifiera höftleden. Använd en fin sax och gör ett litet (5-10 mm) snitt genom huden som täcker den proximala och främre (kraniala) aspekten av överbenet.
  5. Dra isär snittet för att expandera, nyp ihop det exponerade överbenet med fingrarna och dra försiktigt huden distalt för att deglove bakbenet till fotledens nivå. För försiktigt in ett saxblad under huden längs fotens dorsala aspekt och gör ett snitt som sträcker sig till tårna. Fortsätt att dra huden distalt för att ta bort den helt.
  6. Placera musen för att visualisera akillessenans insättning på den bakre (kaudala) aspekten av calcaneus, nära fotleden. Proximalt om akillessenan ligger plantarissenan direkt intill den mediala gränsen av akillessenan och sträcker sig distalt mot fotens plantaraspekt och passerar över den bakre aspekten av calcaneus.
  7. För att ta bort plantarissenan, sätt försiktigt in en spets av den släta, fina spetspincetten mellan de två senorna och förläng spetsen medialt under plantarissenan. Dra spetsen proximalt och riv igenom plantarismuskeln. Använd en tandad pincett med fin spets, ta tag i den lossnade proximala änden av plantarissenan och dra distalt för att ta bort den.
  8. Vid höftleden, använd en fin sax för att klippa igenom bäckenet och isolera bakbenet. Använd saxen för att bända bort det återstående bäckenet och exponera lårbenshuvudet.
  9. Överför bakbensexplantationen till BSC och till skålen som innehåller cellodlingssubstrat med dexametason. Flytta skålen till inkubatorn och förbehandla i 48 timmar.

3. Explantering av odling och lastplattformar

  1. När förbehandlingen på 48 timmar avslutas, förvärm tillräckliga mängder odlingssubstrat (avsnitt 1). Från och med nu kommer inget dexametason att tillsättas i odlingsmedier. Vid denna tidpunkt kan lemmar från den förbehandlade gruppen (dag 0) fixeras, avkalkas och bäddas in i paraffin för framtida snittning, färgning och analys.
  2. För den avlastade gruppen, aspirera förbehandlingsmedia och överför explantat till färska petriskålar, tillsätt 70 ml odlingssubstrat vardera och återgå till inkubatorn.
  3. För baslinjespännings- och statiska impingementgrupper, förbered explanteringsplattformar. Klipp till bitar av sandpapper som är lika stora som greppplattorna. För den statiska impingementgruppen, klipp bitar av flätad lina som är cirka 18 tum lång och knyt en lös överhandsknut halvvägs längs linans längd. Riv bitar av aluminiumfolie för att täcka varje akrylbad och spraya med 70 % etanol (EtOH). Överför förberedelserna till BSC.
  4. Varje plattform innehåller ett akrylbad, bas, volymreduceringsinsats, klämma och grepp. Varje grepp innehåller två plattor och tre olika typer av skruvar, inklusive en M5 x 0,8 mm gänga x 10 mm lång skruv som fäster handtagen på basen; två M6 x 1 mm gänga x 20 mm långa skruvar som förlänger plattorna för att klämma fast handtagen; och fyra M3 x 0,5 mm gänga x 14 mm långa skruvar som i kombination med fyra tryckfjädrar drar in plattorna för att öppna handtagen.
  5. Placera alla komponenter i sekundära behållare som kan fånga upp alla odlingsmedier i händelse av läckage. Sänk ner i ≥ 10% blekmedelslösning och blötlägg i minst 1 timme. Skölj av blekmedelslösningen med kranvatten (autoklav vid behov) och flytta in i BSC.
    OBS: För felsökning av föroreningar, överväg att autoklavera allt kranvatten eller använda renat vatten. Se diskussionen för ytterligare tips när du tar itu med kontaminering.
  6. Använd M3-skruvarna och tryckfjädrarna för att fästa plattorna på handtagen, fäst handtagen på basen med M5-skruven och sätt i M6-skruvarna tills de griper in i plattorna. Använd dubbelhäftande tejp för att fästa sandpapper på plattorna och stäng sedan handtagen för att främja sandpapprets vidhäftning till plattorna. Upprepa för alla plattformar.
  7. När du är redo att lasta en plattform, öppna handtagen helt och använd en pincett, placera överbenet och knäet mellan plattorna med den ytliga ytan av akillessenan vänd uppåt (Figur 1A). Stäng handtagen löst för att försiktigt hålla dem på plats.
  8. Använd en pincett för att ta tag i det exponerade lårbenshuvudet eller lårbensfoten och manipulera knäböjningsvinkeln när du gradvis stänger greppen för att säkra på plats. För baslinjespänningsgruppen, förläng knäleden som beskrivits tidigare. När greppen dras åt med knäet utsträckt ska fotleden naturligt sträckas ut. För den statiska impingementgruppen, böj knäleden mellan greppen som beskrivits tidigare.
  9. För den statiska impingementgruppen, placera överhandsknuten på snöret runt den distala tassen och dra åt. Dra snöret genom en skåra i basen som ligger under explantan och genom klämhålet. Placera basen i akrylbadet och fäst klämman i badkarets överkant (Figur 1A).
  10. Dra snöret för att dorsalflexa foten till minst 110° i förhållande till skenbenet och använd en permanent markör för att markera strängen när den lämnar klämman. Ta ett fotografi av explantan i denna position för att senare kvantifiera dorsalflexionsvinkeln (Figur 1A).
  11. Ta bort basen och fäst volymreduceringsinsatsen genom att glida längs ett spår på basen. Sätt tillbaka basen (nu fäst vid volymreduceringsinsatsen) i akrylbadet och sätt tillbaka klämman på den övre kanten. Dra i snöret för att återgå till den ursprungliga dorsalflexionsvinkeln med hjälp av det markerade snöret som guide och fäst snöret på utsidan av badet med tejp för att bibehålla statisk dorsalflexion.
  12. För baslinjespänningsgruppen, placera helt enkelt basen med volymreduceringsinsatsen i akrylbadet när explanten är placerad mellan greppen och ta ett fotografi för kvantifiering av dorsalflexionsvinkeln.
  13. Tillsätt 125 ml förvärmt (37 °C) odlingssubstrat till varje plattform för att sänka explanteringen. Täck toppen av badet med aluminiumfolie, lägg i en sekundär behållare och flytta in i inkubatorn. Kultur i ytterligare 7 dagar, byte av media var 48-72:e timme.
    OBS: Tejp placerad över toppen av badet kan förhindra att PLA-delar flyter.

4. Fixering, avkalkning och paraffininbäddning

  1. Efter explantodling, använd en sax för att klippa tånaglar/distala tår och klipp bort överbenet proximalt till Achilles myotendinous junction. Placera varje trimmad fotled i en bearbetningskassett fodrad med skumbiopsikuddar. Tryck in fotleden i kassetthörnet för att placera fotleden vid cirka 90° dorsalflexion och stäng kassetten för att hålla den på plats.
  2. Fixera i 3 dagar i 10 % neutralt buffrat formalin (NBF) och avkalka i 2 veckor i 14 % etylendiamaentetraättiksyra (EDTA) löst i destillerat vatten (diH2O) med pH justerat till 7,4-7,6 med isättika.
  3. För att avlägsna salter, skölj proverna noggrant tre gånger i både 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) följt av diH2O, 5 minuter vardera. Utför rutinmässig provbehandling för paraffinhistologi: dehydrera genom en graderad serie EtOH, klar i xylen och infiltrera med paraffinvax. Orientera och bädda in prover i paraffin för att erhålla sagittala vävnadssnitt genom akillessenan i medial-till-lateral progression enligt beskrivningen i avsnitt 5 nedan (Figur 1B).

5. Sektionering av vävnad

  1. Med en mikrotom, trimma försiktigt in i sample tills sektionerna är parallella med blockytan. Trimma grovt in i fotleden från den mediala aspekten av leden, stanna innan du når den mediala gränsen för akillessenan.
  2. Överför sample till ett isblock för att justera temperatur och hydrering, och byt blad (eller flytta till en ny del av det nuvarande bladet). Fortsätt snitta in i provet med en tjocklek på 10 μm och identifiera noggrant ingången till akillessenan med ett ljusfältsmikroskop. När den har identifierats, utför seriesnittsspårning sektionsnummer (dvs. vävnadsdjup) genom hela akillesseninsättningen.

6. Deparaffinisering/rehydrering och val av objektglas

  1. För varje analys nedan, välj nivåmatchade vävnadssnitt från varje par av kontralaterala extremiteter. Före färgning, placera på ett glidställ och gå igenom 3 byten av xylen, 2 byten av 100 % EtOH, 2 byten av 95 % EtOH och 1 byte av 70 % EtOH, 5 min vardera. Avsluta rehydreringen i diH2O.

7. TUNEL för att bedöma hälsenans livsduglighet

  1. För TUNEL-märkning, färga enligt tillverkarens protokoll. Inkubera i 20 μg/ml proteinas K i 20 minuter vid rumstemperatur och skölj i diH2O. Inkubera i 50 μl TUNEL-färglösning (5 μl enzymlösning, 45 μL etikettlösning) i 1 timme vid 37 °C. Skölj i diH2O. Montera med antifad-reagens som innehåller DAPI och täckglas.
  2. Föreställ dig insättningen av akillessenan med hjälp av ett fluorescensmikroskop med en 4x objektivlins. Inkludera en DAPI-kanal (excitations-/emissionsvåglängder = 360/460 nm) för att visualisera alla kärnor, en TUNEL (TMR Red) kanal (excitations-/emissionsvåglängder = 540/580 nm) för att visualisera apoptotiska kärnor, och om möjligt en ljusfältskanal.
  3. För bildanalys importerar du bilder till ett bildanalysprogram som är lämpligt för ROI-baserad bearbetning, till exempel FIJI/ImageJ eller MATLAB. Definiera ett intresseområde (ROI) som beskriver hela akillessenan i sikte (Figur 2A), exklusive celler i epitenon som är mycket mottagliga för död inducerad av dissektion och plötsliga förändringar i miljöförhållanden när de placeras i odling.
  4. Det gör du genom att utföra ROI-val i MATLAB genom att importera ljusfältsbilden och använda funktionen drawpolygon() för att spåra och omsluta senans gränser. MATLAB skapar ett Polygon-objekt för ROI, som sedan kan tillämpas på DAPI- och TUNEL-kanalbilderna för att maskera pixelintensitetsdata utanför ROI med hjälp av createMask() för att endast analysera kärnor i akillessenan.
  5. Importera DAPI- och TUNEL-kanalbilderna och identifiera en fluorescensintensitetströskel för att definiera apoptotiska (TUNEL+) kärnor genom att normalisera till den maximala fluorescensintensiteten för apoptotiska kärnor i icke-viabla vävnader såsom ben, muskler eller fett som oavsiktligt fångas i vävnadssnittet. När bilderna är maskerade, beräkna fraktionen av apoptotiska kärnor (TUNEL+-kärnor/DAPI-kärnor) i akillessenan.

8. Toluidinblå histologi för att karakterisera fibrobroskbildning

  1. När den har rehydrerats (avsnitt 6), överför objektstället med nivåmatchade vävnadssnitt från kontralaterala par av explantat till 0,4 % w/v toluidinblått O i 0,1 M natriumacetatbuffert med pH justerat till 4,0 med hjälp av isättika. Inkubera i 10 minuter i rumstemperatur och skölj sedan 3 gånger i diH2O i 30 s vardera.
  2. Torka genom tre förändringar på 95 % EtOH och två förändringar på 100 % EtOH, 30 s vardera. Rensa genom tre byten xylen, 1 min vardera. Täckglas med xylenbaserat monteringsmedium.
  3. Få 24-bitars röd-blå-grön (RGB) färgbilder av akillessenan. Till exempelample, för detta protokoll använd en adapter för att ansluta en digital färgkamera till okularet på ett enkelt ljusfältsmikroskop med ett 4x objektiv.
  4. För att kvantifiera skillnader i toluidinblå färgning inom kompressionssenans fibrobrosk (CTF)16 vid akillesseninsättningen (figur 3A,B), importera RGB-bilder till en bildanalysprogramvara som kan definiera och hantera flera ROI:er. Alternativen inkluderar valen och ROI-hanteringsverktygen i FIJI/ImageJ eller verktygslådan för bildbehandling i MATLAB. Börja med att ställa in pixel-/längdskalan.
    OBS: Valet av programvara är upp till forskaren och är absolut inte begränsat till MATLAB eller FIJI/ImageJ. Författarna har tillhandahållit MATLAB-kod (tilläggsfil 2), dokumentation som beskriver implementeringen (tilläggsfil 3) och en exempelbild (tilläggsfil 4). Vi uppmuntrar forskare att översätta denna kod till alternativa programmeringsspråk för användning i annan programvara efter behov eller önskemål.
  5. Med bilden som visas i den valda programvaran identifierar du skärningspunkten mellan den djupa sengränsen och calcaneus. Härifrån spårar du proximalt 800 μm längs den djupa sengränsen för att fastställa CTF:s djupa gräns. Använd till exempel funktionen drawpolyline() i MATLAB för att interaktivt rita en polylinje över RGB-bilden. MATLAB skapar ett Polyline-objekt som innehåller linjens hörn, som kan bearbetas och trimmas till en längd på 800 μm.
  6. Från denna position, skapa den proximala gränsen för CTF genom att rita ett linjesegment som ansluter till den ytliga sengränsen som är vinkelrät mot den lokala fiberorienteringen.
  7. Gå tillbaka till skärningspunkten mellan den djupa sengränsen och calcaneus och definiera den distala gränsen för CTF genom att rita ett linjesegment som ansluter till den ytliga sengränsen längs den distinkta tidvattenmarkeringen som skiljer CTF från fästzonens fibrobrosk (AZF)16 (Figur 3A,B). Slutligen, generera den ytliga gränsen för CTF genom att spåra den ytliga sengränsen för att omsluta.
  8. För att beskriva rumsliga variationer i GAG-färgning över insättningen, dela upp den totala CTF i 4 kvadranter (Figur 3A,B). Anslut mittpunkten för de djupa och ytliga CTF-gränserna med ett linjesegment för att skapa en distal/proximal gräns. Genom att passera genom mittpunkten för denna gräns, anslut mittpunkterna för de distala och proximala CTF-gränserna längs fiberorienteringen för att skapa en ytlig/djup gräns.
  9. Dessa 6 gränser ger information som kan användas för att definiera ROI som representerar hela CTF, men också 4 kvadranter som delar upp CTF. I MATLAB kan du till exempel kompilera hörn som definierar gränserna för varje enskild ROI (CTF, kvadranter 1–4) till vektorer och använda images.roi.Polygon() för att generera inneslutna Polygon-objekt för varje ROI.
  10. Med ROI definierad, omvandla RGB-pixeldata till färgrymden Hue-Saturation-Value (HSV) med hjälp av färgtransformatorns plugin i FIJI, rgb2hsv()-funktionen i MATLAB eller annan programvara som tillämpar lämpliga transformationsekvationer76. HSV-data kan sedan projiceras i 2D-nyansmättnadsutrymmet, där varje kombination av nyans och mättnad kodar en unik färg (figur 3C).
  11. Inom varje ROI beräknar du den genomsnittliga nyansen och mättnaden som beskriver den genomsnittliga fläckfärgen i ROI. Detta kan uppnås i MATLAB, till exempel genom att använda Polygon-objekten som definierar varje ROI för att maskera bilden med hjälp av createMask() för att analysera pixeldata för nyansmättnad specifikt inom varje ROI.
  12. Definiera ytterligare en liten ROI inom periosteal fibrobrosk (PF)16 (Figur 3A, B) och beräkna genomsnittlig nyans och mättnad. Beräkna sedan det euklidiska avståndet som skiljer den genomsnittliga färgen i varje ROI för CTF till den för PF (figur 3C).
    Equation 1
    OBS: Den euklidiska avståndsberäkningen beskriver graden av likhet mellan den genomsnittliga färgen på ROI och den för PF, en kvintessentiell fibrobroskvävnad 16,17,77. Ett mindre euklidiskt avstånd indikerar en ROI-färg som är mer fibrobroskig till utseendet.
  13. Använd detta avstånd för att beräkna fibrobroskpoängen, vilket förutsätter ett maximalt värde på 1 om ROI-färgen är identisk med PF-färgen och ett minimivärde på -1 om ROI- och PF-färgen når maximal separation inom färgrymden för nyansmättnad.
    Equation 2
  14. Genomsnittliga data för nyans, mättnad och fibrobroskpoäng inom varje ROI över vävnadssnitt från varje extremitet. Utför parade statistiska jämförelser mellan grupper av kontralaterala extremiteter.

9. SHG-avbildning för att undersöka förändring i kollagennätverkets organisation

  1. Utför SHG-avbildning av de toluidinblåfärgade sektionerna med hjälp av ett kapabelt mikroskopsystem med en 20x objektlins. Samla in z-staplar genom sektionstjockleken och utför kakelskanning efter behov för att helt fånga akillessenans insättning.
  2. Importera SHG-bilder till en föredragen bildanalysprogramvara och definiera ROI som omfattar och delar upp CTF vid akillesseninsättningen enligt beskrivningen för toluidinblå bildanalys i avsnitt 8 (figur 4A,B).
  3. Om SHG-bilder importeras till MATLAB använder du metoden för att definiera CTF ROI i MATLAB enligt beskrivningen i avsnitt 8 . När du har definierat ROI, överför ROI-koordinater till FIJI genom att exportera ROI-hörn från MATLAB som .txt filer och importera till FIJI med hjälp av File > Import > XY-koordinater. Överlagra urvalet och skicka till ROI-chefen för analys.
  4. För att kvantifiera kollagenorganisationen, använd plugin-programmet Directionality i FIJI, som utför Fourierspektrumanalys för att beräkna fördelningar av fiberorienteringar över små fönster som spänner över en ROI. Spridningen av denna fördelning, kallad dispersion, är omvänt relaterad till fiberinriktning.
    OBS: Kollagenfibrer kan anta varierande orientering i olika fönster över CTF på grund av grov krökning av senan snarare än frånvaron av inriktning/organisation. För att bättre kunna skilja förändringar i kollagenorganisationen från senans grova krökning vid insättningen är det nödvändigt att definiera mindre ROI.
  5. Importera SHG-bilder till FIJI och ställ in pixel-/längdskalan. Projicera data för maximal pixelintensitet i en sammansatt 2D-bild och lägg till ROI i ROI-hanteraren. Överlägg sekventiellt varje CTF ROI på bilden och rita 10 små sub-ROI:er av konsekvent storlek inom ROI, lägg till sub-ROI:erna till ROI-hanteraren.
  6. Inom varje sub-ROI kör du riktningsplugin-programmet i FIJI för att beräkna fiberdispersion. Genomsnittliga spridningsdata över sub-ROI inom varje CTF ROI och genomsnittliga spridningsdata inom varje CTF ROI över sektioner från varje explant. Utför parade statistiska jämförelser mellan grupper av kontralaterala extremiteter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representativa bilder av TUNEL-färgade vävnadssnitt visar minimala apoptotiska kärnor i akillessenans kropp efter 7 dagars explanteringsodling i experimentgrupperna (Figur 2A). Kvantifiering av dessa bilder ger belägg för att vävnadsodlingsprotokollet bibehåller upp till 78 % livsduglighet i genomsnitt i akillessenan efter 7 dagars explanteringsodling under belastningsförhållanden (Figur 2B).

Kvalitativt uppskattas förbättrad toluidinblå färgning efter 7 dagars statisk impingement jämfört med obelastade kontroller (Figur 3A,B), särskilt i djupa kvadranter i anslutning till calcaneus där vi tidigare har uppmätt maximal tvärgående trycktöjning 5,6. Kvantifiering av dessa toluidinblåfärgade vävnadssnitt indikerar signifikant förändring i nyans (Figur 3D), mättnad (Figur 3E) och fibrobroskpoäng (Figur 3F) efter 7 dagars statisk impingement jämfört med kontralaterala obelastade explantat. Denna förändrade GAG-färgning representerar sannolikt fibrobroskbildning sekundärt till statisk impingement inom denna modell. Statistiskt signifikanta skillnader i mättnad och fibrobroskpoäng upptäcktes endast i kvadrant 1 efter 7 dagars baslinjespänning (Figur 3E,F). Dessutom minskade mättnads- och fibrobroskpoängen i förhållande till kontralaterala obelastade senor, en motsatt trend jämfört med statisk impingement. Dessa data kan stödja hypotesen att dragbelastning kan dämpa eller vända impingement-driven fibrobroskbildning och motiverar ytterligare undersökning i framtiden.

Kvantifiering av SHG-avbildning tyder på subtil men signifikant förändring i kollagenfiberns orientering efter 7 dagars statisk impingement, återigen i den djupa och distala regionen intill calcaneus, vilket indikeras av signifikanta skillnader i dispersion (Figur 4C).

Figure 1
Figur 1: Explanteringsplattform och försöksplanering. A) Fotografisk och schematisk framställning av explanteringsplattformen. (Överst) Fotografi av en hel murin bakbensexplantering lastad i plattformen, med kritiska komponenter märkta. (Nederst) Schematisk bild av infogningsimpingement i akillessenan som framkallas av passivt applicerad fotledsdorsalflexion i denna explantationsmodell. (B) Schematisk bild av studiedesign och explanteringskultur. Bakbensexplantor förbehandlas med 100 nM dexametason i 48 timmar74. Från varje mus odlas sedan en bakbensexplantat i en skål som avlastas i 7 dagar, medan den kontralaterala extremiteten laddas in i experimentplattformen för att placera akillessenan under antingen baslinjespänning eller statisk impingement i 7 dagar. Seriella vävnadssnitt från kontralaterala extremitetspar färgas antingen med toluidinblått för att visualisera GAG-rik vävnad eller används för TUNEL-färgning. Toluidinblåfärgade sektioner används sedan för SHG-avbildning för att bedöma kollagenorganisationen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Explantationens livsduglighet. (A) Representativa bilder av TUNEL-färgade sektioner från förbehandlade (dag 0) explantat (överst till vänster), obelastade senor (överst till höger), senor som bibehålls vid baslinjespänningen (nederst till vänster) och statiskt påverkade senor (nederst till höger). Akillessenan är markerad med en streckad vit linje och märkt AT, medan calcaneus är markerad med en heldragen gul linje och märkt C. Apoptotiska kärnor är röda (TUNEL), alla kärnor är blå (DAPI). (B) Kvantifieringen av döda cellfraktioner var i genomsnitt mindre än 22 % för grupperna för obelastad belastning, spänning vid baslinjen och statisk impingement. Data representerar medelvärdet ± standardavvikelsen. Extremvärden finns i dessa datamängder med mer än 50 % celldöd, vilket kan tillskrivas senskador inducerade av dålig dissektionsteknik. Den genomsnittliga andelen döda celler med borttagna statistiska extremvärden är mindre än 15 % för alla grupper. Ingen statistiskt signifikant skillnad i celldöd hittades mellan obelastade, baslinjespännings- och statiska impingementgrupper (p < 0,05). Dag 0-kontroll: n=8. Obelastad: n=18. Baslinjespänning: n = 8. Statisk impingement: n = 12. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Histologi för toluidinblått. (A) Representativ toluidinblå fläck efter 7 dagars obelastad odling som visar kompressionssenans fibrobrosk (CTF), fästzonens fibrobrosk (AZF) och periostealt fibrobrosk (PF) vid akillesinsättningen16. Calcaneus märkt C. ROI som fångar CTF är markerad i rött och är vidare indelad i 4 kvadranter för att ge ytterligare rumslig information. (B) Representativ toluidinblå betning efter 7 dagars statisk impingement, med förstärkt färgning av CTF, särskilt i kvadrant 1 där vi tidigare har uppmätt maximala tvärgående trycktöjningar 5,6. (C) Schematisk bild av färgrymden för färgmättnad som används för färgbildsanalys. Färg beskrivs av en kombination av nyans (0°-360°) och mättnad (0-255)76. Den genomsnittliga färgen i varje ROI normaliseras till den genomsnittliga färgen på PF genom att beräkna det euklidiska avståndet som skiljer färgerna i varje ROI från färgen i PF, vilket ger en normaliserad fibrobroskpoäng. (D-F) Förändringar i toluidinblå fläck efter 7 dagars statisk impingement (överst) och baslinjespänning (nederst) jämfört med kontralaterala obelastade senor. Data representerar medelvärdet ± standardavvikelsen. (D) Kvantifiering av nyans indikerar signifikanta skillnader i genomsnittlig nyans över alla regioner efter 7 dagars statisk impingement jämfört med kontralaterala obelastade senor. Ingen liknande trend upptäcktes efter 7 dagars baslinjespänning jämfört med kontralaterala obelastade senor. (E) Kvantifiering av mättnad, med signifikanta förändringar i genomsnittlig mättnad över hela CTF och inom kvadranterna 1-3 efter 7 dagars statisk impingement jämfört med kontralaterala obelastade senor. Omvänt upptäcktes signifikanta skillnader endast i kvadrant 1 efter 7 dagars baslinjespänning, där mättnaden minskade jämfört med kontralaterala obelastade senor. (F) Kvantifiering av fibrobroskpoäng, med signifikanta förändringar i fibrobroskpoäng i alla regioner efter 7 dagars statisk impingement jämfört med kontralaterala obelastade senor. Omvänt upptäcktes signifikanta skillnader endast i kvadrant 1 efter 7 dagars baslinjespänning, där fibrobroskpoängen minskade jämfört med kontralaterala obelastade senor. Data tyder på ökad GAG-färgning orsakad av statisk impingement som tyder på ökad fibrobroskbildning. Data som beskriver den totala CTF jämfördes med hjälp av Wilcoxon matched-pairs signerade rangtester. Kvadrantdata jämfördes med hjälp av tvåvägs ANOVA med upprepade mätningar med Šídáks test för multipla jämförelser. *p < 0,05. **p < 0,01. p < 0,005. p < 0,001. Baslinjespänning kontra obelastad: n = 6 par. Statisk impingement vs. obelastad: n = 8 par. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: SHG-avbildning. (A) Representativ SHG-bild efter 7 dagars obelastad odling jämfört med (B) 7 dagars statisk impingement. CTF är markerad i rött och uppdelad i 4 kvadranter enligt märkning, i överensstämmelse med ROI i toluidinblå analys ovan. (C) Inom varje kvadrant utfördes Fourierspektrumanalys i ett rörligt underfönster med hjälp av Directionality-pluginet i FIJI. Spridningen av fördelningen av fiberorienteringar inom varje underfönster kallas dispersion (°) och är omvänt relaterad till fiberinriktning. Dispersion = 0° representerar perfekt parallell inriktning av fibrer. Ökad dispersion representerar en minskning av kollagenfiberinriktningen. Data representerar medelvärdet ± standardavvikelsen. Statistiskt signifikanta skillnader i dispersion upptäcktes i kvadrant 1 efter 7 dagars statisk impingement jämfört med kontralaterala obelastade senor, vilket tyder på ökad kollagendesorganisation. Kvadrantdata jämfördes med hjälp av tvåvägs ANOVA med upprepade mätningar med Šídáks test för multipla jämförelser. * p < 0,05. Statisk impingement vs obelastad: n = 5 par. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tilläggsfil 1: CAD-filer. Dessa CAD-filer, kompilerade i flera filformat, kan användas för att 3D-printa plattformsbasen, volymreduceringsinsatsen och klippet. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 2: MATLAB-filer. De kompilerade MATLAB-filerna möjliggör kvantifiering av toluidinblå histologi enligt beskrivningen i avsnitt 8 i protokollet för att bedöma fibrobroskbildning genom rumslig förändring i GAG-färgning vid akillesseninsättningen. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 3: Riktlinjer för implementering av MATLAB-kod. Detta dokument beskriver en pipeline för kvantifiering av förändringar i GAG-färgning vid akillesseninsättning via bildanalys av toluidinblå histologi med hjälp av den medföljande MATLAB-koden. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 4: Exempelbild av toluidinblå histologi. Denna RGB-färgbild av toluidinblå histologi kan användas för att exekvera den medföljande MATLAB-koden. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den experimentella murina explanteringsplattformen i bakbenen i kombination med det vävnadsodlingsprotokoll som beskrivs i denna studie ger en lämplig modell för att studera mekanobiologin för impingementdriven fibrobroskbildning vid akillesseninsättningen. Användbarheten av denna explantationsmodell demonstreras av de representativa resultaten, som indikerar bibehållande av cellviabilitet samtidigt med betydande och rumsligt heterogen förändring i toluidinblå färgning efter 7 dagars statisk impingement. Dessa fynd tyder på förändrad metabolism av GAG-rika matrixmolekyler sekundärt till mekanisk impingement, i överensstämmelse med andra modeller och kliniska studier 3,4,9,13,23,25,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,44,49. Dessutom upptäcktes subtila men signifikanta förändringar i kollagenorganisationen via SHG-avbildning efter 7 dagars statisk impingement, i överensstämmelse med kliniska tecken på impingementassocierad tendinopati och in vivo-modeller av senimpingement 28,37,38,43,44,49,64.

Tidigare försök att utforska de biologiska följdsjukdomarna av senimpingement har tillämpat enkel kompression på isolerade senceller27,29. När en mekanobiologisk mekanism av intresse har identifierats ger dessa modeller överlägsna terapeutiska screeningplattformar jämfört med vår explantationsmodell. Resultaten av dessa studier måste dock tolkas med försiktighet, eftersom isolerade celler odlade in vitro saknar en tredimensionell extracellulär miljö som påverkar mekanoresponse57,59. Dessutom uppvisar celler isolerade från andra kollagena vävnader (t.ex. brosk) förändrad mekanokänslig jonkanalaktivitet när de utsätts för mekanisk proviant in vitro i frånvaro av en extracellulär miljö78,79. Modellen som presenteras adresserar dessa begränsningar genom att tillhandahålla en plattform för att utsätta in situ-senceller i livskraftiga explantat för fysiologiskt relevanta belastningsförhållanden.

Explantationsmodeller är populära experimentella system för att undersöka senans biologi och fysiologi57,58. I den specifika kontexten av senimpingement har flera tidigare studier använt partiella- och helsenexplantat för att utforska sencellers svar på artificiell enaxlig kompression 30,31,32,33,34,39. Även om dessa studier visade en direkt koppling mellan enaxlig kompression och fibrobroskbildning, är den in vivo mekaniska töjningsmiljön som genereras av senimpingement fleraxiell och beror på anatomiska egenskaper hos det inträngda området 5,6. Till exempel påverkas den belastningsmiljö som skapas genom att calcaneus stöter på akillessenan under fotledens dorsalflexion av insättningsvinkel, fästområde och närvaron av omgivande mjukvävnader 60,61,62,63,80,81. Vår explanteringsplattform bevarar dessa yttre strukturer och reproducerar den multiaxiella töjningsmiljön som genereras av impingement samtidigt som cellerna bibehålls i sin ursprungliga miljö6.

Djurmodeller har varit grundläggande för att styrka ett omedelbart samband mellan mekanisk påverkan och de väsentliga egenskaperna hos senfibrobrosk och patologi, som delar analoga fenotyper 1,25,28,37,64,65,66. Under de senaste decennierna har majoriteten av in vivo impingement forskning använt gnagarmodeller för att studera rotatorkuffsjukdom genom kirurgisk minskning av det subacromiala utrymmet för att artificiellt påverka rotatorkuffens senor. Dessa djurmodeller har använts för att beskriva den cellulära och molekylära patogenesen av impingement-tendinopati in vivo och kan utvidgas till att utvärdera nya terapeutiska strategier för att främja klinisk översättning av impingementforskning 36,37,38,66,82,83,84,85.

Etablerade in vivo-modeller för senimpingement har dock flera viktiga begränsningar när det gäller att studera mekanobiologi57,58. Dessa modeller introducerar eller tar bort kirurgiskt en extern källa till senpåverkan och återupptar fysisk aktivitet (aktivitet i fri bur, påtvingad löpbandslöpning, etc.) Detta tillvägagångssätt saknar kontroll över storleken, orienteringen och frekvensen av kraften som appliceras direkt på senan under hela experimentets varaktighet. Med tanke på svårigheten att mäta vävnadsbelastning in vivo erbjuder dessa modeller begränsad kontroll över, eller karakterisering av, den mekaniska miljön som genereras i senan som svar på impingement. Denna begränsning är välkänd inom området senmekanobiologisk forskning 57,58,67,68,69,70. På andra håll har sofistikerade experimentella plattformar utformats för att applicera kontrollerad mekanisk överbelastning (utmattning) direkt på senor in vivo under anestesi 67,68,69. Dessa modeller kontrollerar appliceringen av mekaniska stimuli under korta perioder under narkos och ger ingen kontroll över belastningshistoriken under resten av försöket när djuren återgår till normal buraktivitet i dagar till veckor efter mekanisk överbelastning. Explantationsmodellen som beskrivs i detta protokoll erbjuder kontrollerad förskrivning av impingement av akillessenan för att generera mätbara och väl beskrivna mönster av vävnadsstam6, vilket möjliggör rigorösa studier av impingementmekanobiologi. Det bör dock noteras att denna explantationsmodell inte undanröjer behovet av in vivo-undersökning av senimpingement, utan snarare fungerar som ett kompletterande verktyg för att berika data som härrör från dessa oumbärliga djurmodeller. Cellulära och molekylära vägar definierade i relation till impingementmekanik med hjälp av denna explanteringsmodell kan karakteriseras in vivo och utvärderas som terapeutiska mål med hjälp av djurmodeller i ett kompletterande tillvägagångssätt för att förbättra klinisk översättning av mekanobiologisk forskning. Kraften i denna integrerade strategi utnyttjas inom andra områden av senmekanobiologisk forskning 58,86,87,88, och denna explantationsmodell ger sin tillämpning på senimpingement.

Explantationsmodellen är inte utan begränsningar. Som med alla explantationsmodeller kan mekanobiologi endast studeras över relativt korta tidsskalor medan vävnaden förblir livskraftig57,89. Även om modellen är ett kraftfullt verktyg för att studera det omedelbara cellulära svaret på mekanisk impingement, är den inte lämplig för att studera kronisk sensjukdom i samband med impingement. Dessutom kan modellen inte ta hänsyn till systemisk respons och vävnadsöverhörning eftersom blodtillförsel och neural kommunikation inte upprätthålls. Icke desto mindre ger modellen en plattform för att avgränsa det inneboende svaret hos endogena senceller på mekanisk impingement. En ytterligare begränsning med modellen är att vi enligt tidigare forskning 32,90,91,92 förväntar oss att många stora GAG-rika proteoglykaner diffunderar ut ur senan under förbehandling och tidiga tidpunkter för explantkultur, särskilt fragment av aggregerande proteoglykaner som inte är förankrade i markmatrisen. Därför är det troligt att förändringar i GAG-färgning sekundärt till impingement i modellen återspeglar förändringar i nyligen syntetiserade GAG-rika makromolekyler som ännu inte har kataboliserats och förblir förankrade i den extracellulära matrisen. Med tanke på att dessa GAG-rika proteoglykaner lokaliseras till det pericellulära utrymmet 22,30,93,94,95, kan explantationsmodellen underlätta undersökning av PCM-ombyggnad sekundärt till senimpingement.

Dissektionen av murina bakbensexplantor som beskrivs i detta protokoll kräver övning, men skicklig teknik kan uppnås snabbt. Fullständig avmattning (dvs. avlägsnande av skinn) kan visa sig vara utmanande, särskilt runt fingrarna på baktassen. Även om huden runt tårna inte behöver tas bort helt, förstärker den steriliteten under hela odlingen eftersom bakterier finns på huden och pälsen.

Den svåraste aspekten av dissektionen är avlägsnande av plantarissenan medialt till akillessenan proximalt och övergående ytligt till akillessenan distalt. Plantaris muskelsenenhet sträcker sig över knä- och fotlederna i nära anslutning till triceps surae och akillessenan 81,96,97,98,99. Mekaniska belastningar som överförs över den bakre aspekten av fotleden under passiv fotledsdorsalflexion fördelas mellan plantaris- och akillessenorna, och plantarissenan är känd för att bära hög stress in vivo100,101. Dessutom är den anatomiska variationen i den mänskliga plantaris väl beskriven 96,102,103 och även om denna variabilitet är mindre utbredd hos gnagare97, har den en benägenhet att påverka den mekaniska miljön i akillessenan in situ. I överensstämmelse med tidigare tekniker som använts för att mäta töjning i akillessenan in situ 6,104, bör plantarissenan avlägsnas för att kontrollera den inre töjningsmiljön som genereras av externt applicerad senimpingement.

Försiktigt avlägsnande av plantaris är nödvändigt för att undvika dissektionsinducerad celldöd i akillessenan, och variabiliteten i cellapoptos som finns i data (Figur 2B) kan återspegla dissektionsinducerad skada på grund av dålig dissektionsteknik. Avlägsnande av plantarissenan drar nytta av en fin spetspincett för att försiktigt separera plantaris från akilleshälen och frigöra plantarismuskel-senkomplexet proximalt. Tandad pincett hjälper till att greppa den proximala fria änden av plantarissenan för att dra distalt, runt calcaneus och mot fingrarna på tassen för fullständig borttagning. Lee och Elliott ger en användbar anatomisk beskrivning av råttans plantaris och akillessenor och tillhörande muskulatur97.

Även om vi fann att dissektionstekniken som beskrivs i denna studie var tillräcklig för att säkerställa sterilitet, kan protokollet justeras eller modifieras efter behov i miljöer där det är svårt att upprätthålla steriliteten. Kirurgiska verktyg kan autoklaveras, betadinlösning kan appliceras lokalt på huden och dissektion kan utföras i ett biologiskt säkerhetsskåp. Vi har funnit att snabb och effektiv dissektion av bänkskivor är avgörande och gör det möjligt att snabbt överföra dissekerade extremiteter till sterila medier i ett biologiskt säkerhetsskåp efter att den sterila gränsen som huden utgör har överskridits.

Ett annat viktigt mål för felsökning av kontaminering är den teknik som används för sterilisering av plattformskomponenter. I våra händer har vi haft konsekvent framgång med enkla blötläggningar i ≥ 10 % blekmedelslösning med tillräcklig sköljning i kranvatten utan autoklavering. Ytterligare sterilisering med 70 % etanol kan appliceras vid behov, men var medveten om att alla komponenter som 3D-skrivs ut med PLA är inkompatibla med EtOH och kommer att skevna. Dessutom kan alla delar av plattformen förutom akrylbadet och 3D-printade PLA-komponenter autoklaveras, och komponenter som är indränkta i ≥ 10 % blekmedelslösning kan sköljas med autoklaverat eller renat vatten. För att undvika rost rekommenderas det att tvätta och handtorka alla metallkomponenter omedelbart efter varje experiment.

Metodiken för att kvantifiera toluidinblå färgning för att karakterisera fibrobroskbildning som beskrivs i detta protokoll använder en innovativ anpassad färgbildsanalys som erbjuder bred tillämpning på senforskning. Betydande fördelar ges genom att konvertera pixeldata från RGB till HSV-färgrymden76. Här kodar nyansen en dominerande våglängd som en karakteristisk färg från 0°-360°, medan mättnad definierar renheten för varje nyans från 0-255. Värde, omvänt, beskriver färgens ljusstyrka och som sådan separerar HSV-färgschemat ljusstyrka (värde) från färg (nyans, mättnad). I samband med histologiska analyser är HSV-pixeldata mer robusta mot förändringar i ljustransmission under mikroskopi och variationer i vävnadssnitttjocklek76. Att arbeta i HSV-färgrymden gör det dessutom möjligt att avgränsa specifika våglängder av intresse (via nyans) beroende på den histologiska färgningen76, t.ex. nyanser runt 240° för toluidinblå färgning.

En innovativ aspekt av den toluidinblå bildanalysen som presenteras i denna studie är fibrobroskpoängen, ett mått som är relaterat till det euklidiska avståndet som skiljer färgen på varje ROI till färgen på det periosteala fibrobrosket. Det periosteala fibrobrosket framträder som ett sekundärt brosk omedelbart efter födseln, medan kompressionssenans fibrobrosk saknas postnatalt och, liksom andra sesamoida fibrobrosk, verkar regleras av mekanisk efterfrågan i regioner med förhöjd senkompression 16,17,28,77 . Genom att jämföra fibrobroskpoäng mellan experimentella grupper kan vi avgöra inte bara om färgen på den blå tonen i toluidin förändras sekundärt till impingement, utan även om denna förändring resulterar i ett utseende som ligger närmare fibrobrosk. Denna analys kan utvidgas till andra populära GAG-fläckar som Alcian blue och Safranin O, såväl som andra regioner av senfibrobrosk och fibrocartilaginösa senenteser, så länge det finns en kontrollvävnad som liknar periosteal fibrocartilage. Till exempel kan förändringar i GAG-färgning i knäets senor och ligament normaliseras via fibrobroskpoängen till färgning i den fibrobroskiga menisken.

En viktig aspekt av detta protokoll är seriell vävnadssnittning och spårning av sektionsnivå genom akillessenan, vilket kräver repeterbar paraffininbäddning och noggrann identifiering av inträde i akillessenan för spårning av snittdjupet. Detta snittnings- och färgningsprotokoll kräver utan tvekan övning och förfining men kan utvidgas till kryosektion.

Det histologiska tillvägagångssättet som beskrivs i detta manuskript kan enkelt utvidgas till immunhistokemi eller immunofluorescens. I detta avseende är en viktig aspekt av ovanstående experimentella design den parvisa jämförelsen av kontralaterala extremiteter från varje mus. Här görs alla statistiska jämförelser mellan vävnadssnitt på jämförbar snittnivå genom hälsenan från kontralaterala extremiteter från samma mus som tilldelats olika experimentgrupper. Denna strategi hjälper till att kontrollera biologisk variabilitet. Dessutom färgas nivåmatchade par av kontralaterala vävnadssnitt på samma objektglas samtidigt (histologi) eller på objektglas samtidigt med identiska arbetslösningar för alla reagenser, buffertar och antikroppslösningar (immunfärgning) för att hjälpa till att kontrollera för fläck-till-fläck-variabilitet som är inneboende i histologi och immunmärkning, såväl som anatomisk heterogenitet beroende på sektionsnivå, plats och orientering.

Flera andra modifieringar av protokollet som beskrivs i detta manuskript kan implementeras för vidare studier av ytterligare forskningsfrågor. Till exempel, medan de representativa data som tillhandahålls här är fokuserade på 7 dagars statisk impingement, kan detta tillvägagångssätt anpassas för att undersöka de biologiska följderna av intermittent eller cyklisk impingement genom att koppla snöret lindat runt baktassen genom klämman till ett mekaniskt ställdon såsom en sprutpump. Dessutom ger plattformen möjlighet att undersöka molekylära mekanismer av intresse genom att komplettera odlingsmediet med småmolekylära agonister/antagonister, eller genom att använda bakbensexplantationer från transgena musstammar.

Sammanfattningsvis har vi presenterat en ny modell för explantation av bakbenen hos möss för att studera mekanobiologi som ligger till grund för impingement av akillessenan. Detta är utrustat med ett vävnadsodlingsprotokoll som upprätthåller cellviabiliteten under belastningsförhållanden under 7 dagar. Denna modell rekapitulerar impingement-driven fibrobroskbildning och kollagena förändringar som beskrivs i andra modellsystem såväl som vid degenerativ sensjukdom. Den experimentella plattformen möjliggör kontrollerad tillämpning och kvantifiering av mekaniska töjningsmönster och utgör därför en utmärkt modell för rigorösa studier av impingementmekanobiologi. Denna modell kan användas för att undersöka molekylära mekanismer av intresse för att identifiera potentiella terapeutiska mål vid behandling av insertionella tendinopatier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna är tacksamma för stöd och hjälp från Jeff Fox och Vidya Venkatramani vid University of Rochester Center for Musculoskeletal Research's Histology, Biochemistry, and Molecular Imaging (HBMI) Core, delvis finansierad av P30AR06965. Dessutom vill författarna tacka Center for Light Microscopy and Nanoscopy (CALMN) vid University of Rochester Medical Center för hjälp med multifotonmikroskopi. Denna studie finansierades av R01 AR070765 och R01 AR070765-04S1, samt 1R35GM147054 och 1R01AR082349.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbent underpads VWR 82020-845 For benchtop dissection
Acrylic bath Source One X001G46CB1 Contains the explant platform submerged in culture media
Autoclave bin Thermo Scientific 13-361-20 Used as secondary containment, holds two platforms
Base - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Braided line KastKing 30lb test Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion
Clip - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Cover glass Fisherbrand 12-541-034 Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYL VWR 8312-4 Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections
Dexamethasone MP Biomedical LLC 194561 CAS#50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous Invitrogen by ThermoFisher D12345 CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions
Double-sided tape Scotch Brand 34-8724-5195-9 To attach sandpaper to Grip platens
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM) Gibco by ThermoFisher 11965092 high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine
EDTA tetrasodium salt dihydrate Thermo Scientific Chemicals J15700.A1 CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation
Ethanol, 200 proof Thermo Scientific T038181000 CAS#64-17-5, 1 L supply
Foam biopsy pads Leica 3801000 Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification
Forceps, #SS Standard Inox Dumont 11203-23 Straight, smooth, fine tips
Forceps, Micro-Adson 4.75" Fisherbrand 13-820-073 Straight, fine tips with serrated teeth
Garnet Sandpaper, 50-D Grit Norton M600060 01518 Or other coarse grit sandpaper
Glacial acetic acid Fisher Chemical A38S-500 CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution
Grips ADMET GV-100NT-A4 Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included
Histobond Adhesive Microscope Slides VWR 16005-108 Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red Roche 12156792910 TUNEL assay
Labeling tape Fisherbrand 15-959 Or any other labeling tape of preference
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544-100G CAS#50-81-7, for culture media formulation
Neutral buffered formalin, 10% Leica 3800600 For sample fixation, 5 gallon supply
Nunc petri dishes Sigma-Aldrich P7741-1CS 100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol
Penicillin-streptomycin (100X) Gibco by ThermoFisher 15140122 Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament Hatchbox - Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.
Processing cassettes Leica 3802631 For fixation, decalcification and paraffin embedding
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Invitrogen by ThermoFisher P36931 Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL
Proteinase K Fisher BioReagents BP1700-50 CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol
Scissors, Fine FST 14094-11 Straight, sharp
Slide Staining Set, 12-place Mercedes Scientific  MER 1011 Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology
Sodium acetate, anhydrous Thermo Scientific Chemicals A1318430 CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades VWR 25608-964 For paraffin sectioning
Toluidine Blue O Thermo Scientific Chemicals 348601000 CAS#92-31-9
Volume Reduction Insert - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Xylenes Leica 3803665 4 gallon supply for histological staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cook, J. L., Purdam, C. Is compressive load a factor in the development of tendinopathy. Br J Sports Med. 46 (3), 163-168 (2012).
  2. Benjamin, M., Qin, S., Ralphs, J. R. Fibrocartilage associated with human tendons and their pulleys. J Anat. 187 (Pt 3), 625-633 (1995).
  3. Benjamin, M., Ralphs, J. R. Fibrocartilage in tendons and ligaments - an adaptation to compressive load. J Anat. 193 (4), 481-494 (1998).
  4. Benjamin, M., Theobald, P., Suzuki, D., Toumi, H. The anatomy of the Achilles tendon. The Achilles Tendon. 3, 5-16 (2007).
  5. Chimenti, R. L., et al. Insertional achilles tendinopathy associated with altered transverse compressive and axial tensile strain during ankle dorsiflexion. J Orthop Res. 35 (4), 910-915 (2017).
  6. Mora, K. E., et al. Ultrasound strain mapping of the mouse Achilles tendon during passive dorsiflexion. J Biomech. 132, 110920 (2022).
  7. Pringels, L., et al. Intratendinous pressure changes in the Achilles tendon during stretching and eccentric loading: Implications for Achilles tendinopathy. Scand J Med Sci Sports. 33 (5), 619-630 (2023).
  8. Koob, T. J., Vogel, K. G. Site-related variations in glycosaminoglycan content and swelling properties of bovine flexor tendon. J Orthop Res. 5 (3), 414-424 (1987).
  9. Vogel, K. G., Koob, T. J. Structural specialization in tendons under compression. Int Rev Cytol. 115, 267-293 (1989).
  10. Vogel, K. G., Ordög, A., Pogány, G., Oláh, J. Proteoglycans in the compressed region of human tibialis posterior tendon and in ligaments. J Orthop Res. 11 (1), 68-77 (1993).
  11. Vogel, K. G., Sandy, J. D., Pogány, G., Robbins, J. R. Aggrecan in bovine tendon. Matrix Biol. 14 (2), 171-179 (1994).
  12. Robbins, J. R., Vogel, K. G. Regional expression of mRNA for proteoglycans and collagen in tendon. Eur J Cell Biol. 64 (2), 264-270 (1994).
  13. Vogel, K. Repetitive motion disorders of the upper extremity. Gordon, S. I., Blair, S. J., Fine, L. J. , American Academy of Orthopedic Surgeons, Michigan. (1995).
  14. Benjamin, M., Tyers, R. N., Ralphs, J. R. Age-related changes in tendon fibrocartilage. J Anat. 179, 127-136 (1991).
  15. Ralphs, J. R., Benjamin, M., Thornett, A. Cell and matrix biology of the suprapatella in the rat: a structural and immunocytochemical study of fibrocartilage in a tendon subject to compression. Anat Rec. 231 (2), 167-177 (1991).
  16. Rufai, A., Benjamin, M., Ralphs, J. R. Development and ageing of phenotypically distinct fibrocartilages associated with the rat Achilles tendon. Anat Embryol (Berl). 186 (6), 611-618 (1992).
  17. Rufai, A., Ralphs, J. R., Benjamin, M. Ultrastructure of fibrocartilages at the insertion of the rat Achilles tendon. J Anat. 189 (Pt 1), 185-191 (1996).
  18. Waggett, A. D., Ralphs, J. R., Kwan, A. P. L., Woodnutt, D., Benjamin, M. Characterization of collagens and proteoglycans at the insertion of the human achilles tendon. Matrix Biol. 16 (8), 457-470 (1998).
  19. Ralphs, J., et al. Regional differences in cell shape and gap junction expression in rat Achilles tendon: relation to fibrocartilage differentiation. J Anat. 193 (pt 2), 215-222 (1998).
  20. Milz, S., et al. Three-dimensional reconstructions of the Achilles tendon insertion in man. J Anat. 200 (Pt 2), 145-152 (2002).
  21. Tischer, T., Milz, S., Maier, M., Schieker, M., Benjamin, M. An immunohistochemical study of the rabbit suprapatella, a sesamoid fibrocartilage in the quadriceps tendon containing aggrecan. J Histochem Cytochem. 50 (7), 955-960 (2002).
  22. Esquisatto, M. A., Joazeiro, P. P., Pimentel, E. R., Gomes, L. The effect of age on the structure and composition of rat tendon fibrocartilage. Cell Biol Int. 31 (6), 570-577 (2007).
  23. Matuszewski, P. E., et al. Regional variation in human supraspinatus tendon proteoglycans: Decorin, biglycan, and aggrecan. Connect Tissue Res. 53 (5), 343-348 (2012).
  24. Buckley, M. R., Huffman, G. R., Iozzo, R. V., Birk, D. E., Soslowsky, L. J. The location-specific role of proteoglycans in the flexor carpi ulnaris tendon. Connect Tissue Res. 54 (6), 367-373 (2013).
  25. Gillard, G. C., Reilly, H. C., Bell-Booth, P. G., Flint, M. H. The influence of mechanical forces on the glycosaminoglycan content of the rabbit flexor digitorum profundus tendon. Connect Tissue Res. 7 (1), 37-46 (1979).
  26. Giori, N. J., Beaupre, G. S., Carter, D. R. Cellular shape and pressure may mediate mechanical control of tissue composition in tendons. J Orthop Res. 11 (4), 581-591 (1993).
  27. Wren, T. A., Beaupré, G. S., Carter, D. R. Mechanobiology of tendon adaptation to compressive loading through fibrocartilaginous metaplasia. J Rehabil Res Dev. 37 (2), 135-143 (2000).
  28. Malaviya, P., et al. An in vivo model for load-modulated remodeling in the rabbit flexor tendon. J Orthop Res. 18 (1), 116-125 (2000).
  29. Shim, J. W., Elder, S. H. Influence of Cyclic Hydrostatic Pressure on Fibrocartilaginous Metaplasia of Achilles Tendon Fibroblasts. Biomech Model Mechanobiol. 5 (4), 247-252 (2006).
  30. Koob, T. J., Clark, P. E., Hernandez, D. J., Thurmond, F. A., Vogel, K. G. Compression loading in vitro regulates proteoglycan synthesis by tendon fibrocartilage. Arch Biochem Biophys. 298 (1), 303-312 (1992).
  31. Evanko, S. P., Vogel, K. G. Proteoglycan Synthesis in Fetal Tendon Is Differentially Regulated by Cyclic Compression in Vitro. Arch Biochem Biophys. 307 (1), 153-164 (1993).
  32. Vogel, K. G. The effect of compressive loading on proteoglycan turnover in cultured fetal tendon. Connect Tissue Res. 34 (3), 227-237 (1996).
  33. Thornton, G. M., et al. Changes in mechanical loading lead to tendon specific alterations in MMP and TIMP expression: influence of stress deprivation and intermittent cyclic hydrostatic compression on rat supraspinatus and Achilles tendons. Br J Sports Med. 44 (10), 698-703 (2010).
  34. Robbins, J. R., Evanko, S. P., Vogel, K. G. Mechanical Loading and TGF-β Regulate Proteoglycan Synthesis in Tendon. Arch Biochem Biophys. 342 (2), 203-211 (1997).
  35. Docking, S., Samiric, T., Scase, E., Purdam, C., Cook, J. Relationship between compressive loading and ECM changes in tendons. Muscles Ligaments Tendons J. 3 (1), 7-11 (2013).
  36. Wang, X., et al. Aberrant TGF-β activation in bone tendon insertion induces enthesopathy-like disease. J Clin Invest. 128 (2), 846-860 (2018).
  37. Cong, G. T., et al. Evaluating the role of subacromial impingement in rotator cuff tendinopathy: Development and analysis of a novel murine model. J Orthop Res. 36 (10), 2780-2788 (2018).
  38. Liu, Y., et al. Evaluating the role of subacromial impingement in rotator cuff tendinopathy: development and analysis of a novel rat model. J Shoulder Elbow Surg. 31 (9), 1898-1908 (2022).
  39. Majima, T., et al. Compressive compared with tensile loading of medial collateral ligament scar in vitro uniquely influences mRNA levels for aggrecan, collagen type II, and collagenase. J Orthop Res. 18 (4), 524-531 (2000).
  40. Hopkins, C., et al. Critical review on the socio-economic impact of tendinopathy. Asia Pac J Sports Med, Arthrosc, Rehabil Technol. 4, 9-20 (2016).
  41. Scott, A., Ashe, M. C. Common tendinopathies in the upper and lower extremities. Curr Sports Med Rep. 5 (5), 233-241 (2006).
  42. Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. Types and epidemiology of tendinopathy. Clin Sports Med. 22 (4), 675-692 (2003).
  43. Bah, I., et al. Tensile mechanical changes in the Achilles tendon due to Insertional Achilles tendinopathy. J Mech Behav Biomed Mater. 112, 104031 (2020).
  44. Chondral Metaplasia in Calcific Insertional Tendinopathy of the Achilles Tendon. Clin J Sport Med. Maffulli, N., Reaper, J., Ewen, S. W. B., Waterston, S. W., Barrass, V. 16 (4), 329-334 (2006).
  45. Corps, A. N., et al. Increased expression of aggrecan and biglycan mRNA in Achilles tendinopathy. Rheumatology (Oxford). 45 (3), 291-294 (2006).
  46. Scott, A., et al. Increased versican content is associated with tendinosis pathology in the patellar tendon of athletes with jumper's knee. Scand J Med Sci Sports. 18 (4), 427-435 (2008).
  47. Attia, M., et al. Greater glycosaminoglycan content in human patellar tendon biopsies is associated with more pain and a lower VISA score. Br J Sports Med. 48 (6), 469-475 (2014).
  48. Kujala, U. M., Sarna, S., Kaprio, J. Cumulative Incidence of Achilles Tendon Rupture and Tendinopathy in Male Former Elite Athletes. Clin J Sport Med. 15 (3), 133-135 (2005).
  49. Corps, A. N., et al. Changes in matrix protein biochemistry and the expression of mRNA encoding matrix proteins and metalloproteinases in posterior tibialis tendinopathy. Ann Rheum Dis. 71 (5), 746-752 (2012).
  50. Neer, C. S. 2nd Anterior acromioplasty for the chronic impingement syndrome in the shoulder: a preliminary report. J Bone Joint Surg Am. 54 (1), 41-50 (1972).
  51. Bigliani, L. U., Ticker, J. B., Flatow, E. L., Soslowsky, L. J., Mow, V. C. The relationship of acromial architecture to rotator cuff disease. Clin Sports Med. 10 (4), 823-838 (1991).
  52. Chimenti, R. L., Cychosz, C. C., Hall, M. M., Phisitkul, P. Current Concepts Review Update Insertional Achilles Tendinopathy. Foot Ankle Int. 38 (10), 1160-1169 (2017).
  53. Nicholson, C. W., Berlet, G. C., Lee, T. H. Prediction of the Success of Nonoperative Treatment of Insertional Achilles Tendinosis Based on MRI. Foot Ankle Int. 28 (4), 472-477 (2007).
  54. Lohrer, H., David, S., Nauck, T. Surgical treatment for achilles tendinopathy - a systematic review. BMC musculoskelet disord. 17 (1), 207 (2016).
  55. McGarvey, W. C., Palumbo, R. C., Baxter, D. E., Leibman, B. D. Insertional Achilles Tendinosis: Surgical Treatment Through a Central Tendon Splitting Approach. Foot Ankle Int. 23 (1), 19-25 (2002).
  56. Maffulli, N., et al. Surgery for chronic Achilles tendinopathy produces worse results in women. Disabil Rehabil. 30 (20-22), 1714-1720 (1714).
  57. Wunderli, S. L., Blache, U., Snedeker, J. G. Tendon explant models for physiologically relevant in vitro study of tissue biology - a perspective. Connect Tissue Res. 61 (3-4), 262-277 (2020).
  58. Dyment, N. A., et al. A brief history of tendon and ligament bioreactors: Impact and future prospects. J Orthop Res. 38 (11), 2318-2330 (2020).
  59. Screen, H. R. C., Berk, D. E., Kadler, K. E., Ramirez, F., Young, M. F. Tendon Functional Extracellular Matrix. J Orthop Res. 33 (6), 793-799 (2015).
  60. Theobald, P., et al. The functional anatomy of Kager's fat pad in relation to retrocalcaneal problems and other hindfoot disorders. J Anat. 208 (1), 91-97 (2006).
  61. Ghazzawi, A., Theobald, P., Pugh, N., Byrne, C., Nokes, L. Quantifying the motion of Kager's fat pad. J Orthop Res. 27 (11), 1457-1460 (2009).
  62. Malagelada, F., et al. Pressure changes in the Kager fat pad at the extremes of ankle motion suggest a potential role in Achilles tendinopathy. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 28 (1), 148-154 (2020).
  63. Shaw, H. M., Benjamin, M. Structure-function relationships of entheses in relation to mechanical load and exercise. Scand J Med Sci Sports. 17 (4), 303-315 (2007).
  64. Soslowsky, L. J., et al. Rotator cuff tendinosis in an animal model: role of extrinsic and overuse factors. Ann Biomed Eng. 30 (8), 1057-1063 (2002).
  65. Schneeberger, A. G., Nyffeler, R. W., Gerber, C. Structural changes of the rotator cuff caused by experimental subacromial impingement in the rat. J Shoulder Elbow Surg. 7 (4), 375-380 (1998).
  66. Croen, B. J., et al. Chronic subacromial impingement leads to supraspinatus muscle functional and morphological changes: Evaluation in a murine model. J Orthop Res. 39 (10), 2243-2251 (2021).
  67. Andarawis-Puri, N., Flatow, E. L. Tendon fatigue in response to mechanical loading. J Musculoskelet Neuronal Interact. 11 (2), 106-114 (2011).
  68. Gains, C. C., Giannapoulos, A., Zamboulis, D. E., Lopez-Tremoleda, J., Screen, H. R. C. Development and application of a novel in vivo overload model of the Achilles tendon in rat. J Biomech. 151, 111546 (2023).
  69. Williamson, P. M., et al. A passive ankle dorsiflexion testing system to assess mechanobiological and structural response to cyclic loading in rat Achilles tendon. J Biomech. 156, 111664 (2023).
  70. Pedaprolu, K., Szczesny, S. E. A Novel, Open-Source, Low-Cost Bioreactor for Load-Controlled Cyclic Loading of Tendon Explants. J Biomech Eng. 144 (8), 084505 (2022).
  71. Orishimo, K. F., et al. Effect of Knee Flexion Angle on Achilles Tendon Force and Ankle Joint Plantarflexion Moment During Passive Dorsiflexion. J Foot Ankle Surg. 47 (1), 34-39 (2008).
  72. Liu, C. L., et al. Influence of different knee and ankle ranges of motion on the elasticity of triceps surae muscles, Achilles tendon, and plantar fascia. Sci Rep. 10 (1), 6643 (2020).
  73. Cruz-Montecinos, C., et al. Soleus muscle and Achilles tendon compressive stiffness is related to knee and ankle positioning. J Electromyogr Kinesiol. 66, 102698 (2022).
  74. Connizzo, B. K., Grodzinsky, A. J. Lose-dose administration of dexamethasone is beneficial in preventing secondary tendon damage in a stress-deprived joint injury explant model. J Orthop Res. 38 (1), 139-149 (2020).
  75. Wunderli, S. L., et al. Tendon response to matrix unloading is determined by the patho-physiological niche. Matrix Biol. 89, 11-26 (2020).
  76. Yabusaki, K., et al. A Novel Quantitative Approach for Eliminating Sample-To-Sample Variation Using a Hue Saturation Value Analysis Program. PloS one. 9 (3), e89627 (2014).
  77. Gao, J., Messner, K., Ralphs, J. R., Benjamin, M. An immunohistochemical study of enthesis development in the medial collateral ligament of the rat knee joint. Anat Embryol. 194 (4), 399-406 (1996).
  78. Han, S. K., Wouters, W. A. J., Clark, A., Herzog, W. Mechanically induced calcium signaling in chondrocytes in situ. J Orthop Res. 30 (3), 475-481 (2012).
  79. Han, W., et al. Impact of cellular microenvironment and mechanical perturbation on calcium signalling in meniscus fibrochondrocytes. Eur Cell Mater. 27, 321-331 (2014).
  80. Rossetti, L., et al. The microstructure and micromechanics of the tendon-bone insertion. Nat Mater. 16 (6), 664-670 (2017).
  81. Sartori, J., Köhring, S., Witte, H., Fischer, M. S., Löffler, M. Three-dimensional imaging of the fibrous microstructure of Achilles tendon entheses in Mus musculus. J Anat. 233 (3), 370-380 (2018).
  82. Eliasberg, C. D., et al. Identification of Inflammatory Mediators in Tendinopathy Using a Murine Subacromial Impingement Model. J Orthop Res. 37 (12), 2575-2582 (2019).
  83. Zhang, Y., et al. Expression of alarmins in a murine rotator cuff tendinopathy model. J Orthop Res. 38 (11), 2513-2520 (2020).
  84. Zhang, X., et al. Assessment of Mitochondrial Dysfunction in a Murine Model of Supraspinatus Tendinopathy. J Bone Joint Surg. Am. 103 (2), 174-183 (2021).
  85. Liu, Y., et al. The role of Indian Hedgehog Signaling in tendon response to subacromial impingement: evaluation using a mouse model. Am J Sports Med. 50 (2), 362-370 (2022).
  86. Wang, T., et al. Load-induced regulation of tendon homeostasis by SPARC, a genetic predisposition factor for tendon and ligament injuries. Sci Transl Med. 13 (582), eabe5738 (2021).
  87. Passini, F. S., et al. Shear-stress sensing by PIEZO1 regulates tendon stiffness in rodents and influences jumping performance in humans. Nat Biomed Eng. 5 (12), 1457-1471 (2021).
  88. Jones, D. L., et al. Mechanoepigenetic regulation of extracellular matrix homeostasis via Yap and Taz. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (22), e2211947120 (2023).
  89. Connizzo, B. K., Grodzinsky, A. J. Release of pro-inflammatory cytokines from muscle and bone causes tenocyte death in a novel rotator cuff in vitro explant culture model. Connect Tissue Res. 59 (5), 423-436 (2018).
  90. Rees, S. G., et al. Catabolism of aggrecan, decorin and biglycan in tendon. Biochem J. 350 (Pt 1), 181-188 (2000).
  91. Samiric, T., Ilic, M. Z., Handley, C. J. Large aggregating and small leucine-rich proteoglycans are degraded by different pathways and at different rates in tendon. Eur J Biochem. 271 (17), 3612-3620 (2004).
  92. Rees, S. G., Curtis, C. L., Dent, C. M., Caterson, B. Catabolism of aggrecan proteoglycan aggregate components in short-term explant cultures of tendon. Matrix Biol. 24 (3), 219-231 (2005).
  93. Taye, N., Karoulias, S. Z., Hubmacher, D. The "other" 15-40%: The Role of Non-Collagenous Extracellular Matrix Proteins and Minor Collagens in Tendon. J Orthop Res. 38 (1), 23-35 (2020).
  94. Carvalho, H. F., Felisbino, S. L. The development of the pressure-bearing tendon of the bullfrog, Rana catesbeiana. Anat Embryol. 200 (1), 55-64 (1999).
  95. Carvalho, H. F., Felisbino, S. L., Covizi, D. Z., Della Colleta, H. H., Gomes, L. Structure and proteoglycan composition of specialized regions of the elastic tendon of the chicken wing. Cell Tissue Res. 300 (3), 435-446 (2000).
  96. van Sterkenburg, M. N., Kerkhoffs, G. M., Kleipool, R. P., Niek van Dijk, C. The plantaris tendon and a potential role in mid-portion Achilles tendinopathy: an observational anatomical study. J Anat. 218 (3), 336-341 (2011).
  97. Lee, A. H., Elliott, D. M. Comparative multi-scale hierarchical structure of the tail, plantaris, and Achilles tendons in the rat. J Anat. 234 (2), 252-262 (2019).
  98. Lee, A. H., Elliott, D. M. Multi-Scale Loading and Damage Mechanisms of Plantaris and Rat Tail Tendons. J Orthop Res. 37 (8), 1827-1837 (2019).
  99. Fan, H. M., Shrestha, L., Guo, Y., Tao, H. R., Sun, Y. L. The twisted structure of the rat Achilles tendon. J Anat. 239 (5), 1134-1140 (2021).
  100. Cutlip, R. G., Stauber, W. T., Willison, R. H., McIntosh, T. A., Means, K. H. Dynamometer for rat plantar flexor muscles in vivo. Med Biol Eng Comput. 35 (5), 540-543 (1997).
  101. Rijkelijkhuizen, J. M., Baan, G. C., de Haan, A., de Ruiter, C. J., Huijing, P. A. Extramuscular myofascial force transmission for in situ rat medial gastrocnemius and plantaris muscles in progressive stages of dissection. J Exp Biol. 208 (Pt 1), 129-140 (2005).
  102. Saxena, A., Bareither, D. Magnetic Resonance and Cadaveric Findings of the Incidence of Plantaris Tendon. Foot Ankle Int. 21 (7), 570-572 (2000).
  103. dos Santos, M. A., Bertelli, J. A., Kechele, P. R., Duarte, H. Anatomical study of the plantaris tendon: reliability as a tendo-osseous graft. Surg Radiol Anat. 31 (1), 59-61 (2009).
  104. Sartori, J., Köhring, S., Bruns, S., Moosmann, J., Hammel, J. U. Gaining Insight into the Deformation of Achilles Tendon Entheses in Mice. Adv Eng Mater. 23 (11), 2100085 (2021).

Tags

Bioteknik utgåva 202
Murin bakbensexplantationsmodell för att studera mekanobiologin vid impingement av akillessenan
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wise, B. C., Mora, K. E., Lee, W.,… More

Wise, B. C., Mora, K. E., Lee, W., Buckley, M. R. Murine Hind Limb Explant Model for Studying the Mechanobiology of Achilles Tendon Impingement. J. Vis. Exp. (202), e65801, doi:10.3791/65801 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter