Valorização da Alga Vermelha Gracilaria gracilis Através de uma Abordagem de Biorrefinaria

Summary

Aqui, descrevemos vários protocolos visando uma valorização integrada de Gracilaria gracilis: colheita de espécies silvestres, crescimento interno e extração de ingredientes bioativos. Os efeitos antioxidantes, antimicrobianos e citotóxicos dos extratos são avaliados, assim como a avaliação nutricional e de estabilidade de alimentos enriquecidos com biomassa e pigmentos integrais de algas marinhas.

Abstract

O interesse em algas marinhas como matéria-prima abundante para a obtenção de ingredientes bioativos valiosos e multialvos está crescendo continuamente. Neste trabalho, exploramos o potencial de Gracilaria gracilis, uma alga vermelha comestível cultivada mundialmente por seu interesse comercial como fonte de ágar e outros ingredientes para aplicações cosméticas, farmacológicas, alimentícias e de ração.

As condições de crescimento de G. gracilis foram otimizadas através da propagação vegetativa e esporulação, manipulando-se as condições físico-químicas para atingir um grande estoque de biomassa. Metodologias de extração verde com etanol e água foram realizadas sobre a biomassa de algas marinhas. O potencial bioativo dos extratos foi avaliado através de um conjunto de ensaios in vitro quanto à citotoxicidade, propriedades antioxidantes e antimicrobianas. Adicionalmente, biomassa seca de algas marinhas foi incorporada às formulações de massas alimentícias para aumentar o valor nutricional dos alimentos. Pigmentos extraídos de G. gracilis também foram incorporados ao iogurte como corante natural, e sua estabilidade foi avaliada. Ambos os produtos foram submetidos à apreciação de um painel sensorial semi-treinado visando alcançar a melhor formulação final antes de chegarem ao mercado.

Os resultados suportam a versatilidade de G. gracilis seja aplicado como biomassa inteira, extratos e/ou pigmentos. Através da implementação de vários protocolos otimizados, este trabalho permite o desenvolvimento de produtos com potencial para rentabilizar os mercados alimentar, cosmético e aquícola, promovendo a sustentabilidade ambiental e uma economia circular azul.

Além disso, e de acordo com uma abordagem de biorrefinaria, a biomassa residual de algas marinhas será utilizada como bioestimulante para o crescimento vegetal ou convertida em materiais de carbono para ser utilizada na purificação da água dos sistemas aquícolas internos do MARE-Politécnico de Leiria, Portugal.

Introduction

As algas marinhas podem ser consideradas uma matéria-prima natural interessante a ser aproveitada pelos setores farmacêutico, alimentício, de rações e ambiental. Biossintetizam uma panóplia de moléculas, muitas não encontradas em organismos terrestres, com propriedades biológicas relevantes ^1,2. No entanto, protocolos de cultivo otimizados para algas marinhas precisam ser implementados para garantir um grande estoque de biomassa.

Os métodos de cultivo devem sempre considerar a natureza do talo de algas marinhas e a morfologia geral. Gracilaria gracilis é um táxon clonal, o que significa que o órgão de ligação produz múltiplos eixos vegetativos. A propagação por fragmentação (reprodução vegetativa) é assim alcançada, pois cada um desses eixos é plenamente capaz de adotar uma vida independente do talo principal³. Os táxons clonais podem ser integrados com sucesso com metodologias simples e rápidas de cultivo em uma etapa, pois grandes quantidades de biomassa são obtidas dividindo o talo em pequenos fragmentos que rapidamente se regeneram e crescem em novos indivíduos geneticamente idênticos. Tanto o talo haplontico quanto o diplontico podem ser utilizados nesse processo. Embora o gênero exiba um complexo ciclo de vida trifásico isomórfico haplo-diplontic, a esporulação raramente é necessária, exceto quando a renovação genética dos estoques é necessária para alcançar culturas melhoradas. Nesse caso, tanto os tetrasporos (esporos haplônicos formados pela meiose) quanto os carposporos (esporos diplonticos formados pela mitose) dão origem aos talos macroscópicos que podem ser cultivados e propagados pela reprodução vegetativa⁴. Os ciclos de crescimento são ditados pelas condições ambientais e pelo estado fisiológico dos indivíduos, entre outros fatores biológicos, como o surgimento de epífitas e a adesão de outros organismos. Portanto, otimizar as condições de cultivo é crucial para garantir alta produtividade e produzir biomassa de boa qualidade⁵.

A extração de compostos bioativos de algas marinhas, incluindo G. gracilis, pode ser obtida através de vários métodos ^6,7. A escolha do método de extração depende dos compostos específicos de interesse, da aplicação alvo e das características da alga. Neste estudo, focamos na extração por solvente, que envolve o uso de solventes verdes, como água ou etanol, para dissolver e extrair compostos bioativos da biomassa de algas marinhas. A extração pode ser realizada através de maceração de forma versátil e eficaz e pode ser utilizada para uma ampla gama de compostos. É um método simples e amplamente utilizado que envolve a imersão de biomassa em um solvente por um período prolongado, tipicamente em temperaturas ambientes ou ligeiramente elevadas. O solvente é agitado para melhorar o processo de extração. Após o tempo de extração desejado, o solvente é separado do material sólido por filtração ou centrifugação.

A água é um solvente comumente usado em aplicações alimentares devido à sua segurança, disponibilidade e compatibilidade com uma ampla gama de produtos alimentícios. A extração de água é adequada para compostos polares como polissacarídeos, peptídeos e certos fenólicos. No entanto, pode não extrair eficazmente compostos apolares. O etanol também é um solvente amplamente utilizado em aplicações alimentares e pode ser eficaz para extrair uma variedade de moléculas bioativas, incluindo compostos fenólicos, flavonoides e certos pigmentos. O etanol é geralmente reconhecido como seguro para uso em alimentos e pode ser facilmente evaporado, deixando para trás os compostos extraídos. Vale ressaltar que a escolha do método de extração deve considerar fatores como eficiência, seletividade, custo-efetividade e impacto ambiental. A otimização dos parâmetros de extração, tais como concentração de solvente, tempo de extração, temperatura e pressão, é crucial para alcançar rendimentos ideais de compostos bioativos de G. gracilis ou outras algas marinhas.

Descobriu-se que as algas marinhas exibem atividade antimicrobiana contra uma ampla gama de microrganismos, incluindo bactérias, fungos e vírus⁸. Essa atividade é atribuída a componentes bioativos, incluindo fenólicos, polissacarídeos, peptídeos e ácidos graxos. Vários estudos têm demonstrado sua eficácia contra patógenos como Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp., Pseudomonas aeruginosa, entre^outros9. A atividade antimicrobiana das algas marinhas é atribuída à presença de compostos bioativos que podem interferir na parede celular microbiana, membranas, enzimas e vias de sinalização¹⁰. Esses compostos podem interromper o crescimento microbiano, inibir a formação de biofilme e modular as respostas imunes.

As algas vermelhas, também conhecidas como rodófitas, são um grupo de algas que podem apresentar atividade antimicrobiana contra uma variedade de microrganismos. Dentro deste grupo, G. gracilis contém vários compostos bioativos que podem contribuir para sua atividade antimicrobiana relatada. Embora as moléculas específicas possam variar, as classes comuns que têm sido relatadas em G. gracilis e podem possuir propriedades antimicrobianas são polissacarídeos, fenólicos, terpenóides e pigmentos¹¹. No entanto, é importante notar que a presença e a quantidade desses componentes podem variar dependendo de fatores como o local de coleta das algas, sazonalidade, condição fisiológica dos talos e condições ambientais. Portanto, a classe específica e a concentração de compostos antimicrobianos em G. gracilis podem variar de acordo.

G. gracilis também possui propriedades antioxidantes, contendo vários compostos fenólicos, que demonstraram eliminar radicais livres e reduzir o estresse oxidativo¹².Os antioxidantes ajudam a proteger as células dos danos causados por espécies reativas de oxigênio e têm potenciais benefícios para a saúde. A capacidade antioxidante pode ser avaliada diretamente através de diferentes métodos, incluindo a atividade sequestradora do radical livre 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) e, indiretamente, através da quantificação do conteúdo polifenólico total (TPC)¹³.

Embora um ingrediente tenha uma bioatividade proeminente, sua avaliação da citotoxicidade é indispensável na avaliação de substâncias naturais e sintéticas a serem usadas em contato com células ou tecidos vivos. Existem vários métodos para medir a citotoxicidade, cada um com vantagens e limitações. De modo geral, oferecem uma gama de opções para avaliar os efeitos nocivos de muitas substâncias sobre as células e, ao mesmo tempo, investigar os mecanismos de dano e morte celular¹⁴.

Neste trabalho, utilizamos o ensaio de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT), método colorimétrico introduzido por Mosmann (1983)¹⁵. Este método mede a redução de sais de tetrazólio a um produto de formazana roxa por células metabolicamente ativas. Quanto maior a quantidade de cristais de formazana, maior o número de células viáveis, proporcionando uma medida indireta de citotoxicidade¹⁴. Como neste trabalho os extratos aquoso e etanólico de G. gracilis pretendem ser incorporados em formulações dermocosméticas, a avaliação in vitro da citotoxicidade é realizada em uma linhagem celular de queratinócitos (HaCaT).

Quanto à aplicação alimentar, as algas marinhas são geralmente pobres em calorias e nutricionalmente ricas em fibras alimentares, elementos essenciais e aminoácidos, polissacarídeos, ácidos graxos poli-insaturados, polifenóis e vitaminas ^2,16. G. gracilis não é exceção, tendo um valor nutricional interessante. (2021)⁴ verificaram que G. gracilis cultivada apresentou maiores níveis de proteína e vitamina C e manteve o nível de lipídios totais em relação às algas silvestres. Isso pode representar uma vantagem econômica e ambiental, pois nutricionalmente falando, a produção é preferível à exploração de recursos silvestres. Além disso, os consumidores estão cada vez mais preocupados com o tipo de alimento que comem, por isso é importante introduzir novos ingredientes para o enriquecimento alimentar e usar novos recursos para obter extratos que possam agregar valor a um produto e reivindicar um "rótulo limpo". Além disso, o mercado atual é bastante competitivo, exigindo o desenvolvimento de novos produtos e estratégias inovadoras para diferenciar os fabricantes de seus concorrentes¹⁷.

O enriquecimento de produtos de baixo valor nutricional, como as massas, com recursos marinhos, incluindo algas marinhas, é uma estratégia para introduzir este recurso como um novo alimento e uma estratégia de diferenciação de mercado através de um produto com valor nutricional distinto. Por outro lado, G. gracilis é fonte de pigmentos vermelhos naturais, como as ficobiliproteínas18, apresentando alto potencial para aplicações na indústria de alimentos. Esta alga tem demonstrado grande interesse em diversas áreas, e sua aplicação pode ser feita utilizando a totalidade das algas, extratos e/ou a biomassa remanescente. Neste trabalho, demonstramos alguns exemplos de tais aplicações.

Protocol

1. Colheita e preparação da biomassa

1. Colher os espécimes de G. gracilis durante a maré baixa e transportá-los rapidamente para o laboratório em caixas escuras e resfriadas para evitar secagem, luz e exposição ao ar.
2. No laboratório, lave cada talo com água do mar corrente e limpe bem para remover detritos, partes necróticas, epífitas e outros organismos da superfície.
3. Manter a biomassa silvestre em água do mar constantemente aerada (31-35 psu) em sala climática (20 ± 1 °C) com baixa irradiância proporcionada pela luz do dia, lâmpadas brancas e fluorescentes frias e fotoperíodo fixado às 16:08 (claro: escuro) por 7 dias. Durante este período, não forneça nenhum meio nutriente; Isso permite que as algas se ajustem lentamente às novas condições internas.

2. Manutenção de estoque

1. Após o período de aclimatação, corte pontas saudáveis de talos de algas marinhas com uma lâmina estéril. (2014)¹⁹ e sob condições estéreis, arraste cada ponta através de um gel de ágar previamente preparado em placas de Petri (ágar bacteriológico a 1,0%, na proporção água destilada/água do mar de 1:1) para remover quaisquer contaminantes remanescentes. Execute o arraste do ágar três vezes para cada ponta e arraste sempre a ponta através de porções não utilizadas do gel de ágar.
2. Lave os vidros com ácido em solução de ácido clorídrico (HCl, 15%) e enxágue abundantemente com água destilada. Esterilizar todas as ferramentas, vidros, ágar, água do mar e água destilada utilizados no processo de limpeza em autoclave (121 °C, 15 min).
   ATENÇÃO: Consulte a ficha de dados de segurança do HCl entregue pelo fornecedor.
3. As pontas crescem em água do mar esterilizada a 35 psu, suplementada com solução enriquecida de Von Stosch (VSE) modificada para algas vermelhas, de acordo com Redmond et al (2014)¹⁹. Adicionar dióxido de germânio (GeO₂) ao meio (1 mL/L) para evitar o crescimento de diatomáceas epífitas.
   ATENÇÃO: Consulte a ficha de dados de segurança do GeO₂ entregue pelo fornecedor.
   OBS: Ponteiras que apresentam perda de pigmentação, observada por descoloração parcial ou total, estão sob estresse ou já estão mortas e devem ser descartadas.

3. Cultivo e aumento de escala

1. Após o período de aclimatação, distribuir aleatoriamente cerca de 8-10 pontas saudáveis em frascos de fundo plano de 250 mL em uma sala climática regulada a 20 ± 1 °C com a luz branca fria de 20 ± fótons ^{m-2 s-1} de 0,5 μmol (1500 lux), um fotoperíodo fixado em 16 h: 8 h (claro: escuro) e água do mar estéril enriquecida com meios de cultura VSE renovados a cada semana.
2. Realizar medidas semanais de peso, evitando forçar excessivamente os talos²⁰. Para isso, retire cuidadosamente as pontas do meio de cultura, enxágue suavemente e pese os miligramas em uma balança de laboratório.
   NOTA: Este procedimento pode ser realizado juntamente com a renovação semanal dos meios de cultura.
3. Thalli pode crescer nestes frascos até uma densidade de 2 g/L. Nesse momento, realize um scale-up do receptor (250 mL, 1 L e 5 L). Transfira o cultivo para recipientes brancos abertos ao ar livre de 50 L ou mais quando o volume atingir 5 L.
4. Calcule a taxa de crescimento relativo (RGR) de acordo com Patarra et al (2017)²¹ :
   RGR (% fw/dia) = ([Ln (fw) - Ln (iw)]/t) x 100
   onde iw e fw são o peso fresco inicial e final, respectivamente, expressos em gramas, e t é o tempo em dias.
   NOTA: Nesta configuração laboratorial, o RGR atinge valores de até 21% ao dia. A colheita da biomassa pode ser realizada a qualquer momento. A biomassa deve ser rapidamente processada para evitar a degradação por secagem em estufa, liofilização ou simplesmente armazenada congelada (-20 °C), dependendo da utilização pretendida. A biomassa seca pode ser preservada à temperatura ambiente (TR) ou armazenada congelada.

4. Procedimento de extração

NOTA: Para avaliar a citotoxicidade, propriedades antioxidantes e antimicrobianas in vitro dos extratos de G. gracils , sua preparação considera dois parâmetros diferentes: a temperatura de extração e o tipo de solvente.

1. Para realizar as extrações, seque em estufa a biomassa de G. gracilis e triture a biomassa (por exemplo, em um moedor de café doméstico) até que o pó passe por uma peneira de 200 μm.
2. Pesar a biomassa seca (10 g) e dissolvê-la em 100 mL de solvente (etanol absoluto ou água estéril).
3. Mexa em um recipiente protegido da luz por 30 min.
4. Realizar extrações sequenciais de etanol > água e água > etanol a 40 °C e 70 °C.
5. Para cada temperatura, realizar as extrações com etanol e água separadamente duas vezes.
6. Separe os extratos líquidos da biomassa remanescente por filtração através de papel filtro (Whatman No.1), seguida de centrifugação a 8000 x g por 10 min em RT.
7. Reutilize a biomassa algal restante para posterior extração com o outro solvente. Se uma amostra foi extraída primeiro com etanol, extraia-a com água em seguida e vice-versa.
8. Liofilizar os extractos aquosos e evaporar os extractos etanólicos num evaporador rotativo a 40 °C.
9. Conservar os extractos secos a 4 °C.
10. Dissolver os extratos na concentração de 50 mg/mL (ensaios antimicrobianos) ou 10 mg/mL (ensaios antioxidantes). Dissolver os extratos aquosos em água estéril e os extratos etanólicos em etanol absoluto.

5. Atividade antimicrobiana

NOTA: Os extratos etanólico e aquoso devem ser testados individualmente contra Bacillus subtilis subsp. spizizenii (DSM 347), Escherichia coli (DSM 5922) e Listonella anguillarum (DSM 21597). Os testes antimicrobianos devem ser realizados de acordo com as recomendações do National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2012)²². Todas as culturas foram obtidas da Coleção Alemã de Microrganismos e Culturas de Células (DSMZ). L. anguillarum foi cultivada em caldo de soja tríptico (TSB) ou ágar tríptico de soja (TSA) suplementado com cloreto de sódio (NaCl) a 1%. As duas linhagens restantes foram cultivadas em meio LB (VWR Chemicals). spizizenii (DSM 347) e Listonella anguillarum (DSM 21597) foram incubadas a 30 °C, enquanto Escherichia coli (DSM 5922) foi incubada a 37 °C, de acordo com as instruções do fornecedor. O método de microdiluição em caldo pode ser utilizado para a determinação da atividade antimicrobiana em meio líquido, devendo ser realizada em microescala, permitindo que o potencial antimicrobiano seja determinado de forma rápida e eficiente. Este método de baixo custo permite a obtenção de resultados em apenas 24 h, sendo, portanto, adequado para determinar, precocemente, as melhores condições de extração que permitam, para uma determinada cepa microbiana, obter resultados em termos de ação inibitória do crescimento. Entretanto, a metodologia requer o uso de microplacas estéreis com tampa específica para o crescimento microbiano, bem como a disponibilidade de um leitor de microplacas para o comprimento de onda de 600 nm.

1. Realizar os testes de microdiluição em caldo utilizando microplacas de 96 poços não tratadas e de fundo redondo com 170 μL de Caldo Muller-Hinton (MHB), inoculadas com 10 μL de inóculo padronizado (padrão McFarland de 0,5) e 20 μL de cada extrato (50 mg/mL).
2. Incubar as placas durante 24 h à temperatura ideal para cada estirpe.
3. Detectar a atividade antimicrobiana pela redução da turbidez visível medida pelo registro da densidade óptica (OD ₆₀₀) em espectrofotômetro de microplacas, a 0 h e 24 h.
4. Expresse os resultados como uma porcentagem de inibição:
   
   onde Abs. ext é a diferença na absorbância medida, entre 0 h e 24 h, nos poços que contêm cepa bacteriana crescendo na presença do extrato, e Abs refere-se à mesma medida em poços que contêm a cepa bacteriana e o solvente.
5. Neste método, incluem-se as reações de controle, com poços contendo apenas meio de cultura que será o controle negativo, mas também poços com meio inoculado com a cepa padrão adicionada de solvente (etanol ou água) e meio com a cepa bacteriana e o antibiótico controle positivo (cloranfenicol).

6. Atividade antioxidante e quantificação de polifenóis totais

1. Teor de polifenólicos totais
   NOTA: O conteúdo polifenólico total (CPT) é realizado pelo método de Folin-Ciocalteu²³ e adaptado à microescala.
   1. Adicionar a cada poço de uma microplaca de 96 poços, protegida da luz, 158 μL de água ultrapura, 2 μL da amostra e 10 μL do reagente Folin-Ciocalteu.
      ATENÇÃO: Consulte a ficha de dados de segurança do reagente Folin-Ciocalteu entregue pelo fornecedor.
   2. Após 2 min, adicionar 30 μL de Na₂CO₃ (20%).
   3. Após incubação no escuro em TR por 1 h, medir as amostras espectrofotometricamente a 755 nm.
   4. Use ácido gálico (que permite traçar a curva de calibração) ou água ultrapura (2 μL) como controles.
   5. Exprimir os resultados em equivalentes de ácido gálico (mg GAE/g extracto).
2. Atividade sequestradora do radical 2,2 difenil-1-picrilhidrazil (DPPH)
   OBS: A atividade antioxidante dos extratos é avaliada conforme descrito por Duan et al (2006)²⁴, adaptado para microescala
   1. Em uma microplaca de 96 poços protegida da luz, colocar 2 μL de cada amostra (na concentração de 10 mg/mL) e 198 μL de DPPH dissolvidos em etanol absoluto (0,1 mM).
      ATENÇÃO: Consulte a ficha de dados de segurança do DPPH entregue pelo fornecedor.
   2. Execute a reação por 30 min no RT no escuro. Medir a absorbância a 517 nm em espectrofotômetro de microplacas.
   3. Realizar uma reação de controle com 2 μL de etanol absoluto/água destilada e 198 μL de solução de DPPH. Efectuar uma medição em branco com 2 μL de extracto e 198 μL de etanol absoluto.
   4. Expresse os resultados como a porcentagem de inibição do DPPH usando a seguinte equação:
      
      onde As é a absorbância do extrato algal, Ab é a absorbância das amostras em branco e Ac é a absorbância do controle.

7. Avaliação da citotoxicidade em células epidérmicas

OBS: O efeito citotóxico in vitro dos extratos aquoso e etanólico de G. gracilis é avaliado em queratinócitos humanos (células HaCaT - 300493) através do ensaio colorimétrico MTT conforme descrito^{anteriormente25}. As células foram adquiridas da Cell Lines Services, Alemanha (CLS) e o método foi realizado de acordo com as diretrizes institucionais e instruções CLS.
ATENÇÃO: Veja a ficha de dados de segurança do MTT entregue pelo fornecedor)

1. Manutenção de cultura celular
   1. Cultura de células HaCaT em meio de alta glicose (DMEM) Dulbecco's Modified Eagle suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de solução antibiótica/antimicótica (anfotericina B, 0,25 mM; penicilina, 60 mM; estreptomicina, 100 mM).
   2. Use tripsina-EDTA para dissociar as células.
      NOTA: O sub-cultivo de células HaCaT é realizado após as células atingirem confluência total.
   3. Cultivar as células em câmara a 37 °C com 5% de CO₂ e 95% de umidade.
   4. Subcultivar as células de acordo com as instruções do biobanco sempre que as culturas atingirem 80%-85% de confluência.
2. Avaliação da citotoxicidade
   1. Após semear as células em placas de 96 poços e incubar durante a noite, tratar as células HaCaT (4 x 10⁴ células/poço) com os extratos secos previamente dissolvidos em DMSO (100 mg/mL). Em seguida, adicione 2 μL da solução do extrato a 198 μL de meio e incube as placas por 24 h.
   2. Retirar o meio de cultura e adicionar 100 μL de MTT (0,5 mg/mL) às células. Incubar as células por 30 min no escuro em condições de cultura regulares mencionadas acima.
   3. Remover a solução de MTT e solubilizar os cristais de formazana intracelulares com 100 μL de DMSO.
   4. Meça a absorbância a 570 nm usando um leitor de microplacas. Expresse os resultados em percentagem das células de controlo não tratadas.

8. Inovação alimentar

1. Novo produto alimentício: Macarrão com algas marinhas
   1. Seleção de ingredientes e formulação de massas alimentícias
      NOTA: A seleção dos ingredientes foi feita em colaboração com uma empresa de massas. A escolha dos ingredientes-chave (descritos na secção 8.2) foi feita tendo em conta o seu fácil acesso e compatibilidade com as linhas de produção existentes, utilizando recursos marinhos para obter massas com valor nutricional acrescentado.
      1. Após a escolha dos ingredientes, elaborar a formulação seguindo o valor nutricional pretendido (fonte de fibras, vitaminas e elementos minerais, baixo teor de gorduras saturadas), analisando a composição química teórica das formulações por meio de uma planilha eletrônica.
      2. Quando os requisitos teóricos forem cumpridos, proceder à produção em escala laboratorial conforme descrito na etapa 8.1.2.
      3. Realizar um teste sensorial com um painel semi-treinado (>10 provadores) para validar a necessidade de reformulação ou a aceitação da formulação para as etapas seguintes.
         OBS: O painel foi previamente treinado para a degustação de massas e avaliado hedonicamente as formulações apresentadas quanto a atributos como sabor, sabor, odor, textura e aparência.
   2. Produção de massas alimentícias
      NOTA: Produza amostras de massas Chifferi usando uma extrusora de massas.
      1. No equipamento, misture porções previamente definidas de farinha de arroz, G. gracilis e Chlorella vulgaris, e adicione cerca de 30% de água à mistura.
      2. Para obter massas secas, secar Chifferi a 68 °C por 42 min, seguido de 5 h, 30 min a 76 °C, simulando um processo industrial.
      3. Finalmente, embale e sele a vácuo as amostras e armazene-as em local escuro em RT até nova análise.
   3. Análise nutricional
      OBS: Para as análises do perfil nutricional, utilizar amostras secas e maceradas em triplicata.
      1. Teor de proteína bruta: Realizar ensaio de proteína total através do método de Kjeldahl , adaptado de Duarte et al (2022)²⁶, seguindo os passos 8.1.3.2-8.1.3.6.
      2. Pesar com precisão 1,0 g de amostra (ou água destilada para o ensaio em branco) e misturar com dois comprimidos de Kjeldahl e 25 ml de H₂SO₄ em tubos de digestão.
         ATENÇÃO: Consulte a ficha de dados de segurança da H₂SO₄ entregue pelo fornecedor.
      3. Efectuar a digestão das amostras num digestor Kjeldahl a 220 °C durante 30 minutos, seguindo-se 90 minutos a 400 °C.
      4. Após arrefecer até RT, adicionar 80 ml de água destilada e destilar o amoníaco formado em 30 ml de uma solução de 4% H 3BO₃ contendo verde de bromocresol e vermelho de metilo. Esta etapa ocorre em condições alcalinas (destilação com NaOH a 40% usando um destilador Kjeldahl.
         CUIDADO: Consulte a ficha de dados de segurança da solução H3 BO₃ contendo verde de bromocresol, vermelho de metilo e NaOH a 40% fornecida pelo fornecedor.
      5. Titular as amostras destiladas com HCl 0,1 M até se observar uma mudança de cor para um rosa acinzentado.
      6. Calcular o teor de proteína bruta, representado pelo teor de azoto da amostra, e exprimi-lo em g por 100 g utilizando a seguinte equação:
         
         onde V_s corresponde ao volume de HCl (mL) utilizado na titulação da amostra; V_b corresponde ao volume utilizado no espaço em branco; N corresponde à normalidade do HCl; w corresponde ao peso da amostra (g).
      7. Teor de gordura total: Determinar o teor de gordura total utilizando o método de Folch, adaptado de Folch et al (1957)²⁷, seguindo os passos 8.1.3.8-8.1.3.14.
      8. Preparar o reagente Folch misturando CHCl₃ e MeOH numa proporção de 2:1 (v:v).
         ATENÇÃO: Consulte a Ficha de Dados de Segurança do reagente Folch entregue pelo fornecedor.
      9. Para tubos de ensaio contendo alíquotas de 1 g de amostras, adicionar 5 mL de reagente de Folch e 0,8 mL de água destilada. Misture em um vórtice por 1 min.
      10. Em seguida, adicione mais 5 mL do reagente Folch e homogeneize por 5 min. Adicionar 1,2 mL de solução de NaCl a 0,8% e homogeneizar por 2 min_.
      11. Centrifugar as amostras a 7000 x g durante 10 min. Filtrar a fase orgânica (fase inferior) através de algodão hidrofílico e sulfato de sódio anidro para um balão de vidro de fundo redondo.
      12. Para evitar a perda da amostra, repita as etapas de adição de 5 mL de CHCl₃, homogeneização, centrifugação e filtração nas mesmas condições.
      13. Retire o solvente orgânico das fases orgânicas coletadas por evaporação a baixa pressão e deixe no forno a 105 °C por 4 h. Resfriar as amostras em um dessecador.
      14. Calcular o teor de matéria gorda, expresso em g por 100 g, utilizando a seguinte equação:
          
          onde W₁ é o peso vazio do frasco de vidro de fundo redondo; W₂ é o peso inicial da amostra; W₃ é o frasco de vidro de fundo redondo com o peso da amostra.
      15. Teor de fibra bruta: Determinar o teor de fibra bruta utilizando uma metodologia adaptada da ISO 6865 (2000)²⁸, seguindo os passos 8.1.3.16-8.1.3.22.
      16. Pesar 1 g da amostra (W0) num cadinho de vidro com fundo filtrante (referência P2) e colocá-lo no analisador de fibras.
      17. O primeiro passo é a hidrólise ácida: adicionar 150 mL de H 2 SO₄ a 1,25%, pré-aquecido, e₂mL de agente antiespumante (n-octanol) à coluna de cada cadinho; Aqueça até ferver e mantenha por 30 min.
      18. Após a remoção deste solvente, lavar três vezes com água deionizada para proceder à hidrólise básica. Adicionar 150 mL de NaOH a 1,25%, pré-aquecido, e 5 mL de agente antiespumante à coluna livre de líquido e realizar o mesmo procedimento de aquecimento da hidrólise ácida.
      19. Por fim, faça uma lavagem tripla com 150 mL de acetona para a extração a frio.
      20. Após este processo, retire cuidadosamente os cadinhos do sistema e coloque-os num forno a 150 °C durante 1 h. Registre o peso final (W1).
      21. Colocar os cadinhos numa mufla a 500 °C durante 3 h e, em seguida, registar o peso final (W2).
      22. Calcule o teor bruto de fibras e expresse os resultados em porcentagens usando a seguinte equação:
          %Fibra bruta = 100 x (W1-W2)/W0
      23. Perfil de ácidos graxos (AG): Determinar o perfil de ácidos graxos de acordo com Fernández et ^al.29, seguindo as etapas 8.1.3.24-8.1.3.29.
          NOTA: Os ácidos graxos ésteres metílicos (FAMEs) são obtidos por transmetilação direta catalisada por ácido das amostras liofilizadas moídas. Todas as análises são feitas em triplicata.
      24. Adicionar 2 ml de uma solução de 2% (v/v) H 2 SO₄ em metanol a uma amostra de 50 mg e deitar a mistura a 80 °C durante₂h com agitação contínua.
          ATENÇÃO: Consulte a ficha de dados de segurança do metanol entregue pelo fornecedor.
      25. Após o resfriamento para RT, adicionar 1 mL de água ultrapura e 2 mL de n-heptano a cada amostra, agitar a mistura por 1 min e centrifugar por 5 min.
          ATENÇÃO: Consulte a ficha de dados de segurança do n-heptano entregue pelo fornecedor.
      26. Recuperar a fase n-heptano superior (orgânica) contendo os FAMEs e transferi-la para frascos de cromatografia gasosa (GC).
      27. Analise em um cromatógrafo gasoso equipado com uma coluna capilar TR-FAME (60 m × 0,25 mm ID, 0,25 μm de espessura de filme), um amostrador automático e um detector de ionização de chama (FID).
      28. Ajuste o injetor (modo splitless) a 250 °C e o detector a 280 °C. Ajuste a temperatura inicial da coluna em 75 °C e segure por 1 min. Em seguida, aumente a 5 °C/min a 170 °C e segure por 10 min. Em seguida, aumente a 5 °C/min a 190 °C e segure mais 10 min. Por fim, eleve a 2 °C/min a 240 °C e segure por 10 min. Use hélio como gás carreador a uma taxa de fluxo de 1,5 mL/min. Fornecer ar e hidrogênio a vazões de 350 e 35 mL/min, respectivamente.
      29. Determine o perfil de AF comparando os tempos de retenção resultantes com um padrão e expresse os resultados como uma porcentagem da gordura total.
      30. Perfil dos elementos minerais: Determinar os elementos minerais (Ca, P, Mg, Na, K, Fe,, Mn, Zn) analisados por ICP-OES, seguindo o método adaptado de Pinto et al (2022)³⁰, seguindo os passos 8.1.3.31-8.1.3.34.
      31. Pesar com precisão cerca de 0,4 g de cada amostra seca e adicionar 7,5 mL de HNO₃ e 2,5 mL de HCl.
          ATENÇÃO: Consulte a ficha de dados de segurança do HNO₃ e HCl entregue pelo fornecedor.
      32. A digestão segue um processo de duas etapas: aumentar a temperatura de RT para 90 °C em 30 min (e manter mais 30 min nesta temperatura) seguido de 60 min a 105 °C.
      33. Resfriar as soluções da amostra, diluí-las em 25 mL, filtrá-las e mantê-las em tubos marcados. Em cada digestão, realize o mesmo processo com um material de referência e um branco. Obter a concentração dos diferentes elementos por ICP-OES.
      34. Expresse os resultados em mg por 100 g de fw.
      35. Teor de hidratos de carbono: Calcular o teor de hidratos de carbono de acordo com os passos 8.1.3.36-8.1.3.37.
      36. Calcular o teor de carboidratos disponíveis (excluindo fibras) pela diferença dos fatores previamente determinados por 100 g, utilizando a seguinte equação, de acordo com a Food and Agriculture Organization (FAO; 2003)³¹
          
      37. Expresse os resultados em g por 100 g.
      38. Teor de humidade e cinzas: Estimar os teores de humidade e cinzas de acordo com os passos 8.1.3.39-8.1.3.45.
      39. Incubar cadinhos de porcelana durante 3 h a 105 °C, arrefecê-los num exsicador e pesá-los.
      40. Pesar 10 g da amostra no cadinho e colocá-la num forno de secagem a 105 °C durante ciclos de 3 h até que os valores das pesagens sucessivas não difiram mais de 10 mg.
      41. Calcular o teor de humidade, expresso em g por 100 g de fw, utilizando a seguinte equação:
          
          onde W₁ é o peso do cadinho vazio, W₂ é o peso do cadinho com a amostra fresca e W₃ é o peso do cadinho com a amostra seca.
      42. Após o ensaio do teor de humidade, colocar os cadinhos com as amostras secas num incinerador a 525 °Cdurante 4 horas.
      43. Repita este procedimento até que as ponderações sucessivas não difiram mais de 1 mg.
      44. Resfriar as amostras para RT em um exsicador e, em seguida, pesá-las.
      45. Calcular o teor de cinzas, expresso em g por 100 g de fw, utilizando a seguinte equação:
          
          onde W₁ é o peso do cadinho vazio, W₂ é o peso do cadinho com amostra fresca, W₃ é o peso do cadinho com peso.
      46. Valor energético: Calcule o valor energético seguindo os passos 8.1.3.47-8.1.3.48.
      47. Calcular o valor energético das amostras de acordo com o regulamento da UE:Fornecimento de informação alimentar aos consumidores (Regulamento 1169/2011)³², utilizando as equações:
          Energia (kcal/ 100 g) = 4 x (g proteínas) + 4 x (g carboidratos) + 9 x (g gordura) + 2 x (g fibra)
          Energia (kJ/ 100 g) = 17 x (g proteínas) + 17 x (g carboidratos) + 37 x (g gordura) + 8 x (g fibra)
      48. Expresse os resultados em quilocalorias por 100 g e quilojoules por 100 g.
   4. Aceitação do consumidor
      1. Avaliar a aceitação do consumidor utilizando amostras de massas cozidas em água destilada por 8 min.
      2. Realize o teste de aceitação do consumidor: avalie a aparência visual, a cor, a textura, o odor, o sabor do mar, o sabor geral, a avaliação geral e a intenção de compra das amostras.
         NOTA: O teste de aceitação do consumidor é baseado em testes hedônicos que avaliam aparência visual, cor, textura, odor, sabor do mar, sabor geral, avaliação geral e intenção de compra em uma escala de 1 a 9, onde 1 é uma avaliação ruim e 9 é uma avaliação muito boa.
      3. Realizar testes sensoriais em cabines sensoriais individuais em laboratório de análise sensorial (com controle de temperatura e iluminação). Forneça talheres, guardanapos e copos de vidro de água mineral para limpar o paladar entre as amostras.
         NOTA: Os provadores têm entre 16 e 64 anos de todas as origens (n > 80).
2. Iogurte
   1. Extração de pigmentos
      OBS: Realizar a extração do pigmento através da metodologia descrita em Pereira et al (2020)¹⁸.
      1. Preparar o solvente de extracção, tampão fosfato de sódio a 0,1 M, com fosfato de sódio dibásico (0,03 M) e fosfato de sódio monobásico (0,07 M). Ajuste o pH em pH 6,8 usando NaOH ou HCl.
      2. Pesar 1 g de G. gracilis e adicionar 50 ml de tampão fosfato de sódio (pH 6,8). Homogeneizar por 10 min, seguido de 10 min de maceração com argamassa e pilão.
      3. Transferir a solução para um tubo e centrifugar durante 20 minutos a 12,298 x g (4 °C).
      4. Junte o sobrenadante e adicione lentamente 65% de sulfato de amônio. Quando todo o sulfato de amónio estiver dissolvido, cubra a solução com uma folha de alumínio e deixe-a precipitar a 4 °C durante a noite.
         ATENÇÃO: Consulte a ficha de dados de segurança do sulfato de amônio entregue pelo fornecedor.
      5. Centrifugar o precipitado durante 20 minutos a 12,298 x g (4 °C). Recuperar o pellet e dissolver em água destilada (aproximadamente 5 mL).
      6. Realizar diálise do extrato utilizando membrana tubular (14 kDa) contra água por 24 h, seguida de liofilização. Conservar o extracto liofilizado protegido da luz a 4 °C até à utilização.
   2. Preparação de iogurte
      1. Prepare o iogurte natural misturando 1 L de leite pasteurizado, 120 g de iogurte natural, 20 g de açúcar e 50 g de leite em pó em uma termomisturadora por 5 min, 50 °C, velocidade 3.
      2. Colocar a mistura no frasco termomisturador numa incubadora a 37 °C durante 12 horas.
      3. Incorpore o extrato misturando-o em iogurte a uma concentração de 0,21%. Conservar as amostras em frascos de vidro individuais a 4 °C até à análise.
      4. Conservar porções individuais de iogurte sem pigmento (controlo) a 4 °C até à análise.
   3. Estabilidade de cor
      OBS: Avaliar a estabilidade do pigmento nos iogurtes através da análise de cor por 12 dias. Realize a análise de cores usando um colorímetro de reflectância, usando um observador padrão de 2 graus e um iluminador D65. Os resultados são apresentados como coordenadas CIELab com os parâmetros L (luminosidade, preto - branco, 0 - 100), a* (verde - vermelho, -60 - 60) e b* (azul - amarelo, -60 - 60). O parâmetro a* tem valores positivos para cores avermelhadas e valores negativos para cores esverdeadas. O parâmetro b* considera valores positivos para cores amareladas e valores negativos para cores azuladas. L* é o parâmetro de luminosidade, que é a propriedade segundo a qual cada cor pode ser considerada equivalente a um membro da escala de cinza entre o preto e o branco³³.
      1. Calibrar o colorímetro usando uma placa cerâmica branca (L* 88.5, a* 0.32, b* 0.33) fornecida pelo fabricante.
      2. Preencha uma célula com aproximadamente 28 g da amostra (ou controle) e analise a cor usando um software de análise de dados de cor.
         NOTA: O software utilizado para análise dos dados de cor foi o SpectraMagic NX.
      3. Realizar leituras 5 vezes em triplicatas amostra/controle.
   4. Análise sensorial
      OBS: Realizar avaliação sensorial de iogurtes com incorporação de pigmentos utilizando um teste de triângulo (ISO 4120, 2004)³⁴ e uma avaliação hedônica de cor, sabor e apreciação geral.
      1. Para o teste do triângulo, dê aos provadores três amostras (uma amostra de iogurte com pigmento e duas amostras de controle, ou duas amostras de iogurte com pigmento e um controle) e peça-lhes que escolham uma amostra diferente com base no aroma, textura e sabor. Forneça amostras em volumes semelhantes identificados com códigos aleatórios de 3 números.
      2. Para a avaliação hedônica do iogurte com pigmento, dê aos painelistas uma amostra de iogurte com pigmento e peça-lhes que avaliem a cor, o sabor e a apreciação geral usando uma escala hedônica de 9 pontos (de extremamente antipática a extremamente gostada).

Representative Results

Atividade antimicrobiana

Ao interpretar os resultados obtidos, deve-se ter em mente que quanto maior o percentual de inibição, maior a eficácia do extrato em inibir o crescimento daquela cepa específica e, consequentemente, mais interessante é o extrato como antimicrobiano. Através desta metodologia, podemos identificar rapidamente quais extratos têm maior atividade sobre determinadas cepas bacterianas, identificando também os mais interessantes em termos de uso futuro. Podemos, assim, ter um ponto de partida para novos estudos sobre esse mesmo extrato.

A Figura 1 apresenta os resultados obtidos com os extratos aquosos, tanto na primeira quanto na segunda extração, imediatamente após a secagem da biomassa (Figura 1A) e na terceira e quarta extrações (Figura 1B), obtidos após as extrações etanólicas, utilizando-se a biomassa integralmente. Podemos observar que os resultados mais interessantes, correspondentes à terceira e quarta extrações aquosas, revelam maior atividade antimicrobiana, particularmente nos extratos obtidos a 70 °C. A concentração de extrato nos poços é de 5 mg/mL.

Figura 1: Inibição do crescimento de espécies bacterianas na presença de extratos aquosos de G. gracilis. Inibição do crescimento de 3 espécies bacterianas (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Listonella anguillarum) após 24 h de crescimento em meio líquido, na presença de extratos aquosos (Aq) de G. gracilis obtidos em diferentes temperaturas, temperatura ambiente (TR), 40 °C (40) e 70 °C (70). O controle positivo foi feito com cloranfenicol (CHL), e os resultados estão expressos em valores médios (n = 8). Os dados referem-se às 4 etapas sequenciais de extração (1ª, 2ª, 3ª, ^4ª). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os extratos etanólicos parecem ser particularmente eficazes na inibição do crescimento de L. anguillarum, como mostrado na Figura 2. Isto mostra os resultados obtidos com os extratos etanólicos, também na primeira e segunda extrações (Figura 2A) e na terceira e quarta extrações (Figura 2B), obtidos após a primeira extração aquosa.

Figura 2: Inibição do crescimento de espécies bacterianas na presença de extratos etanólicos de G. gracilis. Inibição do crescimento de 3 espécies bacterianas (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Listonella anguillarum) após 24 h de crescimento, em meio líquido, na presença de extratos etanólicos (Et) de G. gracilis, obtidos em diferentes temperaturas, temperatura ambiente (TR), 40 °C (40) e 70 °C (70). O controle positivo foi feito com cloranfenicol (CHL), e os resultados foram expressos em valores médios (n = 8). Os dados referem-se às 4 etapas sequenciais de extração (1ª, 2ª, 3ª, ^4ª). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Atividade antioxidante

Em relação aos resultados que destacam o potencial antioxidante dos diversos extratos, nomeadamente no teste DPPH, os resultados expressos na Figura 3 indicam que a temperatura de 40 °C foi a mais eficaz, resultando em valores de inibição da atividade oxidante superiores aos observados nos extratos obtidos a TR ou 70 °C. Isso é válido para as amostras de G. gracilis , e pode haver grandes variações dependendo das amostras utilizadas e das condições de crescimento algal. Assim, recomenda-se a realização de testes para indicar as melhores condições para cada tipo específico de amostra.

Figura 3: Inibição do radical DPPH (%) na presença de extratos obtidos em diferentes temperaturas. Os extratos foram obtidos por extração etanólica (Et) ou aquosa (Aq). A 1ª e^2ª extrações foram feitas a partir de biomassa seca sequencialmente. Os demais (3ª e^4ª) foram confeccionados com biomassa previamente extraída com o solvente alternativo. RT significa temperatura ambiente; 40, extracto obtido a 40 °C; e 70, extrato obtido a 70 °C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados semelhantes foram obtidos em termos de quantificação de polifenóis totais (Figura 4), sendo a temperatura de 40 °C considerada a melhor em termos de extração de compostos antioxidantes. Isso mostra que a atividade antioxidante parece estar correlacionada com os componentes fenólicos presentes nos extratos.

Figura 4: Quantificação do teor de polifenóis totais (TPC) em extratos obtidos em diferentes temperaturas. Os extratos foram obtidos por extração etanólica (Et) ou aquosa (Aq), onde a 1ª e 2ª extração foram feitas sequencialmente a partir de algas secas e as demais (3ª e ^4ª) foram feitas com biomassa previamente extraída com outro solvente. RT significa temperatura ambiente; 40, extracto obtido a 40 °C; e 70, extrato obtido a 70 °C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Citotoxicidade em células HaCat

O primeiro passo para avaliar a segurança dos ingredientes cosméticos é o estudo de sua citotoxicidade in vitro em linhagens celulares epidérmicas e dérmicas. Como pode ser observado na Figura 5, não foram observados efeitos citotóxicos sobre os queratinócitos (células HaCaT), sugerindo que, na concentração máxima ensaiada (1 mg/mL), tanto o extrato aquoso quanto o etanólico são seguros para uso cutâneo.

Figura 5: Efeito citotóxico dos extratos de Gracilaria gracilis (1 mg/mL) sobre as células HaCaT após 24 h de tratamento. Os valores em cada coluna são expressos como a média ± o erro padrão da média (EPM) de três experimentos independentes em triplicata. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Inovação alimentar

As formulações finais de massas foram obtidas após inúmeros ensaios entre formulação teórica e testes sensoriais por um painel semi-treinado. Após essa etapa, foi realizada a caracterização química, incluindo avaliação nutricional, perfis de ácidos graxos e elementos minerais. Foi possível construir uma caracterização nutricional (Tabela 1 e Tabela 2) e verificar a existência de alegações nutricionais esperadas com base na legislação europeia (REG (UE) nº 1169/2011)³².

Informação Nutricional		por 100 g de Macarrão	% IDI
Energia		1478,90 kJ (348,74 kcal)	17
Lípidos		1,06 ± 0,10 gr	2
Do que:
	Ácidos graxos saturados	0,38 ± 0,01 gr	2
	Carboidratos	72,59± 0,21 gr	28
	Fibra	3,84 ± 0,20 gr
	Proteína	10.29 ± 0.20 g	21
	Sal	0,22 ± 0,02 gr	9

Tabela 1: Dados nutricionais. Informação nutricional de massas alimentícias desenvolvidas com base em análises químicas (n=3) de energia e carboidratos obtidos por cálculo e respectivo percentual de dose recomendada ingerida (n = 3).

Essas formulações de massas foram projetadas para atrair um consumidor-alvo que tenha uma dieta mais saudável em mente, portanto, a quantidade de gordura por 100 g de um produto deve ser a menor possível. A análise detalhada do perfil de ácidos graxos mostra um valor de 0,38 g de ácidos graxos saturados/100 g, que está bem abaixo do limite para produtos com baixo teor de gordura saturada, cumprindo a meta inicial na produção dessa massa. Em relação ao teor de fibras, também foi possível, de acordo com as regulamentações europeias, reivindicar essa formulação de massa como fonte de fibra.

Na caracterização do elemento mineral, determinada por ICP-OES e apresentada na Tabela 2, é relatado o valor de cerca de 219 mg/100 g de Na presente em 100 g deste produto, portanto não se pode verificar que se trata de um produto com baixo teor de sódio (<0,12 g/100 g). Devido ao elevado teor de sódio naturalmente presente nos ingredientes, este produto pode não necessitar da adição de sal na sua confecção.

Tabela 2: Perfil dos elementos minerais das massas. Azul - alto teor de elemento; Vermelho - fonte de um determinado elemento (n = 3). Clique aqui para baixar esta tabela.

De acordo com o referido regulamento da União Europeia e o IDR % para cada elemento, pode-se observar que este produto possui alto teor de K, P, Fe, além de ser fonte de Zn. Tem Se, Mg e Ca presentes em menores quantidades.

Para os testes de aceitação de massas, foram utilizados 86 testadores, sendo 63 do sexo feminino e 23 do sexo masculino, com idade superior a 18 anos. Os testes de aceitação foram baseados em escalas hedônicas de 9 pontos, conforme estipulado nas normas. A massa Saudável obteve pontuação 5 e 6 em escala hedônica de 1 a 9 para os parâmetros "Gosto do mar" e "Aparência visual", respectivamente (Figura 6).

Figura 6: Resultados dos testes sensoriais de aceitação do consumidor . (A) A escolha hedônica para aparência visual, cor, textura, odor, sabor do mar e sabor geral. (B) A escolha hedônica para apreciação geral e intenção de compra. Escala de 1 a 9, onde 1 é uma avaliação ruim e 9 é uma avaliação muito boa (n = 86). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O macarrão obteve notas 5 e 6 em escala hedônica de 1 a 9 para os parâmetros "Gosto do mar" e "Aparência visual", respectivamente (Figura 6A). Esse macarrão obteve baixo valor nessa escala quanto ao parâmetro textura (considerando outras formulações já estudadas), provavelmente porque o ingrediente base é a farinha de arroz; Apesar disso, obteve valores em uma escala de 1 a 9, variando de 4 a 7, o que reflete uma boa aceitação pelo consumidor médio. Em uma escala hedônica de 1 a 9, o macarrão teve como respostas mais frequentes o valor de 5 para intenção de compra e o valor de 6 para apreciação geral, como mostra a Figura 6B. Verificou-se que cerca de 65% dos provadores escolheram uma resposta igual ou superior ao escore 6 para a avaliação global dessa massa. A estabilidade de cor dos iogurtes com pigmento foi avaliada por 12 dias a -4 °C, e os resultados estão apresentados na Figura 7.

Figura 7: Estabilidade de cor dos iogurtes. (esquerda) Controle iogurtes e iogurtes (à direita) com pigmento Gracilaria gracilis durante 12 dias de armazenamento. Os parâmetros a*, b* e L* são adimensionais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os resultados indicam que os parâmetros a* e b* mantiveram-se estáveis ao longo do tempo, enquanto os valores de L* apresentaram maior variância. A luminosidade apresentou maiores valores após 8 dias de armazenamento. Enquanto algumas diferenças foram encontradas nos parâmetros de luminosidade, indicando que as amostras foram mais claras ao longo do tempo, os parâmetros de vermelhidão (a*) e azul (b*) apresentaram boa estabilidade. A incorporação dos extratos nos iogurtes apresentou boa retenção de cor, com ΔE de 7,01 ± 2,36 após 12 dias de armazenamento. Em relação à avaliação sensorial do iogurte, 9 em cada 13 provadores identificaram corretamente a amostra correta no teste do triângulo, sugerindo que houve diferenças entre os iogurtes que permitiram essa distinção. Os testes hedônicos realizados no painel semitreinado mostraram boa aceitação do produto, refletida em escores acima de 7 (Figura 8). A moda do escore para qualquer um dos três atributos em teste foi 9, levando a médias de pontuação acima de 8. A melhor avaliação foi feita para a cor, o que reflete uma excelente aceitação pelo painel, resultado revelador.

Figura 8: Resultados da avaliação sensorial hedônica do iogurte com pigmento Gracilaria gracilis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Os testes de atividade antimicrobiana em meio líquido são utilizados para avaliar a eficácia de substâncias antimicrobianas contra microrganismos suspensos em meio líquido e geralmente são realizados para determinar a capacidade de uma substância inibir o crescimento ou matar microrganismos^35,36,37,38. São utilizados para avaliar a sensibilidade de microrganismos a agentes antimicrobianos e são conduzidos em tubos de ensaio ou placas de microtitulação, onde diferentes concentrações da substância antimicrobiana são testadas contra uma suspensão padronizada do microrganismo-alvo²². A atividade antimicrobiana é avaliada medindo-se o crescimento microbiano ou a presença/ausência de turbidez no meio de cultura após um período de incubação adequado.

Existem várias técnicas e métodos para a realização desses testes, como o método de diluição em caldo, o método de difusão em ágar (como o teste de difusão em disco) e o método de microdiluição em caldo, que é um dos mais utilizados³⁸. Alguns dos pontos mais críticos desses métodos incluem o preparo adequado do inóculo, a escolha do meio de cultura, a qualidade dos antimicrobianos utilizados, a padronização da técnica e o controle efetivo da contaminação. O inóculo, que é uma suspensão padronizada de microrganismos, deve ser preparado corretamente para garantir a precisão dos resultados. Isso envolve uma seleção apropriada de cultura microbiana, uma cultura adequada de cepas puras, ajuste da concentração celular e padronização da suspensão para obter uma densidade óptica ou concentração celular apropriada.

O meio de cultura utilizado deve ser cuidadosamente selecionado para garantir que proporcione as condições ideais de crescimento para o microrganismo em teste. A composição química, o pH e outros fatores podem afetar os resultados dos testes. É importante seguir as recomendações do fabricante para o preparo do meio de cultura. A qualidade dos antimicrobianos utilizados como controle é fundamental, sendo importante garantir que estes estejam puros, dentro do prazo de validade e armazenados corretamente. A rotulagem e os prazos de validade devem ser sempre consultados, seguindo as instruções do fabricante. A padronização da técnica também é fundamental para garantir a acurácia dos resultados. Isso inclui a adição das concentrações testadas ao meio de cultura, bem como a manutenção de condições assépticas durante todo o procedimento. Além disso, a contaminação cruzada de microrganismos durante os testes pode levar a resultados falsos ou não confiáveis. É essencial seguir práticas assépticas rigorosas durante todo o procedimento, desde a manipulação do inóculo até a incubação dos tubos ou placas. O uso de bancadas limpas, técnicas adequadas de pipetagem e descarte adequado de materiais são medidas importantes para evitar a contaminação.

A atenção aos detalhes e a estrita adesão aos protocolos e diretrizes estabelecidos são fundamentais para minimizar erros e garantir a confiabilidade dos resultados em testes de atividade antimicrobiana em meio líquido. Além disso, os testes de atividade antimicrobiana apresentam algumas limitações que devem ser consideradas³⁷.

Fatores como pH, temperatura, presença de componentes sanguíneos e interações com o sistema imunológico não são considerados nesses testes, o que pode limitar a capacidade de prever a eficácia de um agente antimicrobiano em um organismo vivo. Além disso, os testes medem a capacidade de uma substância antimicrobiana de inibir o crescimento microbiano ou matar microrganismos e não fornecem informações detalhadas sobre o mecanismo de ação do antimicrobiano ou sua seletividade contra microrganismos específicos. Existem limitações na detecção de resistência, pois os métodos empregados podem não permitir a detecção ou previsão do desenvolvimento de resistência ao longo do tempo. Alguns microrganismos podem desenvolver mecanismos de resistência em resposta à exposição prolongada a um antimicrobiano, e essas alterações podem não ser facilmente detectadas por meio desses testes. Testes de atividade antimicrobiana em meio líquido geralmente não consideram outros fatores do hospedeiro que possam influenciar a eficácia de um agente antimicrobiano, como a presença de biofilmes ou a resposta imune do hospedeiro.

É importante considerar essas limitações e complementar o teste de atividade antimicrobiana em meio líquido com outros métodos e abordagens, como estudos in vivo , modelos de biofilme e outros³⁹. Na área de bioprospecção de compostos bioativos de macroalgas, testes de atividade antimicrobiana podem ser utilizados para avaliar o potencial antimicrobiano de extratos de algas ou compostos isolados, identificando substâncias com atividade antimicrobiana contra patógenos microbianos específicos, que podem ter aplicações em campos como a produção de medicamentos, cosméticos, alimentos ou produtos agrícolas⁴⁰.

Testes de atividade antioxidante são métodos usados para avaliar a capacidade de um composto ou extrato em neutralizar radicais livres ou reduzir o estresse oxidativo. Esses testes são amplamente utilizados em pesquisas antioxidantes, tanto em alimentos quanto em produtos naturais como algas, por exemplo. Existem vários métodos para avaliar a atividade antioxidante, sendo um dos mais utilizados é a capacidade de absorção de radicais livres. Neste teste, um radical livre estável, o 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH), é usado para avaliar a capacidade de um composto de doar um elétron e neutralizar o radical livre. A atividade antioxidante é medida pela redução da cor roxa do DPPH, que ocorre quando o composto antioxidante doa um elétron ao radical livre. Outros métodos incluem a capacidade de absorção de radicais de oxigênio (ORAC), a capacidade de redução de ferro (FRAP) ou a capacidade de redução de radicais livres (ABTS)⁴¹.

A quantificação de polifenóis totais (QTP), por outro lado, não é um método direto para determinar a atividade antioxidante, mas fornece uma medida da concentração total de polifenóis em uma amostra, embora várias substâncias interferentes possam afetar os resultados. Embora muitos polifenóis sejam conhecidos por possuírem propriedades antioxidantes, a atividade antioxidante de um composto está relacionada a vários fatores, como sua estrutura química, concentração, capacidade de doar ou capturar radicais livres e interações com outros componentes celulares⁴². A simples quantificação de polifenóis totais não pode fornecer uma avaliação da atividade antioxidante da amostra. No entanto, é importante notar que a presença de polifenóis em uma amostra pode estar associada a uma maior probabilidade de atividade antioxidante, uma vez que muitos polifenóis possuem propriedades antioxidantes. Assim, o QTP pode servir como um indicador preliminar da presença de polifenóis na amostra, mas a confirmação da atividade antioxidante requer ensaios de atividade antioxidante. Polifenóis são uma classe de compostos químicos amplamente distribuídos na natureza, encontrados em alimentos, plantas, frutas, vegetais e algas. Existem diferentes métodos para a quantificação de polifenóis totais, sendo o método de Folin-Ciocalteu um dos mais utilizados. QTP fornece uma medida geral da concentração de polifenóis, mas não especifica os compostos polifenólicos individuais presentes na amostra. Trata-se, portanto, de um método quantitativo, mas não qualitativo. Além disso, é importante considerar que diferentes polifenóis possuem diferentes capacidades antioxidantes e atividades biológicas, de modo que a QTP não fornece informações detalhadas sobre as propriedades funcionais específicas dos polifenóis presentes.

Cada método tem suas vantagens e limitações, e a escolha de um determinado ensaio depende das características do composto em estudo e do objetivo da análise. É importante seguir as instruções específicas de cada método para garantir resultados confiáveis e comparáveis. Ao determinar a capacidade antioxidante, algumas das etapas críticas comuns incluem, em primeiro lugar, a preparação da amostra. É importante preparar as amostras corretamente, garantindo que concentrações adequadas sejam obtidas e evitando contaminação. Isto implica a pesagem precisa dos compostos ou extractos e a sua dissolução em solventes adequados. Também é importante considerar a estabilidade dos compostos e extratos durante o processo de preparação, armazenamento e manuseio. Todos os reagentes utilizados nos testes de atividade antioxidante devem ser adequadamente preparados e padronizados para garantir a reprodutibilidade dos resultados. Isso envolve a preparação correta do padrão de ácido gálico e a precisão dos volumes. O tempo de reação é um aspecto crítico para obter resultados precisos em testes antioxidantes. É necessário otimizar o tempo de incubação para garantir uma reação completa entre o composto antioxidante e o radical livre. O tempo insuficiente pode levar à subestimação da atividade antioxidante, enquanto o tempo excessivo pode resultar em degradação dos compostos ou interferência de reações secundárias. Além disso, a temperatura durante os ensaios deve ser controlada de forma precisa e consistente. A temperatura influencia a velocidade das reações químicas e pode afetar os resultados. É importante seguir as condições de temperatura recomendadas pelos métodos específicos e garantir a estabilidade da temperatura durante todo o procedimento. A inclusão de controles adequados é essencial para validar os resultados dos testes antioxidantes. Isso pode incluir controles positivos (compostos conhecidos por terem atividade antioxidante) e controles negativos (amostras sem atividade antioxidante). Os controles fornecem uma base de comparação para a interpretação dos resultados e ajudam a garantir a precisão dos dados obtidos. Para obter resultados confiáveis, recomenda-se realizar testes de atividade antioxidante em réplicas e repetir o experimento várias vezes para aumentar a significância dos dados e obter resultados mais confiáveis e robustos.

Os métodos de teste de atividade antioxidante apresentam algumas limitações que devem ser consideradas na interpretação dos resultados, a saber, o fato de que, em meios líquidos, eles podem não capturar totalmente a complexidade dos sistemas biológicos e interações entre diferentes compostos, a ampla gama de reações antioxidantes que podem ocorrer, o metabolismo celular e fatores ambientais que podem influenciar a atividade antioxidante. Assim, diferentes testes devem ser utilizados. Também é preciso estar atento à falta de correlação direta com benefícios à saúde; Embora a atividade antioxidante seja frequentemente associada a benefícios para a saúde, isso nem sempre se traduz diretamente em benefícios para a saúde em organismos vivos devido a muitos outros fatores, como biodisponibilidade, metabolismo e interações com outros sistemas biológicos.

É importante ter em mente que os testes de atividade antioxidante são ferramentas úteis para a avaliação inicial do potencial antioxidante de compostos e extratos, mas não devem ser considerados um indicador definitivo de efeitos biológicos ou benefícios à saúde. Estudos adicionais são necessários para entender completamente o impacto dos antioxidantes no corpo.

Embora os métodos de teste da atividade antioxidante em meio líquido sejam amplamente utilizados em pesquisas e tenham suas vantagens e limitações, quando comparados às alternativas, esses métodos podem ser considerados bons em termos de praticidade, rapidez, custo e facilidade de implementação. Uma das principais vantagens é a simplicidade e rapidez dos procedimentos e sua adequação para pesquisas iniciais, triagem de compostos e estudos em larga escala. Esses métodos são relativamente rápidos de serem executados e podem fornecer resultados em um curto período, de forma mais acessível e requerem equipamentos menos especializados em comparação com outros métodos.

As algas são conhecidas por sua capacidade de produzir compostos bioativos, incluindo antioxidantes, que podem ter propriedades benéficas à saúde⁴³. Os extratos de algas podem ser preparados a partir de diferentes partes das algas e podem ser obtidos usando diferentes solventes, como água, etanol, metanol, acetona, entre outros. É importante lembrar que a atividade antioxidante dos extratos de algas pode variar dependendo de vários fatores, como as espécies de algas, a metodologia de extração e a concentração dos compostos bioativos presentes. Portanto, recomenda-se a realização de testes de atividade antioxidante em réplicas e comparações com controles apropriados para obter resultados mais confiáveis. Estes métodos podem ser utilizados como ferramenta inicial na triagem e seleção de extratos de algas com potencial antioxidante para estudos posteriores.

O ensaio MTT é uma técnica amplamente utilizada para uma avaliação preliminar dos efeitos citotóxicos in vitro de substâncias para uso humano e animal. Entretanto, apesar de ser o método mais utilizado para testar a citotoxicidade, a conversão do MTT em cristais de formazana é influenciada por inúmeros fatores, como a taxa metabólica e o número de mitocôndrias, sendo aplicável apenas a alvos celulares^aderentes14. As principais etapas críticas do protocolo aqui descrito estão relacionadas à eventual ocorrência de contaminações em cultura celular, crescimento indesejável de células HaCaT e baixo percentual de confluência celular. Existem outros métodos, como desidrogenase lática (LDH), trifosfato de adenosina (ATP) e ensaios de formação de colônias para medir a citotoxicidade. No entanto, todos eles têm vantagens e restrições. (2021)⁴⁴ avaliaram o efeito de várias variáveis nas medidas do ensaio de MTT em uma linhagem celular de câncer de próstata (PC-3). Fatores como densidade de semeadura celular, concentração de MTT, tempo de incubação após a adição de MTT, inanição de soro, composição dos meios de cultura celular, conteúdo intracelular liberado e extrusão de formazana para o espaço extracelular foram analisados. A partir deste estudo, recomendações úteis sobre como aplicar o ensaio e uma perspectiva sobre onde a utilidade do ensaio é uma ferramenta poderosa, mas também onde ele tem limitações, foram delineadas por esses autores. No entanto, o ensaio MTT é uma metodologia rápida, altamente sensível e fácil que pode ser aplicada como uma avaliação preliminar da citotoxicidade de muitas substâncias com potencial aplicação nas áreas terapêutica, alimentícia, de alimentos para animais, agricultura e meio ambiente. Em particular, o ensaio de MTT aqui realizado evidenciou que o etanol e os extratos aquosos de G. gracilis , nas concentrações ensaiadas, não afetaram a viabilidade dos queratinócitos e podem prosseguir para ensaios in vivo para garantir que sejam completamente seguros para uso cutâneo humano.

A utilização dos recursos marinhos nos produtos alimentares mostrou, mais uma vez, o seu potencial não só para obter produtos com valor nutricional acrescentado, mas também para encontrar produtos de rótulo mais limpo. A adição de G. gracilis integral (massa) ou extrato (como corante alimentar) apresenta potencial de mercado, e sua aplicação pode ser uma das estratégias para as empresas se destacarem no mercado, satisfazerem as necessidades nutricionais dos consumidores e acompanharem suas tendências de mercado.

Quando algas marinhas foram adicionadas às formulações de massas, verificou-se inicialmente que a estrutura estava alterada e que não era possível obter as formas de massa desejadas. Tivemos o desafio de ajustar quantidades e adicionar outros ingredientes não previstos anteriormente, visando manter a textura da massa. Além da quantidade adequada de cada ingrediente, o método de extrusão foi adaptado ao longo do desenvolvimento da massa. Além dessa dificuldade, o desenvolvimento de novos produtos baseia-se em três princípios fundamentais: o produto deve ser sensorial atraente (textura, sabor, cheiro); o produto deve ter valor nutricional acrescentado; e deve fazer o máximo uso de ingredientes e metodologias sustentáveis. Nesse sentido, outro grande desafio é o uso do painel sensorial para alcançar a formulação mais atraente. A maioria das análises físico-químicas realizadas em massas alimentícias já estava otimizada para matrizes alimentares; No entanto, neste trabalho, o preparo da amostra foi otimizado para que pudesse ser aplicado de forma eficiente a todos os métodos de análise.

Em relação ao uso do pigmento de G. gracilis como corante, optou-se por um produto refrigerado devido à sensibilidade térmica desse tipo de molécula⁴⁵. Como o preparo do iogurte envolve processamento térmico, o pigmento foi adicionado ao produto final. A mistura do pigmento no iogurte resultou em um produto um pouco mais fluido do que o controle sem pigmento. De fato, ao final do teste do triângulo, alguns provadores comentaram que a única diferença entre as amostras era a textura. Este é um bom resultado, uma vez que o principal objetivo do teste do triângulo foi verificar se havia diferenças perceptíveis entre iogurtes com e sem pigmento, especialmente diferenças no sabor e cheiro, pois extratos de algas marinhas podem conferir sabor/cheiro desagradável aos produtos alimentícios. Trata-se de um estudo preliminar envolvendo um pequeno painel semi-treinado. Em estudos futuros, um número maior de provadores deve ser considerado para alcançar resultados de mercado mais confiáveis. Quanto à avaliação da estabilidade do pigmento em iogurte, outros estudos poderão incluir a avaliação de outras propriedades físico-químicas do iogurte com pigmento ao longo do tempo, como pH, atividade de água (aw) e textura. A avaliação sensorial ao longo do tempo também seria desejável.

Em conclusão, os protocolos aqui descritos destacam o potencial da alga vermelha G. gracilis como fonte de ingredientes para o desenvolvimento de novos produtos com potenciais aplicações nas indústrias farmacêutica, dermocosmética e alimentícia. Além disso, a biomassa residual pós-extraída continua sendo um material valioso para ser aplicado como bioestimulante do crescimento vegetal, enriquecimento do solo, alimentação de peixes ou matéria-prima para obtenção de biocarvão e/ou carbonos funcionalizados para fins de purificação de água. A abordagem de biorrefinaria aqui descrita pode ser aplicada a outras espécies de algas marinhas, promovendo uma economia circular azul e sustentabilidade ambiental.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute Ethanol	Aga, Portugal	64-17-5
Ammonium Chloride	PanReac	12125-02-9
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	1397-89-3
Analytical scale balance	Sartorius, TE124S	22105307
Bacillus subtilis subsp. spizizenii	German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)	DSM 347
Biotin	Panreac AppliChem	58-85-5
Centrifuge	Eppendorf, 5810R	5811JH490481
Chloramphenicol	PanReac	56-75-7
CO2 Chamber	Memmert	N/A
Cool White Fluorescent Lamps	OSRAM Lumilux Skywhite	N/A
Densitometer McFarland	Grant Instruments	N/A
DMEM medium	Sigma-Aldrich	D5796
DMSO	Sigma-Aldrich	67-68-5
DPPH	Sigma, Steinheim, Germany	1898-66-4
Escherichia coli (DSM 5922)	German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)	DSM5922
Ethanol 96%	AGA-Portugal	64-17-5
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA)	J.T.Baker	6381-92-6
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524
Filter Paper (Whatman No.1)	Whatman	WHA1001320
Flasks	VWR International, Alcabideche, Portugal	N/A
Folin-Ciocalteu	VWR Chemicals	31360.264
Gallic Acid	Merck	149-91-7
Germanium (IV) Oxide, 99.999%	AlfaAesar	1310-53-8
HaCaT cells – 300493	CLS-Cell Lines Services, Germany	300493
Hot Plate Magnetic Stirrer	IKA, C-MAG HS7	06.090564
Iron Sulfate	VWR Chemicals	10124-49-9
Laminar flow hood	TelStar, Portugal	526013
LB Medium	VWR Chemicals	J106
Listonella anguillarum	German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)	DSM 21597
Manganese Chloride	VWR Chemicals	7773.01.5
Micropipettes	Eppendorf, Portugal	N/A
Microplates	VWR International, Alcabideche, Portugal	10861-666
Microplates	Greiner	738-0168
Microplates (sterile)	Fisher Scientific	10022403
Microplate reader	Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA	1611151E
MTT	Sigma-Aldrich	289-93-1
Muller-Hinton Broth (MHB)	VWR Chemicals	90004-658
Oven	Binder, FD115	12-04490
Oven	Binder, BD115	04-62615
Penicillin	Sigma-Aldrich	1406-05-9
pH meter Inolab	VWR International, Alcabideche, Portugal	15212099
Pippete tips	Eppendorf, Portugal	5412307
Pyrex Bottles Media Storage	VWR International, Alcabideche, Portugal	16157-169
Rotary Evaporator	Heidolph, Laborota 4000	80409287
Rotavapor	IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal	07.524254
Sodium Carbonate (Na2CO3)	Chem-Lab	497-19-8
Sodium Chloride (NaCl)	Normax Chem	7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic	Riedel-de Haën	7558-79-4
SpectraMagic NX	Konica Minolta, Japan		color data analysis software
Spectrophotometer	Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA	5A4T092004
Streptomycin	Sigma-Aldrich	57-92-1
Thiamine	Panreac AppliChem	59-43-8
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049
Tryptic Soy Agar (TSA)	VWR Chemicals	ICNA091010617
Tryptic Soy Broth (TSB)	VWR Chemicals	22091
Ultrapure water	Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany	F5HA17360B
Vacuum pump	Buchi, Switzerland	FIS05-402-103
Vitamin B12	Merck	68-19-9