Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Повышение ценности красных морских водорослей Gracilaria gracilis с помощью биоперерабатывающего подхода

Published: November 21, 2023 doi: 10.3791/65923
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1, 1, 1
1MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, ESTM, Polytechnic University of Leiria, 2MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, Department of Life Sciences, University of Coimbra

Summary

Здесь мы опишем несколько протоколов, направленных на комплексную оценку Gracilaria gracilis: сбор дикорастущих видов, выращивание в домашних условиях и экстракция биологически активных ингредиентов. Оценивается антиоксидантное, антимикробное и цитотоксическое действие экстрактов, а также оценка питательности и стабильности пищи, обогащенной биомассой и пигментами цельных морских водорослей.

Abstract

Интерес к морским водорослям как к обильному исходному материалу для получения ценных и многоцелевых биологически активных ингредиентов постоянно растет. В этой работе мы исследуем потенциал Gracilaria gracilis, съедобных красных водорослей, культивируемых во всем мире из-за их коммерческого интереса в качестве источника агара и других ингредиентов для косметических, фармакологических, пищевых и кормовых применений.

Условия роста G. gracilis были оптимизированы за счет вегетативного размножения и спороношения при одновременном манипулировании физико-химическими условиями для достижения большого запаса биомассы. Методы «зеленой» экстракции с использованием этанола и воды были выполнены над биомассой морских водорослей. Биоактивный потенциал экстрактов оценивали с помощью комплекса анализов in vitro на предмет их цитотоксичности, антиоксидантных и антимикробных свойств. Кроме того, высушенная биомасса морских водорослей была включена в рецептуры макаронных изделий для повышения питательной ценности пищи. Пигменты, извлеченные из G. gracilis , также были включены в йогурт в качестве натурального красителя, и была оценена их стабильность. Оба продукта были представлены на суд полуобученной сенсорной комиссии, целью которой было достижение наилучшей конечной формулы до выхода на рынок.

Результаты подтверждают универсальность G. gracilis независимо от того, применяется ли он в виде целой биомассы, экстрактов и/или пигментов. Благодаря внедрению нескольких оптимизированных протоколов эта работа позволяет разрабатывать продукты, которые могут принести прибыль рынкам продуктов питания, косметики и аквакультуры, способствуя экологической устойчивости и «голубой» экономике замкнутого цикла.

Кроме того, в соответствии с подходом к биопереработке, остаточная биомасса морских водорослей будет использоваться в качестве биостимулятора для роста растений или преобразована в углеродные материалы, которые будут использоваться для очистки воды в собственных системах аквакультуры MARE-Polytechnic в Лейрии, Португалия.

Introduction

Морские водоросли можно рассматривать как интересное природное сырье для фармацевтической, пищевой, кормовой и экологической отраслей. Они биосинтезируют множество молекул, многие из которых не встречаются в наземных организмах, обладающих соответствующими биологическими свойствами 1,2. Тем не менее, для обеспечения большого запаса биомассы необходимо внедрить оптимизированные для морских водорослей протоколы выращивания.

Методы выращивания всегда должны учитывать природу слоевищ водорослей и общую морфологию. Gracilaria gracilis является клональным таксоном, что означает, что орган прикрепления производит несколько вегетативных осей. Таким образом, достигается размножение путем фрагментации (вегетативное размножение), так как каждая из этих осей полностью способна к самостоятельной жизни от основного слоевища3. Клональные таксоны могут быть успешно интегрированы с помощью простых и быстрых одноэтапных методологий культивирования, так как большое количество биомассы получается путем расщепления слоевища на мелкие фрагменты, которые быстро регенерируют и вырастают в новых, генетически идентичных особей. В этом процессе могут использоваться как гаплонтические, так и диплонтические слоевища. Несмотря на то, что род демонстрирует сложный гапло-диплонтический изоморфный трехфазный жизненный цикл, спороношение редко требуется, за исключением тех случаев, когда требуется генетическое обновление запасов для получения улучшенных урожаев. В этом случае как тетраспоры (гаплонтические споры, образующиеся мейозом), так и карпоспоры (диплонтические споры, образующиеся в результате митоза) дают начало макроскопическим слоевищам, которые затем могут быть выращены и размножаться путем вегетативного размножения4. Циклы роста диктуются условиями окружающей среды и физиологическим состоянием особей, а также другими биологическими факторами, такими как появление эпифитов и сцепление других организмов. Таким образом, оптимизация условий выращивания имеет решающее значение для обеспечения высокой продуктивности и производства высококачественной биомассы5.

Извлечение биологически активных соединений из морских водорослей, включая G. gracilis, может быть достигнуто различными методами 6,7. Выбор метода экстракции зависит от конкретных интересующих соединений, целевого применения и характеристик морских водорослей. В этом исследовании мы сосредоточились на жидкостной экстракции, которая включает в себя использование зеленых растворителей, таких как вода или этанол, для растворения и извлечения биологически активных соединений из биомассы морских водорослей. Экстракция может осуществляться с помощью мацерации универсальным и эффективным способом и может использоваться для широкого спектра соединений. Это простой и широко используемый метод, включающий замачивание биомассы в растворителе в течение длительного периода времени, как правило, при комнатной или слегка повышенной температуре. Растворитель перемешивают для усиления процесса экстракции. По истечении требуемого времени экстракции растворитель отделяется от твердого материала путем фильтрации или центрифугирования.

Вода является широко используемым растворителем в пищевой промышленности из-за ее безопасности, доступности и совместимости с широким спектром пищевых продуктов. Водная экстракция подходит для полярных соединений, таких как полисахариды, пептиды и некоторые фенольные соединения. Однако он не может эффективно извлекать неполярные соединения. Этанол также широко используется в качестве растворителя в пищевых продуктах и может быть эффективным для извлечения различных биологически активных молекул, включая фенольные соединения, флавоноиды и некоторые пигменты. Этанол в целом признан безопасным для использования в пищевых продуктах и может легко испаряться, оставляя после себя извлеченные соединения. Стоит отметить, что при выборе метода экстракции следует учитывать такие факторы, как эффективность, селективность, экономичность и воздействие на окружающую среду. Оптимизация параметров экстракции, таких как концентрация растворителя, время экстракции, температура и давление, имеет решающее значение для достижения оптимального выхода биологически активных соединений из G. gracilis или других морских водорослей.

Было обнаружено, что морские водоросли проявляют антимикробную активность в отношении широкого спектра микроорганизмов, включая бактерии, грибки и вирусы8. Эта активность объясняется биологически активными компонентами, включая фенольные соединения, полисахариды, пептиды и жирные кислоты. Несколько исследований продемонстрировали их эффективность против таких патогенов, как Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. и Pseudomonas aeruginosa, среди прочих9. Антимикробная активность морских водорослей объясняется присутствием биологически активных соединений, которые могут вмешиваться в микробные клеточные стенки, мембраны, ферменты и сигнальные пути10. Эти соединения могут нарушать рост микробов, ингибировать образование биопленки и модулировать иммунные реакции.

Красные водоросли, также известные как родофиты, представляют собой группу водорослей, которые могут проявлять антимикробную активность против различных микроорганизмов. В этой группе G. gracilis содержит различные биологически активные соединения, которые могут способствовать его антимикробной активности. В то время как конкретные молекулы могут варьироваться, общими классами, которые были зарегистрированы у G. gracilis и могут обладать антимикробными свойствами, являются полисахариды, фенолы, терпеноиды и пигменты11. Однако важно отметить, что наличие и количество этих компонентов может варьироваться в зависимости от таких факторов, как место сбора водорослей, сезонность, физиологическое состояние слоевища и условия окружающей среды. Таким образом, конкретный класс и концентрация антимикробных соединений в G. gracilis могут варьироваться соответствующим образом.

Также было обнаружено, что G. gracilis обладает антиоксидантными свойствами, содержа различные фенольные соединения, которые, как было показано, поглощают свободные радикалы и снижают окислительныйстресс.Антиоксиданты помогают защитить клетки от повреждений, вызванных активными формами кислорода, и имеют потенциальную пользу для здоровья. Антиоксидантная способность может быть оценена непосредственно с помощью различных методов, включая активность 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (ДФПГ) по удалению свободных радикалов и, косвенно, через количественное определение общего содержания полифенольных соединений (TPC)13.

Несмотря на то, что ингредиент, как сообщается, обладает выраженной биологической активностью, оценка его цитотоксичности необходима при оценке натуральных и синтетических веществ, используемых в контакте с живыми клетками или тканями. Существует несколько методов измерения цитотоксичности, каждый из которых имеет свои преимущества и ограничения. В целом, они предлагают ряд возможностей для оценки вредного воздействия многих веществ на клетки и, в то же время, для исследования механизмов поврежденияи гибели клеток.

В этой работе мы используем 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид (МТТ), колориметрический метод, введенный Мосманном (1983)15. Этот метод измеряет восстановление солей тетразолия до пурпурного формазана метаболически активными клетками. Чем выше количество кристаллов формазана, тем выше число жизнеспособных клеток, что обеспечивает косвенную меру цитотоксичности14. Поскольку в данной работе водные и этаноловые экстракты G. gracilis предназначены для включения в дермокосметические составы, оценка цитотоксичности in vitro проводится в клеточной линии кератиноцитов (HaCaT).

Что касается применения в пищу, морские водоросли, как правило, низкокалорийны и богаты питательными веществами пищевыми волокнами, незаменимыми элементами и аминокислотами, полисахаридами, полиненасыщенными жирными кислотами, полифенолами и витаминами 2,16. G. gracilis не является исключением, обладая интересной пищевой ценностью. Freitas et al. (2021)4 обнаружили, что культивируемый G. gracilis имеет более высокий уровень белка и витамина С и поддерживает уровень общих липидов по сравнению с дикими морскими водорослями. Это может представлять собой экономическое и экологическое преимущество, поскольку с точки зрения питания производство предпочтительнее, чем эксплуатация диких ресурсов. Кроме того, потребители все больше обеспокоены типом пищи, которую они едят, поэтому важно вводить новые ингредиенты для обогащения пищевых продуктов и использовать новые ресурсы для получения экстрактов, которые могут повысить ценность продукта и претендовать на «чистую этикетку». Кроме того, современный рынок характеризуется высокой конкуренцией, требующей разработки новых продуктов и инновационных стратегий, позволяющих дифференцировать производителей от их конкурентов17.

Обогащение продуктов с низкой питательной ценностью, таких как макаронные изделия, морскими ресурсами, в том числе морскими водорослями, является стратегией внедрения этого ресурса в качестве нового продукта питания и стратегии дифференциации рынка за счет продукта с определенной питательной ценностью. С другой стороны, G. gracilis является источником природных красных пигментов, таких как фикобилипротеины18, обладающие высоким потенциалом для применения в пищевой промышленности. Эта водоросль проявила большой интерес в нескольких областях, и ее применение может быть произведено с использованием целых водорослей, экстрактов и/или оставшейся биомассы. В данной работе мы демонстрируем некоторые примеры таких приложений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Заготовка и подготовка биомассы

  1. Собирайте образцы G. gracilis во время отлива и быстро транспортируйте их в лабораторию в темных, охлаждаемых боксах, чтобы избежать высыхания, воздействия света и воздуха.
  2. В лаборатории промойте каждое слоевище проточной морской водой и тщательно очистите, чтобы удалить с поверхности мусор, некротические части, эпифиты и другие организмы.
  3. Хранить дикую биомассу в постоянно аэрируемой морской воде (31-35 psu) в климатическом помещении (20 ± 1 °C) с низкой освещенностью, обеспечиваемой дневным светом, прохладными, белыми и люминесцентными лампами и фотопериодом, установленным на 16:08 (свет: темно) в течение 7 дней. В течение этого периода не поставляйте питательные среды; Это позволяет водорослям медленно приспосабливаться к новым условиям в помещении.

2. Поддержание складских запасов

  1. После периода акклиматизации стерильным лезвием срежьте здоровые кончики слоевищ морских водорослей. В соответствии с Redmond et al. (2014)19 и в стерильных условиях протащите каждый наконечник через агаровый гель, предварительно приготовленный в чашках Петри (1,0% бактериологический агар, в соотношении дистиллированная вода/морская вода 1:1), чтобы удалить все оставшиеся загрязнения. Выполняйте перетаскивание агара три раза для каждого наконечника и всегда протаскивайте наконечник через неиспользованные участки агарового геля.
  2. Кислоту моют стеклянную посуду в растворе соляной кислоты (HCl, 15%) и тщательно ополаскивают дистиллированной водой. Стерилизовать все инструменты, стеклянную посуду, агар, морскую воду и дистиллированную воду, используемые в процессе очистки, в автоклаве (121 °C, 15 мин).
    ВНИМАНИЕ: См. паспорт безопасности HCl, поставляемый поставщиком.
  3. По данным Redmond et al. (2014)19, кончики растут в стерилизованной морской воде при концентрации 35 psu, дополненной обогащенным раствором фон Стоша (VSE), модифицированным для красных водорослей. Добавьте диоксид германия (GeO2) в среду (1 мл/л) для предотвращения роста эпифитных диатомовых водорослей.
    ВНИМАНИЕ: Ознакомьтесь с паспортом безопасности GeO2 , поставляемым поставщиком.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кончики, которые показывают потерю пигментации, что наблюдается в виде частичного или полного обесцвечивания, находятся в состоянии стресса или уже мертвы, и их следует выбросить.

3. Выращивание и масштабирование

  1. После периода акклиматизации случайным образом распределить около 8-10 здоровых наконечников по 250 мл плоскодонных колб в климатическом помещении, установленном при температуре 20 ± 1 °С с белым холодным светом 20 ± 0,5 мкмоль фотонов м-2 с-1 (1500 люкс), фотопериодом 16 ч: 8 ч (светлый: темный) и стерильной морской водой, обогащенной питательными средами ВСЭ, обновляемой каждую неделю.
  2. Выполняйте еженедельные измерения веса, избегая чрезмерного напряжения слоевища20. Для этого аккуратно извлеките кончики из питательной среды, аккуратно промойте и взвесьте миллиграммы на лабораторных весах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эту процедуру можно проводить вместе с еженедельным обновлением питательной среды.
  3. Слоевища могут расти в этих колбах до плотности до 2 г/л. На этом этапе выполните увеличение масштаба реципиента (250 мл, 1 л и 5 л). Перенесите культивацию в открытые открытые белые емкости объемом 50 л и больше, когда объем достигнет 5 л.
  4. Рассчитать относительный темп роста (RGR) по Patarra et al. (2017)21 :
    RGR (% fw/день) = ([Ln (fw) - Ln (iw)]/t) x 100
    где iw и fw — начальный и конечный свежий вес соответственно, выраженный в граммах, а t — время в днях.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При такой лабораторной установке РВЖ достигает значений до 21% в день. Заготовка биомассы может быть произведена в любое время. Биомасса должна быть быстро переработана, чтобы предотвратить разложение, путем сушки в печи, сублимационной сушки или просто хранения в замороженном виде (-20 °C), в зависимости от предполагаемого использования. Высушенную биомассу можно консервировать при комнатной температуре (RT) или хранить в замороженном виде.

4. Процедура экстракции

ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки цитотоксичности, антиоксидантных и антимикробных свойств экстрактов G. gracils in vitro при его приготовлении учитывают два различных параметра: температуру экстракции и тип растворителя.

  1. Для проведения экстракции высушите биомассу G. gracilis в духовке и измельчите биомассу (например, в бытовой кофемолке) до тех пор, пока порошок не пройдет через сито 200 мкм.
  2. Взвесьте высушенную биомассу (10 г) и растворите ее в 100 мл растворителя (абсолютного этанола или стерильной воды).
  3. Перемешать в сосуде, защищенном от света, в течение 30 минут.
  4. Последовательная экстракция этанола > водой и водой > этанолом при RT, 40 °C и 70 °C.
  5. Для каждой температуры проводите экстракцию с этанолом и водой отдельно дважды.
  6. Жидкие экстракты отделяют от оставшейся биомассы фильтрацией через фильтровальную бумагу (ватман No 1) с последующим центрифугированием при 8000 х г в течение 10 мин при RT.
  7. Повторно используйте оставшуюся биомассу водорослей для дальнейшей экстракции другим растворителем. Если образец был сначала экстрагирован с помощью этанола, затем экстрагируйте его водой, и наоборот.
  8. Водные экстракты сублимировать и выпарить экстракты этанола во вращающемся испарителе при температуре 40 °C.
  9. Храните высушенные экстракты при температуре 4 °C.
  10. Растворяют экстракты в концентрации 50 мг/мл (антимикробные анализы) или 10 мг/мл (антиоксидантные анализы). Водные экстракты растворяют в стерильной воде, а этанольные экстракты — в абсолютном этаноле.

5. Антимикробная активность

ПРИМЕЧАНИЕ: Этанольные и водные экстракты должны быть протестированы по отдельности против Bacillus subtilis subsp . spizizenii (DSM 347), Escherichia coli (DSM 5922) и Listonella anguillarum (DSM 21597). Антимикробные испытания должны проводиться в соответствии с рекомендациями Национального комитета по клиническим лабораторным стандартам (NCCLS, 2012)22. Все культуры были получены из Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ). L. anguillarum выращивали на триптическом соевом бульоне (TSB) или триптическом соевом агаре (TSA) с добавлением 1% хлорида натрия (NaCl). Оставшиеся два штамма были выращены на среде LB (VWR Chemicals). Культуры Bacillus subtilis subsp . spizizenii (DSM 347) и Listonella anguillarum (DSM 21597) инкубировали при 30 °C, а Escherichia coli (DSM 5922) — при 37 °C, в соответствии с инструкциями поставщика. Метод микроразведения бульона может быть использован для определения антимикробной активности в жидкой среде, и это должно проводиться в микромасштабе, что позволяет быстро и эффективно определять антимикробный потенциал. Этот недорогой метод позволяет получить результаты всего за 24 часа, поэтому он подходит для определения на ранней стадии наилучших условий экстракции, которые позволяют для данного штамма микроорганизмов получить результаты с точки зрения ингибирующего роста действия. Однако методика требует использования стерильных микропланшетов с крышкой, специфичной для роста микроорганизмов, а также наличия считывателя микропланшетов для длины волны 600 нм.

  1. Проводят испытания микроразведения бульона с использованием необработанных и круглодонных 96-луночных микропланшетов со 170 мкл бульона Мюллера-Хинтона (MHB), инокулированных 10 мкл стандартизированного посевного материала (при стандарте 0,5 по Мак-Фарланду) и 20 мкл каждого экстракта (50 мг/мл).
  2. Выдерживают пластины в течение 24 ч при оптимальной температуре для каждого штамма.
  3. Определение антимикробной активности путем снижения видимой мутности, измеренного путем регистрации оптической плотности (OD 600) в микропланшетном спектрофотометре через 0 ч и 24 ч.
  4. Выразим результаты в процентах от торможения:
    Equation 1
    где Abs. ext - это разница в измеренной абсорбции между 0 ч и 24 ч в лунках, содержащих бактериальный штамм, растущий в присутствии экстракта, а Abs относится к той же мере в лунках, содержащих бактериальный штамм и растворитель.
  5. В этом методе включают контрольные реакции, при этом лунки содержат только питательную среду, которая будет отрицательным контролем, а также лунки со средой, выделенной стандартным штаммом, добавленным к растворителю (этанол или вода), и средой с бактериальным штаммом и положительным контрольным антибиотиком (левомицетин).

6. Антиоксидантная активность и количественное определение общих полифенолов

  1. Общее содержание полифенольных соединений
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общее содержание полифенольных соединений (TPC) проводят с помощью метода Фолина-Чокальтеу23 и адаптировали к микромасштабу.
    1. Добавьте в каждую лунку 96-луночного микропланшета, защищенного от света, 158 мкл сверхчистой воды, 2 мкл образца и 10 мкл реактива Фолина-Чокальтеу.
      ВНИМАНИЕ: Ознакомьтесь с паспортом безопасности реагента Фолина-Чокальтеу, поставляемого поставщиком.
    2. Через 2 мин добавляют 30 мклNa2CO3 (20%).
    3. После инкубации в темноте при РТ в течение 1 ч измеряют образцы спектрофотометрически при длине волны 755 нм.
    4. Используйте галловую кислоту (которая позволяет построить калибровочную кривую) или сверхчистую воду (2 мкл) в качестве контроля.
    5. Выразите результаты в эквивалентах галловой кислоты (мг GAE/г экстракта).
  2. 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (ДФПГ) радикальная поглощающая активность
    ПРИМЕЧАНИЕ: Антиоксидантная активность экстрактов оценивается в соответствии с описанием Duan et al. (2006)24, адаптированным к микромасштабу
    1. В 96-луночный микропланшет, защищенный от света, помещают по 2 мкл каждого образца (в концентрации 10 мг/мл) и 198 мкл DPPH, растворенного в абсолютном этаноле (0,1 мМ).
      ВНИМАНИЕ: См. паспорт безопасности DPPH, поставляемый поставщиком.
    2. Запустите реакцию в течение 30 минут на RT в темноте. Измерьте поглощение на длине волны 517 нм в микропланшетном спектрофотометре.
    3. Проведите контрольную реакцию с 2 мкл абсолютного этанола/дистиллированной воды и 198 мкл раствора DPPH. Выполните холостое измерение с 2 мкл экстракта и 198 мкл абсолютного этанола.
    4. Выразите результаты в процентах ингибирования ДФПГ, используя следующее уравнение:
      Equation 2
      где As - абсорбция экстракта водорослей, Ab - поглощение пустых образцов и Ac - поглощение контроля.

7. Оценка цитотоксичности в клетках эпидермиса

ПРИМЕЧАНИЕ: Цитотоксический эффект in vitro водного и этанолового экстрактов G. gracilis оценивают в кератиноцитах человека (клетки HaCaT - 300493) с помощью колориметрического анализа МТТ, как описано ранее25. Ячейки были получены от Cell Lines Services, Германия (CLS), и метод был выполнен в соответствии с институциональными рекомендациями и инструкциями CLS.
ВНИМАНИЕ: См. паспорт безопасности MTT, поставляемый поставщиком.

  1. Поддержание клеточных культур
    1. Культивирование клеток HaCaT в модифицированной среде с высоким содержанием глюкозы (DMEM) Dulbecco с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% раствора антибиотика/антимикотика (амфотерицин B, 0,25 мМ; пенициллин, 60 мМ; стрептомицин, 100 мМ).
    2. Используйте трипсин-ЭДТА для диссоциации клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Субкультивирование клеток HaCaT осуществляется после того, как клетки достигают полного слияния.
    3. Культивирование клеток в камере при температуре 37 °C с содержаниемCO2 5% и влажностью 95%.
    4. Субкультивирование клеток в соответствии с инструкциями биобанка всякий раз, когда культуры достигают 80%-85% слияния.
  2. Оценка цитотоксичности
    1. После посева клеток в 96-луночные планшеты и инкубации в течение ночи обработать клетки HaCaT (4 x 104 клеток/лунку) высушенными экстрактами, предварительно растворенными в ДМСО (100 мг/мл). Затем добавляют 2 мкл раствора экстракта к 198 мкл среды и инкубируют планшеты в течение 24 ч.
    2. Извлеките питательную среду и добавьте 100 мкл МТТ (0,5 мг/мл) к клеткам. Инкубируют клетки в течение 30 мин в темноте при обычных условиях культивирования, упомянутых выше.
    3. Раствор МТТ удалить и растворить внутриклеточные кристаллы формазана со 100 мкл ДМСО.
    4. Измерьте поглощение при длине волны 570 нм с помощью микропланшетного ридера. Выразите результаты в процентах от контрольных необработанных клеток.

8. Инновации в пищевой промышленности

  1. Новый пищевой продукт: Паста с морскими водорослями
    1. Выбор ингредиентов и рецептуры макаронных изделий
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор ингредиентов был сделан в сотрудничестве с компанией по производству макаронных изделий. Выбор ключевых ингредиентов (описанных в разделе 8.2) был сделан с учетом их легкой доступности и совместимости с существующими производственными линиями, использованием морских ресурсов для получения макаронных изделий с добавленной питательной ценностью.
      1. После выбора ингредиентов разработайте рецептуру в соответствии с предполагаемой питательной ценностью (источник клетчатки, витаминов и минеральных элементов, низкое содержание насыщенных жиров), проанализировав теоретический химический состав состава с помощью электронной таблицы.
      2. Когда теоретические требования будут выполнены, приступайте к лабораторному производству, как описано в шаге 8.1.2.
      3. Проведите органолептический тест с полуобученной группой (>10 дегустаторов), чтобы подтвердить необходимость изменения рецептуры или приемлемости рецептуры для следующих этапов.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Группа ранее была обучена дегустации макаронных изделий и гедонистически оценивала представленные рецептуры в отношении таких атрибутов, как аромат, вкус, запах, текстура и внешний вид.
    2. Производство макаронных изделий
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изготовьте образцы макаронных изделий Chifferi с помощью экструдера для макаронных изделий.
      1. В оборудовании смешайте предварительно определенные порции рисовой муки, G. gracilis, и Chlorella vulgaris и добавьте в смесь около 30% воды.
      2. Для получения сухих макаронных изделий высушите чиффери при 68 °C в течение 42 мин, а затем 5 ч, 30 мин при 76 °C, имитируя промышленный процесс.
      3. Наконец, упакуйте и запечатайте образцы в вакууме и храните их в темном месте в RT до дальнейшего анализа.
    3. Анализ питательной ценности
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа профиля питательной ценности используйте высушенные и мацерированные образцы в трех экземплярах.
      1. Содержание сырого протеина: Проведите анализ общего белка с помощью метода Кьельдаля , адаптированного из Duarte et al. (2022)26, выполнив шаги 8.1.3.2-8.1.3.6.
      2. Точно взвесьте 1,0 г образца (или дистиллированной воды для бланкового анализа) и смешайте с двумя таблетками Кьельдаля и 25 млH2SO4 в пробирках для сбраживания.
        ВНИМАНИЕ: Ознакомьтесь с паспортом безопасности H2SO4 , поставляемым поставщиком.
      3. Проводят разложение образцов в дигесторе по Кьельдалю при 220 °C в течение 30 мин, а затем 90 мин при 400 °C.
      4. После охлаждения до RT добавляют 80 мл дистиллированной воды и перегоняют сформированный аммиак в 30 мл 4%-ного раствораH3BO3, содержащего бромкрезол зеленый и метиловый красный. Этот этап проходит в щелочных условиях (дистилляция с 40% NaOH с использованием дистиллятора Кьельдаля).
        ВНИМАНИЕ: См. паспорт безопасности раствора H 3 BO3,содержащего бромкрезол зеленый, метиловый красный и 40% NaOH, поставляемого поставщиком.
      5. Титруют дистиллированные образцы HCl 0,1 М до тех пор, пока не будет наблюдаться изменение цвета на серовато-розовый.
      6. Рассчитайте содержание сырого протеина, представленное содержанием азота в образце, и выразите его в г на 100 г по следующему уравнению:
        Equation 3
        где Vs соответствует объему HCl (мл), используемому при титровании образца; Vb соответствует объему, используемому в заготовке; N соответствует нормальности HCl; w соответствует весу образца (g).
      7. Общее содержание жира: Определите общее содержание жира с помощью метода Фолча, адаптированного из Folch et al. (1957)27, выполнив шаги 8.1.3.8-8.1.3.14.
      8. Приготовьте реактив Folch, смешав CHCl3 и MeOH в пропорции 2:1 (v:v).
        ВНИМАНИЕ: См. Паспорт безопасности реагента Folch, поставляемого поставщиком.
      9. К пробиркам, содержащим 1 г аликвот образцов, добавляют 5 мл реактива Фолч и 0,8 мл дистиллированной воды. Перемешивайте в вихревом в течение 1 мин.
      10. Затем добавьте еще 5 мл реагента Folch и гомогенизируйте в течение 5 мин. Добавьте 1,2 мл 0,8% раствора NaCl и гомогенизируйте в течение 2 мин.
      11. Центрифугируют образцы при 7000 х г в течение 10 мин. Органическую фазу (нижнюю фазу) фильтруют через гидрофильную вату и безводный сульфат натрия в стеклянную колбу с круглым дном.
      12. Чтобы избежать потери образца, повторите этапы добавления 5 мл CHCl3, гомогенизации, центрифугирования и фильтрации в тех же условиях.
      13. Органический растворитель удалить из собранных органических фаз путем выпаривания под низким давлением и оставить в духовке при 105 °C на 4 часа. Охладите образцы в эксикаторе.
      14. Рассчитайте содержание жира, выраженное в г на 100 г, используя следующее уравнение:
        Equation 4
        гдеW1 – пустая круглодонная стеклянная колба; W2 — начальный вес образца; W3 — круглодонная стеклянная колба с массой образца.
      15. Содержание сырой клетчатки: Определите содержание сырой клетчатки с помощью методологии, адаптированной из ISO 6865 (2000)28, выполнив шаги 8.1.3.16-8.1.3.22.
      16. Взвесьте 1 г образца (W0) в стеклянный тигель с фильтрующим дном (ссылка P2) и поместите его в анализатор волокон.
      17. Первый этап - кислотный гидролиз: добавьте 150 мл предварительно нагретого 1,25%H2SO4 и 2 мл пеногасителя (n-октанола) в колонку каждого тигля; Нагреть до закипания и держать 30 мин.
      18. После удаления этого растворителя трижды промыть деионизированной водой, чтобы приступить к основному гидролизу. Добавьте 150 мл предварительно подогретого 1,25% NaOH и 5 мл пеногасителя в безжидкостную колонку и выполните ту же процедуру нагрева, что и для кислотного гидролиза.
      19. Наконец, сделайте тройную стирку со 150 мл ацетона для холодного отжима.
      20. После этого процесса осторожно извлеките тигли из системы и поместите их в духовку при температуре 150 °C на 1 час. Запишите окончательный вес (W1).
      21. Поместите тигли в муфельную печь при температуре 500 °C на 3 ч, а затем запишите окончательный вес (W2).
      22. Рассчитайте содержание сырой клетчатки и выразите результаты в процентах, используя следующее уравнение:
        % сырой клетчатки = 100 x (W1-W2)/W0
      23. Профиль жирных кислот (ЖК): Определите профиль жирных кислот в соответствии с Fernández et al.(2015)29, выполнив шаги 8.1.3.24-8.1.3.29.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Метиловые эфиры жирных кислот (FAME) получают путем прямого кислотно-катализируемого трансметилирования измельченных лиофилизированных образцов. Все анализы проводятся в трех экземплярах.
      24. Добавьте 2 мл 2% (v/v) раствораH2SO4 в метаноле к образцу 50 мг и залейте смесь при 80 °C в течение 2 ч при непрерывном перемешивании.
        ВНИМАНИЕ: См. паспорт безопасности метанола, поставляемого поставщиком.
      25. После охлаждения до RT добавляют 1 мл сверхчистой воды и 2 мл н-гептана в каждый образец, перемешивают смесь в течение 1 мин и центрифугируют в течение 5 мин.
        ВНИМАНИЕ: См. паспорт безопасности н-гептана, поставляемый поставщиком.
      26. Восстановите верхнюю фазу н-гептана (органическую), содержащую FAMEs, и перенесите ее во флаконы для газовой хроматографии (ГХ).
      27. Анализ проводится в газовом хроматографе, оснащенном капиллярной колонкой TR-FAME (внутренний диаметр 60 м × 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм), автосамплером и пламенно-ионизационным детектором (FID).
      28. Установите инжектор (безраздельный режим) на 250 °C, а детектор на 280 °C. Установите начальную температуру колонны на 75 °C и держите 1 минуту. Затем поднять при 5 °C/мин до 170 °C и выдержать 10 мин. Затем поднять при 5 °С/мин до 190 °С и подержать еще 10 мин. Наконец, поднимите при 2 °C/мин до 240 °C и держите 10 мин. Используйте гелий в качестве газа-носителя со скоростью потока 1,5 мл/мин. Подача воздуха и водорода со скоростью потока 350 и 35 мл/мин соответственно.
      29. Определите профиль ЖК, сравнив полученное время удержания со стандартом, и выразите результаты в процентах от общего количества жира.
      30. Профиль минеральных элементов: Определите минеральные элементы (Ca, P, Mg, Na, K, Fe, Cu, Mn, Zn), проанализированные с помощью ICP-OES, в соответствии с методом, адаптированным из Pinto et al. (2022)30, выполнив шаги 8.1.3.31-8.1.3.34.
      31. Точно взвесьте около 0,4 г каждого сухого образца и добавьте 7,5 мл HNO3 и 2,5 мл HCl.
        ВНИМАНИЕ: См. паспорт безопасности HNO3 и HCl, предоставленный поставщиком.
      32. Разложение происходит в два этапа: повышение температуры от RT до 90 °C в течение 30 минут (и поддержание этой температуры еще 30 минут), а затем 60 минут при 105 °C.
      33. Растворы для образцов охладить, разбавить их до 25 мл, отфильтровать и хранить в пробирках с этикетками. В каждом разложении выполняйте один и тот же процесс с эталонным материалом и заготовкой. Получение концентрации различных элементов с помощью ИСП-ОЭС.
      34. Выражают результаты в мг на 100 г фв.
      35. Содержание углеводов: Рассчитайте содержание углеводов, выполнив шаги 8.1.3.36-8.1.3.37.
      36. Рассчитайте содержание доступных углеводов (без клетчатки) по разности ранее определенных коэффициентов на 100 г, используя следующее уравнение, согласно Продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН (FAO; 2003)31
        Equation 5
      37. Выразите результаты в г на 100 г.
      38. Влажность и зольность: Оцените содержание влаги и золы, выполнив шаги 8.1.3.39-8.1.3.45.
      39. Фарфоровые тигли инкубируют в течение 3 ч при 105 °С, охлаждают их в эксикаторе и взвешивают.
      40. Взвесьте 10 г образца в тигле и поместите его в сушильный шкаф при температуре 105 °C на 3 цикла до тех пор, пока значения последовательных взвешиваний не будут отличаться более чем на 10 мг.
      41. Рассчитайте содержание влаги, выраженное в г на 100 г fw, используя следующее уравнение:
        Equation 6
        гдеW1 — вес пустого тигля,W2 — вес тигля со свежим образцом,W3 — вес тигля с высушенным образцом.
      42. После определения содержания влаги тигли с высушенными образцами помещают в печь для сжигания при температуре 525 °Cна 4 ч.
      43. Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока последующие взвешивания не будут отличаться более чем на 1 мг.
      44. Охладите образцы до RT в эксикаторе, а затем взвесьте их.
      45. Рассчитайте зольность, выраженную в г на 100 г fw, используя следующее уравнение:
        Equation 7
        гдеW1 — вес пустого тигля,W2 — вес тигля со свежим образцом,W3 — вес тигля с весом.
      46. Энергетическая ценность: Рассчитайте энергетическую ценность, выполнив шаги 8.1.3.47-8.1.3.48.
      47. Рассчитайте энергетическую ценность образцов в соответствии с регламентом ЕС:Предоставление информации о пищевых продуктах потребителям (Регламент 1169/2011)32, используя уравнения:
        Энергетическая ценность (ккал / 100 г) = 4 х (г белков) + 4 х (г углеводов) + 9 х (г жиров) + 2 х (г клетчатки)
        Энергетическая ценность (кДж / 100 г) = 17 x (г белков) + 17 x (г углеводов) + 37 x (г жиров) + 8 x (г клетчатки)
      48. Выразите результаты в килокалориях на 100 г и килоджоулях на 100 г.
    4. Принятие потребителями
      1. Оцените потребительскую приемлемость с помощью образцов макаронных изделий, приготовленных в дистиллированной воде в течение 8 минут.
      2. Проведите потребительские приемочные испытания: оцените внешний вид, цвет, текстуру, запах, морской вкус, общий вкус, общую оценку и намерение покупки образцов.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Потребительский тест основан на гедонистических тестах, оценивающих внешний вид, цвет, текстуру, запах, морской вкус, общий вкус, общую оценку и намерение совершить покупку по шкале от 1 до 9, где 1 - плохая оценка, а 9 - очень хорошая оценка.
      3. Проводите сенсорные тесты в отдельных сенсорных кабинах в лаборатории сенсорного анализа (с контролем температуры и освещения). Обеспечьте столовые приборы, салфетки и стеклянные чашки с минеральной водой, чтобы очистить нёбо между образцами.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Дегустаторы в возрасте от 16 до 64 лет из всех слоев общества (n > 80).
  2. Йогурт
    1. Экстракция пигмента
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте экстракцию пигмента с помощью метода, описанного в Pereira et al. (2020)18.
      1. Приготовьте растворитель для экстракции, натрий-фосфатный буфер при 0,1 М, с двухосновным (0,03 М) фосфатом натрия (0,03 М) и одноосновным фосфатом натрия (0,07 М). Установите рН на уровне рН 6,8 с помощью NaOH или HCl.
      2. Взвесьте 1 г G. gracilis и добавьте 50 мл натрий-фосфатного буфера (pH 6,8). Гомогенизируйте в течение 10 минут, затем 10 минут мацерации в ступке и пестике.
      3. Переложите раствор в пробирку и центрифугу на 20 мин при 12,298 x g (4 °C).
      4. Смешайте надосадочную жидкость и медленно добавьте 65% сульфата аммония. Когда весь сульфат аммония растворится, накройте раствор алюминиевым листом и оставьте осаждаться при температуре 4 °C на ночь.
        ВНИМАНИЕ: См. паспорт безопасности сульфата аммония, поставляемый поставщиком.
      5. Центрифугируют осадок в течение 20 мин при 12,298 x g (4 °C). Извлеките гранулу и растворите в дистиллированной воде (примерно 5 мл).
      6. Проводят диализ экстракта с помощью трубчатой мембраны (14 кДа) против воды в течение 24 ч с последующей сублимационной сушкой. Храните лиофилизированный экстракт в защищенном от света месте при температуре 4 °C до использования.
    2. Приготовление йогурта
      1. Приготовьте натуральный йогурт, смешав 1 л пастеризованного молока, 120 г натурального йогурта, 20 г сахара и 50 г сухого молока в термомиксере в течение 5 мин, 50 °C, скорость 3.
      2. Поместите смесь в банку-термомиксер в инкубатор при температуре 37 °C на 12 ч.
      3. Добавьте экстракт, смешав его с йогуртом в концентрации 0,21%. Хранят образцы в отдельных стеклянных колбах при температуре 4 °C до проведения анализа.
      4. Отдельные порции йогурта без пигмента (контроль) хранить при температуре 4 °C до анализа.
    3. Стабильность цвета
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените стабильность пигмента в йогуртах с помощью анализа цвета в течение 12 дней. Выполните анализ цвета с помощью колориметра отражения, стандартного наблюдателя с температурой 2 градуса и источника света D65. Результаты представлены в виде координат CIELab с параметрами L (яркость, черно-белый, 0 - 100), a* (зеленый - красный, -60 - 60) и b* (синий - желтый, -60 - 60). Параметр a* имеет положительные значения для красноватых цветов и отрицательные значения для зеленоватых цветов. Параметр b* принимает положительные значения для желтоватых цветов и отрицательные значения для голубоватых. L* — параметр яркости, которая является свойством, согласно которому каждый цвет может считаться эквивалентным элементу оттенков серого между черным и белым33.
      1. Откалибруйте колориметр с помощью белой керамической пластины (L* 88,5, a* 0,32, b* 0,33), предоставленной производителем.
      2. Заполните ячейку примерно 28 г образца (или контрольной группы) и проанализируйте цвет с помощью программного обеспечения для анализа цветовых данных.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа цветовых данных использовалось программное обеспечение SpectraMagic NX.
      3. Выполните показания 5 раз в образцах/контрольных тройках.
    4. Органолептический анализ
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите органолептическую оценку йогуртов с включением пигмента с помощью треугольного теста (ISO 4120, 2004)34 и гедонистической оценки цвета, вкуса и общей оценки.
      1. Для треугольного теста дайте участникам дискуссии три образца (один образец йогурта с пигментом и два образца контроля или два образца йогурта с пигментом и один контроль) и попросите их выбрать другой образец в зависимости от аромата, текстуры и вкуса. Предоставьте образцы в аналогичных объемах, идентифицированных случайными 3-значными кодами.
      2. Для гедонистической оценки йогурта с пигментом дайте участникам дискуссии образец йогурта с пигментом и попросите их оценить цвет, вкус и общую оценку по 9-балльной гедонистической шкале (от крайне неприязни до крайней симпатии).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Антимикробная активность

При интерпретации полученных результатов следует иметь в виду, что чем выше процент ингибирования, тем больше эффективность экстракта в ингибировании роста данного конкретного штамма и, следовательно, тем интереснее экстракт как антимикробное средство. С помощью этой методологии мы можем быстро определить, какие экстракты обладают большей активностью в отношении определенных бактериальных штаммов, а также определить наиболее интересные с точки зрения будущего использования. Таким образом, мы можем получить отправную точку для дальнейших исследований того же самого экстракта.

На рисунке 1 показаны результаты, полученные с водными экстрактами, как в первой, так и во второй экстракции, сразу после сушки биомассы (Рисунок 1A) и в третьей и четвертой экстракциях (Рисунок 1B), полученных после этанольной экстракции, таким образом, используя биомассу целиком. Мы видим, что наиболее интересные результаты, соответствующие третьей и четвертой водным экстракциям, показывают более высокую антимикробную активность, особенно в экстрактах, полученных при 70 °C. Концентрация экстракта в лунках составляет 5 мг/мл.

Figure 1
Рисунок 1: Ингибирование роста бактерий в присутствии водных экстрактов G. gracilis. Ингибирование роста 3 видов бактерий (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Listonella anguillarum) после 24 ч роста в жидкой среде, в присутствии водных экстрактов (Aq) G. gracilis, полученных при различных температурах, комнатной температуре (RT), 40 °C (40) и 70 °C (70). Положительный контроль проводили хлорамфениколом (CHL), а результаты выражали в виде средних значений (n = 8). Данные относятся к 4 последовательным этапам экстракции (1-й, 2-й,3-й,4-й). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Этанольные экстракты, по-видимому, особенно эффективны в подавлении роста L. anguillarum, как показано на рисунке 2. Здесь показаны результаты, полученные с этанольными экстрактами, а также в первой и второй экстракциях (Рисунок 2A) и третьей и четвертой экстракциях (Рисунок 2B), полученных после первой водной экстракции.

Figure 2
Рисунок 2: Ингибирование роста бактериальных видов в присутствии этанольных экстрактов G. gracilis. Ингибирование роста 3 видов бактерий (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Listonella anguillarum) после 24 ч роста, в жидкой среде, в присутствии этанольных экстрактов (Et) G. gracilis, полученных при различных температурах, комнатной температуре (RT), 40 °C (40) и 70 °C (70). Положительный контроль проводили с использованием левомицетина (ХЛ), а результаты выражали в виде средних значений (n = 8). Данные относятся к 4 последовательным этапам экстракции (1-й, 2-й,3-й,4-й). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Антиоксидантная активность

Что касается результатов, которые подчеркивают антиоксидантный потенциал различных экстрактов, а именно в тесте DPPH, результаты, выраженные на рисунке 3 , показывают, что температура 40 °C была наиболее эффективной, что привело к более высоким значениям ингибирования окислительной активности, чем те, которые наблюдались в экстрактах, полученных при RT или 70 °C. Это справедливо для образцов G. gracilis , и могут быть большие вариации в зависимости от используемых образцов и условий роста водорослей. Таким образом, рекомендуется проводить испытания для выявления наилучших условий для каждого конкретного типа образца.

Figure 3
Рисунок 3: Ингибирование радикала ДФПГ (%) в присутствии экстрактов, полученных при различных температурах. Экстракты получали путем этанольной (Et) или водной (Aq) экстракции. 1-й и2-й отборы производили из сухой биомассы последовательно. Остальные (3-й и4-й) были изготовлены из биомассы, предварительно экстрагированной альтернативным растворителем. RT означает комнатную температуру; 40, экстракт, полученный при 40 °С; и 70, экстракт, полученный при 70 °C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Аналогичные результаты были получены и при количественном определении общего содержания полифенолов (рис. 4), при этом температура 40 °C считается лучшей с точки зрения экстракции антиоксидантных соединений. Это показывает, что антиоксидантная активность, по-видимому, коррелирует с фенольными компонентами, присутствующими в экстрактах.

Figure 4
Рисунок 4: Количественное определение общего содержания полифенолов (ТПК) в экстрактах, полученных при различных температурах. Экстракты получали методом этанольной (Et) или водной (Aq) экстракции, где 1-я и 2-я экстракция производились последовательно из сухих водорослей, а остальные (3-я и 4-я) были получены из биомассы, предварительно экстрагированной другим растворителем. RT означает комнатную температуру; 40, экстракт, полученный при 40 °С; и 70, экстракт, полученный при 70 °C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Цитотоксичность в клетках HaCat

Первым шагом для оценки безопасности косметических ингредиентов является изучение их цитотоксичности in vitro в эпидермальных и дермальных клеточных линиях. Как видно на рисунке 5, цитотоксического воздействия на кератиноциты (HaCaT-клетки) не наблюдалось, что позволяет предположить, что при максимальной концентрации (1 мг/мл) как водные, так и этаноловые экстракты безопасны для накожного применения.

Figure 5
Рисунок 5: Цитотоксическое действие экстрактов Gracilaria gracilis (1 мг/мл) на клетки HaCaT после 24 ч обработки. Значения в каждом столбце выражаются как среднее значение ± стандартная ошибка среднего значения (SEM) трех независимых экспериментов в трех экземплярах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Инновации в пищевой промышленности

Окончательные рецептуры макаронных изделий были получены после многочисленных испытаний между теоретической рецептурой и органолептическим тестированием полуобученной группой. После этого был получен доступ к химическим характеристикам, включая оценку питательной ценности, жирных кислот и минеральных элементов. На основе европейского законодательства (REG (EU) No 1169/2011) удалось построить характеристику пищевой ценности (Таблица 1 и Таблица 2) и проверить наличие ожидаемых заявлений о пищевой ценности)32.

Пищевая ценность по 100 г макаронных изделий % РСНП
Энергия 1478,90 кДж (348,74 ккал) 17
Липидов 1,06 ± 0,10 г 2
Из чего:
Насыщенные жирные кислоты 0,38 ± 0,01 г 2
Углеводы 72,59± 0,21 г 28
Волокно 3,84 ± 0,20 г
Белок 10,29 ± 0,20 г 21
Соль 0,22 ± 0,02 г 9

Таблица 1: Пищевая ценность. Пищевая ценность разработанных макаронных изделий основана на химическом анализе (n=3) энергетических и углеводных веществ, полученных расчетным путем, и соответствующем проценте рекомендуемой дозы потребления (n = 3).

Эти рецептуры макаронных изделий были разработаны для целевого потребителя, который стремится к более здоровому питанию, поэтому количество жира на 100 г продукта должно быть как можно меньше. Детальный анализ профиля жирных кислот показывает значение 0,38 г насыщенных жирных кислот на 100 г, что значительно ниже предела для продуктов с низким содержанием насыщенных жиров, что соответствует первоначальной цели в производстве этих макаронных изделий. Что касается содержания клетчатки, то в соответствии с европейскими нормами эту рецептуру макаронных изделий также можно было назвать источником клетчатки.

В характеристике минерального элемента, определенной с помощью ИСП-ОЭС и представленной в таблице 2, указано значение около 219 мг/100 г Na, присутствующего в 100 г этого продукта, поэтому невозможно проверить, что это продукт с низким содержанием натрия (<0,12 г/100 г). Благодаря повышенному содержанию натрия, естественным образом присутствующему в ингредиентах, этот продукт может не требовать добавления соли в свои кондитерские изделия.

Table 2

Таблица 2: Профиль минеральных элементов макаронных изделий. Синий - высокое содержание элемента; Красный - источник определенного элемента (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

В соответствии с упомянутым регламентом Европейского Союза и RDI% для каждого элемента видно, что этот продукт имеет высокое содержание K, P, Fe, а также является источником Zn. В нем присутствуют Se, Mg и Ca в меньших количествах.

Для приемо-сдаточных испытаний макаронных изделий было задействовано 86 испытателей, из которых 63 женщины и 23 мужчины в возрасте старше 18 лет. Приемо-сдаточные испытания проводились по гедонистической шкале в 9 баллов, как это предусмотрено стандартами. Здоровое тесто набрало 5 и 6 баллов по гедонистической шкале от 1 до 9 по параметрам «Морской вкус» и «Внешний вид» соответственно (рис. 6).

Figure 6

Рисунок 6: Результаты сенсорных потребительских приемочных испытаний . (А) Гедонистический выбор внешнего вида, цвета, текстуры, запаха, морского вкуса и общего вкуса. (Б) Гедонистический выбор общей оценки и намерения покупки. Шкала от 1 до 9, где 1 - плохая оценка, а 9 - очень хорошая оценка (n = 86). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Макаронные изделия набрали 5 и 6 баллов по гедонистической шкале от 1 до 9 по параметрам «Морской вкус» и «Внешний вид» соответственно (рис. 6А). Эта паста получила низкое значение по этой шкале по параметру текстуры (с учетом других уже изученных рецептур), вероятно, потому, что основным ингредиентом является рисовая мука; Несмотря на это, он получил значения по шкале от 1 до 9, в диапазоне от 4 до 7, что отражает хорошее восприятие среднестатистическим потребителем. По гедонистической шкале от 1 до 9 макароны имели наиболее частые ответы: значение 5 для намерения покупки и значение 6 для общего удорожания, как показано на рисунке 6B. Было обнаружено, что около 65% дегустаторов выбрали ответ, равный или превышающий балл 6 для общей оценки этой пасты. Стабильность цвета йогуртов с пигментом оценивали в течение 12 дней при -4 °C, и результаты представлены на рисунке 7.

Figure 7
Рисунок 7: Стабильность цвета йогуртов. (слева) Контрольные йогурты и (правые) йогурты с пигментом Gracilaria gracilis в течение 12 дней хранения. Параметры a*, b* и L* безразмерны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты показывают, что параметры a* и b* были стабильны с течением времени, в то время как значения L* показали более высокую дисперсию. Легкость показала более высокие значения после 8 дней хранения. Несмотря на то, что были обнаружены некоторые различия в параметрах светлоты, указывающие на то, что образцы были светлее с течением времени, параметры покраснения (a*) и синего цвета (b*) показали хорошую стабильность. Включение экстрактов в йогурты показало хорошее сохранение цвета, с ΔE 7,01 ± 2,36 после 12 дней хранения. Что касается органолептической оценки йогурта, то 9 из 13 участников правильно определили правильный образец в треугольном тесте, предполагая, что между йогуртами были различия, которые позволяли это различие. Гедонистические тесты, проведенные для полуобученной группы, показали хорошее восприятие продукта, что отразилось в баллах выше 7 (рис. 8). Режим оценки по любому из трех тестируемых атрибутов был равен 9, что привело к тому, что средний балл превысил 8. Наилучшая оценка была дана цвету, что отражает отличное принятие жюри, что является показательным результатом.

Figure 8
Рисунок 8: Результаты гедонистической сенсорной оценки йогурта с пигментом Gracilaria gracilis. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Испытания на антимикробную активность в жидкой среде используются для оценки эффективности антимикробных веществ против микроорганизмов, взвешенных в жидкой среде, и обычно проводятся для определения способности вещества подавлять рост или убивать микроорганизмы35,36,37,38. Они используются для оценки чувствительности микроорганизмов к антимикробным агентам и проводятся в пробирках или планшетах для микротитрования, где различные концентрации антимикробного вещества тестируются в сравнении со стандартизированной суспензией целевого микроорганизма22. Антимикробную активность оценивают путем измерения роста микробов или наличия/отсутствия мутности в питательной среде после надлежащего инкубационного периода.

Существует несколько техник и методов для проведения этих тестов, таких как метод разбавления бульона, метод диффузии агара (например, тест на диффузию диска) и метод микроразведения бульона, который является одним из наиболее часто используемых38. Некоторые из наиболее важных моментов в этих методах включают надлежащую подготовку посевного материала, выбор питательной среды, качество используемых противомикробных препаратов, стандартизацию метода и эффективный контроль загрязнения. Посевной материал, представляющий собой стандартизированную суспензию микроорганизмов, должен быть приготовлен правильно, чтобы обеспечить точность результатов. Это включает в себя надлежащий отбор микробной культуры, надлежащую культуру чистых штаммов, корректировку клеточной концентрации и стандартизацию суспензии для получения соответствующей оптической плотности или клеточной концентрации.

Используемая питательная среда должна быть тщательно выбрана, чтобы обеспечить идеальные условия роста для исследуемого микроорганизма. Химический состав, pH и другие факторы могут повлиять на результаты теста. Важно следовать рекомендациям производителя по приготовлению питательной среды. Качество противомикробных препаратов, используемых для контроля, имеет основополагающее значение, и важно убедиться, что они чистые, в пределах срока годности и правильно хранятся. Всегда следует сверяться с маркировкой и сроками годности, следуя инструкциям производителя. Стандартизация методики также имеет решающее значение для обеспечения точности результатов. Это включает в себя добавление испытуемых концентраций в питательную среду, а также поддержание асептических условий на протяжении всей процедуры. Кроме того, перекрестное загрязнение микроорганизмами во время тестирования может привести к ложным или ненадежным результатам. Очень важно соблюдать строгие асептические правила на протяжении всей процедуры, начиная с манипуляций с посевным материалом и заканчивая инкубацией пробирок или планшетов. Использование чистых столешниц, надлежащие методы пипетирования и надлежащая утилизация материалов являются важными мерами по предотвращению загрязнения.

Внимание к деталям и строгое соблюдение установленных протоколов и рекомендаций имеют решающее значение для минимизации ошибок и обеспечения надежности результатов испытаний на антимикробную активность в жидкой среде. Кроме того, тесты на антимикробную активность имеют некоторые ограничения, которые следует учитывать37.

Такие факторы, как рН, температура, наличие компонентов крови и взаимодействие с иммунной системой, в этих тестах не учитываются, что может ограничить возможность прогнозирования эффективности антимикробного агента в живом организме. Кроме того, тесты измеряют способность антимикробного вещества подавлять рост микробов или убивать микроорганизмы и не дают подробной информации о механизме действия противомикробного препарата или его селективности в отношении конкретных микроорганизмов. Существуют ограничения в выявлении резистентности, так как используемые методы могут не позволять обнаружить или предсказать развитие резистентности с течением времени. У некоторых микроорганизмов могут развиться механизмы резистентности в ответ на длительное воздействие противомикробного препарата, и эти изменения может быть нелегко обнаружить с помощью этих тестов. Испытания антимикробной активности в жидкой среде, как правило, не учитывают другие факторы хозяина, которые могут влиять на эффективность противомикробного препарата, такие как наличие биопленок или иммунный ответ хозяина.

Важно учитывать эти ограничения и дополнять тестирование на антимикробную активность в жидкой среде другими методами и подходами, такими как исследования in vivo , модели биопленок и др.39. В области биоразведки соединений биоактивных макроводорослей тесты на антимикробную активность могут использоваться для оценки антимикробного потенциала экстрактов водорослей или изолированных соединений, выявления веществ, обладающих антимикробной активностью в отношении конкретных микробных патогенов, которые могут применяться в таких областях, как производство лекарств, косметики, продуктов питания или сельскохозяйственной продукции40.

Тесты на антиоксидантную активность — это методы, используемые для оценки способности соединения или экстракта нейтрализовать свободные радикалы или снижать окислительный стресс. Эти тесты широко используются в исследованиях антиоксидантов, как в продуктах питания, так и в натуральных продуктах, таких как, например, водоросли. Существует несколько методов оценки антиоксидантной активности, и одним из наиболее часто используемых является способность абсорбции свободных радикалов. В этом тесте стабильный свободный радикал, 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (DPPH), используется для оценки способности соединения отдавать электрон и нейтрализовать свободный радикал. Антиоксидантная активность измеряется путем уменьшения фиолетового цвета DPPH, который возникает, когда антиоксидантное соединение отдает электрон свободному радикалу. Другие методы включают способность поглощать кислородные радикалы (ORAC), способность восстанавливать железо (FRAP) или способность восстанавливать свободные радикалы (ABTS)41.

Количественное определение общих полифенолов (QTP), с другой стороны, не является прямым методом определения антиоксидантной активности, но позволяет измерить общую концентрацию полифенолов в образце, хотя на результаты могут повлиять несколько мешающих веществ. Хотя известно, что многие полифенолы обладают антиоксидантными свойствами, антиоксидантная активность соединения связана с несколькими факторами, такими как его химическая структура, концентрация, способность отдавать или захватывать свободные радикалы и взаимодействие с другими клеточнымикомпонентами. Простое количественное определение общего количества полифенолов не может дать оценку антиоксидантной активности образца. Однако важно отметить, что присутствие полифенолов в образце может быть связано с более высокой вероятностью антиоксидантной активности, поскольку многие полифенолы обладают антиоксидантными свойствами. Таким образом, QTP может служить предварительным индикатором наличия полифенолов в образце, но для подтверждения антиоксидантной активности необходимы анализы антиоксидантной активности. Полифенолы — это класс химических соединений, широко распространенных в природе, содержащихся в продуктах питания, растениях, фруктах, овощах и водорослях. Существуют различные методы количественного определения общих полифенолов, и метод Фолина-Чокальтео является одним из наиболее часто используемых. QTP дает общую меру концентрации полифенолов, но не указывает отдельные полифенольные соединения, присутствующие в образце. Таким образом, это количественный, но не качественный метод. Кроме того, важно учитывать, что различные полифенолы обладают разной антиоксидантной способностью и биологической активностью, поэтому QTP не предоставляет подробной информации о конкретных функциональных свойствах присутствующих полифенолов.

Каждый метод имеет свои преимущества и ограничения, а выбор того или иного теста зависит от характеристик исследуемого соединения и цели анализа. Важно следовать конкретным инструкциям каждого метода, чтобы обеспечить надежные и сопоставимые результаты. При определении антиоксидантной способности некоторые из общих критических этапов включают, во-первых, подготовку пробы. Важно правильно подготовить образцы, обеспечив получение адекватных концентраций и избежав загрязнения. Это включает в себя точное взвешивание соединений или экстрактов и их растворение в соответствующих растворителях. Также важно учитывать стабильность соединений и экстрактов в процессе приготовления, хранения и обработки. Все реагенты, используемые в тестах на антиоксидантную активность, должны быть надлежащим образом приготовлены и стандартизированы, чтобы обеспечить воспроизводимость результатов. Это включает в себя правильное приготовление стандарта галловой кислоты и точность объемов. Время реакции является критически важным аспектом получения точных результатов в тестах на антиоксиданты. Необходимо оптимизировать время инкубации, чтобы обеспечить полноценную реакцию между антиоксидантным соединением и свободным радикалом. Недостаточное время может привести к недооценке антиоксидантной активности, в то время как чрезмерное время может привести к деградации соединений или интерференции вторичных реакций. Кроме того, температура во время испытаний должна контролироваться точно и последовательно. Температура влияет на скорость химических реакций и может повлиять на результаты. Важно соблюдать температурный режим, рекомендованный конкретными методами, и обеспечивать температурную стабильность на протяжении всей процедуры. Включение соответствующих средств контроля имеет важное значение для проверки результатов тестов на антиоксиданты. Это может быть положительный контроль (соединения, обладающие антиоксидантной активностью) и отрицательный контроль (образцы без антиоксидантной активности). Средства контроля обеспечивают основу для сравнения для интерпретации результатов и помогают обеспечить точность полученных данных. Для получения достоверных результатов рекомендуется проводить испытания антиоксидантной активности на репликатах и повторять эксперимент несколько раз, чтобы повысить значимость данных и получить более надежные и устойчивые результаты.

Методы тестирования антиоксидантной активности имеют некоторые ограничения, которые следует учитывать при интерпретации результатов, а именно тот факт, что в жидких средах они могут не полностью отражать сложность биологических систем и взаимодействий между различными соединениями, широкий спектр антиоксидантных реакций, которые могут происходить, клеточный метаболизм и факторы окружающей среды, которые могут влиять на антиоксидантную активность. Таким образом, следует использовать разные тесты. Также следует помнить об отсутствии прямой корреляции с пользой для здоровья; Несмотря на то, что антиоксидантная активность часто ассоциируется с пользой для здоровья, это не всегда приводит непосредственно к пользе для здоровья живых организмов из-за многих других факторов, таких как биодоступность, метаболизм и взаимодействие с другими биологическими системами.

Важно иметь в виду, что тесты на антиоксидантную активность являются полезными инструментами для первоначальной оценки антиоксидантного потенциала соединений и экстрактов, но их не следует рассматривать как окончательный показатель биологических эффектов или пользы для здоровья. Необходимы дополнительные исследования, чтобы полностью понять влияние антиоксидантов на организм.

Несмотря на то, что методы тестирования антиоксидантной активности в жидкой среде широко используются в научных исследованиях и имеют свои преимущества и ограничения, по сравнению с альтернативными методами эти методы можно считать хорошими с точки зрения практичности, скорости, стоимости и простоты внедрения. Одним из основных преимуществ является простота и быстрота процедур и их пригодность для первичных исследований, комплексного скрининга и крупномасштабных исследований. Эти методы относительно быстры в выполнении и могут дать результаты за короткий период, более доступным способом, и требуют меньшего специализированного оборудования по сравнению с другими методами.

Водоросли известны своей способностью вырабатывать биологически активные соединения, в том числе антиоксиданты, которые могут обладать полезными свойствамидля здоровья. Экстракты водорослей могут быть приготовлены из различных частей водорослей и могут быть получены с использованием различных растворителей, таких как вода, этанол, метанол или ацетон, среди прочих. Важно помнить, что антиоксидантная активность экстрактов водорослей может варьироваться в зависимости от нескольких факторов, таких как вид водорослей, метод экстракции и концентрация присутствующих биологически активных соединений. Поэтому рекомендуется проводить тесты на антиоксидантную активность репликатов и проводить сравнения с соответствующими контрольными группами для получения более надежных результатов. Эти методы могут быть использованы в качестве исходного инструмента при скрининге и отборе экстрактов водорослей с антиоксидантным потенциалом для дальнейших исследований.

МТТ-анализ является широко используемым методом для предварительной оценки цитотоксических эффектов in vitro веществ для использования человеком и животными. Однако, несмотря на то, что это наиболее часто используемый метод для тестирования цитотоксичности, превращение МТТ в кристаллы формазана зависит от множества факторов, таких как скорость метаболизма и количество митохондрий, и он применим толькок адгезивным клеточным мишеням. Основные критические этапы протокола, описанные здесь, связаны с возможным возникновением контаминации клеточных культур, нежелательным ростом клеток HaCaT и низким процентом слияния клеток. Существуют и другие методы, такие как лактатдегидрогеназа (ЛДГ), аденозинтрифосфат (АТФ) и анализы образования колоний для измерения цитотоксичности. Однако все они имеют свои преимущества и ограничения. Ghasemi et al. (2021)44 оценили влияние нескольких переменных на измерения МТТ-анализа на клеточной линии рака предстательной железы (PC-3). Были проанализированы такие факторы, как плотность клеточного посева, концентрация МТТ, инкубационное время после добавления МТТ, сывороточное голодание, состав питательных сред клеток, высвобождаемое внутриклеточное содержимое и экструзия формазана во внеклеточное пространство. На основе этого исследования эти авторы изложили полезные рекомендации о том, как применять анализ, а также о том, где полезность анализа является мощным инструментом, а также где у него есть ограничения. Тем не менее, МТТ-анализ является быстрой, высокочувствительной и простой методологией, которая может быть применена в качестве предварительной оценки цитотоксичности многих веществ с потенциальным применением в терапевтической, пищевой, кормовой, сельскохозяйственной и экологической областях. В частности, проведенный здесь анализ МТТ показал, что этанол и водные экстракты G. gracilis , в исследуемых концентрациях, не влияют на жизнеспособность кератиноцитов и могут быть проведены для анализа in vivo , чтобы убедиться, что они полностью безопасны для использования на коже человека.

Использование морских ресурсов в пищевых продуктах в очередной раз показало свой потенциал не только для получения продуктов с добавленной питательной ценностью, но и для поиска продуктов с более чистой этикеткой. Добавление цельного G. gracilis (макаронных изделий) или экстракта (в качестве пищевого красителя) показывает рыночный потенциал, и его применение может стать одной из стратегий для компаний, чтобы выделиться на рынке, удовлетворить потребности потребителей в питательных веществах и следовать их рыночным тенденциям.

Когда морские водоросли были добавлены в рецептуры макаронных изделий, первоначально было обнаружено, что структура была изменена и что невозможно получить желаемую форму теста. Перед нами стояла задача отрегулировать количество и добавить другие ингредиенты, которые ранее не предусматривались, чтобы сохранить текстуру пасты. Помимо соответствующего количества каждого ингредиента, метод экструзии был адаптирован на протяжении всей разработки макаронных изделий. Помимо этой сложности, разработка новых продуктов основана на трех фундаментальных принципах: продукт должен быть сенсорно привлекательным (текстура, вкус, запах); продукт должен обладать добавленной питательной ценностью; Кроме того, она должна максимально использовать устойчивые ингредиенты и методологии. В этом смысле еще одной серьезной проблемой является использование сенсорной панели для достижения наиболее привлекательной формулировки. Большинство физико-химических анализов, проведенных для макаронных изделий, уже были оптимизированы для пищевых матриц; Однако в этой работе пробоподготовка была оптимизирована таким образом, чтобы ее можно было эффективно применять ко всем методам анализа.

Что касается использования пигмента G. gracilis в качестве красителя, то был выбран охлажденный продукт из-за термической чувствительности этого типа молекулы45. Так как приготовление йогурта предполагает термическую обработку, пигмент добавляли в конечный продукт. Смешивание пигмента с йогуртом привело к получению продукта немного более жидкого, чем контроль без пигмента. На самом деле, в конце теста с треугольником некоторые участники дискуссии отметили, что единственное различие между образцами заключается в текстуре. Это хороший результат, поскольку основная цель треугольного теста состояла в том, чтобы проверить, есть ли заметные различия между йогуртом с пигментом и без него, особенно различия во вкусе и запахе, поскольку экстракты морских водорослей могут придавать неприятный вкус/запах пищевым продуктам. Это было предварительное исследование, в котором участвовала небольшая полуобученная группа. В дальнейших исследованиях следует рассмотреть возможность использования большего количества дегустаторов для достижения более надежных рыночных результатов. Что касается оценки стабильности пигмента в йогурте, дальнейшие исследования могут включать оценку других физико-химических свойств йогурта с пигментом с течением времени, таких как pH, активность воды (aw) и текстура. Также желательна сенсорная оценка с течением времени.

В заключение, протоколы, описанные здесь, подчеркивают потенциал красной морской водоросли G. gracilis в качестве источника ингредиентов для разработки новых продуктов с потенциальным применением в фармацевтической, дермокосметической и пищевой промышленности. Кроме того, постэкстрагированная остаточная биомасса остается ценным материалом, который можно использовать в качестве биостимулятора роста растений, обогащения почвы, кормления рыб или сырья для получения биоугля и/или функционализированных углеродов для целей очистки воды. Описанный здесь подход к биопереработке может быть применен и к другим видам морских водорослей, способствуя развитию экономики замкнутого цикла и экологической устойчивости.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Португальским фондом науки и технологий (FCT) в рамках стратегических проектов, предоставленных Центру морских и экологических наук MARE-(UIDP/04292/2020 и UIDB/04292/2020) и ассоциированной лаборатории ARNET (LA/P/0069/2020). FCT также профинансировал индивидуальные докторские гранты, присужденные Марте В. Фрейтас (UI/BD/150957/2021) и Татьяне Перейре (2021. 07791. БД). Эта работа также была финансово поддержана проектом HP4A - ЗДОРОВЫЕ МАКАРОНЫ ДЛЯ ВСЕХ (совместная реклама No 039952), софинансируемым ЕФРР - Европейским фондом регионального развития в рамках Программы Португалия 2020 в рамках Оперативной программы конкурентоспособности и интернационализации COMPETE 2020.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute Ethanol Aga, Portugal 64-17-5
Ammonium Chloride PanReac 12125-02-9
Amphotericin B Sigma-Aldrich 1397-89-3
Analytical scale balance Sartorius, TE124S 22105307
Bacillus subtilis subsp. spizizenii German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) DSM 347
Biotin Panreac AppliChem 58-85-5
Centrifuge Eppendorf, 5810R 5811JH490481
Chloramphenicol PanReac 56-75-7
CO2 Chamber Memmert N/A
Cool White Fluorescent Lamps OSRAM Lumilux Skywhite N/A
Densitometer McFarland Grant Instruments N/A
DMEM medium Sigma-Aldrich D5796
DMSO Sigma-Aldrich 67-68-5
DPPH Sigma, Steinheim, Germany 1898-66-4
Escherichia coli (DSM 5922) German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) DSM5922
Ethanol 96% AGA-Portugal 64-17-5
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA) J.T.Baker 6381-92-6
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Filter Paper (Whatman No.1) Whatman WHA1001320
Flasks VWR International, Alcabideche, Portugal  N/A
Folin-Ciocalteu VWR Chemicals 31360.264
Gallic Acid  Merck 149-91-7
Germanium (IV) Oxide, 99.999% AlfaAesar 1310-53-8
HaCaT cells – 300493 CLS-Cell Lines Services, Germany  300493
Hot Plate Magnetic Stirrer IKA, C-MAG HS7 06.090564
Iron Sulfate VWR Chemicals 10124-49-9
Laminar flow hood TelStar, Portugal 526013
LB Medium  VWR Chemicals J106
Listonella anguillarum German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)  DSM 21597
Manganese Chloride VWR Chemicals 7773.01.5
Micropipettes  Eppendorf, Portugal N/A
Microplates VWR International, Alcabideche, Portugal  10861-666
Microplates Greiner 738-0168
Microplates (sterile) Fisher Scientific 10022403
Microplate reader  Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA 1611151E
MTT Sigma-Aldrich 289-93-1
Muller-Hinton Broth (MHB) VWR Chemicals 90004-658
Oven Binder, FD115 12-04490
Oven Binder, BD115 04-62615
Penicillin Sigma-Aldrich 1406-05-9
pH meter Inolab  VWR International, Alcabideche, Portugal  15212099
Pippete tips Eppendorf, Portugal 5412307
Pyrex Bottles Media Storage  VWR International, Alcabideche, Portugal  16157-169
Rotary Evaporator Heidolph, Laborota 4000 80409287
Rotavapor IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal 07.524254
Sodium Carbonate (Na2CO3) Chem-Lab 497-19-8
Sodium Chloride (NaCl)  Normax Chem 7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic Riedel-de Haën 7558-79-4
SpectraMagic NX Konica Minolta, Japan color data analysis software
Spectrophotometer Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA 5A4T092004
Streptomycin Sigma-Aldrich 57-92-1
Thiamine Panreac AppliChem 59-43-8
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4049
Tryptic Soy Agar (TSA) VWR Chemicals ICNA091010617
Tryptic Soy Broth (TSB)  VWR Chemicals 22091
Ultrapure water  Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany F5HA17360B
Vacuum pump Buchi, Switzerland FIS05-402-103
Vitamin B12 Merck 68-19-9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Charoensiddhi, S., Abraham, R. E., Su, P., Zhang, W. Seaweed and seaweed-derived metabolites as prebiotics. Advances in Food and Nutrition Research. 91, 97-156 (2020).
  2. Roohinejad, S., Koubaa, M., Barba, F. J., Saljoughian, S., Amid, M., Greiner, R. Application of seaweeds to develop new food products with enhanced shelf-life, quality, and health-related beneficial properties. Food Research International. 99, 1066-1083 (2017).
  3. Hurd, C. L., Harrison, P. J., Bischof, K., Lobban, C. S. Seaweed Ecology and Physiology. (second). , Cambridge University Press, UK. (2014).
  4. Freitas, M. V., Mouga, T., Correia, A. P., Afonso, C., Baptista, T. New insights on the sporulation, germination, and nutritional profile of Gracilaria gracilis (Rhodophyta) grown under controlled conditions. Journal of Marine Science and Engineering. 9 (6), 562 (2021).
  5. Friedlander, M. Advances in cultivation of Gelidiales. Journal of Applied Phycology. 20 (5), 451-456 (2008).
  6. Matos, G. S., Pereira, S. G., Genisheva, Z. A., Gomes, A. M., Teixeira, J. A., Rocha, C. M. R. Advances in extraction methods to recover added-value compounds from seaweeds: Sustainability and functionality. Foods. 10, 516 (2021).
  7. Ummat, V., Sivagnanam, S. P., Rajauria, G., O'Donnell, C., Tiwari, B. K. Advances in pre-treatment techniques and green extraction technologies for bioactives from seaweeds. Trends in Food Science & Technology. 110, 90-106 (2021).
  8. Pérez, M. J., Falqué, E., Domínguez, H. Seaweed Antimicrobials, Present Status and Future Perspectives. Handbook of Algal Technologies andPhytochemicals:Volume I Food, Health and Nutraceutical Applications. Ravishankar, G., Ambati, R. R. , 1st ed, CRC Press, Boca Raton, Florida. (2019).
  9. Cavallo, R. A., Acquaviva, M. I., Stabili, L., Cecere, E., Petrocelli, A., Narracci, M. Antibacterial activity of marine macroalgae against fish pathogenic Vibrio species. Central European Journal of Biology. 8, 646-653 (2013).
  10. Shannon, E., Abu-Ghannam, N. Antibacterial derivatives of marine algae: An overview of pharmacological mechanisms and applications. Marine Drugs. 14 (4), 81 (2016).
  11. Capillo, G., et al. New insights into the culture method and antibacterial potential of Gracilaria gracilis. Marine Drugs. 16 (12), 492 (2018).
  12. Francavilla, M., Franchi, M., Monteleone, M., Caroppo, C. The red seaweed Gracilaria gracilis as a multi products source. Marine Drugs. 11 (10), 3754-3776 (2013).
  13. Sánchez-Ayora, H., Pérez-Jiménez, J. Antioxidant Capacity of Seaweeds: In Vitro and In Vivo Assessment. Marine Phenolic Compounds. Pérez-Correa, J. R., Mateos, R., Domínguez, R. , Elsevier. 299-341 (2023).
  14. Anil, S., Sweety, V. K., Vikas, B., Betsy-Joseph, B. Cytotoxicity and Cell Viability Assessment of Biomaterials. Cytotoxicity. , Intechopen. 111822 (2023).
  15. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  16. Roleda, M. Y., et al. Variations in polyphenol and heavy metal contents of wild-harvested and cultivated seaweed bulk biomass: Health risk assessment and implication for food applications. Food Control. 95, 121-134 (2019).
  17. Souza, K. D., et al. Gastronomy and the development of new food products: Technological prospection. International Journal of Gastronomy and Food Science. 33, 100769 (2023).
  18. Pereira, T., et al. Optimization of phycobiliprotein pigments extraction from red algae Gracilaria gracilis for substitution of synthetic food colorants. Food Chemistry. 321, 126688 (2020).
  19. Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. New England Seaweed Culture Handbook-Nursery Systems. Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. , Connecticut Sea Grant, University of Connecticut. (2014).
  20. Yong, Y. S., Yong, W. T. L., Anton, A. Analysis of formulae for determination of seaweed growth rate. Journal of Applied Phycology. 25 (6), 1831-1834 (2013).
  21. Patarra, R. F., Carreiro, A. S., Lloveras, A. A., Abreu, M. H., Buschmann, A. H., Neto, A. I. Effects of light, temperature and stocking density on Halopteris scoparia growth. Journal of Applied Phycology. 29 (1), 405-411 (2017).
  22. NCCLS, National Committee for Clinical Laboratory Standards, Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests: Approved Standard. 32, 11th ed, Wayne, PA, USA. M02-M11 (2012).
  23. Singleton, V. L., Rossi, J. A. J. Colorimetry to total phenolics with phosphomolybdic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
  24. Duan, X. J., Zhang, W. W., Li, X. M., Wang, B. G. Evaluation of antioxidant property of extract and fractions obtained from a red alga, Polysiphonia urceolata. Food Chemistry. 95 (1), 37-43 (2006).
  25. Freitas, R., et al. Highlighting the biological potential of the brown seaweed Fucus spiralis for skin applications. Antioxidants. 9 (7), 611 (2020).
  26. Duarte, A., et al. Seasonal study of the nutritional composition of unexploited and low commercial value fish species from the Portuguese coast. Food Science and Nutrition. 10 (10), 3368-3379 (2020).
  27. Folch, J., Lees, M., Stanley, G. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  28. ISO 6865. Animal feeding stuffs - Determination of crude fibre content - Method with intermediate filtration. Bureau of Indian Standards (BIS). , (2000).
  29. Fernández, A., Grienke, U., Soler-Vila, A., Guihéneuf, F., Stengel, D. B., Tasdemir, D. Seasonal and geographical variations in the biochemical composition of the blue mussel (Mytilus edulis L.) from Ireland. Food Chemistry. 177, 43-52 (2015).
  30. Pinto, F., et al. Annual variations in the mineral element content of five fish species from the Portuguese coast. Food Research International. 158, 111482 (2022).
  31. FAO. Food energy - methods of analysis and conversion factors. , FAO Food and Nutrition Paper 77 at https://www.fao.org/fileadmin/templates/food_composition/documents/book_abstracts/Food_energy.pdf (2003).
  32. Regulation (EU) Nr. 1169/2011 of the European Parliament and of the Council of 25 -10-2011. 25, https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/?uri=CELEX%3A32011R1169 (2011).
  33. Pathare, P. B., Opara, U. L., Al-Said, F. A. J. Colour measurement and analysis in fresh and processed foods: A review. Food and Bioprocess Technology. 6 (1), 36-60 (2013).
  34. ISO 4120. Sensory analysis - Methodology - Triangle test. International Standard. , https://www.iso.org/standard/33495.html (2004).
  35. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: A review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  36. Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
  37. Gajic, I., et al. Antimicrobial susceptibility testing: A comprehensive review of currently used methods. Antibiotics. 11 (4), 427 (2022).
  38. Gonzalez-Pastor, R., et al. Current landscape of methods to evaluate antimicrobial activity of natural extracts. Molecules. 28 (3), 1068 (2023).
  39. Li, J., et al. Antimicrobial activity and resistance: Influencing factors. Frontiers in Pharmacology. 13 (8), 364 (2017).
  40. Silva, A., et al. Macroalgae as a source of valuable antimicrobial compounds: Extraction and applications. Antibiotics. 9 (10), 642 (2020).
  41. Munteanu, I. G., Apetrei, C. Analytical methods used in determining antioxidant activity: A review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3380 (2021).
  42. Ma, S., et al. Comparison of common analytical methods for the quantification of total polyphenols and flavanols in fruit juices and ciders. Journal of Food Science. 84 (8), 2147-2158 (2019).
  43. Tziveleka, L. A., Tammam, M. A., Tzakou, O., Roussis, V., Ioannou, E. Metabolites with antioxidant activity from marine macroalgae. Antioxidants. 10 (9), 1431 (2021).
  44. Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
  45. Pereira, T., Barroso, S., Mendes, S., Gil, M. M. Stability, kinetics, and application study of phycobiliprotein pigments extracted from red algae Gracilaria gracilis. Journal of Food Science. 85 (10), 3400-3405 (2020).

Tags

Биология выпуск 201
Повышение ценности красных морских водорослей <em>Gracilaria gracilis</em> с помощью биоперерабатывающего подхода
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martins, A., Pinto, F. R., Barroso,… More

Martins, A., Pinto, F. R., Barroso, S., Pereira, T., Mouga, T., Afonso, C., Freitas, M. V., Pinteus, S., Pedrosa, R., Gil, M. M. Valorization of the Red Seaweed Gracilaria gracilis Through a Biorefinery Approach. J. Vis. Exp. (201), e65923, doi:10.3791/65923 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter