Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تثمين الأعشاب البحرية الحمراء Gracilaria gracilis من خلال نهج التكرير الحيوي

Published: November 21, 2023 doi: 10.3791/65923
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1, 1, 1
1MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, ESTM, Polytechnic University of Leiria, 2MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, Department of Life Sciences, University of Coimbra

Summary

هنا ، نصف العديد من البروتوكولات التي تهدف إلى تثمين متكامل ل Gracilaria gracilis: حصاد الأنواع البرية ، والنمو الداخلي ، واستخراج المكونات النشطة بيولوجيا. يتم تقييم التأثيرات المضادة للأكسدة ومضادات الميكروبات والسامة للخلايا للمستخلصات ، جنبا إلى جنب مع التقييم الغذائي والاستقرار للأغذية المخصبة بالكتلة الحيوية والأصباغ الكاملة للأعشاب البحرية.

Abstract

يتزايد باستمرار الاهتمام بالأعشاب البحرية كمادة وسيطة وفيرة للحصول على مكونات نشطة بيولوجيا قيمة ومتعددة الأهداف. في هذا العمل ، نستكشف إمكانات Gracilaria gracilis ، وهي أعشاب بحرية حمراء صالحة للأكل تزرع في جميع أنحاء العالم لمصلحتها التجارية كمصدر للأجار والمكونات الأخرى لتطبيقات مستحضرات التجميل والأدوية والغذاء والأعلاف.

تم تحسين ظروف نمو G. gracilis من خلال التكاثر الخضري والأبواغ أثناء التلاعب بالظروف الفيزيائية والكيميائية لتحقيق مخزون كبير من الكتلة الحيوية. تم تنفيذ منهجيات الاستخراج الأخضر باستخدام الإيثانول والماء على الكتلة الحيوية للأعشاب البحرية. تم تقييم الإمكانات النشطة بيولوجيا للمستخلصات من خلال مجموعة من المقايسات في المختبر فيما يتعلق بسميتها الخلوية ومضادات الأكسدة وخصائص مضادات الميكروبات. بالإضافة إلى ذلك ، تم دمج الكتلة الحيوية للأعشاب البحرية المجففة في تركيبات المعكرونة لزيادة القيمة الغذائية للأغذية. كما تم دمج الأصباغ المستخرجة من G. gracilis في الزبادي كملون طبيعي ، وتم تقييم ثباتها. تم تقديم كلا المنتجين لتقدير لوحة حسية شبه مدربة تهدف إلى تحقيق أفضل صياغة نهائية قبل الوصول إلى السوق.

تدعم النتائج تعدد استخدامات G. gracilis سواء تم تطبيقه ككتلة حيوية كاملة و / أو مستخلصات و / أو أصباغ. من خلال تنفيذ العديد من البروتوكولات المحسنة ، يسمح هذا العمل بتطوير منتجات ذات إمكانية ربح أسواق الأغذية ومستحضرات التجميل وتربية الأحياء المائية ، وتعزيز الاستدامة البيئية والاقتصاد الدائري الأزرق.

وعلاوة على ذلك، وتمشيا مع نهج التكرير الحيوي، سيتم استخدام الكتلة الحيوية المتبقية من الأعشاب البحرية كمنشط حيوي لنمو النبات أو تحويلها إلى مواد كربونية لاستخدامها في تنقية المياه لأنظمة الاستزراع المائي الداخلية لماري بوليتكنيك في ليريا، البرتغال.

Introduction

يمكن اعتبار الأعشاب البحرية مادة خام طبيعية مثيرة للاهتمام تستفيد منها قطاعات الأدوية والأغذية والأعلاف والبيئة. إنها تقوم بالتخليق الحيوي لمجموعة من الجزيئات ، والعديد منها غير موجود في الكائنات الحية الأرضية ، مع الخصائص البيولوجية ذات الصلة 1,2. ومع ذلك ، يجب تنفيذ بروتوكولات الزراعة المحسنة للأعشاب البحرية لضمان وجود مخزون كبير من الكتلة الحيوية.

يجب أن تأخذ طرق الزراعة دائما في الاعتبار طبيعة ثالي الأعشاب البحرية والتشكل العام. Gracilaria gracilis هو تصنيف نسيلي ، مما يعني أن العضو المرتبط ينتج محاور نباتية متعددة. وبالتالي يتم تحقيق التكاثر عن طريق التجزئة (التكاثر الخضري) ، حيث أن كل محور من هذه المحاور قادر تماما على تبني حياة مستقلة عن الثاليوس3 الرئيسي. يمكن دمج الأصناف المستنسخة بنجاح مع منهجيات زراعة بسيطة وسريعة من خطوة واحدة ، حيث يتم الحصول على كميات كبيرة من الكتلة الحيوية عن طريق تقسيم الثاليوس إلى شظايا صغيرة تتجدد بسرعة وتنمو لتصبح أفرادا جدد متطابقين وراثيا. يمكن استخدام كل من الثالي الهابلونتيك والديبلوني في هذه العملية. على الرغم من أن الجنس يظهر دورة حياة ثلاثية الشكل متماثلة الشكل معقدة ، إلا أن التبويض نادرا ما يكون ضروريا إلا عندما يكون التجديد الوراثي للأرصدة مطلوبا لتحقيق محاصيل محسنة. في هذه الحالة ، يؤدي كل من tetraspores (الجراثيم الهابلونية التي تشكلها الانقسام الاختزالي) والأبواغ الكاربوسية (الجراثيم الثنائية التي تشكلها الانقسام) إلى ظهور ثالي عياني يمكن بعد ذلك زراعته ونشره عن طريق التكاثر الخضري4. تملي دورات النمو الظروف البيئية والحالة الفسيولوجية للأفراد ، من بين عوامل بيولوجية أخرى مثل ظهور النباتات الهوائية والتصاق الكائنات الحية الأخرى. لذلك ، يعد تحسين ظروف النمو أمرا بالغ الأهمية لضمان إنتاجية عالية وإنتاج كتلة حيوية عالية الجودة5.

يمكن تحقيق استخراج المركبات النشطة بيولوجيا من الأعشاب البحرية ، بما في ذلك G. gracilis ، من خلال طرق مختلفة 6,7. يعتمد اختيار طريقة الاستخراج على المركبات المحددة ذات الأهمية والتطبيق المستهدف وخصائص الأعشاب البحرية. في هذه الدراسة ، ركزنا على استخراج المذيبات ، والذي يتضمن استخدام المذيبات الخضراء ، مثل الماء أو الإيثانول ، لإذابة واستخراج المركبات النشطة بيولوجيا من الكتلة الحيوية للأعشاب البحرية. يمكن إجراء الاستخراج من خلال النقع بطريقة متعددة الاستخدامات وفعالة ويمكن استخدامه لمجموعة واسعة من المركبات. إنها طريقة بسيطة ومستخدمة على نطاق واسع تتضمن نقع الكتلة الحيوية في مذيب لفترة طويلة ، عادة في الغرفة أو درجات حرارة مرتفعة قليلا. يتم تقليب المذيب لتعزيز عملية الاستخراج. بعد وقت الاستخراج المطلوب ، يتم فصل المذيب عن المادة الصلبة عن طريق الترشيح أو الطرد المركزي.

الماء مذيب شائع الاستخدام في التطبيقات الغذائية نظرا لسلامته وتوافره وتوافقه مع مجموعة واسعة من المنتجات الغذائية. استخراج المياه مناسب للمركبات القطبية مثل السكريات والببتيدات وبعض الفينول. ومع ذلك ، قد لا يستخرج المركبات غير القطبية بشكل فعال. الإيثانول هو أيضا مذيب يستخدم على نطاق واسع في التطبيقات الغذائية ويمكن أن يكون فعالا في استخراج مجموعة متنوعة من الجزيئات النشطة بيولوجيا ، بما في ذلك المركبات الفينولية والفلافونويد وبعض الأصباغ. يعرف الإيثانول عموما بأنه آمن للاستخدام في الطعام ويمكن تبخيره بسهولة ، تاركا وراءه المركبات المستخرجة. تجدر الإشارة إلى أن اختيار طريقة الاستخراج يجب أن يأخذ في الاعتبار عوامل مثل الكفاءة والانتقائية والفعالية من حيث التكلفة والتأثير البيئي. يعد تحسين معلمات الاستخراج ، مثل تركيز المذيبات ووقت الاستخراج ودرجة الحرارة والضغط أمرا بالغ الأهمية لتحقيق الغلة المثلى للمركبات النشطة بيولوجيا من G. gracilis أو الأعشاب البحرية الأخرى.

تم العثور على الأعشاب البحرية لإظهار نشاط مضاد للميكروبات ضد مجموعة واسعة من الكائنات الحية الدقيقة ، بما في ذلك البكتيريا والفطريات والفيروسات8. يعزى هذا النشاط إلى المكونات النشطة بيولوجيا ، بما في ذلك الفينولات والسكريات والببتيدات والأحماض الدهنية. أثبتت العديد من الدراسات فعاليتها ضد مسببات الأمراض مثل الإشريكية القولونية والمكورات العنقودية الذهبية والسالمونيلا sp. والزائفة الزنجارية وغيرها. 9. يعزى النشاط المضاد للميكروبات للأعشاب البحرية إلى وجود مركبات نشطة بيولوجيا يمكن أن تتداخل مع جدران الخلايا الميكروبية والأغشية والإنزيمات ومسارات الإشارات10. قد تعطل هذه المركبات نمو الميكروبات ، وتمنع تكوين الأغشية الحيوية ، وتعدل الاستجابات المناعية.

الأعشاب البحرية الحمراء ، والمعروفة أيضا باسم نباتات رودوفيت ، هي مجموعة من الطحالب التي يمكن أن تظهر نشاطا مضادا للميكروبات ضد مجموعة متنوعة من الكائنات الحية الدقيقة. ضمن هذه المجموعة ، يحتوي G. gracilis على العديد من المركبات النشطة بيولوجيا التي قد تساهم في نشاطه المضاد للميكروبات المبلغ عنه. في حين أن الجزيئات المحددة يمكن أن تختلف ، فإن الفئات الشائعة التي تم الإبلاغ عنها في G. gracilis والتي قد تمتلك خصائص مضادة للميكروبات هي السكريات والفينولات والتيربينويدات والأصباغ11. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن وجود وكميات هذه المكونات يمكن أن تختلف اعتمادا على عوامل مثل موقع جمع الأعشاب البحرية ، والموسمية ، والحالة الفسيولوجية للتالي ، والظروف البيئية. لذلك ، قد تختلف الفئة المحددة وتركيز المركبات المضادة للميكروبات في G. gracilis وفقا لذلك.

كما وجد أن G. gracilis يحمل خصائص مضادة للأكسدة ، تحتوي على مركبات فينولية مختلفة ، والتي ثبت أنها تزيل الجذور الحرة وتقلل من الإجهاد التأكسدي12.تساعد مضادات الأكسدة على حماية الخلايا من التلف الناجم عن أنواع الأكسجين التفاعلية ولها فوائد صحية محتملة. يمكن تقييم قدرة مضادات الأكسدة مباشرة من خلال طرق مختلفة ، بما في ذلك نشاط كسح الجذور الحرة 2،2-ثنائي فينيل -1-بيكريل هيدرازيل (DPPH) ، وبشكل غير مباشر ، من خلال القياس الكمي لمحتوى البوليفينول الكلي (TPC) 13.

على الرغم من الإبلاغ عن أن أحد المكونات له نشاط حيوي بارز ، إلا أن تقييم السمية الخلوية لا غنى عنه في تقييم المواد الطبيعية والاصطناعية لاستخدامها في اتصال مع الخلايا أو الأنسجة الحية. هناك عدة طرق لقياس السمية الخلوية ، ولكل منها مزايا وقيود. بشكل عام ، يقدمون مجموعة من الخيارات لتقييم الآثار الضارة للعديد من المواد على الخلايا ، وفي الوقت نفسه ، للتحقيق في آليات تلف الخلايا وموتها14.

في هذا العمل ، نستخدم مقايسة بروميد 3- (4،5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-يل) -2،5-ثنائي فينيل تيترازوليوم بروميد (MTT) ، وهي طريقة قياس لوني قدمها Mosmann (1983) 15. تقيس هذه الطريقة اختزال أملاح التترازوليوم إلى منتج فورمازان أرجواني بواسطة الخلايا النشطة الأيضية. كلما زادت كمية بلورات الفورمازان ، زاد عدد الخلايا القابلة للحياة ، مما يوفر مقياسا غير مباشر للسمية الخلوية14. نظرا لأنه في هذا العمل ، يقصد من مستخلصات G. gracilis المائية والإيثانول دمجها في تركيبات مستحضرات التجميل الجلدية ، يتم إجراء تقييم السمية الخلوية في المختبر في خط خلايا الخلايا الكيراتينية (HaCaT).

فيما يتعلق بتطبيق الغذاء ، فإن الأعشاب البحرية منخفضة السعرات الحرارية بشكل عام وغنية من الناحية التغذوية بالألياف الغذائية والعناصر الأساسية والأحماض الأمينية والسكريات والأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة والبوليفينول والفيتامينات 2,16. G. gracilis ليست استثناء ، ولها قيمة غذائية مثيرة للاهتمام. وجد Freitas et al. (2021) 4 أن G. gracilis المزروعة تحتوي على مستويات أعلى من البروتين وفيتامين C وحافظت على مستوى الدهون الكلية مقارنة بالأعشاب البحرية البرية. وقد يمثل ذلك ميزة اقتصادية وبيئية، لأن الإنتاج أفضل من استغلال الموارد البرية من الناحية التغذوية. بالإضافة إلى ذلك ، يشعر المستهلكون بقلق متزايد بشأن نوع الطعام الذي يتناولونه ، لذلك من المهم إدخال مكونات جديدة لإثراء الغذاء واستخدام موارد جديدة للحصول على مقتطفات يمكن أن تضيف قيمة إلى المنتج والمطالبة ب "ملصق نظيف". إلى جانب ذلك ، فإن السوق الحالي تنافسي للغاية ، ويتطلب تطوير منتجات جديدة واستراتيجيات مبتكرة لتمييز الشركات المصنعة عن منافسيها17.

إن إثراء المنتجات ذات القيمة الغذائية الرديئة ، مثل المعكرونة ، بالموارد البحرية ، بما في ذلك الأعشاب البحرية ، هو استراتيجية لإدخال هذا المورد كغذاء جديد واستراتيجية تمايز السوق من خلال منتج ذي قيمة غذائية متميزة. من ناحية أخرى ، G. gracilis هو مصدر للأصباغ الحمراء الطبيعية مثل phycobiliproteins18 ، لديها إمكانات عالية للتطبيقات في صناعة المواد الغذائية. أظهرت هذه الأعشاب البحرية اهتماما كبيرا في العديد من المجالات ، ويمكن تطبيقها باستخدام الأعشاب البحرية بأكملها والمستخلصات و / أو الكتلة الحيوية المتبقية. في هذا العمل ، نعرض بعض الأمثلة على هذه التطبيقات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. حصاد الكتلة الحيوية وإعدادها

  1. احصد عينات G. gracilis أثناء انخفاض المد وانقلها بسرعة إلى المختبر في صناديق مظلمة ومبردة لتجنب التجفيف والضوء والتعرض للهواء.
  2. في المختبر ، اغسل كل ثالوس بمياه البحر الجارية ونظفها جيدا لإزالة الحطام والأجزاء الميتة والنباتات الهوائية والكائنات الحية الأخرى من السطح.
  3. حافظ على الكتلة الحيوية البرية في مياه البحر المهواة باستمرار (31-35 psu) في غرفة مناخية (20 ± 1 درجة مئوية) مع إشعاع منخفض يوفره ضوء النهار الأبيض البارد ومصابيح الفلورسنت والفترة الضوئية المحددة في الساعة 16:08 (الضوء: الظلام) لمدة 7 أيام. خلال هذه الفترة ، لا توفر أي وسائط مغذية ؛ هذا يسمح للأعشاب البحرية بالتكيف ببطء مع الظروف الداخلية الجديدة.

2. صيانة المخزون

  1. بعد فترة التأقلم ، قم بقطع نصائح صحية من thalli الأعشاب البحرية بشفرة معقمة. بعد Redmond et al. (2014) 19 وتحت ظروف معقمة ، اسحب كل طرف من خلال هلام أجار تم إعداده مسبقا في أطباق بتري (1.0٪ أجار بكتريولوجي ، بنسبة 1: 1 ماء مقطر / مياه البحر) لإزالة أي ملوثات متبقية. قم بإجراء سحب الآجار ثلاث مرات لكل طرف واسحب الطرف دائما عبر الأجزاء غير المستخدمة من هلام أجار.
  2. غسل الأواني الزجاجية الحمضية في محلول حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك ، 15 ٪) وشطف جيدا بالماء المقطر. تعقيم جميع الأدوات والأواني الزجاجية والأجار ومياه البحر والماء المقطر المستخدم في عملية التنظيف بواسطة الأوتوكلاف (121 درجة مئوية ، 15 دقيقة).
    تنبيه: راجع ورقة بيانات السلامة الخاصة بحمض الهيدروكلوريك التي يقدمها المورد.
  3. تنمو الأطراف في مياه البحر المعقمة عند 35 رطلا من السو ، مكملة بمحلول Von Stosch المخصب (VSE) المعدل للأعشاب البحرية الحمراء ، وفقا ل Redmond et al. (2014) 19. أضف ثاني أكسيد الجرمانيوم (GeO2) إلى الوسط (1 مل / لتر) لمنع نمو الدياتومات النباتية.
    تنبيه: راجع ورقة بيانات السلامة الخاصة ب GeO2 التي سلمها المورد.
    ملاحظة: النصائح التي تظهر فقدان التصبغ ، كما لوحظ من خلال تغير اللون الجزئي أو الكلي ، تحت الضغط أو ميتة بالفعل ويجب التخلص منها.

3. زراعة وتوسيع النطاق

  1. بعد فترة التأقلم ، قم بتوزيع حوالي 8-10 أطراف صحية بشكل عشوائي في قوارير مسطحة القاع سعة 250 مل في غرفة مناخية محددة عند 20 ± 1 درجة مئوية مع الضوء الأبيض البارد لفوتونات 20 ± 0.5 μmol m-2 s-1 (1500 لوكس) ، وهي فترة ضوئية محددة في 16 ساعة: 8 ساعات (فاتح: داكن) ، ومياه البحر المعقمة المخصبة بوسائط زراعة VSE التي يتم تجديدها كل أسبوع.
  2. قم بإجراء قياسات الوزن الأسبوعية ، وتجنب إجهاد الثالي بشكل مفرط20. لهذا ، قم بإزالة النصائح بعناية من وسط الثقافة ، واشطفها برفق ، ووزن الملليغرام على نطاق مختبري.
    ملاحظة: يمكن تنفيذ هذا الإجراء جنبا إلى جنب مع التجديد الأسبوعي لوسائل الإعلام الثقافية.
  3. قد ينمو ثالي في هذه القوارير حتى كثافة 2 جم / لتر. في هذه المرحلة ، قم بإجراء توسيع نطاق المستلم (250 مل و 1 لتر و 5 لتر). انقل الزراعة إلى حاويات بيضاء مفتوحة في الهواء الطلق سعة 50 لترا وأكبر عندما يصل الحجم إلى 5 لتر.
  4. حساب معدل النمو النسبي (RGR) وفقا ل Patarra et al. (2017) 21 :
    RGR (٪ fw / يوم) = ([Ln (fw) - Ln (iw)] / t) × 100
    حيث IW و FW هما الوزن الطازج الأولي والنهائي ، على التوالي ، معبرا عنه بالجرام ، و T هو الوقت بالأيام.
    ملاحظة: في ظل هذا الإعداد المختبري ، يصل RGR إلى قيم تصل إلى 21٪ في اليوم. يمكن إجراء حصاد الكتلة الحيوية في أي وقت. يجب معالجة الكتلة الحيوية بسرعة لمنع التدهور إما عن طريق التجفيف في الفرن أو التجفيف بالتجميد أو ببساطة تخزينها مجمدة (-20 درجة مئوية) ، اعتمادا على الاستخدام المقصود. يمكن الحفاظ على الكتلة الحيوية المجففة في درجة حرارة الغرفة (RT) أو تخزينها مجمدة أيضا.

4. إجراء الاستخراج

ملاحظة: لتقييم السمية الخلوية في المختبر ، ومضادات الأكسدة ، والخصائص المضادة للميكروبات لمستخلصات G. gracils ، يأخذ تحضيرها في الاعتبار معلمتين مختلفتين: درجة حرارة الاستخراج ونوع المذيب.

  1. لإجراء عمليات الاستخراج ، جفف الكتلة الحيوية G. gracilis في الفرن وطحن الكتلة الحيوية (على سبيل المثال ، في مطحنة القهوة المنزلية) حتى يمر المسحوق عبر غربال 200 ميكرومتر.
  2. وزن الكتلة الحيوية المجففة (10 جم) وحلها في 100 مل من المذيب (الإيثانول المطلق أو الماء المعقم).
  3. يقلب في وعاء محمي من الضوء لمدة 30 دقيقة.
  4. قم بإجراء الإيثانول المتسلسل > الماء والماء > استخراج الإيثانول عند RT و 40 °C و 70 °C.
  5. لكل درجة حرارة ، قم بإجراء عمليات الاستخراج باستخدام الإيثانول والماء بشكل منفصل مرتين.
  6. افصل المستخلصات السائلة عن الكتلة الحيوية المتبقية عن طريق الترشيح من خلال ورق الترشيح (Whatman No.1) ، متبوعا بالطرد المركزي عند 8000 × g لمدة 10 دقائق في RT.
  7. أعد استخدام الكتلة الحيوية الطحلبية المتبقية لمزيد من الاستخراج مع المذيب الآخر. إذا تم استخراج عينة أولا باستخدام الإيثانول ، فاستخرجها بالماء بعد ذلك ، والعكس صحيح.
  8. قم بتجميد وتجفيف المستخلصات المائية وتبخير مستخلصات الإيثانول في مبخر دوار عند 40 درجة مئوية.
  9. تحفظ المستخلصات المجففة على حرارة 4 درجات مئوية.
  10. قم بإذابة المستخلصات بتركيز 50 مجم / مل (مقايسات مضادات الميكروبات) أو 10 مجم / مل (مقايسات مضادات الأكسدة). إذابة المستخلصات المائية في الماء المعقم والمستخلصات الإيثانولية في الإيثانول المطلق.

5. نشاط مضادات الميكروبات

ملاحظة: يجب اختبار المستخلصات الإيثانولية والمائية بشكل فردي ضد Bacillus subtilis subsp. spizizenii (DSM 347) و Escherichia coli (DSM 5922) و Listonella anguillarum (DSM 21597). يجب إجراء اختبار مضادات الميكروبات وفقا لتوصيات اللجنة الوطنية لمعايير المختبرات السريرية (NCCLS ، 2012) 22. تم الحصول على جميع الثقافات من المجموعة الألمانية للكائنات الحية الدقيقة ومزارع الخلايا (DSMZ). نمت L. anguillarum على مرق الصويا التربتيك (TSB) أو أجار الصويا التربتيك (TSA) المكمل بكلوريد الصوديوم 1٪ (كلوريد الصوديوم). تمت زراعة السلالتين المتبقيتين على وسط LB (VWR Chemicals ). تم تحضين مستزرعات Bacillus subtilis subsp. spizizenii (DSM 347) و Listonella anguillarum (DSM 21597) عند 30 درجة مئوية ، بينما تم تحضين الإشريكية القولونية (DSM 5922) عند 37 درجة مئوية ، وفقا لتعليمات المورد. يمكن استخدام طريقة التخفيف الدقيق للمرق لتحديد النشاط المضاد للميكروبات في الوسائط السائلة ، ويجب أن يتم ذلك على نطاق مجهري ، مما يسمح بتحديد إمكانات مضادات الميكروبات بسرعة وكفاءة. تسمح هذه الطريقة منخفضة التكلفة بالحصول على النتائج في غضون 24 ساعة فقط ، وبالتالي فهي مناسبة لتحديد ، في مرحلة مبكرة ، أفضل ظروف الاستخراج التي تسمح ، لسلالة ميكروبية معينة ، بالحصول على نتائج من حيث العمل المثبط للنمو. ومع ذلك ، تتطلب المنهجية استخدام ألواح دقيقة معقمة بغطاء خاص بنمو الميكروبات ، بالإضافة إلى توفر قارئ صفيحة دقيقة لطول الموجة 600 نانومتر.

  1. قم بإجراء اختبارات التخفيف الدقيق للمرق باستخدام صفائح دقيقة غير معالجة ومستديرة القاع ذات 96 بئرا مع 170 ميكرولتر من مرق مولر-هينتون (MHB) ، ملقحة ب 10 ميكرولتر من اللقاح القياسي (عند 0.5 معيار McFarland) و 20 ميكرولتر من كل مستخلص (50 مجم / مل).
  2. احتضان اللوحات لمدة 24 ساعة في درجة الحرارة المثلى لكل سلالة.
  3. الكشف عن النشاط المضاد للميكروبات عن طريق تقليل العكارة المرئية المقاسة عن طريق تسجيل الكثافة البصرية (OD 600) في مقياس الطيف الضوئي للصفائح الدقيقة ، عند 0 ساعة و 24 ساعة.
  4. التعبير عن النتائج كنسبة مئوية من تثبيط:
    Equation 1
    حيث Abs. ext هو الفرق في الامتصاص المقاس ، بين 0 h و 24 h ، في الآبار التي تحتوي على سلالة بكتيرية تنمو في وجود المستخلص ، ويشير Abs إلى نفس المقياس في الآبار التي تحتوي على السلالة البكتيرية والمذيب.
  5. في هذه الطريقة ، تشمل تفاعلات التحكم ، مع الآبار التي تحتوي فقط على وسط الاستزراع الذي سيكون السيطرة السلبية ، ولكن أيضا الآبار ذات الوسط الملقح بالسلالة القياسية المضافة إلى المذيب (الإيثانول أو الماء) والوسط مع السلالة البكتيرية والمضاد الحيوي الموجب السيطرة (الكلورامفينيكول).

6. نشاط مضادات الأكسدة والقياس الكمي للبوليفينول الكلي

  1. إجمالي محتوى البوليفينول
    ملاحظة: يتم تنفيذ إجمالي محتوى البوليفينول (TPC) باستخدام طريقة Folin-Ciocalteu23 وتكييفها مع النطاق الجزئي.
    1. أضف إلى كل بئر صفيحة دقيقة من 96 بئرا ، محمية من الضوء ، و 158 ميكرولتر من الماء عالي النقاء ، و 2 ميكرولتر من العينة ، و 10 ميكرولتر من كاشف Folin-Ciocalteu.
      تنبيه: راجع ورقة بيانات السلامة الخاصة بكاشف Folin-Ciocalteu الذي تم تسليمه من قبل المورد.
    2. بعد دقيقتين ، أضف 30 ميكرولتر من Na2CO3 (20٪).
    3. بعد الحضانة في الظلام عند RT لمدة 1 ساعة ، قم بقياس العينات الطيفية عند 755 نانومتر.
    4. استخدم حمض الغال (الذي يسمح برسم منحنى المعايرة) أو الماء عالي النقاء (2 ميكرولتر) كعناصر تحكم.
    5. عبر عن النتائج كمكافئات حمض الغال (مستخلص mg GAE / g).
  2. 2،2 ثنائي فينيل -1-بيكريل هيدرازيل (DPPH) نشاط كسح جذري
    ملاحظة: يتم تقييم النشاط المضاد للأكسدة للمستخلصات كما هو موضح من قبل Duan et al. (2006) 24 ، وتكييفها مع المجهرية
    1. في صفيحة ميكروية ذات 96 بئرا محمية من الضوء ، ضع 2 ميكرولتر من كل عينة (بتركيز 10 مجم / مل) و 198 ميكرولتر من DPPH المذاب في الإيثانول المطلق (0.1 مللي مول).
      تنبيه: راجع ورقة بيانات السلامة الخاصة ب DPPH التي قدمها المورد.
    2. قم بتشغيل رد الفعل لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام. قم بقياس الامتصاص عند 517 نانومتر في مقياس الطيف الضوئي للصفائح الدقيقة.
    3. قم بإجراء تفاعل تحكم باستخدام 2 ميكرولتر من الإيثانول المطلق / الماء المقطر و 198 ميكرولتر من محلول DPPH. قم بإجراء قياس فارغ باستخدام 2 ميكرولتر من المستخلص و 198 ميكرولتر من الإيثانول المطلق.
    4. عبر عن النتائج كنسبة مئوية من تثبيط DPPH باستخدام المعادلة التالية:
      Equation 2
      حيث كما هو امتصاص مستخلص الطحالب ، Ab هو امتصاص العينات الفارغة و Ac هو امتصاص السيطرة.

7. تقييم السمية الخلوية في خلايا البشرة

ملاحظة: يتم تقييم التأثير السام للخلايا في المختبر للمستخلصات المائية والإيثانول من G. gracilis في الخلايا الكيراتينية البشرية (خلايا HaCaT - 300493) من خلال مقايسة MTT اللونية كما هو موضح سابقا25. تم الحصول على الخلايا من خدمات خطوط الخلايا ، ألمانيا (CLS) وتم تنفيذ الطريقة وفقا للإرشادات المؤسسية وتعليمات CLS.
تنبيه: راجع ورقة بيانات السلامة الخاصة ب MTT التي يقدمها المورد)

  1. صيانة زراعة الخلايا
    1. زراعة خلايا HaCaT في وسط الجلوكوز عالي الجلوكوز (DMEM) من Dulbecco المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) ومحلول مضاد حيوي / مضاد حيوي 1٪ (أمفوتريسين B ، 0.25 مللي مول ؛ بنسلين ، 60 مللي مول ؛ ستربتومايسين ، 100 مللي مول).
    2. استخدم التربسين-EDTA لفصل الخلايا.
      ملاحظة: يتم إنجاز المزرعة الفرعية لخلايا HaCaT بعد وصول الخلايا إلى الالتقاء الكلي.
    3. استزرع الخلايا في غرفة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 و 95٪ رطوبة.
    4. الاستزراع الفرعي للخلايا وفقا لتعليمات البنك الحيوي كلما وصلت الثقافات إلى التقاء 80٪ -85٪.
  2. تقييم السمية الخلوية
    1. بعد زرع الخلايا في 96 بئرا وحضانتها طوال الليل، عالج خلايا HaCaT (4 × 104 خلايا/بئر) بالمستخلصات المجففة المذابة مسبقا في DMSO (100 ملغم/مل). ثم أضف 2 ميكرولتر من محلول المستخلص إلى 198 ميكرولتر من الوسط واحتضان الألواح لمدة 24 ساعة.
    2. قم بإزالة وسط الاستزراع وأضف 100 ميكرولتر من MTT (0.5 مجم / مل) إلى الخلايا. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في الظلام في ظروف الثقافة العادية المذكورة أعلاه.
    3. قم بإزالة محلول MTT وإذابة بلورات الفورمازان داخل الخلايا باستخدام 100 ميكرولتر من DMSO.
    4. قم بقياس الامتصاص عند 570 نانومتر باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة. التعبير عن النتائج كنسبة مئوية من الخلايا الضابطة غير المعالجة.

8. الابتكار الغذائي

  1. منتج غذائي جديد: المعكرونة مع الأعشاب البحرية
    1. اختيار المكونات وصياغة المعكرونة
      ملاحظة: تم اختيار المكونات بالتعاون مع شركة معكرونة. تم اختيار المكونات الرئيسية (الموصوفة في القسم 8.2) مع مراعاة سهولة الوصول إليها وتوافقها مع خطوط الإنتاج الحالية ، باستخدام الموارد البحرية للحصول على المعكرونة ذات القيمة الغذائية المضافة.
      1. بعد اختيار المكونات ، صمم التركيبة وفقا للقيمة الغذائية المقصودة (مصدر الألياف والفيتامينات والعناصر المعدنية والدهون المشبعة المنخفضة) من خلال تحليل التركيب الكيميائي النظري للتركيبات باستخدام جدول بيانات.
      2. عند استيفاء المتطلبات النظرية ، تابع الإنتاج على نطاق المختبر كما هو موضح في الخطوة 8.1.2.
      3. قم بإجراء اختبار حسي باستخدام لوحة شبه مدربة (>10 متذوقين) للتحقق من الحاجة إلى إعادة الصياغة أو قبول التركيبة للخطوات التالية.
        ملاحظة: تم تدريب اللجنة مسبقا على تذوق المعكرونة وتقييم التركيبات المقدمة فيما يتعلق بسمات مثل النكهة والطعم والرائحة والملمس والمظهر.
    2. إنتاج المعكرونة
      ملاحظة: أنتج عينات معكرونة شيفيري باستخدام آلة بثق المعكرونة.
      1. في الجهاز ، امزج الأجزاء المحددة مسبقا من دقيق الأرز ، G. gracilis ، و Chlorella vulgaris ، وأضف حوالي 30٪ من الماء إلى الخليط.
      2. للحصول على المعكرونة الجافة ، جفف Chifferi عند 68 درجة مئوية لمدة 42 دقيقة ، تليها 5 ساعات ، 30 دقيقة عند 76 درجة مئوية ، لمحاكاة عملية صناعية.
      3. أخيرا ، قم بتعبئة العينات وإغلاقها بالمكنسة الكهربائية وتخزينها في مكان مظلم في RT حتى إجراء مزيد من التحليل.
    3. التحليل الغذائي
      ملاحظة: لتحليل الملف الغذائي ، استخدم العينات المجففة والمبللة في ثلاث نسخ.
      1. محتوى البروتين الخام: قم بإجراء مقايسة البروتين الكلي من خلال طريقة Kjeldahl ، المقتبسة من Duarte et al. (2022) 26 ، باتباع الخطوات 8.1.3.2-8.1.3.6.
      2. تزن بدقة 1.0 جم من العينة (أو الماء المقطر للمقايسة الفارغة) وتخلط مع قرصين كيلدال و 25 مل من H2SO4 في أنابيب الهضم.
        تنبيه: راجع ورقة بيانات السلامة الخاصة ب H2SO4 التي سلمها المورد.
      3. قم بهضم العينات في جهاز هضم Kjeldahl عند 220 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، تليها 90 دقيقة عند 400 درجة مئوية.
      4. بعد التبريد إلى RT ، أضف 80 مل من الماء المقطر والتقطير الأمونيا المتكونة إلى 30 مل من محلول 4٪ H 3 BO3يحتوي على بروموكريزول أخضر وأحمر ميثيل. تتم هذه الخطوة في ظل ظروف قلوية (التقطير بنسبة 40٪ هيدروكسيد الصوديوم باستخدام جهاز تقطير Kjeldahl.
        تنبيه: انظر ورقة بيانات السلامة الخاصة بمحلول H 3 BO3الذي يحتوي على بروموكريزول أخضر وأحمر ميثيل و 40٪ هيدروكسيد الصوديوم الذي يسلمه المورد.
      5. قم بمعايرة العينات المقطرة باستخدام HCl 0.1 M حتى يلاحظ تغير في اللون إلى اللون الوردي الرمادي.
      6. احسب محتوى البروتين الخام، ممثلا بمحتوى النيتروجين في العينة، وعبر عنه بالصورة g لكل 100 g باستخدام المعادلة التالية:
        Equation 3
        حيث Vs يتوافق مع حجم HCl (mL) المستخدم في معايرة العينة؛ Vb يتوافق مع الحجم المستخدم في الفراغ ؛ N يتوافق مع الحالة الطبيعية حمض الهيدروكلوريك. W يتوافق مع وزن العينة (جم).
      7. إجمالي محتوى الدهون: حدد إجمالي محتوى الدهون باستخدام طريقة Folch ، المقتبسة من Folch et al. (1957) 27 ، باتباع الخطوات 8.1.3.8-8.1.3.14.
      8. تحضير كاشف Folch عن طريق خلط CHCl3 و MeOH بنسبة 2: 1 (v: v).
        تنبيه: راجع ورقة بيانات السلامة الخاصة بكاشف Folch الذي يسلمه المورد.
      9. لاختبار الأنابيب التي تحتوي على 1 غرام من القسامة، أضف 5 مل من كاشف فولش و0.8 مل من الماء المقطر. تخلط في دوامة لمدة 1 دقيقة.
      10. ثم أضيفي 5 مل أخرى من كاشف Folch وتجانسها لمدة 5 دقائق. أضف 1.2 مل من محلول كلوريد الصوديوم 0.8٪ وتجانس لمدة دقيقتين.
      11. أجهزة الطرد المركزي العينات في 7000 × ز لمدة 10 دقائق. قم بتصفية المرحلة العضوية (المرحلة السفلية) من خلال القطن المحب للماء وكبريتات الصوديوم اللامائية في قارورة زجاجية مستديرة القاع.
      12. لتجنب فقدان العينة ، كرر خطوات إضافة 5 مل من CHCl3 ، والتجانس ، والطرد المركزي ، والترشيح في ظل نفس الظروف.
      13. أخرج المذيب العضوي من المراحل العضوية المجمعة عن طريق التبخر منخفض الضغط واتركه في الفرن عند 105 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. تبريد العينات في المجفف.
      14. احسب محتوى الدهون ، معبرا عنه ب g لكل 100 غرام ، باستخدام المعادلة التالية:
        Equation 4
        حيث W1 هو وزن القارورة الزجاجية الفارغة ذات القاع المستدير ؛ W2 هو الوزن الأولي للعينة ؛ W3 هي القارورة الزجاجية ذات القاع المستدير مع وزن العينة.
      15. محتوى الألياف الخام: تحديد محتوى الألياف الخام باستخدام منهجية مقتبسة من ISO 6865 (2000)28، باتباع الخطوات 8.1.3.16-8.1.3.22.
      16. قم بوزن 1 جم من العينة (W0) في بوتقة زجاجية ذات قاع مرشح (مرجع P2) وضعها في محلل الألياف.
      17. الخطوة الأولى هي التحلل المائي الحمضي: أضف 150 مل من 1.25٪ H 2 SO4 ، مسخن مسبقا ، و2مل من العامل المضاد للرغوة (n-octanol) إلى عمود كل بوتقة ؛ يسخن حتى الغليان ويترك لمدة 30 دقيقة.
      18. بعد إزالة هذا المذيب ، اغسل ثلاث مرات بالماء منزوع الأيونات للانتقال إلى التحلل المائي الأساسي. أضف 150 مل من 1.25٪ هيدروكسيد الصوديوم ، مسخن مسبقا ، و 5 مل من العامل المضاد للرغوة إلى العمود الخالي من السوائل ، وقم بإجراء نفس إجراء التسخين مثل التحلل المائي للحمض.
      19. أخيرا ، قم بغسل ثلاثي ب 150 مل من الأسيتون للاستخراج البارد.
      20. بعد هذه العملية ، قم بإزالة البوتقات بعناية من النظام ووضعها في فرن على حرارة 150 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. سجل الوزن النهائي (W1).
      21. ضع البوتقات في فرن دثر عند 500 درجة مئوية لمدة 3 ساعات ثم سجل الوزن النهائي (W2).
      22. احسب محتوى الألياف الخام وعبر عن النتائج بالنسب المئوية باستخدام المعادلة التالية:
        ٪ الألياف الخام = 100 × (W1-W2) / W0
      23. ملف تعريف الأحماض الدهنية (FA): حدد ملف تعريف الأحماض الدهنية وفقا ل Fernández et al. (2015) 29 ، باتباع الخطوات 8.1.3.24-8.1.3.29.
        ملاحظة: يتم الحصول على استرات ميثيل الأحماض الدهنية (FAMEs) عن طريق نقل الميثيل المحفز بالحمض المباشر للعينات المجففة بالتجميد المطحونة. تتم جميع التحليلات في ثلاث نسخ.
      24. أضف 2 مل من محلول 2٪ (v / v) H2SO4 في الميثانول إلى عينة 50 مجم واسكب الخليط عند 80 درجة مئوية لمدة ساعتين مع التحريك المستمر.
        تنبيه: راجع ورقة بيانات السلامة الخاصة بالميثانول التي يسلمها المورد.
      25. بعد التبريد إلى RT ، أضف 1 مل من الماء عالي النقاء و 2 مل من n-heptane إلى كل عينة ، وقم بدامة الخليط لمدة دقيقة واحدة ، وطرده مركزيا لمدة 5 دقائق.
        تنبيه: راجع ورقة بيانات السلامة الخاصة ب n-heptane التي يسلمها المورد.
      26. استعادة المرحلة العليا n-heptane (العضوية) التي تحتوي على FAMEs ونقلها إلى قوارير كروماتوغرافيا الغاز (GC).
      27. التحليل في كروماتوجراف الغاز المجهز بعمود شعري TR-FAME (60 م × 0.25 مم معرف ، سمك فيلم 0.25 ميكرومتر) ، وأخذ عينات تلقائي ، وكاشف تأين اللهب (FID).
      28. اضبط الحاقن (الوضع بدون تقسيم) على 250 درجة مئوية والكاشف على 280 درجة مئوية. اضبط درجة الحرارة الأولية للعمود على 75 درجة مئوية مع الاستمرار لمدة 1 دقيقة. ثم ارفعه عند 5 درجات مئوية / دقيقة إلى 170 درجة مئوية واستمر لمدة 10 دقائق. ثم ارفعه عند 5 درجات مئوية / دقيقة إلى 190 درجة مئوية واستمر لمدة 10 دقائق أخرى. أخيرا ، ارفعه عند 2 درجة مئوية / دقيقة إلى 240 درجة مئوية واستمر لمدة 10 دقائق. استخدم الهليوم باعتباره غازا حاملا بمعدل تدفق مقداره 1.5 mL/min. إمداد الهواء والهيدروجين بمعدلات تدفق تبلغ 350 و 35 مل / دقيقة على التوالي.
      29. حدد ملف تعريف FA من خلال مقارنة أوقات الاحتفاظ الناتجة بمعيار والتعبير عن النتائج كنسبة مئوية من إجمالي الدهون.
      30. ملف تعريف العناصر المعدنية: حدد العناصر المعدنية (Ca ، P ، Mg ، Na ، K ، Fe ، Cu ، Mn ، Zn) التي تم تحليلها بواسطة ICP-OES ، باتباع الطريقة المقتبسة من Pinto et al. (2022) 30 ، باتباع الخطوات 8.1.3.31-8.1.3.34.
      31. قم بوزن حوالي 0.4 جم من كل عينة جافة بدقة وأضف 7.5 مل من HNO3 و 2.5 مل من حمض الهيدروكلوريك.
        تنبيه: راجع ورقة بيانات السلامة الخاصة ب HNO3 و HCl التي قدمها المورد.
      32. يتبع الهضم عملية من مرحلتين: زيادة درجة الحرارة من RT إلى 90 درجة مئوية في 30 دقيقة (والحفاظ على 30 دقيقة أخرى عند درجة الحرارة هذه) تليها 60 دقيقة عند 105 درجة مئوية.
      33. قم بتبريد محاليل العينات ، وقم بتخفيفها إلى 25 مل ، وقم بترشيحها والاحتفاظ بها في أنابيب ملصقة. في كل عملية هضم ، قم بإجراء نفس العملية باستخدام مادة مرجعية وفارغة. الحصول على تركيز العناصر المختلفة بواسطة ICP-OES.
      34. عبر عن النتائج بالملغ لكل 100 غرام من fw.
      35. محتوى الكربوهيدرات: احسب محتوى الكربوهيدرات باتباع الخطوات 8.1.3.36-8.1.3.37.
      36. احسب محتوى الكربوهيدرات المتاحة (باستثناء الألياف) بفارق العوامل المحددة مسبقا لكل 100 غرام ، باستخدام المعادلة التالية ، وفقا لمنظمة الأغذية والزراعة (الفاو ؛ 2003) 31
        Equation 5
      37. عبر عن النتائج بالجرام لكل 100 جم.
      38. محتوى الرطوبة والرماد: قدر محتويات الرطوبة والرماد باتباع الخطوات 8-1-3-39-8-1-3-45.
      39. احتضان البوتقات الخزفية لمدة 3 ساعات عند 105 درجة مئوية ، قم بتبريدها في مجفف ووزنها.
      40. قم بوزن 10 جم من العينة في البوتقة وضعها في فرن تجفيف على حرارة 105 درجة مئوية لمدة 3 ساعات حتى لا تختلف القيم من الأوزان المتتالية بأكثر من 10 مجم.
      41. احسب محتوى الرطوبة ، معبرا عنه ب g لكل 100 جم من fw ، باستخدام المعادلة التالية:
        Equation 6
        حيث W1 هو وزن البوتقة الفارغة ، W2 هو وزن البوتقة مع العينة الطازجة ، و W3 هو وزن البوتقة مع العينة المجففة.
      42. بعد فحص محتوى الرطوبة ، ضع البوتقات مع العينات المجففة في محرقة عند 525 درجة مئويةلمدة 4 ساعات.
      43. كرر هذا الإجراء حتى لا تختلف الأوزان المتتالية بأكثر من 1 ملغ.
      44. قم بتبريد العينات إلى RT في مجفف ثم قم بوزنها.
      45. احسب محتوى الرماد ، معبرا عنه ب g لكل 100 جم من fw ، باستخدام المعادلة التالية:
        Equation 7
        حيث W1 هو وزن البوتقة الفارغة ، W2 هو وزن البوتقة مع عينة جديدة ، W3 هو وزن البوتقة بالوزن.
      46. قيمة الطاقة: احسب قيمة الطاقة باتباع الخطوات 8.1.3.47-8.1.3.48.
      47. احسب القيمة النشطة للعينات وفقا للائحة الاتحاد الأوروبي:توفير المعلومات الغذائية للمستهلكين (اللائحة 1169/2011)32 ، باستخدام المعادلات:
        الطاقة (كيلو كالوري / 100 جم) = 4 × (جم بروتينات) + 4 × (جم كربوهيدرات) + 9 × (جم دهون) + 2 × (جم ألياف)
        الطاقة (كيلوجول / 100 جم) = 17 × (جم بروتينات) + 17 × (جم كربوهيدرات) + 37 × (جم دهون) + 8 × (جم ألياف)
      48. عبر عن النتائج بالكيلوسعرات حرارية لكل 100 جرام وكيلو جول لكل 100 جرام.
    4. قبول المستهلك
      1. تقييم قبول المستهلك باستخدام عينات المعكرونة المطبوخة في الماء المقطر لمدة 8 دقائق.
      2. إجراء اختبار قبول المستهلك: تقييم المظهر المرئي واللون والملمس والرائحة وطعم البحر والذوق العام والتقييم العام ونية الشراء للعينات.
        ملاحظة: يعتمد اختبار قبول المستهلك على اختبارات المتعة التي تقيم المظهر المرئي واللون والملمس والرائحة وطعم البحر والذوق العام والتقييم العام ونية الشراء على مقياس من 1-9 ، حيث 1 هو تقييم ضعيف ، و 9 هو تقييم جيد جدا.
      3. إجراء الاختبارات الحسية في المقصورات الحسية الفردية في مختبر التحليل الحسي (مع التحكم في درجة الحرارة والإضاءة). توفير أدوات المائدة والمناديل وأكواب زجاجية من المياه المعدنية لتنظيف الحنك بين العينات.
        ملاحظة: تتراوح أعمار المتذوقين بين 16 و 64 عاما من جميع الخلفيات (عدد > 80).
  2. زبادي
    1. استخراج الصباغ
      ملاحظة: قم بإجراء استخراج الصباغ من خلال المنهجية الموضحة في Pereira et al. (2020) 18.
      1. تحضير مذيب الاستخراج ، المخزن المؤقت فوسفات الصوديوم عند 0.1 متر ، مع فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة (0.03 م) وفوسفات الصوديوم أحادي القاعدة (0.07 م). اضبط الأس الهيدروجيني على الرقم الهيدروجيني 6.8 باستخدام NaOH أو HCl.
      2. تزن 1 غرام من G. gracilis وتضاف 50 مل من محلول فوسفات الصوديوم (درجة الحموضة 6.8). تجانس لمدة 10 دقائق ، تليها 10 دقائق من النقع مع هاون ومدقة.
      3. انقل المحلول إلى أنبوب وجهاز طرد مركزي لمدة 20 دقيقة عند 12298 × جم (4 درجات مئوية).
      4. تجمع الطافع وإضافة ببطء 65 ٪ كبريتات الأمونيوم. عندما تذوب كل كبريتات الأمونيوم, قم بتغطية المحلول بورقة الألومنيوم واتركه ليترسب عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
        تنبيه: انظر ورقة بيانات السلامة من كبريتات الأمونيوم تسليمها من قبل المورد.
      5. أجهزة الطرد المركزي الراسب لمدة 20 دقيقة عند 12298 × جم (4 درجات مئوية). استعادة بيليه وتذوب في الماء المقطر (حوالي 5 مل).
      6. قم بإجراء غسيل الكلى للمستخلص باستخدام غشاء أنبوب (14 كيلو دالتون) ضد الماء لمدة 24 ساعة ، يليه التجفيف بالتجميد. قم بتخزين المستخلص المجفف بالتجميد المحمي من الضوء على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
    2. إعداد الزبادي
      1. تحضير الزبادي الطبيعي عن طريق خلط 1 لتر من الحليب المبستر ، 120 غرام من اللبن الطبيعي ، 20 غرام من السكر ، و 50 غرام من مسحوق الحليب في خلاط حراري لمدة 5 دقائق ، 50 درجة مئوية ، السرعة 3.
      2. ضع الخليط في جرة الخلاط الحراري في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
      3. دمج المستخلص عن طريق مزجه في اللبن بتركيز 0.21٪. قم بتخزين العينات في قوارير زجاجية فردية عند 4 درجات مئوية حتى التحليل.
      4. قم بتخزين الأجزاء الفردية من الزبادي بدون صبغة (تحكم) عند 4 درجات مئوية حتى التحليل.
    3. استقرار اللون
      ملاحظة: تقييم استقرار الصبغة في الزبادي من خلال تحليل اللون لمدة 12 يوما. قم بإجراء تحليل الألوان باستخدام مقياس ألوان الانعكاس ، باستخدام مراقب قياسي 2 درجة ، وإضاءة D65. يتم عرض النتائج كإحداثيات CIELab مع معلمات L (خفة ، أسود - أبيض ، 0 - 100) ، a * (أخضر - أحمر ، -60 - 60) ، و b * (أزرق - أصفر ، -60 - 60). تحتوي المعلمة a* على قيم موجبة للألوان المحمرة وقيم سالبة للألوان الخضراء. تأخذ المعلمة b* قيما موجبة للألوان الصفراء وقيما سالبة للألوان المزرقة. L * هي معلمة اللمعان ، وهي الخاصية التي يمكن بموجبها اعتبار كل لون مكافئا لعضو في التدرج الرمادي بين الأسود والأبيض33.
      1. قم بمعايرة مقياس الألوان باستخدام لوحة خزفية بيضاء (L * 88.5 ، a * 0.32 ، b * 0.33) مقدمة من الشركة المصنعة.
      2. املأ خلية بحوالي 28 جم من العينة (أو عنصر التحكم) وحلل اللون باستخدام برنامج تحليل بيانات الألوان.
        ملاحظة: كان البرنامج المستخدم لتحليل بيانات الألوان هو SpectraMagic NX.
      3. أداء القراءات 5 مرات في ثلاث نسخ عينة / مراقبة.
    4. التحليل الحسي
      ملاحظة: قم بإجراء تقييم حسي للزبادي مع دمج الصباغ باستخدام اختبار المثلث (ISO 4120 ، 2004) 34 وتقييم المتعة للون والطعم والتقدير العام.
      1. بالنسبة لاختبار المثلث ، أعط أعضاء اللجنة ثلاث عينات (عينة واحدة من الزبادي مع الصباغ وعينتين من التحكم ، أو عينتين من الزبادي مع الصباغ وعنصر تحكم واحد) واطلب منهم اختيار عينة مختلفة بناء على الرائحة والملمس والطعم. تقديم عينات في أحجام مماثلة محددة برموز عشوائية مكونة من 3 أرقام.
      2. لتقييم المتعة للزبادي مع الصباغ ، أعط أعضاء اللجنة عينة من الزبادي مع الصباغ واطلب منهم تقييم اللون والطعم والتقدير العام باستخدام مقياس المتعة المكون من 9 نقاط (من الكراهية الشديدة إلى الإعجاب الشديد).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نشاط مضادات الميكروبات

عند تفسير النتائج التي تم الحصول عليها ، يجب أن يؤخذ في الاعتبار أنه كلما ارتفعت نسبة التثبيط ، زادت فعالية المستخلص في تثبيط نمو تلك السلالة المحددة ، وبالتالي ، كلما كان المستخلص أكثر إثارة للاهتمام كمضاد للميكروبات. من خلال هذه المنهجية ، يمكننا تحديد المستخلصات التي لها نشاط أكبر على سلالات بكتيرية معينة بسرعة ، وكذلك تحديد الأكثر إثارة للاهتمام من حيث الاستخدام في المستقبل. وبالتالي يمكن أن يكون لدينا نقطة انطلاق لمزيد من الدراسات حول نفس المقتطف.

يوضح الشكل 1 النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام المستخلصات المائية ، في كل من المستخلصات الأولى والثانية ، مباشرة بعد تجفيف الكتلة الحيوية (الشكل 1 أ) وفي عمليات الاستخراج الثالثة والرابعة (الشكل 1 ب) ، التي تم الحصول عليها بعد عمليات استخراج الإيثانول ، وبالتالي استخدام الكتلة الحيوية بشكل متكامل. يمكننا أن نرى أن النتائج الأكثر إثارة للاهتمام ، المقابلة للاستخراج المائي الثالث والرابع ، تكشف عن أنشطة أعلى مضادة للميكروبات ، لا سيما في المستخلصات التي تم الحصول عليها عند 70 درجة مئوية. تركيز المستخلص في الآبار هو 5 مجم / مل.

Figure 1
الشكل 1: تثبيط نمو الأنواع البكتيرية في وجود مستخلصات مائية من G. gracilis. تثبيط نمو 3 أنواع بكتيرية (Bacillus subtilis ، الإشريكية القولونية ، Listonella anguillarum) بعد 24 ساعة من النمو في وسط سائل ، في وجود مستخلصات مائية (Aq) من G. gracilis تم الحصول عليها في درجات حرارة مختلفة ، درجة حرارة الغرفة (RT) ، 40 درجة مئوية (40) و 70 درجة مئوية (70). تم إجراء السيطرة الإيجابية باستخدام الكلورامفينيكول (CHL) ، وتم التعبير عن النتائج كقيم متوسطة (n = 8). تشير البيانات إلى 4 خطوات استخراج متسلسلة (1ش ، 2 ، 3ثالث ، 4ث). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يبدو أن المستخلصات الإيثانولية فعالة بشكل خاص في تثبيط نمو L. anguillarum ، كما هو موضح في الشكل 2. يوضح هذا النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام المستخلصات الإيثانولية ، وكذلك في عمليات الاستخراج الأولى والثانية (الشكل 2 أ) والاستخراج الثالث والرابع (الشكل 2 ب) ، التي تم الحصول عليها بعد الاستخراج المائي الأول.

Figure 2
الشكل 2: تثبيط نمو الأنواع البكتيرية في وجود مستخلصات الإيثانول من G. gracilis. تثبيط نمو 3 أنواع بكتيرية (Bacillus subtilis ، Escherichia coli ، Listonella anguillarum) بعد 24 ساعة من النمو ، في وسط سائل ، في وجود مستخلصات الإيثانول (Et) من G. gracilis ، التي تم الحصول عليها في درجات حرارة مختلفة ، درجة حرارة الغرفة (RT) ، 40 درجة مئوية (40) و 70 درجة مئوية (70). تم إجراء التحكم الإيجابي باستخدام الكلورامفينيكول (CHL) ، وتم التعبير عن النتائج كقيم متوسطة (n = 8). تشير البيانات إلى 4 خطوات استخراج متسلسلة (1ش ، 2 ، 3ثالث ، 4ث). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

نشاط مضاد للأكسدة

فيما يتعلق بالنتائج التي تسلط الضوء على إمكانات مضادات الأكسدة لمختلف المستخلصات ، وبالتحديد في اختبار DPPH ، تشير النتائج المعبر عنها في الشكل 3 إلى أن درجة حرارة 40 درجة مئوية كانت الأكثر فعالية ، مما أدى إلى قيم تثبيط أعلى للنشاط المؤكسد ، من تلك التي لوحظت في المستخلصات التي تم الحصول عليها في RT أو 70 °C. ينطبق هذا على عينات G. gracilis ، وقد تكون هناك اختلافات كبيرة اعتمادا على العينات المستخدمة وظروف نمو الطحالب. وبالتالي ، يوصى بإجراء اختبارات للإشارة إلى أفضل الظروف لكل نوع محدد من العينات.

Figure 3
الشكل 3: تثبيط جذر DPPH (٪) في وجود مقتطفات تم الحصول عليها في درجات حرارة مختلفة. تم الحصول على المستخلصات من خلال استخراج الإيثانول (Et) أو المائي (Aq). تمإجراء عمليات الاستخراج 1و 2 من الكتلة الحيوية الجافة بالتتابع. أما البقية (3 و 4) فقد صنعت من الكتلة الحيوية المستخرجة مسبقا بالمذيب البديل. RT تعني درجة حرارة الغرفة. 40 ، استخراج تم الحصول عليها في 40 °C ؛ و 70 ، تم الحصول على المستخلص عند 70 درجة مئوية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم الحصول على نتائج مماثلة من حيث القياس الكمي الكلي للبوليفينول (الشكل 4) ، مع اعتبار درجة حرارة 40 درجة مئوية الأفضل من حيث استخراج مركب مضادات الأكسدة. هذا يدل على أن النشاط المضاد للأكسدة يبدو مرتبطا بالمكونات الفينولية الموجودة في المستخلصات.

Figure 4
الشكل 4: القياس الكمي لمحتوى البوليفينول الكلي (TPC) في المستخلصات التي تم الحصول عليها في درجات حرارة مختلفة. تم الحصول على المستخلصات عن طريق الاستخراج الإيثانولي (Et) أو المائي (Aq) ، حيث تم إجراء الاستخراج 1و 2بالتتابع من الطحالب الجافة والباقي (3 rd و 4th) تم تصنيعه باستخدام الكتلة الحيوية المستخرجة مسبقا بمذيب آخر. RT تعني درجة حرارة الغرفة. 40 ، استخراج تم الحصول عليها في 40 °C ؛ و 70 ، تم الحصول على المستخلص عند 70 درجة مئوية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

السمية الخلوية في خلايا HaCat

الخطوة الأولى لتقييم سلامة مكونات مستحضرات التجميل هي دراسة السمية الخلوية في المختبر في خطوط خلايا البشرة والجلد. كما يتضح من الشكل 5، لم تلاحظ أي تأثيرات سامة للخلايا على الخلايا الكيراتينية (خلايا HaCaT)، مما يشير إلى أنه عند أقصى تركيز مقايسة (1 ملغم/مل)، تكون كل من المستخلصات المائية والإيثانول آمنة للاستخدام الجلدي.

Figure 5
الشكل 5: التأثير السام للخلايا لمستخلصات Gracilaria gracilis (1 ملغم/مل) على خلايا HaCaT بعد 24 ساعة من العلاج. يتم التعبير عن القيم في كل عمود كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM) لثلاث تجارب مستقلة في ثلاث نسخ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الابتكار الغذائي

تم الحصول على تركيبات المعكرونة النهائية بعد العديد من التجارب بين الصياغة النظرية والاختبار الحسي من قبل لجنة شبه مدربة. بعد هذه الخطوة ، تم الوصول إلى التوصيف الكيميائي ، بما في ذلك التقييم الغذائي والأحماض الدهنية وملامح العناصر المعدنية. كان من الممكن بناء توصيف غذائي (الجدول 1 والجدول 2) والتحقق من وجود مطالبات غذائية متوقعة بناء على التشريعات الأوروبية (REG (الاتحاد الأوروبي) رقم 1169/2011)32.

حقائق غذائية بواسطة 100 غرام من المعكرونة ٪ RDI
طاقة 1478.90 كيلو جول (348.74 كيلو كالوري) 17
الدهون 1.06 ± 0.10 غ 2
من ماذا:
الأحماض الدهنية المشبعة 0.38 ± 0.01 غ 2
كربوهيدرات 72.59± 0.21 غ 28
الالياف 3.84 ± 0.20 غ
بروتين 10.29 ± 0.20 غ 21
ملح 0.22 ± 0.02 غ 9

الجدول 1: حقائق غذائية. الحقائق الغذائية للمعكرونة المطورة بناء على التحليلات الكيميائية (ن = 3) للطاقة والكربوهيدرات التي تم الحصول عليها عن طريق الحساب والنسبة المئوية لكل من الجرعة الموصى بها (ن = 3).

تم تصميم تركيبات المعكرونة هذه لجذب المستهلك المستهدف الذي يضع نظاما غذائيا صحيا في الاعتبار ، لذلك يجب أن تكون كمية الدهون لكل 100 جرام من المنتج صغيرة قدر الإمكان. يظهر التحليل التفصيلي لملف تعريف الأحماض الدهنية قيمة 0.38 جم من الأحماض الدهنية المشبعة / 100 جم ، وهي أقل بكثير من الحد الأقصى للمنتجات منخفضة الدهون المشبعة ، مما يحقق الهدف الأولي في إنتاج هذه المعكرونة. فيما يتعلق بمحتوى الألياف ، كان من الممكن أيضا ، وفقا للوائح الأوروبية ، المطالبة بتركيبة المعكرونة هذه كمصدر للألياف.

في توصيف العناصر المعدنية ، الذي حدده ICP-OES والمقدم في الجدول 2 ، تم الإبلاغ عن قيمة حوالي 219 مجم / 100 جم من Na الموجودة في 100 جم من هذا المنتج ، لذلك لا يمكن التحقق من أنه منتج يحتوي على نسبة منخفضة من الصوديوم (<0.12 جم / 100 جم). نظرا لارتفاع محتوى الصوديوم الموجود بشكل طبيعي في المكونات ، قد لا يتطلب هذا المنتج إضافة الملح في حلويته.

Table 2

الجدول 2: لمحة عن العناصر المعدنية المعكرونة. أزرق - نسبة عالية من العنصر ؛ أحمر - مصدر عنصر معين (ن = 3). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

وفقا للوائح الاتحاد الأوروبي المشار إليها و RDI٪ لكل عنصر ، يمكن ملاحظة أن هذا المنتج يحتوي على نسبة عالية من K و P و Fe وهو أيضا مصدر للزنك. لديها Se و Mg و Ca موجودة بكميات أقل.

بالنسبة لاختبارات قبول المعكرونة ، تم استخدام 86 مختبرا ، منهم 63 من الإناث و 23 من الذكور ، الذين تزيد أعمارهم عن 18 عاما. استندت اختبارات القبول إلى مقاييس المتعة المكونة من 9 نقاط ، كما هو منصوص عليه في المعايير. سجل العجين الصحي 5 و 6 على مقياس المتعة من 1 إلى 9 لمعلمات "طعم البحر" و "المظهر المرئي" ، على التوالي (الشكل 6).

Figure 6

الشكل 6: نتائج اختبارات قبول المستهلك الحسية . (أ) اختيار المتعة للمظهر المرئي واللون والملمس والرائحة وطعم البحر والذوق العام. (ب) اختيار المتعة للتقدير العام ونية الشراء. المقياس 1-9 ، حيث 1 هو تقييم ضعيف ، و 9 هو تقييم جيد جدا (ن = 86). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

سجلت المعكرونة 5 و 6 على مقياس المتعة من 1 إلى 9 لمعلمات "طعم البحر" و "المظهر المرئي" ، على التوالي (الشكل 6 أ). حصلت هذه المعكرونة على قيمة منخفضة على هذا المقياس فيما يتعلق بمعلمة الملمس (بالنظر إلى التركيبات الأخرى التي تمت دراستها بالفعل) ، ربما لأن المكون الأساسي هو دقيق الأرز. على الرغم من ذلك ، حصلت على قيم على مقياس من 1 إلى 9 ، تتراوح من 4 إلى 7 مما يعكس قبولا جيدا من قبل المستهلك العادي. على مقياس المتعة من 1 إلى 9 ، كان للمعكرونة استجابات أكثر شيوعا بقيمة 5 لنية الشراء وقيمة 6 للتقدير العام ، كما هو موضح في الشكل 6 ب. وجد أن حوالي 65٪ من المتذوقين اختاروا استجابة مساوية أو أعلى من درجة 6 للتقييم العام لهذه المعكرونة. تم تقييم استقرار لون الزبادي مع الصباغ لمدة 12 يوما عند -4 درجة مئوية ، والنتائج معروضة في الشكل 7.

Figure 7
الشكل 7: استقرار لون الزبادي. (يسار) تحكم في الزبادي والزبادي (الأيمن) باستخدام صبغة Gracilaria gracilis خلال 12 يوما من التخزين. المعلمات a * و b * و L * بلا أبعاد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تشير النتائج إلى أن معلمات a * و b * كانت مستقرة بمرور الوقت ، بينما أظهرت قيم L * تباينا أعلى. أظهرت الخفة قيما أعلى بعد 8 أيام من التخزين. في حين تم العثور على بعض الاختلافات في معلمات الخفة ، مما يشير إلى أن العينات كانت أخف بمرور الوقت ، أظهرت معلمات الاحمرار (a *) والأزرق (b *) ثباتا جيدا. أظهر دمج المستخلصات في الزبادي احتفاظا جيدا بالألوان ، مع ΔE من 7.01 ± 2.36 بعد 12 يوما من التخزين. فيما يتعلق بالتقييم الحسي للزبادي ، حدد 9 من كل 13 عضوا في اللجنة بشكل صحيح العينة الصحيحة في اختبار المثلث ، مما يشير إلى وجود اختلافات بين الزبادي سمحت بهذا التمييز. أظهرت اختبارات المتعة التي أجريت على اللوحة شبه المدربة قبولا جيدا للمنتج ، ينعكس في درجات أعلى من 7 (الشكل 8). كان وضع النتيجة لأي من السمات الثلاث قيد الاختبار 9 ، مما أدى إلى متوسطات درجات أعلى من 8. تم إجراء أفضل تقييم للتلوين ، مما يعكس قبولا ممتازا من قبل اللجنة ، وهي نتيجة كاشفة.

Figure 8
الشكل 8: نتائج التقييم الحسي للمتعة للزبادي مع صبغة Gracilaria gracilis. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تستخدم اختبارات النشاط المضاد للميكروبات في وسط سائل لتقييم فعالية المواد المضادة للميكروبات ضد الكائنات الحية الدقيقة المعلقة في وسط سائل وعادة ما يتم إجراؤها لتحديد قدرة المادة على تثبيط النمو أو قتل الكائنات الحية الدقيقة35،36،37،38. يتم استخدامها لتقييم حساسية الكائنات الحية الدقيقة للعوامل المضادة للميكروبات ويتم إجراؤها في أنابيب الاختبار أو ألواح المعايرة الدقيقة ، حيث يتم اختبار تركيزات مختلفة من المادة المضادة للميكروبات مقابل تعليق موحد للكائنات الحية الدقيقة المستهدفة22. يتم تقييم النشاط المضاد للميكروبات عن طريق قياس نمو الميكروبات أو وجود / عدم وجود تعكر في وسط الاستزراع بعد فترة حضانة مناسبة.

هناك العديد من التقنيات والطرق لإجراء هذه الاختبارات ، مثل طريقة تخفيف المرق ، وطريقة انتشار الآجار (مثل اختبار انتشار القرص) ، وطريقة التخفيف الدقيق للمرق ، والتي تعد واحدة من أكثرالطرق استخداما 38. وتشمل بعض النقاط الأكثر أهمية في هذه الأساليب التحضير السليم للقاح، واختيار وسط الاستزراع، ونوعية مضادات الميكروبات المستخدمة، وتوحيد التقنية، والتحكم الفعال في التلوث. يجب تحضير اللقاح ، وهو تعليق موحد للكائنات الحية الدقيقة ، بشكل صحيح لضمان دقة النتائج. وهذا ينطوي على اختيار مناسب للثقافة الميكروبية ، وثقافة مناسبة من السلالات النقية ، وتعديل تركيز الخلية ، وتوحيد التعليق للحصول على كثافة بصرية مناسبة أو تركيز الخلية.

يجب اختيار وسط الاستزراع المستخدم بعناية للتأكد من أنه يوفر ظروف النمو المثالية للكائنات الحية الدقيقة قيد الاختبار. يمكن أن يؤثر التركيب الكيميائي ودرجة الحموضة وعوامل أخرى على نتائج الاختبار. من المهم اتباع توصيات الشركة المصنعة لإعداد وسط الثقافة. تعد جودة العوامل المضادة للميكروبات المستخدمة كعنصر تحكم أمرا أساسيا ، ومن المهم التأكد من أنها نقية ، خلال فترة الصلاحية ، ومخزنة بشكل صحيح. يجب دائما الرجوع إلى تواريخ وضع العلامات وانتهاء الصلاحية ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة. توحيد التقنية أمر بالغ الأهمية أيضا لضمان دقة النتائج. وهذا يشمل إضافة التركيزات المختبرة إلى وسط الاستزراع ، وكذلك الحفاظ على الظروف المعقمة طوال الإجراء. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي التلوث المتبادل للكائنات الحية الدقيقة أثناء الاختبار إلى نتائج خاطئة أو غير موثوقة. من الضروري اتباع ممارسات معقمة صارمة طوال الإجراء ، من التلاعب باللقاح إلى حضانة الأنابيب أو الألواح. يعد استخدام أسطح العمل النظيفة وتقنيات سحب العينات المناسبة والتخلص السليم من المواد من التدابير المهمة لتجنب التلوث.

يعد الاهتمام بالتفاصيل والالتزام الصارم بالبروتوكولات والمبادئ التوجيهية المعمول بها أمرا بالغ الأهمية لتقليل الأخطاء وضمان موثوقية النتائج في اختبارات النشاط المضاد للميكروبات في وسط سائل. أيضا ، اختبارات النشاط المضاد للميكروبات لها بعض القيود التي ينبغي اعتبارها37.

لا يتم النظر في عوامل مثل درجة الحموضة ودرجة الحرارة ووجود مكونات الدم والتفاعلات مع الجهاز المناعي في هذه الاختبارات ، والتي يمكن أن تحد من القدرة على التنبؤ بفعالية عامل مضاد للميكروبات في كائن حي. أيضا ، تقيس الاختبارات قدرة مادة مضادة للميكروبات على تثبيط نمو الميكروبات أو قتل الكائنات الحية الدقيقة ولا تقدم معلومات مفصلة حول آلية عمل مضادات الميكروبات أو انتقائيتها ضد كائنات دقيقة معينة. هناك قيود في اكتشاف المقاومة ، حيث أن الطرق المستخدمة قد لا تسمح بالكشف أو التنبؤ بتطور المقاومة بمرور الوقت. قد تطور بعض الكائنات الحية الدقيقة آليات مقاومة استجابة للتعرض المطول لمضادات الميكروبات ، وقد لا يتم اكتشاف هذه التغييرات بسهولة من خلال هذه الاختبارات. لا تأخذ اختبارات النشاط المضاد للميكروبات في وسط سائل عموما في الاعتبار العوامل المضيفة الأخرى التي قد تؤثر على فعالية العامل المضاد للميكروبات ، مثل وجود الأغشية الحيوية أو الاستجابة المناعية للمضيف.

من المهم النظر في هذه القيود واستكمال اختبار النشاط المضاد للميكروبات في وسط سائل بطرق ونهج أخرى ، مثل الدراسات في الجسم الحي ، ونماذج الأغشية الحيوية ، وغيرها39. وفي مجال التنقيب البيولوجي عن مركبات الطحالب الكبيرة النشطة بيولوجيا، يمكن استخدام اختبارات النشاط المضاد للميكروبات لتقييم إمكانات مستخلصات الطحالب أو المركبات المعزولة المضادة للميكروبات، وتحديد المواد ذات النشاط المضاد للميكروبات ضد مسببات الأمراض الميكروبية المحددة، والتي يمكن أن يكون لها تطبيقات في مجالات مثل إنتاج الأدوية أو مستحضرات التجميل أو الأغذية أو المنتجات الزراعية40.

اختبارات النشاط المضادة للأكسدة هي طرق تستخدم لتقييم قدرة مركب أو مستخلص على تحييد الجذور الحرة أو تقليل الإجهاد التأكسدي. تستخدم هذه الاختبارات على نطاق واسع في أبحاث مضادات الأكسدة ، سواء في الأطعمة أو في المنتجات الطبيعية مثل الطحالب ، على سبيل المثال. هناك عدة طرق لتقييم نشاط مضادات الأكسدة ، وواحدة من أكثرها استخداما هي قدرة امتصاص الجذور الحرة. في هذا الاختبار ، يتم استخدام الجذور الحرة المستقرة ، 2،2-ثنائي فينيل -1-بيكريل هيدرازيل (DPPH) ، لتقييم قدرة المركب على التبرع بإلكترون وتحييد الجذور الحرة. يتم قياس نشاط مضادات الأكسدة عن طريق تقليل اللون الأرجواني ل DPPH ، والذي يحدث عندما يتبرع المركب المضاد للأكسدة بإلكترون للجذور الحرة. تشمل الطرق الأخرى قدرة امتصاص الأكسجين الجذري (ORAC) أو قدرة تقليل الحديد (FRAP) أو قدرة تقليل الجذور الحرة (ABTS) 41.

من ناحية أخرى ، فإن القياس الكمي للبوليفينول الكلي (QTP) ليس طريقة مباشرة لتحديد نشاط مضادات الأكسدة ولكنه يوفر مقياسا للتركيز الكلي للبوليفينول في العينة ، على الرغم من أن العديد من المواد المتداخلة يمكن أن تؤثر على النتائج. على الرغم من أنه من المعروف أن العديد من البوليفينول لها خصائص مضادة للأكسدة ، إلا أن النشاط المضاد للأكسدة للمركب يرتبط بعدة عوامل ، مثل التركيب الكيميائي والتركيز والقدرة على التبرع بالجذور الحرة أو التقاطها والتفاعلات مع المكونات الخلوية الأخرى42. لا يمكن أن يوفر القياس الكمي البسيط لإجمالي البوليفينول تقييما للنشاط المضاد للأكسدة للعينة. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن وجود البوليفينول في العينة قد يترافق مع احتمال أكبر لنشاط مضادات الأكسدة لأن العديد من البوليفينول تمتلك خصائص مضادة للأكسدة. وبالتالي ، يمكن أن يكون QTP بمثابة مؤشر أولي لوجود مادة البوليفينول في العينة ، ولكن تأكيد نشاط مضادات الأكسدة يتطلب فحوصات نشاط مضادات الأكسدة. البوليفينول هي فئة من المركبات الكيميائية الموزعة على نطاق واسع في الطبيعة ، وتوجد في الأطعمة والنباتات والفواكه والخضروات والطحالب. هناك طرق مختلفة لقياس كمية البوليفينول الكلي ، وطريقة Folin-Ciocalteu هي واحدة من أكثر الطرق استخداما. يعطي QTP مقياسا عاما لتركيز البوليفينول ولكنه لا يحدد مركبات البوليفينول الفردية الموجودة في العينة. لذلك ، فهي طريقة كمية ولكنها ليست نوعية. علاوة على ذلك ، من المهم مراعاة أن البوليفينول المختلفة لها قدرات مضادة للأكسدة وأنشطة بيولوجية مختلفة ، لذلك لا يوفر QTP معلومات مفصلة عن الخصائص الوظيفية المحددة للبوليفينول الموجود.

كل طريقة لها مزاياها وقيودها ، ويعتمد اختيار اختبار معين على خصائص المركب قيد الدراسة والغرض من التحليل. من المهم اتباع التعليمات المحددة لكل طريقة لضمان نتائج موثوقة وقابلة للمقارنة. عند تحديد قدرة مضادات الأكسدة ، تتضمن بعض الخطوات الحاسمة الشائعة ، أولا ، تحضير العينة. من المهم تحضير العينات بشكل صحيح ، وضمان الحصول على تركيزات كافية وتجنب التلوث. يتضمن ذلك الوزن الدقيق للمركبات أو المستخلصات وإذابتها في المذيبات المناسبة. من المهم أيضا مراعاة استقرار المركبات والمستخلصات أثناء عملية التحضير والتخزين والمناولة. يجب إعداد جميع الكواشف المستخدمة في اختبارات نشاط مضادات الأكسدة وتوحيدها بشكل صحيح لضمان استنساخ النتائج. يتضمن ذلك الإعداد الصحيح لمعيار حمض الغال ودقة الأحجام. وقت رد الفعل هو جانب حاسم للحصول على نتائج دقيقة في اختبارات مضادات الأكسدة. من الضروري تحسين وقت الحضانة لضمان تفاعل كامل بين مركب مضادات الأكسدة والجذور الحرة. يمكن أن يؤدي الوقت غير الكافي إلى التقليل من شأن نشاط مضادات الأكسدة ، في حين أن الوقت المفرط يمكن أن يؤدي إلى تدهور المركبات أو التداخل من التفاعلات الثانوية. أيضا ، يجب التحكم في درجة الحرارة أثناء الاختبارات بدقة وثبات. تؤثر درجة الحرارة على سرعة التفاعلات الكيميائية ويمكن أن تؤثر على النتائج. من المهم اتباع ظروف درجة الحرارة الموصى بها من قبل الطرق المحددة وضمان استقرار درجة الحرارة طوال الإجراء. يعد إدراج الضوابط المناسبة أمرا ضروريا للتحقق من صحة نتائج اختبارات مضادات الأكسدة. يمكن أن يشمل ذلك الضوابط الإيجابية (المركبات المعروفة بأن لها نشاطا مضادا للأكسدة) والضوابط السلبية (عينات بدون نشاط مضاد للأكسدة). توفر الضوابط أساسا للمقارنة لتفسير النتائج وتساعد على ضمان دقة البيانات التي تم الحصول عليها. للحصول على نتائج موثوقة ، يوصى بإجراء اختبارات لنشاط مضادات الأكسدة على النسخ المتماثلة وتكرار التجربة عدة مرات لزيادة أهمية البيانات والحصول على نتائج أكثر موثوقية وقوة.

تحتوي طرق اختبار نشاط مضادات الأكسدة على بعض القيود التي يجب مراعاتها عند تفسير النتائج ، وهي حقيقة أنها ، في الوسائط السائلة ، قد لا تلتقط بشكل كامل تعقيد النظم البيولوجية والتفاعلات بين المركبات المختلفة ، ومجموعة واسعة من التفاعلات المضادة للأكسدة التي يمكن أن تحدث ، والتمثيل الغذائي الخلوي ، والعوامل البيئية التي يمكن أن تؤثر على نشاط مضادات الأكسدة. لذلك ، يجب استخدام اختبارات مختلفة. يجب على المرء أيضا أن يكون على دراية بعدم وجود علاقة مباشرة مع الفوائد الصحية. على الرغم من أن النشاط المضاد للأكسدة غالبا ما يرتبط بالفوائد الصحية ، إلا أن هذا لا يترجم دائما مباشرة إلى فوائد صحية في الكائنات الحية بسبب العديد من العوامل الأخرى ، مثل التوافر البيولوجي والتمثيل الغذائي والتفاعلات مع الأنظمة البيولوجية الأخرى.

من المهم أن تضع في اعتبارك أن اختبارات نشاط مضادات الأكسدة هي أدوات مفيدة للتقييم الأولي لإمكانات مضادات الأكسدة للمركبات والمستخلصات ولكن لا ينبغي اعتبارها مؤشرا نهائيا للتأثيرات البيولوجية أو الفوائد الصحية. هناك حاجة إلى دراسات إضافية لفهم تأثير مضادات الأكسدة على الجسم بشكل كامل.

على الرغم من أن طرق اختبار النشاط المضاد للأكسدة في الوسط السائل تستخدم على نطاق واسع في البحث ولها مزاياها وقيودها ، عند مقارنتها بالبدائل ، يمكن اعتبار هذه الطرق جيدة من حيث التطبيق العملي والسرعة والتكلفة وسهولة التنفيذ. واحدة من المزايا الرئيسية هي بساطة وسرعة الإجراءات ومدى ملاءمتها للبحث الأولي والفحص المركب والدراسات واسعة النطاق. هذه الطرق سريعة الأداء نسبيا ويمكن أن توفر نتائج في فترة قصيرة ، بطريقة ميسورة التكلفة ، وتتطلب معدات أقل تخصصا مقارنة بالطرق الأخرى.

تشتهر الطحالب بقدرتها على إنتاج مركبات نشطة بيولوجيا ، بما في ذلك مضادات الأكسدة ، والتي قد يكون لها خصائص صحية مفيدة43. يمكن تحضير مستخلصات الطحالب من أجزاء مختلفة من الطحالب ويمكن الحصول عليها باستخدام مذيبات مختلفة ، مثل الماء أو الإيثانول أو الميثانول أو الأسيتون وغيرها. من المهم أن نتذكر أن النشاط المضاد للأكسدة لمستخلصات الطحالب يمكن أن يختلف اعتمادا على عدة عوامل ، مثل أنواع الطحالب ، ومنهجية الاستخراج ، وتركيز المركبات النشطة بيولوجيا الموجودة. لذلك ، يوصى بإجراء اختبارات نشاط مضادات الأكسدة على النسخ المتماثلة وإجراء مقارنات مع الضوابط المناسبة للحصول على نتائج أكثر موثوقية. يمكن استخدام هذه الطرق كأداة أولية في فحص واختيار مستخلصات الطحالب ذات الإمكانات المضادة للأكسدة لمزيد من الدراسات.

اختبار MTT هو تقنية مستخدمة على نطاق واسع لإجراء تقييم أولي للتأثيرات السامة للخلايا في المختبر للمواد للاستخدام البشري والحيواني. ومع ذلك ، على الرغم من كونها الطريقة الأكثر استخداما لاختبار السمية الخلوية ، فإن تحويل MTT إلى بلورات الفورمازان يتأثر بالعديد من العوامل مثل معدل الأيض وعدد الميتوكوندريا ، وهو ينطبق فقط على أهداف الخلايا الملتصقة14. ترتبط الخطوات الحاسمة الرئيسية للبروتوكول الموصوف هنا بالحدوث النهائي لتلوث زراعة الخلايا ، ونمو خلايا HaCaT غير المرغوب فيه ، ونسبة منخفضة من التقاء الخلايا. هناك طرق أخرى ، مثل نازعة هيدروجين اللاكتات (LDH) ، والأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) ، ومقايسات تكوين المستعمرات لقياس السمية الخلوية. ومع ذلك ، كل منهم لديهم مزايا وقيود. قام قاسمي وآخرون (2021) 44 بتقييم تأثير العديد من المتغيرات على قياسات مقايسة MTT على خط خلايا سرطان البروستاتا (PC-3). تم تحليل عوامل مثل كثافة بذر الخلايا ، وتركيز MTT ، ووقت الحضانة بعد إضافة MTT ، وتجويع المصل ، وتكوين وسائط زراعة الخلايا ، والمحتويات داخل الخلايا المطلقة ، وقذف الفورمازان إلى الفضاء خارج الخلية. من هذه الدراسة ، تم تحديد توصيات مفيدة حول كيفية تطبيق الفحص ومنظور حول المكان الذي تكون فيه فائدة الفحص أداة قوية ، ولكن بالمثل حيث يكون لها قيود ، من قبل هؤلاء المؤلفين. ومع ذلك ، فإن اختبار MTT هو منهجية سريعة وحساسة للغاية وسهلة يمكن تطبيقها كتقييم أولي للسمية الخلوية للعديد من المواد ذات التطبيق المحتمل في المجالات العلاجية والغذائية والأعلاف والزراعة والبيئية. على وجه الخصوص ، أثبتت مقايسة MTT هنا أن الإيثانول والمستخلصات المائية من G. gracilis ، في التركيزات التي تم فحصها ، لم تؤثر على صلاحية الخلايا الكيراتينية ويمكن المضي قدما في المقايسات في الجسم الحي للتأكد من أنها آمنة تماما للاستخدام الجلدي البشري.

وقد أظهر استخدام الموارد البحرية في المنتجات الغذائية، مرة أخرى، قدرته ليس فقط على الحصول على منتجات ذات قيمة غذائية مضافة ولكن أيضا في العثور على منتجات ذات علامات أنظف. تظهر إضافة G. gracilis (المعكرونة) الكاملة أو المستخلص (كملون غذائي) إمكانات السوق ، ويمكن أن يكون تطبيقه أحد الاستراتيجيات للشركات للتميز في السوق ، وتلبية الاحتياجات الغذائية للمستهلكين ، ومتابعة اتجاهات السوق الخاصة بهم.

عندما تمت إضافة الأعشاب البحرية إلى تركيبات المعكرونة ، وجد في البداية أن الهيكل قد تم تغييره وأنه لم يكن من الممكن الحصول على أشكال العجين المطلوبة. واجهنا التحدي المتمثل في تعديل الكميات وإضافة مكونات أخرى لم تكن متوقعة من قبل ، بهدف الحفاظ على قوام المعكرونة. إلى جانب الكمية المناسبة من كل مكون ، تم تكييف طريقة البثق طوال فترة تطوير المعكرونة. بصرف النظر عن هذه الصعوبة ، يعتمد تطوير منتجات جديدة على ثلاثة مبادئ أساسية: يجب أن يكون المنتج جذابا حسيا (الملمس ، النكهة ، الرائحة) ؛ يجب أن يكون المنتج جذابا حسيا (الملمس ، النكهة ، الرائحة) ؛ يجب أن يكون المنتج جذابا حسيا (الملمس ، النكهة ، الرائحة) ؛ يجب أن يكون المنتج جذابا حسيا (الملمس ، النكهة ، الرائحة) ؛ يجب أن يكون المنتج جذابا حسيا يجب أن يكون للمنتج قيمة غذائية مضافة ؛ ويجب أن تستفيد إلى أقصى حد من المكونات والمنهجيات المستدامة. بهذا المعنى ، هناك تحد رئيسي آخر يتمثل في استخدام اللوحة الحسية لتحقيق الصيغة الأكثر جاذبية. معظم التحليلات الفيزيائية والكيميائية التي أجريت على المعكرونة كانت محسنة بالفعل لمصفوفات الطعام. ومع ذلك ، في هذا العمل ، تم تحسين إعداد العينة بحيث يمكن تطبيقها بكفاءة على جميع طرق التحليل.

فيما يتعلق باستخدام صبغة G. gracilis كملون ، تم اختيار منتج مبرد بسبب الحساسية الحرارية لهذا النوع من الجزيء45. نظرا لأن تحضير الزبادي يتضمن معالجة حرارية ، فقد تمت إضافة الصباغ إلى المنتج النهائي. أدى خلط الصبغة في الزبادي إلى منتج أكثر سوائل قليلا من عنصر التحكم بدون صبغة. في الواقع ، في نهاية اختبار المثلث ، بعض أعضاء اللجنة بأن الاختلاف الوحيد بين العينات هو النسيج. هذه نتيجة جيدة لأن الغرض الرئيسي من اختبار المثلث هو التحقق مما إذا كانت هناك اختلافات ملحوظة بين الزبادي مع الصباغ وبدونه ، خاصة الاختلافات في الذوق والرائحة ، لأن مستخلصات الأعشاب البحرية قد تمنح طعما / رائحة كريهة للمنتجات الغذائية. كانت هذه دراسة أولية شملت لجنة صغيرة شبه مدربة. في مزيد من الدراسات ، ينبغي النظر في عدد أكبر من المتذوقين لتحقيق نتائج سوق أكثر موثوقية. أما بالنسبة لتقييم استقرار الصباغ في الزبادي ، فيمكن أن تشمل الدراسات الإضافية تقييم الخصائص الفيزيائية والكيميائية الأخرى للزبادي مع الصباغ بمرور الوقت ، مثل درجة الحموضة والنشاط المائي (aw) والملمس. سيكون التقييم الحسي بمرور الوقت مرغوبا فيه أيضا.

في الختام ، تسلط البروتوكولات الموصوفة هنا الضوء على إمكانات الأعشاب البحرية الحمراء G. gracilis كمصدر للمكونات لتطوير منتجات جديدة ذات تطبيقات محتملة في الصناعات الدوائية والجلدية والغذائية. علاوة على ذلك ، تظل الكتلة الحيوية المتبقية بعد الاستخراج مادة قيمة يتم تطبيقها كمنشط حيوي لنمو النبات ، أو إثراء التربة ، أو تغذية الأسماك ، أو المواد الأولية للحصول على الفحم الحيوي و / أو الكربون الوظيفي لأغراض تنقية المياه. يمكن تطبيق نهج التكرير الحيوي الموصوف هنا على أنواع الأعشاب البحرية الأخرى ، مما يعزز الاقتصاد الدائري الأزرق والاستدامة البيئية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة البرتغالية للعلوم والتكنولوجيا (FCT) من خلال المشاريع الاستراتيجية الممنوحة لمركز MARE-Marine Sciences and Environmental (UIDP / 04292/2020 و UIDB / 04292/2020) ، والمختبر المعاون ARNET (LA / P / 0069/2020). مولت FCT أيضا منح الدكتوراه الفردية الممنوحة لمارتا ف. فريتاس (UI / BD / 150957 / 2021) وتاتيانا بيريرا (2021. 07791. دينار بحريني). تم دعم هذا العمل أيضا ماليا من قبل مشروع HP4A - المعكرونة الصحية للجميع (الترويج المشترك رقم 039952) ، بتمويل مشترك من ERDF - الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية ، في إطار برنامج البرتغال 2020 ، من خلال COMPETE 2020 - البرنامج التشغيلي للتنافسية والتدويل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute Ethanol Aga, Portugal 64-17-5
Ammonium Chloride PanReac 12125-02-9
Amphotericin B Sigma-Aldrich 1397-89-3
Analytical scale balance Sartorius, TE124S 22105307
Bacillus subtilis subsp. spizizenii German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) DSM 347
Biotin Panreac AppliChem 58-85-5
Centrifuge Eppendorf, 5810R 5811JH490481
Chloramphenicol PanReac 56-75-7
CO2 Chamber Memmert N/A
Cool White Fluorescent Lamps OSRAM Lumilux Skywhite N/A
Densitometer McFarland Grant Instruments N/A
DMEM medium Sigma-Aldrich D5796
DMSO Sigma-Aldrich 67-68-5
DPPH Sigma, Steinheim, Germany 1898-66-4
Escherichia coli (DSM 5922) German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) DSM5922
Ethanol 96% AGA-Portugal 64-17-5
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA) J.T.Baker 6381-92-6
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Filter Paper (Whatman No.1) Whatman WHA1001320
Flasks VWR International, Alcabideche, Portugal  N/A
Folin-Ciocalteu VWR Chemicals 31360.264
Gallic Acid  Merck 149-91-7
Germanium (IV) Oxide, 99.999% AlfaAesar 1310-53-8
HaCaT cells – 300493 CLS-Cell Lines Services, Germany  300493
Hot Plate Magnetic Stirrer IKA, C-MAG HS7 06.090564
Iron Sulfate VWR Chemicals 10124-49-9
Laminar flow hood TelStar, Portugal 526013
LB Medium  VWR Chemicals J106
Listonella anguillarum German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)  DSM 21597
Manganese Chloride VWR Chemicals 7773.01.5
Micropipettes  Eppendorf, Portugal N/A
Microplates VWR International, Alcabideche, Portugal  10861-666
Microplates Greiner 738-0168
Microplates (sterile) Fisher Scientific 10022403
Microplate reader  Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA 1611151E
MTT Sigma-Aldrich 289-93-1
Muller-Hinton Broth (MHB) VWR Chemicals 90004-658
Oven Binder, FD115 12-04490
Oven Binder, BD115 04-62615
Penicillin Sigma-Aldrich 1406-05-9
pH meter Inolab  VWR International, Alcabideche, Portugal  15212099
Pippete tips Eppendorf, Portugal 5412307
Pyrex Bottles Media Storage  VWR International, Alcabideche, Portugal  16157-169
Rotary Evaporator Heidolph, Laborota 4000 80409287
Rotavapor IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal 07.524254
Sodium Carbonate (Na2CO3) Chem-Lab 497-19-8
Sodium Chloride (NaCl)  Normax Chem 7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic Riedel-de Haën 7558-79-4
SpectraMagic NX Konica Minolta, Japan color data analysis software
Spectrophotometer Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA 5A4T092004
Streptomycin Sigma-Aldrich 57-92-1
Thiamine Panreac AppliChem 59-43-8
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4049
Tryptic Soy Agar (TSA) VWR Chemicals ICNA091010617
Tryptic Soy Broth (TSB)  VWR Chemicals 22091
Ultrapure water  Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany F5HA17360B
Vacuum pump Buchi, Switzerland FIS05-402-103
Vitamin B12 Merck 68-19-9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Charoensiddhi, S., Abraham, R. E., Su, P., Zhang, W. Seaweed and seaweed-derived metabolites as prebiotics. Advances in Food and Nutrition Research. 91, 97-156 (2020).
  2. Roohinejad, S., Koubaa, M., Barba, F. J., Saljoughian, S., Amid, M., Greiner, R. Application of seaweeds to develop new food products with enhanced shelf-life, quality, and health-related beneficial properties. Food Research International. 99, 1066-1083 (2017).
  3. Hurd, C. L., Harrison, P. J., Bischof, K., Lobban, C. S. Seaweed Ecology and Physiology. (second). , Cambridge University Press, UK. (2014).
  4. Freitas, M. V., Mouga, T., Correia, A. P., Afonso, C., Baptista, T. New insights on the sporulation, germination, and nutritional profile of Gracilaria gracilis (Rhodophyta) grown under controlled conditions. Journal of Marine Science and Engineering. 9 (6), 562 (2021).
  5. Friedlander, M. Advances in cultivation of Gelidiales. Journal of Applied Phycology. 20 (5), 451-456 (2008).
  6. Matos, G. S., Pereira, S. G., Genisheva, Z. A., Gomes, A. M., Teixeira, J. A., Rocha, C. M. R. Advances in extraction methods to recover added-value compounds from seaweeds: Sustainability and functionality. Foods. 10, 516 (2021).
  7. Ummat, V., Sivagnanam, S. P., Rajauria, G., O'Donnell, C., Tiwari, B. K. Advances in pre-treatment techniques and green extraction technologies for bioactives from seaweeds. Trends in Food Science & Technology. 110, 90-106 (2021).
  8. Pérez, M. J., Falqué, E., Domínguez, H. Seaweed Antimicrobials, Present Status and Future Perspectives. Handbook of Algal Technologies andPhytochemicals:Volume I Food, Health and Nutraceutical Applications. Ravishankar, G., Ambati, R. R. , 1st ed, CRC Press, Boca Raton, Florida. (2019).
  9. Cavallo, R. A., Acquaviva, M. I., Stabili, L., Cecere, E., Petrocelli, A., Narracci, M. Antibacterial activity of marine macroalgae against fish pathogenic Vibrio species. Central European Journal of Biology. 8, 646-653 (2013).
  10. Shannon, E., Abu-Ghannam, N. Antibacterial derivatives of marine algae: An overview of pharmacological mechanisms and applications. Marine Drugs. 14 (4), 81 (2016).
  11. Capillo, G., et al. New insights into the culture method and antibacterial potential of Gracilaria gracilis. Marine Drugs. 16 (12), 492 (2018).
  12. Francavilla, M., Franchi, M., Monteleone, M., Caroppo, C. The red seaweed Gracilaria gracilis as a multi products source. Marine Drugs. 11 (10), 3754-3776 (2013).
  13. Sánchez-Ayora, H., Pérez-Jiménez, J. Antioxidant Capacity of Seaweeds: In Vitro and In Vivo Assessment. Marine Phenolic Compounds. Pérez-Correa, J. R., Mateos, R., Domínguez, R. , Elsevier. 299-341 (2023).
  14. Anil, S., Sweety, V. K., Vikas, B., Betsy-Joseph, B. Cytotoxicity and Cell Viability Assessment of Biomaterials. Cytotoxicity. , Intechopen. 111822 (2023).
  15. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  16. Roleda, M. Y., et al. Variations in polyphenol and heavy metal contents of wild-harvested and cultivated seaweed bulk biomass: Health risk assessment and implication for food applications. Food Control. 95, 121-134 (2019).
  17. Souza, K. D., et al. Gastronomy and the development of new food products: Technological prospection. International Journal of Gastronomy and Food Science. 33, 100769 (2023).
  18. Pereira, T., et al. Optimization of phycobiliprotein pigments extraction from red algae Gracilaria gracilis for substitution of synthetic food colorants. Food Chemistry. 321, 126688 (2020).
  19. Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. New England Seaweed Culture Handbook-Nursery Systems. Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. , Connecticut Sea Grant, University of Connecticut. (2014).
  20. Yong, Y. S., Yong, W. T. L., Anton, A. Analysis of formulae for determination of seaweed growth rate. Journal of Applied Phycology. 25 (6), 1831-1834 (2013).
  21. Patarra, R. F., Carreiro, A. S., Lloveras, A. A., Abreu, M. H., Buschmann, A. H., Neto, A. I. Effects of light, temperature and stocking density on Halopteris scoparia growth. Journal of Applied Phycology. 29 (1), 405-411 (2017).
  22. NCCLS, National Committee for Clinical Laboratory Standards, Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests: Approved Standard. 32, 11th ed, Wayne, PA, USA. M02-M11 (2012).
  23. Singleton, V. L., Rossi, J. A. J. Colorimetry to total phenolics with phosphomolybdic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
  24. Duan, X. J., Zhang, W. W., Li, X. M., Wang, B. G. Evaluation of antioxidant property of extract and fractions obtained from a red alga, Polysiphonia urceolata. Food Chemistry. 95 (1), 37-43 (2006).
  25. Freitas, R., et al. Highlighting the biological potential of the brown seaweed Fucus spiralis for skin applications. Antioxidants. 9 (7), 611 (2020).
  26. Duarte, A., et al. Seasonal study of the nutritional composition of unexploited and low commercial value fish species from the Portuguese coast. Food Science and Nutrition. 10 (10), 3368-3379 (2020).
  27. Folch, J., Lees, M., Stanley, G. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  28. ISO 6865. Animal feeding stuffs - Determination of crude fibre content - Method with intermediate filtration. Bureau of Indian Standards (BIS). , (2000).
  29. Fernández, A., Grienke, U., Soler-Vila, A., Guihéneuf, F., Stengel, D. B., Tasdemir, D. Seasonal and geographical variations in the biochemical composition of the blue mussel (Mytilus edulis L.) from Ireland. Food Chemistry. 177, 43-52 (2015).
  30. Pinto, F., et al. Annual variations in the mineral element content of five fish species from the Portuguese coast. Food Research International. 158, 111482 (2022).
  31. FAO. Food energy - methods of analysis and conversion factors. , FAO Food and Nutrition Paper 77 at https://www.fao.org/fileadmin/templates/food_composition/documents/book_abstracts/Food_energy.pdf (2003).
  32. Regulation (EU) Nr. 1169/2011 of the European Parliament and of the Council of 25 -10-2011. 25, https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/?uri=CELEX%3A32011R1169 (2011).
  33. Pathare, P. B., Opara, U. L., Al-Said, F. A. J. Colour measurement and analysis in fresh and processed foods: A review. Food and Bioprocess Technology. 6 (1), 36-60 (2013).
  34. ISO 4120. Sensory analysis - Methodology - Triangle test. International Standard. , https://www.iso.org/standard/33495.html (2004).
  35. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: A review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  36. Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
  37. Gajic, I., et al. Antimicrobial susceptibility testing: A comprehensive review of currently used methods. Antibiotics. 11 (4), 427 (2022).
  38. Gonzalez-Pastor, R., et al. Current landscape of methods to evaluate antimicrobial activity of natural extracts. Molecules. 28 (3), 1068 (2023).
  39. Li, J., et al. Antimicrobial activity and resistance: Influencing factors. Frontiers in Pharmacology. 13 (8), 364 (2017).
  40. Silva, A., et al. Macroalgae as a source of valuable antimicrobial compounds: Extraction and applications. Antibiotics. 9 (10), 642 (2020).
  41. Munteanu, I. G., Apetrei, C. Analytical methods used in determining antioxidant activity: A review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3380 (2021).
  42. Ma, S., et al. Comparison of common analytical methods for the quantification of total polyphenols and flavanols in fruit juices and ciders. Journal of Food Science. 84 (8), 2147-2158 (2019).
  43. Tziveleka, L. A., Tammam, M. A., Tzakou, O., Roussis, V., Ioannou, E. Metabolites with antioxidant activity from marine macroalgae. Antioxidants. 10 (9), 1431 (2021).
  44. Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
  45. Pereira, T., Barroso, S., Mendes, S., Gil, M. M. Stability, kinetics, and application study of phycobiliprotein pigments extracted from red algae Gracilaria gracilis. Journal of Food Science. 85 (10), 3400-3405 (2020).

Tags

علم الأحياء، العدد 201،
تثمين الأعشاب البحرية <em>الحمراء Gracilaria gracilis</em> من خلال نهج التكرير الحيوي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martins, A., Pinto, F. R., Barroso,… More

Martins, A., Pinto, F. R., Barroso, S., Pereira, T., Mouga, T., Afonso, C., Freitas, M. V., Pinteus, S., Pedrosa, R., Gil, M. M. Valorization of the Red Seaweed Gracilaria gracilis Through a Biorefinery Approach. J. Vis. Exp. (201), e65923, doi:10.3791/65923 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter