Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Valorisering av den röda tången Gracilaria gracilis genom en bioraffinaderimetod

Published: November 21, 2023 doi: 10.3791/65923
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1, 1, 1
1MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, ESTM, Polytechnic University of Leiria, 2MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, Department of Life Sciences, University of Coimbra

Summary

Här beskriver vi flera protokoll som syftar till en integrerad valorisering av Gracilaria gracilis: skörd av vilda arter, intern tillväxt och extraktion av bioaktiva ingredienser. Extraktens antioxidativa, antimikrobiella och cytotoxiska effekter utvärderas, tillsammans med närings- och stabilitetsbedömningen av livsmedel berikade med biomassa och pigment från hela alger.

Abstract

Intresset för tång som en riklig råvara för att få fram värdefulla bioaktiva ingredienser med flera mål ökar kontinuerligt. I detta arbete utforskar vi potentialen hos Gracilaria gracilis, en ätbar röd tång som odlas över hela världen för sitt kommersiella intresse som en källa till agar och andra ingredienser för kosmetiska, farmakologiska, livsmedels- och foderapplikationer.

G. gracilis tillväxtbetingelser optimerades genom vegetativ förökning och sporulering samtidigt som de fysikalisk-kemiska förhållandena manipulerades för att uppnå ett stort biomassalager. Gröna extraktionsmetoder med etanol och vatten utfördes över tångbiomassan. Den bioaktiva potentialen hos extrakt bedömdes genom en uppsättning in vitro-analyser avseende deras cytotoxicitet, antioxidant och antimikrobiella egenskaper. Dessutom inkorporerades torkad tångbiomassa i pastaformuleringar för att öka matens näringsvärde. Pigment extraherade från G. gracilis har också införlivats i yoghurt som ett naturligt färgämne, och deras stabilitet utvärderades. Båda produkterna utvärderades av en semi-utbildad sensorisk panel som syftade till att uppnå den bästa slutliga formuleringen innan den nådde marknaden.

Resultaten stöder mångsidigheten hos G. gracilis oavsett om den appliceras som en hel biomassa, extrakt och/eller pigment. Genom att implementera flera optimerade protokoll möjliggör detta arbete utveckling av produkter med potential att tjäna pengar på livsmedels-, kosmetika- och vattenbruksmarknaderna, vilket främjar miljömässig hållbarhet och en blå cirkulär ekonomi.

Dessutom, och i linje med en bioraffinaderistrategi, kommer den kvarvarande tångbiomassan att användas som biostimulant för växttillväxt eller omvandlas till kolmaterial som ska användas vid vattenrening av de interna vattenbrukssystemen vid MARE-Polytechnic i Leiria, Portugal.

Introduction

Tång kan betraktas som en intressant naturlig råvara som kan utnyttjas av läkemedels-, livsmedels-, foder- och miljösektorerna. De biosyntetiserar en mängd molekyler, många som inte finns i landlevande organismer, med relevanta biologiska egenskaper 1,2. Tångoptimerade odlingsprotokoll måste dock implementeras för att säkerställa ett stort biomassalager.

Odlingsmetoderna måste alltid ta hänsyn till tångens talli och den övergripande morfologin. Gracilaria gracilis är ett klonalt taxon, vilket innebär att fästorganet producerar flera vegetativa axlar. Förökning genom fragmentering (vegetativ reproduktion) uppnås således, eftersom var och en av dessa axlar är fullt kapabla att anta ett självständigt liv från huvudtallus3. Klonala taxa kan framgångsrikt integreras med enkla och snabba enstegsodlingsmetoder, eftersom stora mängder biomassa erhålls genom att dela tallus i små fragment som snabbt regenereras och växer till nya, genetiskt identiska individer. Både haplontisk och diplontisk talli kan användas i denna process. Även om släktet uppvisar en komplex haplo-diplontisk isomorf trifasisk livscykel är sporulering sällan nödvändig utom när genetisk förnyelse av bestånden krävs för att uppnå förbättrade grödor. I detta fall ger både tetrasporer (haplontiska sporer som bildas av meios) och karposporer (diplontiska sporer som bildas av mitos) upphov till makroskopiska talli som sedan kan odlas och förökas genom vegetativ reproduktion4. Tillväxtcykler dikteras av miljöförhållanden och individernas fysiologiska tillstånd, bland andra biologiska faktorer som uppkomsten av epifyter och vidhäftning av andra organismer. Därför är det viktigt att optimera odlingsförhållandena för att säkerställa hög produktivitet och producera biomassa av god kvalitet5.

Extraktion av bioaktiva föreningar från alger, inklusive G. gracilis, kan uppnås genom olika metoder 6,7. Valet av extraktionsmetod beror på de specifika föreningarna av intresse, målapplikationen och tångens egenskaper. I den här studien fokuserade vi på lösningsmedelsextraktion, vilket innebär att man använder gröna lösningsmedel, såsom vatten eller etanol, för att lösa upp och extrahera bioaktiva föreningar från tångbiomassan. Extraktionen kan utföras genom maceration på ett mångsidigt och effektivt sätt och kan användas för ett brett spektrum av föreningar. Det är en enkel och allmänt använd metod som innebär att biomassa blötläggs i ett lösningsmedel under en längre period, vanligtvis vid rumstemperatur eller lätt förhöjda temperaturer. Lösningsmedlet rörs om för att förbättra extraktionsprocessen. Efter önskad extraktionstid separeras lösningsmedlet från det fasta materialet genom filtrering eller centrifugering.

Vatten är ett vanligt lösningsmedel i livsmedelsapplikationer på grund av dess säkerhet, tillgänglighet och kompatibilitet med ett brett utbud av livsmedelsprodukter. Vattenextraktion är lämplig för polära föreningar som polysackarider, peptider och vissa fenoler. Det kan dock inte effektivt extrahera opolära föreningar. Etanol är också ett allmänt använt lösningsmedel i livsmedelsapplikationer och kan vara effektivt för att extrahera en mängd olika bioaktiva molekyler, inklusive fenolföreningar, flavonoider och vissa pigment. Etanol är allmänt erkänt som säkert att använda i livsmedel och kan lätt avdunstas och lämna kvar de extraherade föreningarna. Det är värt att notera att valet av extraktionsmetod bör ta hänsyn till faktorer som effektivitet, selektivitet, kostnadseffektivitet och miljöpåverkan. Optimeringen av extraktionsparametrar, såsom lösningsmedelskoncentration, extraktionstid, temperatur och tryck, är avgörande för att uppnå optimalt utbyte av bioaktiva föreningar från G. gracilis eller andra alger.

Tång har visat sig uppvisa antimikrobiell aktivitet mot ett brett spektrum av mikroorganismer, inklusive bakterier, svampar och virus8. Denna aktivitet tillskrivs bioaktiva komponenter, inklusive fenoler, polysackarider, peptider och fettsyror. Flera studier har visat deras effektivitet mot patogener som Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. och Pseudomonas aeruginosa, bland andra9. Den antimikrobiella aktiviteten hos alger tillskrivs närvaron av bioaktiva föreningar som kan störa mikrobiella cellväggar, membran, enzymer och signalvägar10. Dessa föreningar kan störa mikrobiell tillväxt, hämma biofilmbildning och modulera immunsvar.

Röda alger, även kända som rhodofyter, är en grupp alger som kan uppvisa antimikrobiell aktivitet mot en mängd olika mikroorganismer. Inom denna grupp innehåller G. gracilis olika bioaktiva föreningar som kan bidra till dess rapporterade antimikrobiella aktivitet. Även om de specifika molekylerna kan variera, är de vanliga klasserna som har rapporterats i G. gracilis och som kan ha antimikrobiella egenskaper polysackarider, fenoler, terpenoider och pigment11. Det är dock viktigt att notera att förekomsten och mängden av dessa komponenter kan variera beroende på faktorer som platsen för tånginsamlingen, säsongsvariationer, thallis fysiologiska tillstånd och miljöförhållanden. Därför kan den specifika klassen och koncentrationen av antimikrobiella föreningar i G. gracilis variera i enlighet med detta.

G. gracilis har också visat sig ha antioxidativa egenskaper, som innehåller olika fenolföreningar, som har visat sig rensa bort fria radikaler och minska oxidativ stress12.Antioxidanter hjälper till att skydda cellerna från skador orsakade av reaktiva syrearter och har potentiella hälsofördelar. Antioxidanternas kapacitet kan utvärderas direkt genom olika metoder, inklusive 2,2-difenyl-1-pikrylhydrazyl (DPPH) friradikaler och, indirekt, genom kvantifiering av totalt polyfenolinnehåll (TPC)13.

Även om en ingrediens rapporteras ha en framträdande bioaktivitet är dess cytotoxicitetsbedömning oumbärlig för att utvärdera naturliga och syntetiska ämnen som ska användas i kontakt med levande celler eller vävnader. Det finns flera metoder för att mäta cytotoxicitet, var och en med fördelar och begränsningar. Sammantaget erbjuder de en rad alternativ för att utvärdera de skadliga effekterna av många ämnen på celler och samtidigt undersöka mekanismerna för cellskador och celldöd14.

I detta arbete använder vi 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analys, en kolorimetrisk metod introducerad av Mosmann (1983)15. Denna metod mäter reduktionen av tetrazoliumsalter till en lila formazanprodukt av metaboliskt aktiva celler. Ju högre mängd formazankristaller, desto högre antal livsdugliga celler, vilket ger ett indirekt mått på cytotoxicitet14. Eftersom G. gracilis vatten- och etanolextrakt i detta arbete är avsedda att införlivas i dermokosmetiska formuleringar, utförs cytotoxicitetsutvärderingen in vitro i en keratinocytcellinje (HaCaT).

När det gäller livsmedelsapplikationen är alger i allmänhet kalorisnåla och näringsrika på kostfibrer, essentiella element och aminosyror, polysackarider, fleromättade fettsyror, polyfenoler och vitaminer 2,16. G. gracilis är inget undantag och har ett intressant näringsvärde. Freitas et al. (2021)4 fann att odlad G. gracilis hade högre nivåer av protein och C-vitamin och bibehöll nivån av totala lipider jämfört med vild tång. Detta kan utgöra en ekonomisk och miljömässig fördel, eftersom produktion ur näringssynpunkt är att föredra framför utnyttjande av vilda resurser. Dessutom är konsumenterna alltmer oroade över vilken typ av mat de äter, så det är viktigt att introducera nya ingredienser för livsmedelsberikning och använda nya resurser för att få extrakt som kan ge mervärde till en produkt och göra anspråk på en "clean label". Dessutom är den nuvarande marknaden mycket konkurrensutsatt, vilket kräver utveckling av nya produkter och innovativa strategier för att skilja tillverkarna från konkurrenterna17.

Berikning av produkter med lågt näringsvärde, t.ex. pasta, med marina resurser, inklusive tång, är en strategi för att introducera denna resurs som ett nytt livsmedel och en strategi för marknadsdifferentiering genom en produkt med ett distinkt näringsvärde. Å andra sidan är G. gracilis en källa till naturliga röda pigment som fykobiliproteiner18, med hög potential för tillämpningar inom livsmedelsindustrin. Denna tång har visat stort intresse inom flera områden, och dess applicering kan göras med hjälp av hela tången, extrakt och/eller den återstående biomassan. I detta arbete visar vi några exempel på sådana tillämpningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Skörd och beredning av biomassa

  1. Skörda exemplaren av G. gracilis under lågvatten och transportera dem snabbt till laboratoriet i mörka, kylda lådor för att undvika uttorkning, ljus och luftexponering.
  2. I laboratoriet, tvätta varje tallus med rinnande havsvatten och rengör noggrant för att ta bort skräp, nekrotiska delar, epifyter och andra organismer från ytan.
  3. Förvara den vilda biomassan i ständigt luftat havsvatten (31–35 psu) i ett klimatrum (20 ± 1 °C) med låg instrålning från dagsljus, kallvitt ljus och lysrör och fotoperiod inställd på 16:08 (ljus: mörkt) i 7 dagar. Under denna period ska du inte tillföra några näringsmedier; Detta gör att tången långsamt kan anpassa sig till de nya inomhusförhållandena.

2. Underhåll av lager

  1. Efter acklimatiseringsperioden skär du av friska spetsar av tångtalli med ett sterilt blad. I enlighet med Redmond et al. (2014)19 och under sterila förhållanden, dra varje spets genom en agargel som tidigare beretts i petriskålar (1,0 % bakteriologisk agar, i förhållandet 1:1 destillerat vatten/havsvatten) för att avlägsna eventuella kvarvarande föroreningar. Utför agardragningen tre gånger för varje spets och dra alltid spetsen genom oanvända delar av agargelen.
  2. Syratvätta glas i en saltsyralösning (HCl, 15%) och skölj noggrant med destillerat vatten. Sterilisera alla verktyg, glas, agar, havsvatten och destillerat vatten som används i rengöringsprocessen i autoklav (121 °C, 15 min).
    VARNING: Se säkerhetsdatabladet för HCl som levereras av leverantören.
  3. Tips växer i steriliserat havsvatten vid 35 psu, kompletterat med Von Stosch Enriched solution (VSE) modifierad för röda alger, enligt Redmond et al. (2014)19. Tillsätt germaniumdioxid (GeO2) till mediet (1 ml/l) för att förhindra tillväxt av epifytiska kiselalger.
    VARNING: Se säkerhetsdatabladet för GeO2 som levereras av leverantören.
    OBS: Tips som visar förlust av pigmentering, som observeras av partiell eller total missfärgning, är stressade eller är redan döda och bör kasseras.

3. Odling och uppskalning

  1. Efter acklimatiseringsperioden fördelas slumpmässigt cirka 8-10 friska spetsar i 250 ml flatbottnade kolvar i ett klimatrum inställt på 20 ± 1 °C med det vita kalla ljuset på 20 ± 0,5 μmol fotoner m-2 s-1 (1500 lux), en fotoperiod inställd på 16 timmar: 8 timmar (ljus: mörk) och sterilt havsvatten berikat med VSE-odlingsmedier som förnyas varje vecka.
  2. Utför viktmätningar varje vecka och undvik att anstränga tallin förmycket 20. För detta, ta försiktigt bort spetsarna från odlingsmediet, skölj försiktigt och väg milligrammen på en laboratorievåg.
    OBS: Denna procedur kan utföras tillsammans med den veckovisa förnyelsen av kulturmediet.
  3. Thalli kan växa i dessa flaskor upp till en densitet av 2 g/l. Utför nu en uppskalning av mottagaren (250 ml, 1 l och 5 l). Överför odlingen till öppna vita behållare på 50 L och större när volymen når 5 L.
  4. Beräkna relativ tillväxthastighet (RGR) enligt Patarra et al. (2017)21 :
    RGR (% fw/dag) = ([Ln (fw) - Ln (iw)]/t) x 100
    där iW och FW är den ursprungliga respektive slutliga färskvikten, uttryckt i gram, och t är tiden i dagar.
    OBS: Under denna laboratorieinställning når RGR värden upp till 21 % per dag. Skörd av biomassa kan utföras när som helst. Biomassa måste bearbetas snabbt för att förhindra nedbrytning genom antingen ugnstorkning, frystorkning eller helt enkelt förvaring fryst (-20 °C), beroende på den avsedda användningen. Den torkade biomassan kan förvaras i rumstemperatur (RT) eller även förvaras fryst.

4. Extraktionsförfarande

OBS: För att bedöma cytotoxiciteten, antioxidanten och de antimikrobiella egenskaperna hos in vitro-extrakt av G. gracils , tar beredningen hänsyn till två olika parametrar: extraktionstemperaturen och typen av lösningsmedel.

  1. För att utföra extraktionerna, ugnstorka biomassan av G. gracilis och mal biomassan (t.ex. i en kaffekvarn) tills pulvret passerar genom en 200 μm sikt.
  2. Väg upp den torkade biomassan (10 g) och lös den i 100 ml lösningsmedel (absolut etanol eller sterilt vatten).
  3. Rör om i ett kärl skyddat från ljus i 30 minuter.
  4. Utför sekventiell etanol > vatten och vatten > etanolextraktioner vid RT, 40 °C och 70 °C.
  5. För varje temperatur, utför extraktionerna med etanol och vatten separat två gånger.
  6. Separera de flytande extrakten från den återstående biomassan genom filtrering genom filterpapper (Whatman No.1), följt av centrifugering vid 8000 x g i 10 minuter vid RT.
  7. Återanvänd den återstående algbiomassan för ytterligare extraktion med det andra lösningsmedlet. Om ett prov först extraherades med etanol, extrahera det med vatten därefter och vice versa.
  8. Frystorka vattenextrakten och indunsta etanolextrakten i en rotationsindunstare vid 40 °C.
  9. Förvara de torkade extrakten vid 4 °C.
  10. Lös upp extrakten i en koncentration på 50 mg/ml (antimikrobiella analyser) eller 10 mg/ml (antioxidantanalyser). Lös upp vattenextrakten i sterilt vatten och etanolextrakten i absolut etanol.

5. Antimikrobiell aktivitet

Anmärkning: Etanol- och vattenextrakten bör testas individuellt mot Bacillus subtilis subsp. spizizenii (DSM 347), Escherichia coli (DSM 5922) och Listonella anguillarum (DSM 21597). Antimikrobiell testning måste utföras i enlighet med rekommendationerna från National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2012)22. Alla kulturer erhölls från den tyska samlingen av mikroorganismer och cellkulturer (DSMZ). L. anguillarum odlades på tryptisk sojabuljong (TSB) eller tryptisk sojaagar (TSA) kompletterad med 1 % natriumklorid (NaCl). De återstående två stammarna odlades på LB-medium (VWR Chemicals). Kulturerna Bacillus subtilis subsp . spizizenii (DSM 347) och Listonella anguillarum (DSM 21597) inkuberades vid 30 °C, medan Escherichia coli (DSM 5922) inkuberades vid 37 °C enligt leverantörens anvisningar. Buljongmikrospädningsmetoden kan användas för bestämning av antimikrobiell aktivitet i ett flytande medium, och detta bör utföras i mikroskala, vilket gör det möjligt att snabbt och effektivt bestämma den antimikrobiella potentialen. Denna lågkostnadsmetod gör det möjligt att uppnå resultat på bara 24 timmar och är därför lämplig för att i ett tidigt skede fastställa de bästa extraktionsförhållandena som gör det möjligt att för en given mikrobiell stam uppnå resultat i form av tillväxthämmande verkan. Metoden kräver dock användning av sterila mikroplattor med ett lock som är specifikt för mikrobiell tillväxt, samt tillgång till en mikroplattläsare för våglängden 600 nm.

  1. Utför mikroutspädningstesterna av buljongen med obehandlade mikroplattor med 96 brunnar och rundbotten med 170 μl Müller-Hintonbuljong (MHB), inokulerade med 10 μl standardiserad inokulat (vid 0,5 McFarland-standard) och 20 μL av varje extrakt (50 mg/ml).
  2. Inkubera plattorna i 24 timmar vid optimal temperatur för varje stam.
  3. Detektera den antimikrobiella aktiviteten genom reduktion av den synliga grumligheten mätt genom registrering av den optiska densiteten (OD 600) i en mikroplattspektrofotometer, vid 0 timmar och 24 timmar.
  4. Uttryck resultaten i procent av hämningen:
    Equation 1
    där Abs. ext är skillnaden i uppmätt absorbans, mellan 0 h och 24 h, i de brunnar som innehåller bakteriestam som växer i närvaro av extraktet, och Abs hänvisar till samma mått i brunnar som innehåller bakteriestammen och lösningsmedlet.
  5. I denna metod ingår kontrollreaktioner, där brunnar endast innehåller odlingsmedium som kommer att vara den negativa kontrollen, men även brunnar med medium inokulerat med standardstammen tillsatt till lösningsmedel (etanol eller vatten) och medium med bakteriestammen och det positiva kontrollantibiotikumet (kloramfenikol).

6. Antioxidantaktivitet och kvantifiering av totala polyfenoler

  1. Totalt innehåll av polyfenoler
    OBS: Totalt polyfenolinnehåll (TPC) utförs med Folin-Ciocalteu-metoden23 och anpassas till mikroskala.
    1. Tillsätt 158 μl ultrarent vatten, 2 μl prov och 10 μl Folin-Ciocalteu-reagens till varje brunn i en mikroplatta med 96 brunnar, skyddad från ljus.
      VARNING: Se säkerhetsdatabladet för Folin-Ciocalteu-reagenset som levereras av leverantören.
    2. Efter 2 minuter tillsätts 30 μL Na2CO3 (20 %).
    3. Efter inkubation i mörker vid RT i 1 timme mäts proverna spektrofotometriskt vid 755 nm.
    4. Använd gallussyra (som gör att kalibreringskurvan kan ritas ut) eller ultrarent vatten (2 μL) som kontroller.
    5. Uttryck resultaten som gallussyraekvivalenter (mg GAE/g-extrakt).
  2. 2,2 difenyl-1-pikrylhydrazyl (DPPH) radikal reningsaktivitet
    OBS: Extraktens antioxidantaktivitet utvärderas enligt beskrivningen av Duan et al. (2006)24, anpassad till mikroskala
    1. I en mikroplatta med 96 brunnar skyddad från ljus placeras 2 μl av varje prov (i en koncentration av 10 mg/ml) och 198 μl DPPH löst i absolut etanol (0,1 mM).
      VARNING: Se säkerhetsdatabladet för DPPH som levereras av leverantören.
    2. Kör reaktionen i 30 min på RT i mörker. Mät absorbansen vid 517 nm i en mikroplattspektrofotometer.
    3. Utför en kontrollreaktion med 2 μl absolut etanol/destillerat vatten och 198 μl DPPH-lösning. Utför blindmätning med 2 μl extrakt och 198 μl absolut etanol.
    4. Uttryck resultaten som den procentuella DPPH-hämningen med hjälp av följande ekvation:
      Equation 2
      där As är absorbansen hos algextraktet, Ab är absorbansen hos blankproverna och Ac är absorbansen hos kontrollen.

7. Utvärdering av cytotoxicitet i epidermala celler

OBS: Den cytotoxiska effekten in vitro av vatten- och etanolextrakt av G. gracilis utvärderas i humana keratinocyter (HaCaT-celler - 300493) genom MTT-kolorimetrisk analys enligt tidigare beskrivning25. Cellerna förvärvades från Cell Lines Services, Tyskland (CLS) och metoden utfördes i enlighet med institutionella riktlinjer och CLS instruktioner.
VARNING: Se MTT:s säkerhetsdatablad som levereras av leverantören)

  1. Underhåll av cellodling
    1. Odla HaCaT-celler i Dulbeccos modifierade Eagles höga glukosmedium (DMEM) kompletterat med 10 % fetalt bovint serum (FBS) och 1 % antibiotika/antimykotisk lösning (amfotericin B, 0,25 mM; penicillin, 60 mM; streptomycin, 100 mM).
    2. Använd trypsin-EDTA för att dissociera cellerna.
      OBS: Subkulturen av HaCaT-celler åstadkoms efter att cellerna nått total sammanflöde.
    3. Odla cellerna i en kammare vid 37 °C med 5 %CO 2 och 95 % luftfuktighet.
    4. Subkulturera cellerna enligt biobankens instruktioner när odlingarna når 80%-85% confluence.
  2. Utvärdering av cytotoxicitet
    1. Efter sådd av celler i 96-hålsplattor och inkubation över natten, behandla HaCaT-celler (4 x 104 celler/brunn) med de torkade extrakten som tidigare lösts i DMSO (100 mg/ml). Tillsätt sedan 2 μl extraktlösning till 198 μl medium och inkubera plattorna i 24 timmar.
    2. Ta bort odlingsmediet och tillsätt 100 μl MTT (0,5 mg/ml) till cellerna. Inkubera cellerna i 30 minuter i mörker vid de regelbundna odlingsförhållanden som nämns ovan.
    3. Avlägsna MTT-lösningen och solubilisera de intracellulära formazankristallerna med 100 μl DMSO.
    4. Mät absorbansen vid 570 nm med hjälp av en mikroplattläsare. Uttryck resultaten i procent av kontrollcellerna i obehandlad kontroll.

8. Innovation inom livsmedel

  1. Ny livsmedelsprodukt: Pasta med tång
    1. Val av ingredienser och pastaformulering
      OBS: Valet av ingredienser gjordes i samarbete med ett pastaföretag. Valet av huvudingredienser (som beskrivs i avsnitt 8.2) gjordes med tanke på deras lättillgänglighet och kompatibilitet med befintliga produktionslinjer, med hjälp av marina resurser för att få pasta med mervärde.
      1. Efter valet av ingredienser, designa formuleringen efter det avsedda näringsvärdet (källa till fibrer, vitaminer och mineralämnen, låga mättade fetter) genom att analysera formuleringarnas teoretiska kemiska sammansättning med hjälp av ett kalkylblad.
      2. När de teoretiska kraven är uppfyllda fortsätter produktionen i laboratorieskala enligt beskrivningen i steg 8.1.2.
      3. Utför ett sensoriskt test med en halvtränad panel (>10 provare) för att validera behovet av omformulering eller acceptans av formuleringen för följande steg.
        OBS: Panelen var tidigare utbildad för provsmakning av pasta och utvärderade de presenterade formuleringarna med avseende på attribut som smak, smak, lukt, konsistens och utseende.
    2. Pastaproduktion
      OBS: Producera Chifferi-pastaprover med hjälp av en pastaextruder.
      1. Blanda tidigare definierade portioner rismjöl, G. gracilis och Chlorella vulgaris i utrustningen och tillsätt cirka 30 % vatten till blandningen.
      2. För att få torr pasta, torka chifferi vid 68 °C i 42 minuter, följt av 5 timmar, 30 minuter vid 76 °C, vilket simulerar en industriell process.
      3. Packa och vakuumförsegla slutligen proverna och förvara dem på en mörk plats vid RT tills vidare analys.
    3. Näringsanalys
      OBS: För näringsprofilanalyser, använd torkade och macererade prover i tre exemplar.
      1. Råproteinhalt: Utför total proteinanalys genom Kjeldahl-metoden , anpassad från Duarte et al. (2022)26, enligt steg 8.1.3.2-8.1.3.6.
      2. Väg noggrant upp 1,0 g prov (eller destillerat vatten för blindprovet) och blanda med två Kjeldahl-tabletter och 25 ml H2SO4 i uppslutningsrören.
        VARNING: Se säkerhetsdatabladet för H2SO4 som levereras av leverantören.
      3. Utför uppslutningen av proverna i en Kjeldahl-kokare vid 220 °C i 30 minuter, följt av 90 minuter vid 400 °C.
      4. Efter nedkylning till RT, tillsätt 80 ml destillerat vatten och destillera den bildade ammoniaken till 30 ml av en 4% H 3 BO3lösning som innehåller bromkresolgrönt och metylrött. Detta steg sker under alkaliska förhållanden (destillation med 40 % NaOH med hjälp av en Kjeldahl-destillatör).
        VARNING: Se säkerhetsdatabladet för H 3 BO3-lösningensom innehåller bromkresolgrönt, metylrött och 40 % NaOH som levereras av leverantören.
      5. Titrera de destillerade proverna med HCl 0,1 M tills en färgförändring till grårosa observeras.
      6. Beräkna råproteinhalten, representerad av provets kvävehalt, och uttrycka den som g per 100 g med hjälp av följande ekvation:
        Equation 3
        där Vs motsvarar den HCl-volym (ml) som används vid provtitrering. Vb motsvarar den volym som används i ämnet; N motsvarar HCl-normalitet; w motsvarar provets vikt (g).
      7. Total fetthalt: Bestäm den totala fetthalten med hjälp av Folch-metoden, anpassad från Folch et al. (1957)27, enligt steg 8.1.3.8-8.1.3.14.
      8. Bered Folch-reagens genom att blandaCHCl3 och MeOH i förhållandet 2:1 (v:v).
        VARNING: Se säkerhetsdatabladet för Folch-reagenset som levereras av leverantören.
      9. Tillsätt 5 ml folchreagens och 0,8 ml destillerat vatten till provrör som innehåller 1 g alikvoter prover. Blanda i en virvel i 1 min.
      10. Tillsätt sedan ytterligare 5 ml folchreagens och homogenisera i 5 min. Tillsätt 1,2 ml 0,8 % NaCl-lösning och homogenisera i 2 min.
      11. Centrifugera proverna vid 7000 x g i 10 minuter. Filtrera den organiska fasen (nedre fasen) genom hydrofil bomull och vattenfritt natriumsulfat till en rundbottnad glaskolv.
      12. För att undvika provförlust, upprepa stegen med tillsats av 5 ml CHCl3, homogenisering, centrifugering och filtrering under samma förhållanden.
      13. Ta bort det organiska lösningsmedlet från de uppsamlade organiska faserna genom lågtrycksindunstning och låt stå i ugnen vid 105 °C i 4 timmar. Kyl ner proverna i en exsickator.
      14. Beräkna fetthalten, uttryckt i g per 100 g, med hjälp av följande ekvation:
        Equation 4
        där W1 är vikten av en tom rundbottnad glaskolv, W2 är provets ursprungliga vikt, W3 är den rundbottnade glaskolven med provvikten.
      15. Råfiberhalt: Bestäm råfiberhalten med hjälp av en metod som anpassats från ISO 6865 (2000)28, enligt steg 8.1.3.16–8.1.3.22.
      16. Väg upp 1 g av provet (W0) i en glasdegel med filterbotten (referens P2) och placera det i fiberanalysatorn.
      17. Det första steget är sur hydrolys: Tillsätt 150 ml 1,25 % H 2 SO4, förvärmd, och2ml skumdämpningsmedel (n-oktanol) till kolonnen i varje degel; Värm tills det kokar och låt stå i 30 minuter.
      18. Efter avlägsnande av detta lösningsmedel, tvätta tre gånger med avjoniserat vatten för att fortsätta till den grundläggande hydrolysen. Tillsätt 150 ml 1,25 % NaOH, förvärmd, och 5 ml skumdämpande medel till den vätskefria kolonnen och utför samma uppvärmningsprocedur som för syrahydrolysen.
      19. Gör slutligen en trippeltvätt med 150 ml aceton för kallextraktionen.
      20. Ta sedan försiktigt ut deglarna ur systemet och sätt in dem i en ugn vid 150 °C i 1 timme. Anteckna den slutliga vikten (W1).
      21. Placera deglarna i en muffelugn vid 500 °C i 3 timmar och anteckna sedan den slutliga vikten (W2).
      22. Beräkna råfiberinnehållet och uttrycka resultaten i procent med hjälp av följande ekvation:
        %Råfiber = 100 x (W1-W2)/W0
      23. Fettsyraprofil (FA): Bestäm fettsyraprofilen enligt Fernández et al.(2015)29, följ steg 8.1.3.24–8.1.3.29.
        OBS: Fettsyrornas metylestrar (FAME) erhålls genom direkt syrakatalyserad transmetylering av de malda frystorkade proverna. Alla analyser görs i tre exemplar.
      24. Tillsätt 2 ml av en 2 % (v/v) H 2 SO4-lösning i metanol till ett prov på 50 mg och häll blandningen vid 80 °C i2timmar under ständig omrörning.
        VARNING: Se säkerhetsdatabladet för metanol som levereras av leverantören.
      25. Efter kylning till RT, tillsätt 1 ml ultrarent vatten och 2 ml n-heptan till varje prov, virvla blandningen i 1 minut och centrifugera den i 5 min.
        VARNING: Se säkerhetsdatabladet för n-heptan som levereras av leverantören.
      26. Återvinn den övre n-heptanfasen (organisk) som innehåller FAME och överför den till injektionsflaskor med gaskromatografi (GC).
      27. Analysera i en gaskromatograf utrustad med en TR-FAME-kapillärkolonn (60 m × 0,25 mm ID, 0,25 μm filmtjocklek), en autosampler och en flamjoniseringsdetektor (FID).
      28. Ställ injektorn (splitless mode) på 250 °C och detektorn på 280 °C. Ställ in kolonnens initialtemperatur på 75 °C och håll i 1 min. Höj sedan med 5 °C/min till 170 °C och håll i 10 min. Höj sedan med 5 °C/min till 190 °C och håll ytterligare 10 min. Höj slutligen med 2 °C/min till 240 °C och håll i 10 minuter. Använd helium som bärgas med en flödeshastighet på 1,5 ml/min. Tilluft och vätgas med flöden på 350 respektive 35 ml/min.
      29. Bestäm FA-profilen genom att jämföra de resulterande retentionstiderna med en standard och uttrycka resultaten som en procentandel av det totala fettet.
      30. Mineralelementprofil: Bestäm de mineralämnen (Ca, P, Mg, Na, K, Fe, Cu, Mn, Zn) som analyserats av ICP-OES, enligt den metod som anpassats från Pinto et al. (2022)30, enligt steg 8.1.3.31–8.1.3.34.
      31. Väg noggrant upp cirka 0,4 g av varje torrt prov och tillsätt 7,5 ml HNO3 och 2,5 ml HCl.
        VARNING: Se säkerhetsdatabladet för HNO3 och HCl som levereras av leverantören.
      32. Rötningen följer en tvåstegsprocess: Höj temperaturen från RT till 90 °C på 30 minuter (och bibehåll ytterligare 30 minuter vid denna temperatur) följt av 60 min vid 105 °C.
      33. Kyl provlösningarna, späd dem till 25 ml och filtrera och förvara dem i märkta rör. Utför samma process med ett referensmaterial och ett ämne vid varje uppslutning. Erhåll koncentrationen av de olika grundämnena med hjälp av ICP-OES.
      34. Uttryck resultaten i mg per 100 g fw.
      35. Kolhydratinnehåll: Beräkna kolhydratinnehållet enligt punkterna 8.1.3.36–8.1.3.37.
      36. Beräkna det tillgängliga kolhydratinnehållet (exklusive fibrer) med skillnaden mellan de tidigare bestämda faktorerna per 100 g, med hjälp av följande ekvation, enligt FN:s livsmedels- och jordbruksorganisation (FAO; 2003)31
        Equation 5
      37. Uttryck resultaten i g per 100 g.
      38. Fukt- och askhalt: Uppskatta fukt- och askhalten enligt punkterna 8.1.3.39–8.1.3.45.
      39. Inkubera porslinsdeglarna i 3 timmar vid 105 °C, kyl dem i exsickator och väg dem.
      40. Väg upp 10 g av provet i degeln och placera det i en torkugn vid 105 °C i 3 timmar tills värdena från de på varandra följande viktningarna inte skiljer sig med mer än 10 mg.
      41. Beräkna vattenhalten, uttryckt som g per 100 g fw, med hjälp av följande ekvation:
        Equation 6
        där W1 är vikten av den tomma degeln, W2 är vikten av degeln med det färska provet och W3 är vikten av degeln med det torkade provet.
      42. Efter vattenhaltsbestämningen placeras deglarna med de torkade proverna i en förbränningsugn vid 525 °Ci 4 timmar.
      43. Upprepa denna procedur tills det inte skiljer sig mer än 1 mg mellan viktningarna efter varandra.
      44. Kyl proverna till RT i exsickator och väg dem sedan.
      45. Beräkna askhalten, uttryckt i g per 100 g fw, med hjälp av följande ekvation:
        Equation 7
        där W1 är vikten av den tomma degeln, W2 är vikten av degeln med färskt prov, W3 är degelns vikt med vikt.
      46. Energivärde: Beräkna energivärdet enligt steg 8.1.3.47-8.1.3.48.
      47. Beräkna provernas energivärde enligt EU-förordningen:Tillhandahållande av livsmedelsinformation till konsumenterna (förordning 1169/2011)32 med hjälp av ekvationerna:
        Energi (kcal/ 100 g) = 4 x (g proteiner) + 4 x (g kolhydrater) + 9 x (g fett) + 2 x (g fiber)
        Energi (kJ/ 100 g) = 17 x (g proteiner) + 17 x (g kolhydrater) + 37 x (g fett) + 8 x (g fiber)
      48. Uttryck resultaten i kilokalorier per 100 g och kilojoule per 100 g.
    4. Konsumenternas acceptans
      1. Utvärdera konsumenternas acceptans med hjälp av pastaprover kokta i destillerat vatten i 8 minuter.
      2. Utför konsumentacceptanstest: Utvärdera visuellt utseende, färg, konsistens, lukt, havssmak, övergripande smak, övergripande utvärdering och köpavsikt för proverna.
        OBS: Konsumentacceptanstestet är baserat på hedoniska tester som utvärderar visuellt utseende, färg, konsistens, lukt, havssmak, övergripande smak, övergripande utvärdering och köpavsikt på en skala från 1-9, där 1 är en dålig utvärdering och 9 är en mycket bra utvärdering.
      3. Utför sensoriska tester i enskilda sensoriska bås i ett sensoriskt analyslaboratorium (med temperatur- och belysningskontroll). Tillhandahåll bestick, servetter och glaskoppar med mineralvatten för att rengöra gommen mellan proverna.
        OBS: Provsmakare är i åldern 16-64 år från alla bakgrunder (n > 80).
  2. Yoghurt
    1. Extraktion av pigment
      OBS: Utför pigmentextraktionen genom den metod som beskrivs i Pereira et al. (2020)18.
      1. Bered extraktionslösningen, natriumfosfatbufferten vid 0,1 M, med dinatriumfosfat (0,03 M) och mononatriumfosfat (0,07 M). Ställ in pH på pH 6.8 med NaOH eller HCl.
      2. Väg upp 1 g G. gracilis och tillsätt 50 ml natriumfosfatbuffert (pH 6,8). Homogenisera i 10 minuter, följt av 10 minuters maceration med mortel och mortelstöt.
      3. Överför lösningen till ett rör och centrifugera i 20 minuter vid 12 298 x g (4 °C).
      4. Slå ihop supernatanten och tillsätt långsamt 65 % ammoniumsulfat. När allt ammoniumsulfat är upplöst, täck lösningen med en aluminiumplåt och låt den fällas ut vid 4 °C över natten.
        VARNING: Se säkerhetsdatabladet för ammoniumsulfat som levereras av leverantören.
      5. Centrifugera fällningen i 20 minuter vid 12 298 x g (4 °C). Återvinn pelleten och lös upp den i destillerat vatten (ca 5 ml).
      6. Utför dialys av extraktet med hjälp av ett slangmembran (14 kDa) mot vatten i 24 timmar, följt av frystorkning. Förvara det frystorkade extraktet skyddat från ljus vid 4 °C fram till användning.
    2. Yoghurt beredning
      1. Förbered naturell yoghurt genom att blanda 1 L pastöriserad mjölk, 120 g naturell yoghurt, 20 g socker och 50 g mjölkpulver i en termomixer i 5 min, 50 °C, hastighet 3.
      2. Lägg blandningen i termomixerburken i en inkubator vid 37 °C i 12 timmar.
      3. Inkorporera extraktet genom att blanda det i yoghurt i en koncentration av 0,21 %. Förvara proverna i enskilda glaskolvar vid 4 °C fram till analysen.
      4. Förvara enskilda portioner yoghurt utan pigment (kontroll) vid 4 °C fram till analys.
    3. Färgens stabilitet
      OBS: Utvärdera stabiliteten hos pigmentet i yoghurten genom färganalys i 12 dagar. Utför färganalys med hjälp av en reflektanskolorimeter, med en 2-graders standardobservatör och en D65-ljuskälla. Resultaten presenteras som CIELab-koordinater med parametrarna L (ljushet, svart - vit, 0 - 100), a* (grön - röd, -60 - 60) och b* (blå - gul, -60 - 60). Parameter a* har positiva värden för rödaktiga färger och negativa värden för grönaktiga färger. Parameter b* tar positiva värden för gulaktiga färger och negativa värden för blåaktiga färger. L* är parametern för luminositet, som är den egenskap enligt vilken varje färg kan anses motsvara en medlem av gråskalan mellan svart och vitt33.
      1. Kalibrera kolorimetern med en vit keramisk platta (L* 88.5, a* 0.32, b* 0.33) som tillhandahålls av tillverkaren.
      2. Fyll en cell med cirka 28 g av provet (eller kontrollen) och analysera färgen med hjälp av programvara för färgdataanalys.
        OBS: Programvaran som användes för färgdataanalys var SpectraMagic NX.
      3. Utför avläsningar 5 gånger i sample/kontrolltriplicat.
    4. Sensorisk analys
      OBS: Utför sensorisk utvärdering av yoghurt med pigmentinkorporering med hjälp av ett triangeltest (ISO 4120, 2004)34 och en hedonisk utvärdering av färg, smak och allmän uppskattning.
      1. För triangeltestet, ge paneldeltagarna tre prover (ett prov av yoghurt med pigment och två prover av kontroll, eller två prover av yoghurt med pigment och en kontroll) och be dem välja ett annat prov baserat på arom, konsistens och smak. Tillhandahåll prover i liknande volymer identifierade med slumpmässiga 3-siffriga koder.
      2. För den hedoniska utvärderingen av yoghurten med pigment, ge paneldeltagarna ett prov på yoghurt med pigment och be dem utvärdera färgen, smaken och den övergripande uppskattningen med hjälp av en 9-gradig hedonisk skala (från extremt ogillande till extremt gillande).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Antimikrobiell aktivitet

Vid tolkningen av de erhållna resultaten bör man komma ihåg att ju högre andel hämning det har, desto effektivare är extraktet när det gäller att hämma tillväxten av den specifika stammen och följaktligen desto intressantare är extraktet som antimikrobiellt medel. Genom denna metodik kan vi snabbt identifiera vilka extrakt som har större aktivitet på vissa bakteriestammar och även identifiera de mest intressanta när det gäller framtida användning. Vi kan alltså ha en utgångspunkt för vidare studier av samma extrakt.

Figur 1 visar de resultat som erhållits med vattenextrakt, både i den första och andra extraktionen, omedelbart efter torkning av biomassa (figur 1A) och i den tredje och fjärde extraktionen (figur 1B), erhållna efter etanolextraktionen, varvid biomassan används integrerat. Vi kan se att de mest intressanta resultaten, motsvarande den tredje och fjärde vattenextraktionen, visar på högre antimikrobiella aktiviteter, särskilt i extrakt som erhålls vid 70 °C. Koncentrationen av extrakt i brunnarna är 5 mg/ml.

Figure 1
Figur 1: Tillväxthämning av bakteriearter i närvaro av vattenextrakt av G. gracilis. Tillväxthämning av 3 bakteriearter (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Listonella anguillarum) efter 24 timmars tillväxt i flytande medium, i närvaro av vattenextrakt (Aq) av G. gracilis erhållna vid olika temperaturer, rumstemperatur (RT), 40 °C (40) och 70 °C (70). Den positiva kontrollen gjordes med kloramfenikol (CHL), och resultaten uttrycks som medelvärden (n = 8). Data avser de 4 sekventiella extraktionsstegen (1st, 2:a, 3:e, 4:e). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Etanolextrakten verkar vara särskilt effektiva när det gäller att hämma tillväxten av L. anguillarum, vilket visas i figur 2. Detta visar de resultat som erhållits med etanolextrakten, även i den första och andra extraktionen (figur 2A) och den tredje och fjärde extraktionen (figur 2B), erhållna efter den första vattenextraktionen.

Figure 2
Figur 2: Tillväxthämning av bakteriearter i närvaro av etanolextrakt av G. gracilis. Tillväxthämning av 3 bakteriearter (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Listonella anguillarum) efter 24 timmars tillväxt, i flytande medium, i närvaro av etanolextrakt (Et) av G. gracilis, erhållna vid olika temperaturer, rumstemperatur (RT), 40 °C (40) och 70 °C (70). Positiv kontroll gjordes med kloramfenikol (CHL) och resultaten uttrycktes som medelvärden (n = 8). Data avser de 4 sekventiella extraktionsstegen (1st, 2:a, 3:e, 4:e). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Antioxidant aktivitet

När det gäller de resultat som belyser de olika extraktens antioxidativa potential, nämligen i DPPH-testet, visar de resultat som anges i figur 3 att temperaturen på 40 °C var den mest effektiva, vilket ledde till högre hämningsvärden för oxidantaktiviteten, än de som observerades i extrakt som erhölls vid RT eller 70 °C. Detta gäller för G. gracilis-proverna , och det kan finnas stora variationer beroende på vilka prover som används och algtillväxtförhållandena. Det rekommenderas därför att tester utförs för att indikera de bästa förhållandena för varje specifik typ av prov.

Figure 3
Figur 3: Hämning av DPPH-radikalen (%) i närvaro av extrakt erhållna vid olika temperaturer. Extrakten erhölls genom extraktion med etanol (Et) eller vatten (Aq). Den 1:a och 2:a extraktionen gjordes från torr biomassa sekventiellt. De återstående (3:e och 4:e) tillverkades med biomassa som tidigare extraherats med det alternativa lösningsmedlet. RT betyder rumstemperatur; 40, extrakt erhållet vid 40 °C; och 70, extrakt erhållet vid 70 °C. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Liknande resultat erhölls när det gäller total polyfenolkvantifiering (figur 4), där temperaturen på 40 °C anses vara den bästa när det gäller extraktion av antioxidantföreningar. Detta visar att antioxidantaktiviteten verkar vara korrelerad med de fenoliska komponenterna som finns i extrakten.

Figure 4
Figur 4: Kvantifiering av den totala halten av polyfenoler (TPC) i extrakt som erhållits vid olika temperaturer. Extrakten erhölls genom etanolextraktion (Et) eller vattenextraktion (Aq), där 1:a och 2:a extraktionen gjordes sekventiellt från torralger och de återstående (3:e och 4:e) gjordes med biomassa som tidigare extraherats med ett annat lösningsmedel. RT betyder rumstemperatur; 40, extrakt erhållet vid 40 °C; och 70, extrakt erhållet vid 70 °C. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Cytotoxicitet i HaCat-celler

Det första steget för att bedöma kosmetiska ingrediensers säkerhet är att studera deras cytotoxicitet in vitro i epidermala och dermala cellinjer. Som framgår av figur 5 observerades inga cytotoxiska effekter på keratinocyter (HaCaT-celler), vilket tyder på att både vattenextrakt och etanolextrakt är säkra för kutan användning vid den maximala analyskoncentrationen (1 mg/ml).

Figure 5
Figur 5: Cytotoxisk effekt av Gracilaria gracilis-extrakt (1 mg/ml) på HaCaT-celler efter 24 timmars behandling. Värdena i varje kolumn uttrycks som medelvärdet ± medelfelet av medelvärdet (SEM) för tre oberoende experiment i tre exemplar. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Innovation inom livsmedel

De slutliga pastaformuleringarna erhölls efter många försök mellan teoretisk formulering och sensorisk testning av en semi-tränad panel. Efter detta steg fick man tillgång till den kemiska karakteriseringen, inklusive näringsutvärdering, fettsyror och mineralelementprofiler. Det var möjligt att skapa en näringskarakterisering (tabell 1 och tabell 2) och verifiera förekomsten av förväntade näringspåståenden baserat på den europeiska lagstiftningen (REG (EU) nr 1169/2011)32.

Näringsinnehåll med 100 g pasta % RDI
Energi 1478,90 kJ (348,74 kcal) 17
Lipider 1,06 ± 0,10 g 2
Från vad:
Mättade fettsyror 0,38 ± 0,01 g 2
Kolhydrater 72.59± 0.21 g 28
Fiber 3,84 ± 0,20 g
Protein 10.29 ± 0.20 g 21
Salt 0,22 ± 0,02 g 9

Tabell 1: Näringsinnehåll. Näringsfakta för utvecklad pasta baserat på kemiska analyser (n=3) av energi och kolhydrater erhållna genom beräkning och respektive procentandel av rekommenderat dosintag (n = 3).

Dessa pastaformuleringar har utformats för att tilltala en målkonsument som har en hälsosammare kost i åtanke, så mängden fett per 100 g av en produkt måste vara så liten som möjligt. Detaljerad analys av fettsyraprofilen visar ett värde på 0,38 g mättade fettsyror/100 g, vilket är långt under gränsen för produkter med låg mättad fetthalt, vilket uppfyller det ursprungliga målet i produktionen av denna pasta. När det gäller fiberinnehållet var det också möjligt, i enlighet med europeiska bestämmelser, att hävda denna pastaformulering som en fiberkälla.

I karakteriseringen av mineralelement, bestämd med ICP-OES och presenterad i tabell 2, rapporteras värdet på cirka 219 mg/100 g Na som finns i 100 g av denna produkt, så det kan inte verifieras att det är en produkt med låg natriumhalt (<0,12 g/100 g). På grund av den förhöjda natriumhalten som finns naturligt i ingredienserna behöver denna produkt inte tillsättas salt i konfekten.

Table 2

Tabell 2: Profil för pastamineraler. Blå - högt innehåll av element; Röd - källa till ett visst element (n = 3). Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Enligt den hänvisade EU-förordningen och FUI% för varje element kan man se att denna produkt har ett högt innehåll av K, P, Fe och är också en källa till Zn. Den har Se, Mg och Ca närvarande i mindre mängder.

För acceptanstesterna av pasta användes 86 testare, varav 63 var kvinnor och 23 män, över 18 år. Acceptanstesterna baserades på hedoniska skalor på 9 poäng, enligt standarderna. Den hälsosamma degen fick 5 och 6 poäng på en hedonisk skala från 1 till 9 för parametrarna "Havssmak" respektive "Visuellt utseende" (Figur 6).

Figure 6

Figur 6: Resultat från sensoriska konsumentacceptanstester . (A) Det hedoniska valet för visuellt utseende, färg, konsistens, lukt, havssmak och övergripande smak. (B) Det hedoniska valet för övergripande uppskattning och köpavsikt. Skala 1-9, där 1 är en dålig utvärdering och 9 är en mycket bra utvärdering (n = 86). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Pastan fick 5 och 6 poäng på en hedonisk skala från 1 till 9 för parametrarna "Havssmak" respektive "Visuellt utseende" (Figur 6A). Denna pasta fick ett lågt värde på denna skala när det gäller texturparametern (med tanke på andra formuleringar som redan studerats), förmodligen för att basingrediensen är rismjöl; Trots detta erhöll den värden på en skala från 1 till 9, från 4 till 7, vilket återspeglar en god acceptans hos genomsnittskonsumenten. På en hedonisk skala från 1 till 9 hade pastan som vanligaste svar värdet 5 för köpavsikt och värdet 6 för total uppskattning, som visas i figur 6B. Det visade sig att cirka 65 % av provsmakarna valde ett svar som var lika med eller högre än poängen 6 för den övergripande bedömningen av denna pasta. Färgstabiliteten hos yoghurt med pigment utvärderades i 12 dagar vid -4 °C, och resultaten presenteras i figur 7.

Figure 7
Figur 7: Yoghurtens färgstabilitet. (vänster) Kontrollera yoghurt och (höger) yoghurt med Gracilaria gracilis pigment under 12 dagars lagring. Parametrarna a*, b* och L* är dimensionslösa. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Resultaten indikerar att parametrarna a* och b* var stabila över tid, medan L*-värdena visade högre varians. Lättheten visade högre värden efter 8 dagars lagring. Medan vissa skillnader hittades i ljushetsparametrarna, vilket indikerar att proverna var ljusare över tid, visade parametrarna rödhet (a*) och blå (b*) god stabilitet. Införlivandet av extrakten i yoghurt visade god färgbeständighet, med en ΔE på 7,01 ± 2,36 efter 12 dagars lagring. När det gäller den sensoriska utvärderingen av yoghurten identifierade 9 av 13 paneldeltagare korrekt rätt prov i triangeltestet, vilket tyder på att det fanns skillnader mellan yoghurtarna som möjliggjorde denna distinktion. De hedoniska testerna som gjordes på den semi-tränade panelen visade en god acceptans av produkten, vilket återspeglas i poäng över 7 (Figur 8). Läget för poängen för någon av de tre attributen som testades var 9, vilket ledde till poängmedelvärden över 8. Den bästa utvärderingen gjordes för färg, vilket återspeglar ett utmärkt godkännande av panelen, ett avslöjande resultat.

Figure 8
Figur 8: Resultat av den hedoniska sensoriska utvärderingen av yoghurten med Gracilaria gracilis-pigment. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Testerna av antimikrobiell aktivitet i flytande medium används för att utvärdera de antimikrobiella ämnenas effektivitet mot mikroorganismer suspenderade i flytande medium och utförs vanligtvis för att fastställa ett ämnes förmåga att hämma tillväxt eller döda mikroorganismer35,36,37,38. De används för att utvärdera mikroorganismers känslighet för antimikrobiella medel och utförs i provrör eller mikrotitreringsplattor, där olika koncentrationer av det antimikrobiella ämnet testas mot en standardiserad suspension av målmikroorganismen22. Den antimikrobiella aktiviteten bedöms genom mätning av mikrobiell tillväxt eller förekomst/frånvaro av grumlighet i odlingsmediet efter en korrekt inkubationstid.

Det finns flera tekniker och metoder för att utföra dessa tester, såsom buljongutspädningsmetoden, agardiffusionsmetoden (såsom skivdiffusionstestet) och buljongmikroutspädningsmetoden, som är en av de mest använda38. Några av de mest kritiska punkterna i dessa metoder är korrekt beredning av ympen, valet av odlingsmedium, kvaliteten på de antimikrobiella medel som används, standardiseringen av tekniken och effektiv kontamineringskontroll. Inokulatet, som är en standardiserad suspension av mikroorganismer, måste beredas korrekt för att säkerställa att resultaten är korrekta. Detta innebär ett lämpligt urval av mikrobiell odling, en korrekt odling av rena stammar, justering av cellkoncentrationen och standardisering av suspensionen för att erhålla en lämplig optisk densitet eller cellkoncentration.

Det odlingsmedium som används bör väljas med omsorg för att säkerställa att det ger idealiska tillväxtförhållanden för den mikroorganism som testas. Kemisk sammansättning, pH och andra faktorer kan påverka testresultaten. Det är viktigt att följa tillverkarens rekommendationer för beredning av odlingsmediet. Kvaliteten på de antimikrobiella medel som används som kontrollmedel är grundläggande, och det är viktigt att se till att de är rena, håller hållbarhetstiden och förvaras på rätt sätt. Märkning och utgångsdatum bör alltid konsulteras, enligt tillverkarens instruktioner. Standardiseringen av tekniken är också avgörande för att säkerställa resultatens noggrannhet. Detta inkluderar tillsats av de testade koncentrationerna till odlingsmediet, samt upprätthållande av aseptiska förhållanden under hela proceduren. Dessutom kan korskontaminering av mikroorganismer under testning leda till falska eller otillförlitliga resultat. Det är viktigt att följa strikta aseptiska rutiner under hela proceduren, från manipulation av inokulet till inkubation av rören eller plattorna. Användning av rena bänkskivor, korrekt pipetteringsteknik och korrekt bortskaffande av material är viktiga åtgärder för att undvika kontaminering.

Uppmärksamhet på detaljer och strikt efterlevnad av etablerade protokoll och riktlinjer är avgörande för att minimera fel och säkerställa tillförlitligheten hos resultaten i antimikrobiella aktivitetstester i ett flytande medium. Testerna för antimikrobiell aktivitet har också vissa begränsningar som bör beaktas37.

Faktorer som pH, temperatur, förekomst av blodkomponenter och interaktioner med immunsystemet beaktas inte i dessa tester, vilket kan begränsa möjligheten att förutsäga effektiviteten av ett antimikrobiellt medel i en levande organism. Testerna mäter också ett antimikrobiellt ämnes förmåga att hämma mikrobiell tillväxt eller döda mikroorganismer och ger inte detaljerad information om det antimikrobiella medlets verkningsmekanism eller dess selektivitet mot specifika mikroorganismer. Det finns begränsningar när det gäller att detektera resistens, eftersom de metoder som används kanske inte gör det möjligt att upptäcka eller förutsäga resistensutveckling över tid. Vissa mikroorganismer kan utveckla resistensmekanismer som svar på långvarig exponering för ett antimikrobiellt medel, och dessa förändringar kanske inte lätt kan upptäckas genom dessa tester. Tester av antimikrobiell aktivitet i ett flytande medium tar i allmänhet inte hänsyn till andra värdfaktorer som kan påverka ett antimikrobiellt medels effektivitet, t.ex. förekomsten av biofilm eller värdens immunsvar.

Det är viktigt att ta hänsyn till dessa begränsningar och att komplettera testningen av antimikrobiell aktivitet i flytande medier med andra metoder och tillvägagångssätt, t.ex. in vivo-studier , biofilmsmodeller och andra39. När det gäller bioprospektering efter bioaktiva makroalgföreningar kan tester av antimikrobiell aktivitet användas för att utvärdera den antimikrobiella potentialen hos algextrakt eller isolerade föreningar, och identifiera ämnen med antimikrobiell aktivitet mot specifika mikrobiella patogener, som kan ha tillämpningar inom områden som tillverkning av läkemedel, kosmetika, livsmedel eller jordbruksprodukter40.

Antioxidantaktivitetstester är metoder som används för att utvärdera förmågan hos en förening eller ett extrakt att neutralisera fria radikaler eller minska oxidativ stress. Dessa tester används i stor utsträckning inom antioxidantforskning, både i livsmedel och i naturliga produkter som alger, till exempel. Det finns flera metoder för att utvärdera antioxidantaktiviteten, och en av de vanligaste är absorptionsförmågan för fria radikaler. I detta test används en stabil fri radikal, 2,2-difenyl-1-pikrylhydrazyl (DPPH), för att utvärdera förmågan hos en förening att donera en elektron och neutralisera den fria radikalen. Antioxidantaktivitet mäts genom att minska den lila färgen på DPPH, vilket uppstår när antioxidantföreningen donerar en elektron till den fria radikalen. Andra metoder inkluderar syreradikalabsorptionskapacitet (ORAC), järnreduktionskapacitet (FRAP) eller fri radikalreduktionskapacitet (ABTS)41.

Kvantifiering av totala polyfenoler (QTP) är däremot inte en direkt metod för att bestämma antioxidantaktiviteten utan ger ett mått på den totala koncentrationen av polyfenoler i ett prov, även om flera störande ämnen kan påverka resultaten. Även om många polyfenoler är kända för att ha antioxidativa egenskaper, är antioxidantaktiviteten hos en förening relaterad till flera faktorer, såsom dess kemiska struktur, koncentration, förmåga att donera eller fånga fria radikaler och interaktioner med andra cellulära komponenter42. Den enkla kvantifieringen av totala polyfenoler kan inte ge en utvärdering av provets antioxidantaktivitet. Det är dock viktigt att notera att närvaron av polyfenoler i ett prov kan vara förknippad med en högre sannolikhet för antioxidantaktivitet eftersom många polyfenoler har antioxidativa egenskaper. Således kan QTP fungera som en preliminär indikator på närvaron av polyfenoler i provet, men bekräftelse av antioxidantaktivitet kräver antioxidantaktivitetsanalyser. Polyfenoler är en klass av kemiska föreningar som är utbredda i naturen och som finns i livsmedel, växter, frukter, grönsaker och alger. Det finns olika metoder för kvantifiering av totala polyfenoler, och Folin-Ciocalteu-metoden är en av de mest använda. QTP ger ett allmänt mått på koncentrationen av polyfenoler men specificerar inte de enskilda polyfenolföreningarna som finns i provet. Därför är det en kvantitativ men inte en kvalitativ metod. Dessutom är det viktigt att tänka på att olika polyfenoler har olika antioxidantkapacitet och biologiska aktiviteter, så QTP ger inte detaljerad information om de specifika funktionella egenskaperna hos de polyfenoler som finns.

Varje metod har sina fördelar och begränsningar, och valet av ett givet test beror på egenskaperna hos den förening som studeras och syftet med analysen. Det är viktigt att följa de specifika instruktionerna för varje metod för att säkerställa tillförlitliga och jämförbara resultat. Vid bestämning av antioxidantkapaciteten inkluderar några av de vanliga kritiska stegen för det första provberedningen. Det är viktigt att förbereda proverna på rätt sätt, se till att tillräckliga koncentrationer erhålls och undvika kontaminering. Detta innebär att föreningarna eller extrakten vägs exakt och löses upp i lämpliga lösningsmedel. Det är också viktigt att ta hänsyn till stabiliteten hos föreningarna och extrakten under berednings-, lagrings- och hanteringsprocessen. Alla reagenser som används i antioxidantaktivitetstesterna måste vara ordentligt preparerade och standardiserade för att säkerställa resultatens reproducerbarhet. Detta innebär korrekt beredning av gallussyrastandarden och noggrannheten i volymerna. Reaktionstid är en kritisk aspekt för att få korrekta resultat i antioxidanttester. Det är nödvändigt att optimera inkubationstiden för att säkerställa en fullständig reaktion mellan antioxidantföreningen och den fria radikalen. Otillräcklig tid kan leda till underskattning av antioxidantaktiviteten, medan överdriven tid kan resultera i nedbrytning av föreningarna eller störningar från sekundära reaktioner. Dessutom måste temperaturen under testerna kontrolleras noggrant och konsekvent. Temperaturen påverkar hastigheten på kemiska reaktioner och kan påverka resultaten. Det är viktigt att följa de temperaturförhållanden som rekommenderas av de specifika metoderna och säkerställa temperaturstabilitet under hela proceduren. Det är viktigt att inkludera lämpliga kontroller för att validera resultaten av antioxidanttester. Detta kan inkludera positiva kontroller (föreningar som är kända för att ha antioxidantaktivitet) och negativa kontroller (prover utan antioxidantaktivitet). Kontroller ger en grund för jämförelse för tolkning av resultat och hjälper till att säkerställa att de erhållna uppgifterna är korrekta. För att få tillförlitliga resultat rekommenderas att utföra tester av antioxidantaktivitet på replikat och upprepa experimentet flera gånger för att öka betydelsen av data och för att få mer tillförlitliga och robusta resultat.

Testmetoder för antioxidantaktivitet har vissa begränsningar som bör beaktas vid tolkning av resultaten, nämligen det faktum att de i flytande medier kanske inte helt fångar komplexiteten i biologiska system och interaktioner mellan olika föreningar, det breda utbudet av antioxidantreaktioner som kan uppstå, cellulär metabolism och miljöfaktorer som kan påverka antioxidantaktiviteten. Så olika tester bör användas. Man måste också vara medveten om bristen på direkt samband med hälsofördelar; Även om antioxidantaktivitet ofta är förknippad med hälsofördelar, översätts detta inte alltid direkt till hälsofördelar i levande organismer på grund av många andra faktorer, såsom biotillgänglighet, metabolism och interaktioner med andra biologiska system.

Det är viktigt att komma ihåg att antioxidantaktivitetstester är användbara verktyg för den första utvärderingen av antioxidantpotentialen hos föreningar och extrakt, men bör inte betraktas som en definitiv indikator på biologiska effekter eller hälsofördelar. Ytterligare studier behövs för att fullt ut förstå antioxidanternas inverkan på kroppen.

Även om metoderna för att testa antioxidantaktiviteten i flytande medium används i stor utsträckning inom forskning och har sina fördelar och begränsningar, jämfört med alternativen, kan dessa metoder anses vara bra när det gäller praktiskhet, hastighet, kostnad och enkel implementering. En av de största fördelarna är enkelheten och snabbheten i procedurerna och deras lämplighet för inledande forskning, sammansatt screening och storskaliga studier. Dessa metoder är relativt snabba att utföra och kan ge resultat på kort tid, på ett mer prisvärt sätt och kräver mindre specialiserad utrustning jämfört med andra metoder.

Alger är kända för sin förmåga att producera bioaktiva föreningar, inklusive antioxidanter, som kan ha fördelaktiga hälsoegenskaper43. Algextrakt kan framställas från olika delar av algerna och kan erhållas med hjälp av olika lösningsmedel, såsom vatten, etanol, metanol eller aceton, bland annat. Det är viktigt att komma ihåg att antioxidantaktiviteten hos algextrakt kan variera beroende på flera faktorer, såsom algart, extraktionsmetodik och koncentrationen av de bioaktiva föreningar som finns. Det rekommenderas därför att utföra antioxidantaktivitetstester på replikat och att utföra jämförelser med lämpliga kontroller för att få mer tillförlitliga resultat. Dessa metoder kan användas som ett första verktyg vid screening och urval av algextrakt med antioxidantpotential för vidare studier.

MTT-testet är en allmänt använd teknik för en preliminär utvärdering av cytotoxiska effekter in vitro av substanser för human- och djuranvändning. Men trots att det är den mest använda metoden för att testa cytotoxicitet, påverkas omvandlingen av MTT till formazankristaller av många faktorer som ämnesomsättning och antalet mitokondrier, och den är endast tillämplig på vidhäftande cellmål14. De viktigaste kritiska stegen i protokollet som beskrivs här är relaterade till den eventuella förekomsten av cellodlingskontaminering, oönskad HaCaT-cellers tillväxt och en låg andel cellsammanflöde. Det finns andra metoder, såsom laktatdehydrogenas (LDH), adenosintrifosfat (ATP) och kolonibildningsanalyser för att mäta cytotoxicitet. Men alla har fördelar och begränsningar. Ghasemi et al. (2021)44 utvärderade effekten av flera variabler på MTT-analysmätningarna på en prostatacancercellinje (PC-3). Faktorer som cellsåddstäthet, koncentration av MTT, inkubationstid efter MTT-tillsats, serumsvält, sammansättningen av cellodlingsmedia, frigjort intracellulärt innehåll och extrudering av formazan till det extracellulära utrymmet analyserades. Från denna studie beskrevs användbara rekommendationer om hur man tillämpar analysen och ett perspektiv på var analysens användbarhet är ett kraftfullt verktyg, men också var den har begränsningar, av dessa författare. Icke desto mindre är MTT-testet en snabb, mycket känslig och enkel metod som kan användas som en preliminär cytotoxicitetsbedömning av många ämnen med potentiell tillämpning inom terapi-, livsmedels-, foder-, jordbruks- och miljöområdena. I synnerhet visade den MTT-analys som utfördes här att etanol- och vattenextrakten från G. gracilis , i de analyserade koncentrationerna, inte påverkade keratinocyternas viabilitet och kan fortsätta med in vivo-analyser för att säkerställa att de är helt säkra för användning i humana hudar.

Användningen av marina resurser i livsmedelsprodukter har än en gång visat sin potential att inte bara få fram produkter med ett mervärde utan också att hitta renare produkter. Tillsatsen av hela G. gracilis (pasta) eller extrakt (som livsmedelsfärg) visar marknadspotential, och dess tillämpning kan vara en av strategierna för företag att sticka ut på marknaden, tillfredsställa konsumenternas näringsbehov och följa deras marknadstrender.

När tång tillsattes till pastaformuleringarna visade det sig först att strukturen förändrades och att det inte var möjligt att få de önskade degformarna. Vi hade utmaningen att justera mängderna och lägga till andra ingredienser som inte tidigare förutsetts, i syfte att bibehålla pastans konsistens. Förutom den lämpliga mängden av varje ingrediens anpassades extruderingsmetoden under hela utvecklingen av pastan. Bortsett från denna svårighet bygger utvecklingen av nya produkter på tre grundläggande principer: produkten måste vara sensoriskt tilltalande (konsistens, smak, lukt); Produkten måste ha ett tillsatt näringsvärde. Och den måste utnyttja hållbara ingredienser och metoder maximalt. I detta avseende är en annan stor utmaning användningen av den sensoriska panelen för att uppnå den mest tilltalande formuleringen. De flesta av de fysikalisk-kemiska analyserna som utfördes på pasta var redan optimerade för livsmedelsmatriser; I detta arbete optimerades dock provberedningen så att den effektivt kunde appliceras på alla analysmetoder.

När det gäller användningen av G. gracilis-pigment som färgämne valdes en kyld produkt på grund av den termiska känsligheten hos denna typ av molekyl45. Eftersom yoghurtberedning innebär termisk bearbetning tillsattes pigmentet till slutprodukten. Att blanda pigmentet i yoghurten resulterade i en produkt som var något mer flytande än kontrollen utan pigment. Faktum är att i slutet av triangeltestet kommenterade några paneldeltagare att den enda skillnaden mellan proverna var texturen. Detta är ett bra resultat eftersom huvudsyftet med triangeltestet var att verifiera om det fanns märkbara skillnader mellan yoghurt med och utan pigment, särskilt skillnader i smak och lukt, eftersom tångextrakt kan ge obehaglig smak/lukt till livsmedelsprodukter. Detta var en förstudie med en liten halvutbildad panel. I ytterligare studier bör ett större antal provsmakare övervägas för att uppnå mer tillförlitliga marknadsresultat. När det gäller utvärderingen av pigmentstabilitet i yoghurt kan ytterligare studier inkludera utvärdering av andra fysikalisk-kemiska egenskaper hos yoghurten med pigment över tid, såsom pH, vattenaktivitet (aw) och konsistens. Sensorisk utvärdering över tid skulle också vara önskvärd.

Sammanfattningsvis belyser de protokoll som beskrivs här potentialen hos den röda tången G. gracilis som en ingredienskälla för att utveckla nya produkter med potentiella tillämpningar inom läkemedels-, dermokosmetik- och livsmedelsindustrin. Dessutom är den efterextraherade restbiomassan fortfarande ett värdefullt material som ska appliceras som växttillväxtbiostimulant, jordberikning, fiskfoder eller råmaterial för att erhålla biokol och/eller funktionaliserat kol för vattenreningsändamål. Den bioraffinaderimetod som beskrivs här kan tillämpas på andra tångarter, vilket främjar en blå cirkulär ekonomi och miljömässig hållbarhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av den portugisiska stiftelsen för vetenskap och teknik (FCT) genom de strategiska projekt som beviljats MARE-Marine and Environmental Sciences Centre (UIDP/04292/2020 och UIDB/04292/2020) och Associate Laboratory ARNET (LA/P/0069/2020). FCT finansierade också de individuella doktorandstipendierna till Marta V. Freitas (UI/BD/150957/2021) och Tatiana Pereira (2021). 07791. BD). Detta arbete fick också ekonomiskt stöd genom projektet HP4A – HÄLSOSAM PASTA FÖR ALLA (sammarknadsföring nr 039952), som medfinansierades av Eruf – Europeiska regionala utvecklingsfonden, inom ramen för Portugal 2020-programmet, genom det operativa programmet COMPETE 2020 – konkurrenskraft och internationalisering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute Ethanol Aga, Portugal 64-17-5
Ammonium Chloride PanReac 12125-02-9
Amphotericin B Sigma-Aldrich 1397-89-3
Analytical scale balance Sartorius, TE124S 22105307
Bacillus subtilis subsp. spizizenii German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) DSM 347
Biotin Panreac AppliChem 58-85-5
Centrifuge Eppendorf, 5810R 5811JH490481
Chloramphenicol PanReac 56-75-7
CO2 Chamber Memmert N/A
Cool White Fluorescent Lamps OSRAM Lumilux Skywhite N/A
Densitometer McFarland Grant Instruments N/A
DMEM medium Sigma-Aldrich D5796
DMSO Sigma-Aldrich 67-68-5
DPPH Sigma, Steinheim, Germany 1898-66-4
Escherichia coli (DSM 5922) German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) DSM5922
Ethanol 96% AGA-Portugal 64-17-5
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA) J.T.Baker 6381-92-6
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Filter Paper (Whatman No.1) Whatman WHA1001320
Flasks VWR International, Alcabideche, Portugal  N/A
Folin-Ciocalteu VWR Chemicals 31360.264
Gallic Acid  Merck 149-91-7
Germanium (IV) Oxide, 99.999% AlfaAesar 1310-53-8
HaCaT cells – 300493 CLS-Cell Lines Services, Germany  300493
Hot Plate Magnetic Stirrer IKA, C-MAG HS7 06.090564
Iron Sulfate VWR Chemicals 10124-49-9
Laminar flow hood TelStar, Portugal 526013
LB Medium  VWR Chemicals J106
Listonella anguillarum German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)  DSM 21597
Manganese Chloride VWR Chemicals 7773.01.5
Micropipettes  Eppendorf, Portugal N/A
Microplates VWR International, Alcabideche, Portugal  10861-666
Microplates Greiner 738-0168
Microplates (sterile) Fisher Scientific 10022403
Microplate reader  Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA 1611151E
MTT Sigma-Aldrich 289-93-1
Muller-Hinton Broth (MHB) VWR Chemicals 90004-658
Oven Binder, FD115 12-04490
Oven Binder, BD115 04-62615
Penicillin Sigma-Aldrich 1406-05-9
pH meter Inolab  VWR International, Alcabideche, Portugal  15212099
Pippete tips Eppendorf, Portugal 5412307
Pyrex Bottles Media Storage  VWR International, Alcabideche, Portugal  16157-169
Rotary Evaporator Heidolph, Laborota 4000 80409287
Rotavapor IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal 07.524254
Sodium Carbonate (Na2CO3) Chem-Lab 497-19-8
Sodium Chloride (NaCl)  Normax Chem 7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic Riedel-de Haën 7558-79-4
SpectraMagic NX Konica Minolta, Japan color data analysis software
Spectrophotometer Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA 5A4T092004
Streptomycin Sigma-Aldrich 57-92-1
Thiamine Panreac AppliChem 59-43-8
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4049
Tryptic Soy Agar (TSA) VWR Chemicals ICNA091010617
Tryptic Soy Broth (TSB)  VWR Chemicals 22091
Ultrapure water  Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany F5HA17360B
Vacuum pump Buchi, Switzerland FIS05-402-103
Vitamin B12 Merck 68-19-9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Charoensiddhi, S., Abraham, R. E., Su, P., Zhang, W. Seaweed and seaweed-derived metabolites as prebiotics. Advances in Food and Nutrition Research. 91, 97-156 (2020).
  2. Roohinejad, S., Koubaa, M., Barba, F. J., Saljoughian, S., Amid, M., Greiner, R. Application of seaweeds to develop new food products with enhanced shelf-life, quality, and health-related beneficial properties. Food Research International. 99, 1066-1083 (2017).
  3. Hurd, C. L., Harrison, P. J., Bischof, K., Lobban, C. S. Seaweed Ecology and Physiology. (second). , Cambridge University Press, UK. (2014).
  4. Freitas, M. V., Mouga, T., Correia, A. P., Afonso, C., Baptista, T. New insights on the sporulation, germination, and nutritional profile of Gracilaria gracilis (Rhodophyta) grown under controlled conditions. Journal of Marine Science and Engineering. 9 (6), 562 (2021).
  5. Friedlander, M. Advances in cultivation of Gelidiales. Journal of Applied Phycology. 20 (5), 451-456 (2008).
  6. Matos, G. S., Pereira, S. G., Genisheva, Z. A., Gomes, A. M., Teixeira, J. A., Rocha, C. M. R. Advances in extraction methods to recover added-value compounds from seaweeds: Sustainability and functionality. Foods. 10, 516 (2021).
  7. Ummat, V., Sivagnanam, S. P., Rajauria, G., O'Donnell, C., Tiwari, B. K. Advances in pre-treatment techniques and green extraction technologies for bioactives from seaweeds. Trends in Food Science & Technology. 110, 90-106 (2021).
  8. Pérez, M. J., Falqué, E., Domínguez, H. Seaweed Antimicrobials, Present Status and Future Perspectives. Handbook of Algal Technologies andPhytochemicals:Volume I Food, Health and Nutraceutical Applications. Ravishankar, G., Ambati, R. R. , 1st ed, CRC Press, Boca Raton, Florida. (2019).
  9. Cavallo, R. A., Acquaviva, M. I., Stabili, L., Cecere, E., Petrocelli, A., Narracci, M. Antibacterial activity of marine macroalgae against fish pathogenic Vibrio species. Central European Journal of Biology. 8, 646-653 (2013).
  10. Shannon, E., Abu-Ghannam, N. Antibacterial derivatives of marine algae: An overview of pharmacological mechanisms and applications. Marine Drugs. 14 (4), 81 (2016).
  11. Capillo, G., et al. New insights into the culture method and antibacterial potential of Gracilaria gracilis. Marine Drugs. 16 (12), 492 (2018).
  12. Francavilla, M., Franchi, M., Monteleone, M., Caroppo, C. The red seaweed Gracilaria gracilis as a multi products source. Marine Drugs. 11 (10), 3754-3776 (2013).
  13. Sánchez-Ayora, H., Pérez-Jiménez, J. Antioxidant Capacity of Seaweeds: In Vitro and In Vivo Assessment. Marine Phenolic Compounds. Pérez-Correa, J. R., Mateos, R., Domínguez, R. , Elsevier. 299-341 (2023).
  14. Anil, S., Sweety, V. K., Vikas, B., Betsy-Joseph, B. Cytotoxicity and Cell Viability Assessment of Biomaterials. Cytotoxicity. , Intechopen. 111822 (2023).
  15. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  16. Roleda, M. Y., et al. Variations in polyphenol and heavy metal contents of wild-harvested and cultivated seaweed bulk biomass: Health risk assessment and implication for food applications. Food Control. 95, 121-134 (2019).
  17. Souza, K. D., et al. Gastronomy and the development of new food products: Technological prospection. International Journal of Gastronomy and Food Science. 33, 100769 (2023).
  18. Pereira, T., et al. Optimization of phycobiliprotein pigments extraction from red algae Gracilaria gracilis for substitution of synthetic food colorants. Food Chemistry. 321, 126688 (2020).
  19. Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. New England Seaweed Culture Handbook-Nursery Systems. Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. , Connecticut Sea Grant, University of Connecticut. (2014).
  20. Yong, Y. S., Yong, W. T. L., Anton, A. Analysis of formulae for determination of seaweed growth rate. Journal of Applied Phycology. 25 (6), 1831-1834 (2013).
  21. Patarra, R. F., Carreiro, A. S., Lloveras, A. A., Abreu, M. H., Buschmann, A. H., Neto, A. I. Effects of light, temperature and stocking density on Halopteris scoparia growth. Journal of Applied Phycology. 29 (1), 405-411 (2017).
  22. NCCLS, National Committee for Clinical Laboratory Standards, Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests: Approved Standard. 32, 11th ed, Wayne, PA, USA. M02-M11 (2012).
  23. Singleton, V. L., Rossi, J. A. J. Colorimetry to total phenolics with phosphomolybdic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
  24. Duan, X. J., Zhang, W. W., Li, X. M., Wang, B. G. Evaluation of antioxidant property of extract and fractions obtained from a red alga, Polysiphonia urceolata. Food Chemistry. 95 (1), 37-43 (2006).
  25. Freitas, R., et al. Highlighting the biological potential of the brown seaweed Fucus spiralis for skin applications. Antioxidants. 9 (7), 611 (2020).
  26. Duarte, A., et al. Seasonal study of the nutritional composition of unexploited and low commercial value fish species from the Portuguese coast. Food Science and Nutrition. 10 (10), 3368-3379 (2020).
  27. Folch, J., Lees, M., Stanley, G. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  28. ISO 6865. Animal feeding stuffs - Determination of crude fibre content - Method with intermediate filtration. Bureau of Indian Standards (BIS). , (2000).
  29. Fernández, A., Grienke, U., Soler-Vila, A., Guihéneuf, F., Stengel, D. B., Tasdemir, D. Seasonal and geographical variations in the biochemical composition of the blue mussel (Mytilus edulis L.) from Ireland. Food Chemistry. 177, 43-52 (2015).
  30. Pinto, F., et al. Annual variations in the mineral element content of five fish species from the Portuguese coast. Food Research International. 158, 111482 (2022).
  31. FAO. Food energy - methods of analysis and conversion factors. , FAO Food and Nutrition Paper 77 at https://www.fao.org/fileadmin/templates/food_composition/documents/book_abstracts/Food_energy.pdf (2003).
  32. Regulation (EU) Nr. 1169/2011 of the European Parliament and of the Council of 25 -10-2011. 25, https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/?uri=CELEX%3A32011R1169 (2011).
  33. Pathare, P. B., Opara, U. L., Al-Said, F. A. J. Colour measurement and analysis in fresh and processed foods: A review. Food and Bioprocess Technology. 6 (1), 36-60 (2013).
  34. ISO 4120. Sensory analysis - Methodology - Triangle test. International Standard. , https://www.iso.org/standard/33495.html (2004).
  35. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: A review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  36. Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
  37. Gajic, I., et al. Antimicrobial susceptibility testing: A comprehensive review of currently used methods. Antibiotics. 11 (4), 427 (2022).
  38. Gonzalez-Pastor, R., et al. Current landscape of methods to evaluate antimicrobial activity of natural extracts. Molecules. 28 (3), 1068 (2023).
  39. Li, J., et al. Antimicrobial activity and resistance: Influencing factors. Frontiers in Pharmacology. 13 (8), 364 (2017).
  40. Silva, A., et al. Macroalgae as a source of valuable antimicrobial compounds: Extraction and applications. Antibiotics. 9 (10), 642 (2020).
  41. Munteanu, I. G., Apetrei, C. Analytical methods used in determining antioxidant activity: A review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3380 (2021).
  42. Ma, S., et al. Comparison of common analytical methods for the quantification of total polyphenols and flavanols in fruit juices and ciders. Journal of Food Science. 84 (8), 2147-2158 (2019).
  43. Tziveleka, L. A., Tammam, M. A., Tzakou, O., Roussis, V., Ioannou, E. Metabolites with antioxidant activity from marine macroalgae. Antioxidants. 10 (9), 1431 (2021).
  44. Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
  45. Pereira, T., Barroso, S., Mendes, S., Gil, M. M. Stability, kinetics, and application study of phycobiliprotein pigments extracted from red algae Gracilaria gracilis. Journal of Food Science. 85 (10), 3400-3405 (2020).

Tags

Biologi utgåva 201
Valorisering av den röda <em>tången Gracilaria gracilis</em> genom en bioraffinaderimetod
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martins, A., Pinto, F. R., Barroso,… More

Martins, A., Pinto, F. R., Barroso, S., Pereira, T., Mouga, T., Afonso, C., Freitas, M. V., Pinteus, S., Pedrosa, R., Gil, M. M. Valorization of the Red Seaweed Gracilaria gracilis Through a Biorefinery Approach. J. Vis. Exp. (201), e65923, doi:10.3791/65923 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter