Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הערכה של אצה אדומה Gracilaria gracilis באמצעות גישה של זיקוק ביולוגי

Published: November 21, 2023 doi: 10.3791/65923
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1, 1, 1
1MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, ESTM, Polytechnic University of Leiria, 2MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, Department of Life Sciences, University of Coimbra

Summary

במאמר זה אנו מתארים מספר פרוטוקולים המכוונים להערכה משולבת של Gracilaria gracilis: קציר מיני בר, גידול פנימי ומיצוי של מרכיבים ביו-אקטיביים. ההשפעות נוגדות החמצון, האנטי-מיקרוביאליות והציטוטוקסיות של התמציות נבדקות, יחד עם הערכה תזונתית ויציבותית של מזון מועשר בביומסה ופיגמנטים של אצות שלמות.

Abstract

העניין באצות ים כחומר גלם שופע להשגת מרכיבים ביו-אקטיביים יקרי ערך ורב-תכליתיים גדל ללא הרף. בעבודה זו, אנו חוקרים את הפוטנציאל של Gracilaria gracilis, אצה אדומה אכילה, המעובדת ברחבי העולם בשל העניין המסחרי שלה כמקור לאגר ומרכיבים אחרים ליישומים קוסמטיים, פרמקולוגיים, מזון והזנה.

תנאי הגידול של G. gracilis עברו אופטימיזציה באמצעות ריבוי וגטטיבי ונבגים תוך מניפולציה של התנאים הפיזיקוכימיים כדי להשיג מלאי ביומסה גדול. מתודולוגיות מיצוי ירוקות עם אתנול ומים בוצעו על גבי ביומסה של אצות. הפוטנציאל הביו-אקטיבי של תמציות הוערך באמצעות סדרה של בדיקות במבחנה בנוגע לציטוטוקסיות, נוגדות חמצון ותכונות אנטי-בקטריאליות שלהן. נוסף על כך, ביומסה של אצות מיובשות שולבה בפורמולות פסטה כדי להעלות את הערך התזונתי של המזון. פיגמנטים שהופקו מ- G. gracilis שולבו גם ביוגורט כצבע טבעי, ויציבותם הוערכה. שני המוצרים הוגשו להערכה של פאנל חושי מאומן למחצה שמטרתו להשיג את הנוסחה הסופית הטובה ביותר לפני ההגעה לשוק.

התוצאות תומכות ברבגוניות של G. gracilis בין אם הוא מיושם כביומסה שלמה, תמציות ו / או פיגמנטים. באמצעות יישום מספר פרוטוקולים מותאמים, עבודה זו מאפשרת פיתוח מוצרים בעלי פוטנציאל להרוויח בשוקי המזון, הקוסמטיקה והחקלאות הימית, קידום קיימות סביבתית וכלכלה מעגלית כחולה.

יתר על כן, ובהתאם לגישת הזיקוק הביולוגי, הביומסה השיורית של האצות תשמש כביוסטימולנט לגידול צמחים או תומר לחומרי פחמן שישמשו לטיהור מים של מערכות החקלאות הימית של MARE-Polytechnic מלייריה, פורטוגל.

Introduction

אצות ים יכולות להיחשב כחומר גלם טבעי מעניין שיש להרוויח ממנו על ידי מגזרי התרופות, המזון, המזון ואיכות הסביבה. הם מסנתזים ביולוגית מגוון של מולקולות, רבות מהן אינן נמצאות באורגניזמים יבשתיים, עם תכונות ביולוגיות רלוונטיות 1,2. עם זאת, פרוטוקולי גידול אופטימליים לאצות ים צריכים להיות מיושמים כדי להבטיח מלאי ביומסה גדול.

שיטות גידול חייבות תמיד לקחת בחשבון את אופי התאלי האצות ואת המורפולוגיה הכוללת. Gracilaria gracilis הוא טקסון משובט, כלומר איבר ההתקשרות מייצר מספר צירים צמחיים. כך מושגת התפשטות על ידי פיצול (רבייה וגטטיבית), שכן כל אחד מהצירים הללו מסוגל לאמץ חיים עצמאיים מהתאלוס הראשי3. טקסה קלונלית יכולה להשתלב בהצלחה עם מתודולוגיות גידול פשוטות ומהירות בצעד אחד, שכן כמויות גדולות של ביומסה מתקבלות על ידי פיצול התאלוס למקטעים קטנים המתחדשים במהירות וגדלים לפרטים חדשים זהים גנטית. ניתן להשתמש הן בתאלי הפלונטי והן בתאלי הדיפלונטי בתהליך זה. אף על פי שהסוג מציג מחזור חיים משולש איזומורפי הפלו-דיפלונטי מורכב, רק לעתים רחוקות יש צורך בנבגים, למעט כאשר נדרשת התחדשות גנטית של המלאי כדי להשיג יבולים משופרים. במקרה זה, הן tetraspores (נבגים haplontic שנוצרו על ידי meiosis) ו carpospores (נבגים דיפלונטיים שנוצרו על ידי מיטוזה) ליצור thalli macroscopic כי אז ניתן לגדל ולהפיץ על ידי רבייה צמחית4. מחזורי הצמיחה מוכתבים על ידי התנאים הסביבתיים והמצב הפיזיולוגי של הפרטים, בין גורמים ביולוגיים אחרים כגון הופעתם של אפיפיטים והיצמדות של אורגניזמים אחרים. לכן, אופטימיזציה של תנאי הגידול חיונית כדי להבטיח פרודוקטיביות גבוהה ולייצר ביומסה באיכות טובה5.

מיצוי של תרכובות ביו-אקטיביות מאצות, כולל G. gracilis, יכול להיות מושג בשיטות שונות 6,7. בחירת שיטת המיצוי תלויה בתרכובות העניין הספציפיות, ביישום היעד ובמאפייני האצות. במחקר זה התמקדנו במיצוי ממסים, הכולל שימוש בממסים ירוקים, כגון מים או אתנול, כדי להמיס ולמצות תרכובות ביו-אקטיביות מהביומסה של האצות. המיצוי יכול להתבצע באמצעות maceration בצורה תכליתית ויעילה והוא יכול לשמש למגוון רחב של תרכובות. זוהי שיטה פשוטה ונפוצה הכוללת השריית ביומסה בממס לתקופה ממושכת, בדרך כלל בטמפרטורות החדר או מעט גבוהות. את הממס מערבבים כדי לשפר את תהליך המיצוי. לאחר זמן המיצוי הרצוי, הממס מופרד מהחומר המוצק על ידי סינון או צנטריפוגה.

מים הם ממס נפוץ ביישומי מזון בשל בטיחותם, זמינותם והתאמתם למגוון רחב של מוצרי מזון. מיצוי מים מתאים לתרכובות קוטביות כגון רב-סוכרים, פפטידים ופנולים מסוימים. עם זאת, ייתכן שהוא לא יחלץ ביעילות תרכובות שאינן קוטביות. אתנול הוא גם ממס בשימוש נרחב ביישומי מזון והוא יכול להיות יעיל למיצוי מגוון מולקולות ביו-אקטיביות, כולל תרכובות פנוליות, פלבנואידים ופיגמנטים מסוימים. אתנול מוכר בדרך כלל כבטוח לשימוש במזון וניתן להתאדות בקלות, תוך השארת התרכובות המחולצות מאחור. ראוי לציין כי הבחירה של שיטת מיצוי צריך לשקול גורמים כגון יעילות, סלקטיביות, עלות-תועלת, והשפעה על הסביבה. אופטימיזציה של פרמטרים של מיצוי, כגון ריכוז הממס, זמן המיצוי, הטמפרטורה והלחץ, חיונית להשגת יבולים אופטימליים של תרכובות ביו-אקטיביות מ- G. gracilis או מאצות אחרות.

נמצא כי אצות ים מפגינות פעילות אנטי-מיקרוביאלית נגד מגוון רחב של מיקרואורגניזמים, כולל חיידקים, פטריות ונגיפים8. פעילות זו מיוחסת לרכיבים ביו-אקטיביים, כולל פנולים, רב-סוכרים, פפטידים וחומצות שומן. מספר מחקרים הוכיחו את יעילותם נגד פתוגנים כגון Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. ו - Pseudomonas aeruginosa, בין היתר9. הפעילות האנטי-בקטריאלית של אצות מיוחסת לנוכחות של תרכובות ביו-אקטיביות שיכולות להפריע לדפנות התאים המיקרוביאליים, לממברנות, לאנזימים ולמסלולי איתות10. תרכובות אלה עלולות לשבש את גדילת החיידקים, לעכב היווצרות ביופילם ולווסת תגובות חיסוניות.

אצות אדומות, הידועות גם בשם רודופיטים, הן קבוצה של אצות שיכולות להפגין פעילות אנטי-מיקרוביאלית נגד מגוון מיקרואורגניזמים. בתוך קבוצה זו, G. gracilis מכיל תרכובות ביו-אקטיביות שונות שעשויות לתרום לפעילות האנטי-מיקרוביאלית המדווחת שלו. בעוד שהמולקולות הספציפיות יכולות להשתנות, הסוגים הנפוצים שדווחו ב- G. gracilis ועשויים להיות בעלי תכונות מיקרוביאליות הם רב-סוכרים, פנולים, טרפנואידים ופיגמנטים11. עם זאת, חשוב לציין כי נוכחותם וכמותם של רכיבים אלה יכולה להשתנות בהתאם לגורמים כגון מיקום איסוף האצות, עונתיות, מצב פיזיולוגי של התאלי ותנאי הסביבה. לכן, הסוג והריכוז הספציפיים של תרכובות מיקרוביאליות ב- G. gracilis עשויים להשתנות בהתאם.

G. gracilis נמצא גם כבעל תכונות נוגדות חמצון, המכילות תרכובות פנוליות שונות, אשר הוכחו כמסלקות רדיקלים חופשיים ומפחיתות עקה חמצונית12.נוגדי חמצון עוזרים להגן על התאים מפני נזקים שנגרמים על-ידי מיני חמצן תגובתיים, ויש להם יתרונות בריאותיים פוטנציאליים. ניתן להעריך את יכולת נוגדי החמצון ישירות באמצעות שיטות שונות, כולל פעילות ניקוי רדיקלים חופשיים 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), ובעקיפין, באמצעות כימות התוכן הפוליפנולי הכולל (TPC)13.

למרות שמדווח שלמרכיב יש פעילות ביולוגית בולטת, הערכת ציטוטוקסיות שלו היא הכרחית בהערכת חומרים טבעיים וסינתטיים שישמשו במגע עם תאים או רקמות חיים. ישנן מספר שיטות למדידת ציטוטוקסיות, כל אחת עם יתרונות ומגבלות. בסך הכל, הם מציעים מגוון אפשרויות להעריך את ההשפעות המזיקות של חומרים רבים על תאים, ובו בזמן, לחקור את המנגנונים של נזק לתאים ומוות14.

בעבודה זו, אנו משתמשים 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, שיטה קולורימטרית שהוצגה על ידי Mosmann (1983)15. שיטה זו מודדת את הפחתת מלחי הטטרזוליום לתוצר פורמזן סגול על ידי תאים פעילים מטבולית. ככל שכמות גבישי הפורמזן גבוהה יותר, כך גדל מספר התאים בני הקיימא, ובכך ניתן מדד עקיף לציטוטוקסיות14. מכיוון שבעבודה זו, תמציות מים ואתנול של G. gracilis מיועדות להשתלב בפורמולציות דרמו-קוסמטיות, הערכת ציטוטוקסיות במבחנה מבוצעת בקו תאי קרטינוציטים (HaCaT).

לגבי יישום המזון, אצות ים בדרך כלל דלות קלוריות ועשירות מבחינה תזונתית בסיבים תזונתיים, יסודות חיוניים וחומצות אמינו, פוליסכרידים, חומצות שומן רב בלתי רוויות, פוליפנולים וויטמינים 2,16. G. gracilis אינו יוצא מן הכלל, בעל ערך תזונתי מעניין. Freitas et al. (2021)4 מצאו כי G. gracilis מתורבת היה בעל רמות גבוהות יותר של חלבון וויטמין C ושמר על רמת השומנים הכוללת בהשוואה לאצות בר. הדבר עשוי להוות יתרון כלכלי וסביבתי, שכן מבחינה תזונתית הייצור עדיף על ניצול משאבי הבר. בנוסף, הצרכנים מודאגים יותר ויותר מסוג המזון שהם אוכלים, ולכן חשוב להכניס מרכיבים חדשים להעשרת המזון ולהשתמש במשאבים חדשים כדי להשיג תמציות שיכולות להוסיף ערך למוצר ולטעון ל"תווית נקייה". חוץ מזה, השוק הנוכחי הוא תחרותי מאוד, הדורש פיתוח של מוצרים חדשים ואסטרטגיות חדשניות כדי להבדיל יצרנים מן המתחרים שלהם17.

העשרת מוצרים בעלי ערך תזונתי ירוד, כגון פסטה, במשאבים ימיים, כולל אצות, היא אסטרטגיה להחדרת משאב זה כמזון חדש וכאסטרטגיית בידול שוק באמצעות מוצר בעל ערך תזונתי מובהק. מצד שני, G. gracilis הוא מקור של פיגמנטים אדומים טבעיים כגון phycobiliproteins18, בעל פוטנציאל גבוה ליישומים בתעשיית המזון. אצה זו הראתה עניין רב במספר תחומים, וניתן ליישם אותה באמצעות אצות שלמות, תמציות ו / או הביומסה שנותרה. בעבודה זו, אנו מדגימים כמה דוגמאות של יישומים כאלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. קציר ביומסה והכנתה

  1. קצרו את הדגימות של G. gracilis במהלך השפל והעבירו אותן במהירות למעבדה בקופסאות חשוכות ומקוררות כדי למנוע התייבשות, אור וחשיפה לאוויר.
  2. במעבדה, שטפו כל תאלוס במי ים זורמים ונקו היטב כדי להסיר פסולת, חלקי נמק, אפיפיטים ואורגניזמים אחרים מפני השטח.
  3. שמור את הביומסה הפראית במי ים מאווררים כל הזמן (31-35 psu) בחדר אקלימי (20 ± 1 ° C) עם קרינה נמוכה המסופקת על ידי אור יום, מנורות לבנות ופלואורסצנטיות קרירות ו photoperiod להגדיר 16:08 (אור: כהה) במשך 7 ימים. במהלך תקופה זו, אין לספק כל מדיה מזינה; זה מאפשר לאצות להסתגל לאט לאט לתנאי הבית החדשים.

2. תחזוקת מלאי

  1. לאחר תקופת ההתאקלמות, חותכים קצוות בריאים של אצות תאלי עם להב סטרילי. בעקבות Redmond et al. (2014)19 ובתנאים סטריליים, גררו כל קצה דרך ג'ל אגר שהוכן בעבר בצלחות פטרי (1.0% אגר בקטריולוגי, ביחס של 1:1 מים מזוקקים/מי ים) כדי להסיר את המזהמים שנותרו. בצע את גרירת האגר שלוש פעמים עבור כל טיפ ותמיד גרור את הקצה דרך חלקים שאינם בשימוש של ג'ל האגר.
  2. יש לשטוף את כלי הזכוכית בתמיסת חומצה הידרוכלורית (HCl, 15%) ולשטוף היטב במים מזוקקים. יש לעקר את כל הכלים, כלי הזכוכית, האגר, מי הים והמים המזוקקים המשמשים בתהליך הניקוי על ידי אוטוקלאבה (121°C, 15 דקות).
    התראה: עיין בדף נתוני הבטיחות של HCl שנמסר על-ידי הספק.
  3. טיפים גדלים במי ים מעוקרים ב 35 psu, בתוספת תמיסה מועשרת Von Stosch (VSE) שונה עבור אצות אדומות, על פי Redmond et al. (2014)19. הוסף גרמניום דו-חמצני (GeO2) למדיום (1 מ"ל/ליטר) כדי למנוע צמיחה של דיאטומים אפיפיטיים.
    התראה: עיין בגיליון נתוני הבטיחות של GeO2 שסופק על-ידי הספק.
    הערה: טיפים המראים אובדן פיגמנטציה, כפי שנצפה על ידי שינוי צבע חלקי או מלא, נמצאים תחת לחץ או שהם כבר מתים ויש להשליכם.

3. טיפוח וסקייל-אפ

  1. לאחר תקופת ההתאקלמות, יש לפזר באופן אקראי כ-8-10 קצוות בריאים לצלוחיות בעלות תחתית שטוחה של 250 מ"ל בחדר אקלימי שנקבע על 20 ± 1 מעלות צלזיוס עם אור לבן וקריר של 20 ± פוטונים של 0.5 מיקרומול m-2 s-1 (1500 לוקס), פוטופריוד שנקבע על 16 שעות: 8 שעות (בהיר: כהה), ומי ים סטריליים מועשרים במדיה תרבותית VSE המתחדשת מדי שבוע.
  2. בצע מדידות משקל שבועיות, הימנעות מאמץ יתר על המידהthalli 20. לשם כך, בזהירות להסיר את הטיפים ממדיום התרבית, לשטוף בעדינות, ולשקול את מיליגרם בקנה מידה מעבדה.
    הערה: ניתן לבצע הליך זה יחד עם החידוש השבועי של מדיה תרבותית.
  3. תאלי עשוי לגדול בצלוחיות אלה עד לצפיפות של 2 גרם / ליטר. בשלב זה, בצע הרחבה של הנמען (250 מ"ל, 1 ליטר ו- 5 ליטר). מעבירים את הטיפוח למיכלים לבנים פתוחים חיצוניים של 50 ליטר ומעלה כאשר הנפח מגיע ל-5 ליטר.
  4. חישוב קצב הצמיחה היחסי (RGR) על פי Patarra et al. (2017)21 :
    RGR (% fw/day) = ([Ln (fw) - Ln (iw)]/t) x 100
    כאשר IW ו- FW הם המשקל הטרי הראשוני והסופי, בהתאמה, המתבטא בגרמים, ו- t הוא הזמן בימים.
    הערה: תחת הגדרת מעבדה זו, RGR מגיע לערכים של עד 21% ליום. קציר ביומסה יכול להתבצע בכל עת. ביומסה חייבת להיות מעובדת במהירות כדי למנוע התפרקות על ידי ייבוש בתנור, ייבוש בהקפאה, או פשוט מאוחסן קפוא (-20 ° C), בהתאם לשימוש המיועד. ניתן לשמר את הביומסה המיובשת בטמפרטורת החדר (RT) או לאחסן אותה גם בהקפאה.

4. הליך חילוץ

הערה: כדי להעריך את ציטוטוקסיות במבחנה , נוגדי חמצון ותכונות מיקרוביאליות של תמציות G. gracils , ההכנה שלה לוקחת בחשבון שני פרמטרים שונים: טמפרטורת המיצוי וסוג הממס.

  1. כדי לבצע את המיצוי, ייבשו בתנור את הביומסה של G. gracilis וטחנו את הביומסה (למשל, במטחנת קפה ביתית) עד שהאבקה עוברת דרך מסננת של 200 מיקרומטר.
  2. שוקלים את הביומסה המיובשת (10 גרם) וממיסים אותה ב -100 מ"ל של ממס (אתנול מוחלט או מים סטריליים).
  3. ערבבו בכלי המוגן מפני אור במשך 30 דקות.
  4. בצע מיצוי רציף של אתנול > מים ומים > אתנול ב-RT, 40°C ו-70°C.
  5. עבור כל טמפרטורה, לבצע מיצויים עם אתנול ומים בנפרד פעמיים.
  6. הפרידו את תמציות הנוזל מהביומסה הנותרת על ידי סינון דרך נייר סינון (Whatman No.1), ולאחר מכן צנטריפוגה ב 8000 x גרם למשך 10 דקות ב- RT.
  7. השתמש שוב בביומסה הנותרת של האצות למיצוי נוסף עם הממס השני. אם דגימה הופקה תחילה עם אתנול, לחלץ אותו עם מים הבא, ולהיפך.
  8. יבשו בהקפאה את התמציות המיימיות ואדו את תמציות האתנול במאייד סיבובי בטמפרטורה של 40°C.
  9. אחסנו את התמציות המיובשות ב-4°C.
  10. ממיסים את התמציות בריכוז של 50 מ"ג/מ"ל (בדיקות אנטי-מיקרוביאליות) או 10 מ"ג/מ"ל (בדיקות נוגדות חמצון). ממיסים את התמציות המיימיות במים סטריליים ואת התמציות האתנוליות באתנול מוחלט.

5. פעילות מיקרוביאלית

הערה: יש לבדוק את התמציות האתנוליות והמימיות בנפרד מול Bacillus subtilis subsp . spizizenii (DSM 347), Escherichia coli (DSM 5922) ו-Listonella anguillarum (DSM 21597). בדיקות אנטי-מיקרוביאליות חייבות להתבצע בהתאם להמלצות הוועדה הלאומית לתקני מעבדה קליניים (NCCLS, 2012)22. כל התרביות התקבלו מהאוסף הגרמני של מיקרואורגניזמים ותרביות תאים (DSMZ). L. anguillarum גדל על ציר סויה טריפטי (TSB) או אגר סויה טריפטי (TSA) בתוספת 1% נתרן כלורי (NaCl). שני הזנים הנותרים גודלו על LB medium (VWR Chemicals). תרביות Bacillus subtilis subsp . spizizenii (DSM 347) ו-Listonella anguillarum (DSM 21597) הודגרו ב-30°C, ואילו Escherichia coli (DSM 5922) הודגרו ב-37°C, בהתאם להוראות הספק. שיטת מיקרודילול המרק יכולה לשמש לקביעת פעילות מיקרוביאלית במדיה נוזלית, וזה צריך להתבצע בקנה מידה מיקרוביאלי, המאפשר את הפוטנציאל האנטי מיקרוביאלי להיקבע במהירות וביעילות. שיטה זולה זו מאפשרת לקבל תוצאות תוך 24 שעות בלבד, ולכן מתאימה לקביעה, בשלב מוקדם, את תנאי המיצוי הטובים ביותר המאפשרים, עבור זן מיקרוביאלי נתון, להשיג תוצאות במונחים של פעולה מעכבת גדילה. עם זאת, המתודולוגיה דורשת שימוש במיקרו-צלחות סטריליות עם מכסה ספציפי לגידול מיקרוביאלי, כמו גם זמינות של קורא מיקרו-צלחות עבור אורך גל של 600 ננומטר.

  1. בצע את בדיקות המיקרו-דילול של המרק באמצעות מיקרו-צלחות לא מטופלות ובעלות תחתית עגולה של 96 בארות עם 170 מיקרוליטר של מרק מולר-הינטון (MHB), מחוסן ב-10 מיקרוליטר של אינוקולום מתוקנן (בתקן 0.5 מקפרלנד) ו-20 מיקרוליטר מכל תמצית (50 מ"ג/מ"ל).
  2. יש לדגור על הצלחות במשך 24 שעות בטמפרטורה האופטימלית לכל זן.
  3. זהה את הפעילות האנטי-מיקרוביאלית על-ידי הפחתת העכירות הנראית לעין הנמדדת על-ידי רישום הצפיפות האופטית (OD 600) בספקטרופוטומטר מיקרו-פלטות, ב-0 שעות ו-24 שעות.
  4. בטא את התוצאות כאחוז עיכוב:
    Equation 1
    כאשר Abs. ext הוא ההבדל בספיגה הנמדדת, בין 0 שעות ל-24 שעות, בבארות המכילות זן חיידקי הגדל בנוכחות התמצית, ו-Abs מתייחס לאותה מידה בבארות המכילות את זן החיידקים והממס.
  5. בשיטה זו, לכלול תגובות בקרה, עם בארות המכילות רק מדיום תרבית שיהיה הבקרה השלילית, אך גם בארות עם תווך מחוסן עם הזן הסטנדרטי שנוסף לממס (אתנול או מים) ובינוני עם הזן החיידקי ואנטיביוטיקה ביקורת חיובית (chloramphenicol).

6. פעילות נוגדת חמצון וכימות סך הפוליפנולים

  1. סה"כ תוכן פוליפנולי
    הערה: התוכן הפוליפנולי הכולל (TPC) מתבצע בשיטת Folin-Ciocalteu23 ומותאם לקנה מידה מיקרו.
    1. הוסף לכל באר של microplate 96-well, מוגן מפני אור, 158 μL של מים טהורים במיוחד, 2 μL של הדגימה, ו 10 μL של מגיב Folin-Ciocalteu.
      התראה: עיין בגיליון נתוני הבטיחות של מגיב Folin-Ciocalteu שסופק על-ידי הספק.
    2. לאחר 2 דקות, להוסיף 30 μL של Na2CO3 (20%).
    3. לאחר הדגירה בחושך ב-RT במשך שעה אחת, מדדו את הדגימות באופן ספקטרופוטומטרי ב-755 ננומטר.
    4. השתמש בחומצה גאלית (המאפשרת לשרטט את עקומת הכיול) או במים אולטרה-טהורים (2 μL) כבקרות.
    5. בטא את התוצאות כשווה ערך לחומצה גאלית (תמצית מ"ג GAE/g).
  2. 2,2 diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) פעילות ניקוי רדיקלים
    הערה: הפעילות נוגדת החמצון של התמציות מוערכת כמתואר על ידי Duan et al. (2006)24, מותאם בקנה מידה מיקרו
    1. במיקרו-צלחת בעלת 96 בארות המוגנת מפני אור, מניחים 2 μL מכל דגימה (בריכוז של 10 מ"ג/מ"ל) ו-198 μL של DPPH מומס באתנול מוחלט (0.1 mM).
      התראה: עיין בגיליון נתוני הבטיחות של DPPH שסופק על-ידי הספק.
    2. הפעל את התגובה במשך 30 דקות ב- RT בחושך. מדוד את הספיגה ב- 517 ננומטר בספקטרופוטומטר מיקרו-פלטות.
    3. בצע תגובת בקרה עם 2 μL של אתנול מוחלט/מים מזוקקים ו-198 μL של תמיסת DPPH. בצע מדידה ריקה עם 2 μL של תמצית ו 198 μL של אתנול מוחלט.
    4. בטא את התוצאות כאחוז עיכוב DPPH באמצעות המשוואה הבאה:
      Equation 2
      כאשר כמו הספיגה של תמצית האצות, Ab היא הספיגה של הדגימות הריקות ו-Ac היא הספיגה של הביקורת.

7. הערכת ציטוטוקסיות בתאי אפידרמיס

הערה: ההשפעה ציטוטוקסית במבחנה של תמציות מימיות ואתנול של G. gracilis מוערכת בקרטינוציטים אנושיים (תאי HaCaT - 300493) באמצעות בדיקת MTT colorimetric כפי שתואר קודם לכן25. התאים נרכשו מחברת Cell Lines Services בגרמניה (CLS) והשיטה בוצעה בהתאם להנחיות המוסדיות ולהוראות CLS.
התראה: עיין בדף נתוני הבטיחות של MTT שסופק על-ידי הספק)

  1. תחזוקת תרביות תאים
    1. תרבית תאי HaCaT במדיום הגלוקוז הגבוה (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% תמיסה אנטיביוטית/אנטי-מיקוטית (אמפוטריצין B, 0.25 מילימול; פניצילין, 60 מילימול; סטרפטומיצין, 100 מילימול).
    2. השתמש טריפסין-EDTA כדי לנתק את התאים.
      הערה: תת-התרבית של תאי HaCaT מושגת לאחר שהתאים מגיעים למפגש מוחלט.
    3. תרבית את התאים בתא ב 37 ° C עם 5% CO2 ו 95% לחות.
    4. תת-תרבית התאים על פי הוראות ביובנק בכל פעם שהתרביות מגיעות למפגש של 80%-85%.
  2. הערכת ציטוטוקסיות
    1. לאחר זריעת תאים בצלחות 96 בארות ודגירת לילה, יש לטפל בתאי HaCaT (4 x 104 תאים / באר) עם התמציות המיובשות שהומסו בעבר ב- DMSO (100 מ"ג / מ"ל). לאחר מכן, להוסיף 2 μL של תמיסת תמצית 198 μL של בינוני לדגור את הצלחות במשך 24 שעות.
    2. הסר את מדיום התרבית והוסף 100 μL של MTT (0.5 מ"ג / מ"ל) לתאים. לדגור על התאים במשך 30 דקות בחושך בתנאי תרבית רגילים שהוזכרו לעיל.
    3. הסר את תמיסת MTT והמיס את גבישי הפורמזן התוך-תאיים עם 100 μL של DMSO.
    4. מדוד את הספיגה ב- 570 ננומטר באמצעות קורא microplate. לבטא את התוצאות כאחוז של שליטה תאים לא מטופלים.

8. חדשנות מזון

  1. מוצר מזון חדש: פסטה עם אצות
    1. מבחר מרכיבים ונוסחת פסטה
      הערה: בחירת המרכיבים נעשתה בשיתוף פעולה עם חברת פסטה. בחירת מרכיבי המפתח (המתוארים בסעיף 8.2) נעשתה לאור נגישותם הקלה והתאמתם לקווי הייצור הקיימים, תוך שימוש במשאבים ימיים לקבלת פסטה בעלת ערך תזונתי מוסף.
      1. לאחר בחירת המרכיבים, עצבו את הפורמולציה בהתאם לערך התזונתי המיועד (מקור לסיבים, ויטמינים ויסודות מינרליים, שומנים רוויים דלי סויה) על ידי ניתוח ההרכב הכימי התיאורטי של הפורמולציות באמצעות גיליון אלקטרוני.
      2. כאשר הדרישות התיאורטיות מתקיימות, המשך בייצור בקנה מידה מעבדתי כמתואר בשלב 8.1.2.
      3. בצע בדיקה חושית עם פאנל מאומן למחצה (>10 טועמים) כדי לאמת את הצורך בניסוח מחדש או בקבלת הנוסחה לשלבים הבאים.
        הערה: הפאנל הוכשר בעבר לטעימת פסטה והעריך באופן נהנתני את הפורמולציות שהוצגו לגבי תכונות כגון טעם, טעם, ריח, מרקם ומראה.
    2. ייצור פסטה
      הערה: הפק דוגמאות פסטה Chifferi באמצעות מכבש פסטה.
      1. בציוד, מערבבים חלקים מוגדרים מראש של קמח אורז , G. gracilis , ו Chlorella vulgaris, ולהוסיף כ 30% מים לתערובת.
      2. כדי להשיג פסטה יבשה, שיפרי יבש ב 68 ° C במשך 42 דקות, ואחריו 5 שעות, 30 דקות ב 76 ° C, המדמה תהליך תעשייתי.
      3. לבסוף, לארוז ולאטום ואקום את הדגימות ולאחסן אותם במקום חשוך ב RT עד ניתוח נוסף.
    3. ניתוח תזונתי
      הערה: לניתוח הפרופיל התזונתי, יש להשתמש בדגימות מיובשות ומקררות בטריפליקט.
      1. תכולת חלבון גולמי: בצע בדיקת חלבון כוללת בשיטת Kjeldahl , המותאמת מ- Duarte et al. (2022)26, לפי השלבים 8.1.3.2-8.1.3.6.
      2. שוקלים במדויק 1.0 גרם דגימה (או מים מזוקקים לבדיקה הריקה) ומערבבים עם שתי טבליות Kjeldahl ו 25 מ"ל של H2SO4 בצינורות העיכול.
        התראה: עיין בגיליון נתוני הבטיחות של H2SO4 שסופק על-ידי הספק.
      3. בצע את העיכול של דגימות במעכל Kjeldahl ב 220 ° C במשך 30 דקות, ואחריו 90 דקות ב 400 ° C.
      4. לאחר התקררות ל-RT, מוסיפים 80 מ"ל מים מזוקקים ומזקקים את האמוניה שנוצרה ל-30 מ"ל של תמיסת 4% H3 BO3 המכילה ירוק ברומוקרסול ואדום מתיל. שלב זה מתבצע בתנאים בסיסיים (זיקוק עם 40% NaOH באמצעות מזקקת Kjeldahl.
        התראה: עיין בדף נתוני הבטיחות של תמיסת H3 BO3 המכילה ירוק ברומוקרסול, אדום מתיל ו-40% NaOH המסופק על-ידי הספק.
      5. טיטרט את הדגימות המזוקקות עם HCl 0.1 M עד לשינוי בצבע לוורוד אפרפר הוא ציין.
      6. חשב את תכולת החלבון הגולמי, המיוצגת על ידי תכולת החנקן של הדגימה, ובטא אותה כ- g לכל 100 גרם באמצעות המשוואה הבאה:
        Equation 3
        כאשרV s מתאים לנפח HCl (mL) המשמש בטיטרציה לדוגמה; Vb מתאים לנפח המשמש את הריק; N מתאים לנורמליות HCl; W מתאים למשקל המדגם (G).
      7. תכולת השומן הכוללת: קבע את תכולת השומן הכוללת באמצעות שיטת Folch, המותאמת מ- Folch et al. (1957)27, בעקבות השלבים 8.1.3.8-8.1.3.14.
      8. הכינו מגיב Folch על ידי ערבובCHCl 3 ו- MeOH ביחס של 2:1 (v:v).
        התראה: עיין בגיליון נתוני הבטיחות של מגיב Folch שסופק על-ידי הספק.
      9. כדי לבדוק מבחנות המכילות 1 גרם aliquots של דגימות, להוסיף 5 מ"ל של מגיב Folch ו 0.8 מ"ל של מים מזוקקים. מערבבים במערבולת במשך דקה אחת.
      10. לאחר מכן, להוסיף עוד 5 מ"ל של מגיב Folch הומוגניזציה במשך 5 דקות. להוסיף 1.2 מ"ל של 0.8% פתרון NaCl הומוגניזציה במשך 2 דקות.
      11. צנטריפוגה את הדגימות ב 7000 x גרם במשך 10 דקות. מסננים את הפאזה האורגנית (השלב התחתון) דרך כותנה הידרופילית ונתרן גופרתי נטול מים לתוך בקבוק זכוכית בעל תחתית עגולה.
      12. כדי למנוע אובדן דגימה, חזור על השלבים של הוספת 5 מ"ל של CHCl3, הומוגניזציה, צנטריפוגה וסינון באותם תנאים.
      13. מוציאים את הממס האורגני מהשלבים האורגניים שנאספו על ידי אידוי בלחץ נמוך ומשאירים בתנור על 105°C למשך 4 שעות. מצננים את הדגימות במייבש.
      14. חשב את תכולת השומן, המבוטאת כ- g לכל 100 גרם, באמצעות המשוואה הבאה:
        Equation 4
        כאשר W1 הוא משקולת בקבוק הזכוכית העגולה הריקה; W2 הוא המשקל ההתחלתי של הדגימה; W3 הוא בקבוק הזכוכית בעל התחתית העגולה עם משקל הדגימה.
      15. תכולת סיבים גולמיים: קבע את תכולת הסיבים הגולמי באמצעות מתודולוגיה שאומצה מ- ISO 6865 (2000)28, לפי השלבים 8.1.3.16-8.1.3.22.
      16. שוקלים 1 גרם מהדגימה (W0) לתוך כור היתוך מזכוכית עם תחתית מסנן (סימוכין P2) ומניחים אותה במנתח הסיבים.
      17. השלב הראשון הוא הידרוליזה חומצית: להוסיף 150 מ"ל של 1.25% H 2 SO4, מחומם מראש, ו2מ"ל של חומר נגד קצף (n-אוקטאנול) לעמוד של כל כור היתוך; מחממים עד לרתיחה ושומרים 30 דקות.
      18. לאחר הסרת ממס זה, לשטוף שלוש פעמים עם מים deionized כדי להמשיך הידרוליזה בסיסית. הוסף 150 מ"ל של 1.25% NaOH, שחומם מראש, ו 5 מ"ל של חומר אנטי מקציף לעמוד ללא נוזל, ובצע את אותו הליך חימום כמו עבור הידרוליזה חומצית.
      19. לבסוף, לעשות שטיפה משולשת עם 150 מ"ל של אצטון עבור מיצוי קר.
      20. לאחר תהליך זה, בזהירות להסיר את כורי היתוך מהמערכת ומניחים אותם בתנור ב 150 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה. רשום את המשקל הסופי (W1).
      21. הניחו את כורי ההיתוך בכבשן עמום בטמפרטורה של 500°C למשך 3 שעות ולאחר מכן רשמו את המשקל הסופי (W2).
      22. חשב את תכולת הסיבים הגולמיים ובטא את התוצאות באחוזים באמצעות המשוואה הבאה:
        % סיבים גולמיים = 100 x (W1-W2)/W0
      23. פרופיל חומצות שומן (FA): קבע את פרופיל חומצות השומן לפי Fernández et al.(2015)29, לפי השלבים 8.1.3.24-8.1.3.29.
        הערה: חומצות השומן מתיל אסטרים (FAMEs) מתקבלים על ידי טרנסמתילציה ישירה של חומצה מזורזת של דגימות מיובשות בהקפאה טחון. כל הניתוחים נעשים בשלשה.
      24. הוסף 2 מ"ל של 2% (v/v) H 2 SO4 תמיסת מתנול לדגימה של 50 מ"ג ויוצקים את התערובת ב 80 ° C במשך2שעות עם ערבוב מתמשך.
        התראה: עיין בדף נתוני הבטיחות של מתנול שסופק על-ידי הספק.
      25. לאחר קירור ל-RT, הוסיפו 1 מ"ל מים אולטרה-טהורים ו-2 מ"ל של n-הפטן לכל דגימה, ערבבו את התערובת במשך דקה אחת וצנטריפוגו אותה למשך 5 דקות.
        התראה: עיין בגיליון נתוני הבטיחות של n-heptane שסופק על-ידי הספק.
      26. לשחזר את השלב העליון n-heptane (אורגני) המכיל FAMEs ולהעביר אותו כרומטוגרפיה גז (GC) בקבוקונים.
      27. ניתוח בכרומטוגרף גז המצויד בטור נימי TR-FAME (60 מ' × 0.25 מ"מ ID, עובי סרט 0.25 מיקרומטר), דוגם אוטומטי וגלאי יינון להבה (FID).
      28. הגדר את המזרק (מצב מפוצל) ב- 250 ° C ואת הגלאי ב- 280 ° C. כוונו את הטמפרטורה ההתחלתית של העמוד ל-75°C והחזיקו למשך דקה. לאחר מכן יש להעלות ב-5°C לדקה עד 170°C ולהחזיק למשך 10 דקות. לאחר מכן יש להעלות ב-5°C/min ל-190°C ולהחזיק עוד 10 דקות. לבסוף, העלו ב-2°C לדקה ל-240°C והחזיקו למשך 10 דקות. השתמש בהליום כגז נשא בקצב זרימה של 1.5 מ"ל/דקה. אספקת אוויר ומימן בספיקות של 350 ו-35 מ"ל/דקה, בהתאמה.
      29. קבע את פרופיל FA על ידי השוואת זמני השמירה המתקבלים עם תקן ובטא את התוצאות כאחוז מסך השומן.
      30. פרופיל יסודות מינרליים: לקבוע את היסודות המינרליים (Ca, P, Mg, Na, K, Fe, Cu, Mn, Zn) שנותחו על ידי ICP-OES, בעקבות השיטה שאומצה מ- Pinto et al. (2022)30, בעקבות השלבים 8.1.3.31-8.1.3.34.
      31. במדויק לשקול על 0.4 גרם של כל דגימה יבשה ולהוסיף 7.5 מ"ל של HNO3 ו 2.5 מ"ל של HCl.
        התראה: עיין בגיליון נתוני הבטיחות של HNO3 ו-HCl שסופקו על-ידי הספק.
      32. העיכול מתבצע בתהליך דו-שלבי: העלה את הטמפרטורה מ-RT ל-90 מעלות צלזיוס תוך 30 דקות (ושמור על 30 דקות נוספות בטמפרטורה זו) ואחריו 60 דקות ב-105 מעלות צלזיוס.
      33. מצננים את תמיסות הדגימה, מדללים אותן ל-25 מ"ל, מסננים ושומרים אותן בצינורות מסומנים. בכל עיכול, לבצע את אותו תהליך עם חומר התייחסות ריק. להשיג את הריכוז של אלמנטים שונים על ידי ICP-OES.
      34. בטא את התוצאות במ"ג לכל 100 גרם של fw.
      35. תכולת פחמימות: חשב את תכולת הפחמימות לפי השלבים 8.1.3.36-8.1.3.37.
      36. חישוב תכולת הפחמימות הזמינות (לא כולל סיבים) לפי הפרש הגורמים שנקבעו קודם לכן לכל 100 גרם, באמצעות המשוואה הבאה, על פי ארגון המזון והחקלאות (FAO; 2003)31
        Equation 5
      37. בטא את התוצאות ב- g לכל 100 גרם.
      38. תכולת לחות ואפר: הערך את תכולת הלחות והאפר לפי השלבים 8.1.3.39-8.1.3.45.
      39. דוגרים על כורי היתוך מחרסינה במשך 3 שעות ב-105°C, מקררים אותם במייבש ושוקלים אותם.
      40. שוקלים 10 גרם מהדגימה לתוך כור ההיתוך ומניחים אותה בתנור ייבוש ב 105 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות מחזורים עד שהערכים ממשקלולים עוקבים אינם שונים ביותר מ -10 מ"ג.
      41. חשב את תכולת הלחות, המבוטאת כ- g לכל 100 גרם של fw, באמצעות המשוואה הבאה:
        Equation 6
        כאשר W1 הוא משקל כור ההיתוך הריק, W2 הוא משקל כור ההיתוך עם הדגימה הטרייה, ו-W3 הוא משקל כור ההיתוך עם הדגימה המיובשת.
      42. לאחר בדיקת תכולת הלחות, הניחו את כורי ההיתוך עם הדגימות המיובשות במשרפה בטמפרטורה של 525°Cלמשך 4 שעות.
      43. חזור על הליך זה עד לשקלולים רצופים שאינם שונים ביותר מ -1 מ"ג.
      44. מצננים את הדגימות ל-RT במייבש ואז שוקלים אותן.
      45. חשב את תכולת האפר, המבוטאת כ- g לכל 100 גרם של fw, באמצעות המשוואה הבאה:
        Equation 7
        כאשר W1 הוא משקלו של כור ההיתוך הריק, W2 הוא משקלו של כור ההיתוך עם דגימה טרייה, W3 הוא משקלו של כור ההיתוך עם משקל.
      46. ערך אנרגיה: חשב את ערך האנרגיה לפי שלבים 8.1.3.47-8.1.3.48.
      47. חישוב הערך האנרגטי של הדגימות על פי תקנת האיחוד האירופי:מתן מידע מזון לצרכנים (תקנה 1169/2011)32, באמצעות המשוואות:
        אנרגיה (קק"ל / 100 גרם) = 4 x (g חלבונים) + 4 x (גרם פחמימות) + 9 x (גרם שומן) + 2 x (גרם סיבים)
        אנרגיה (kJ / 100 גרם) = 17 x (g חלבונים) + 17 x (פחמימות גרם) + 37 x (גרם שומן) + 8 x (גרם סיבים)
      48. בטאו את התוצאות בקילוקלוריות ל-100 גרם ובקילוג'אול ל-100 גרם.
    4. קבלת צרכנים
      1. הערך את קבלת הצרכנים באמצעות דוגמאות פסטה שבושלו במים מזוקקים במשך 8 דקות.
      2. ביצוע מבחן קבלת צרכנים: הערכת מראה חזותי, צבע, מרקם, ריח, טעם ים, טעם כללי, הערכה כוללת וכוונת רכישה של הדגימות.
        הערה: מבחן קבלת הצרכן מבוסס על מבחנים הדוניים המעריכים מראה חזותי, צבע, מרקם, ריח, טעם ים, טעם כללי, הערכה כללית וכוונת רכישה בסולם של 1-9, כאשר 1 הוא הערכה גרועה, ו -9 הוא הערכה טובה מאוד.
      3. ביצוע בדיקות חושיות בתאי חישה בודדים במעבדה לניתוח חושי (עם בקרת טמפרטורה ותאורה). ספקו סכו"ם, מפיות וכוסות זכוכית של מים מינרליים כדי לנקות את החיך בין הדגימות.
        הערה: הטועמים הם בגילאי 16-64 מכל הרקעים (n > 80).
  2. יוגורט
    1. מיצוי פיגמנטים
      הערה: בצע את מיצוי הפיגמנט באמצעות המתודולוגיה המתוארת ב- Pereira et al. (2020)18.
      1. הכינו את ממס המיצוי, חיץ נתרן פוספט ב 0.1 M, עם נתרן פוספט dibasic (0.03 M) ו נתרן פוספט monobasic (0.07 M). הגדר את ה- pH על pH 6.8 באמצעות NaOH או HCl.
      2. שוקלים 1 גרם של G. gracilis ומוסיפים 50 מ"ל של מאגר נתרן פוספט (pH 6.8). הומוגניזציה במשך 10 דקות, ואחריה 10 דקות של השרייה עם טיט ו pestle.
      3. העבר את התמיסה לצינור וצנטריפוגה למשך 20 דקות במהירות של 12,298 x גרם (4 ° C).
      4. אגרו את הסופרנאטנט והוסיפו לאט 65% אמוניום סולפט. כאשר כל האמוניום גופרתי מומס, לכסות את התמיסה עם יריעת אלומיניום ולהשאיר אותו לשקוע ב 4 ° C במשך הלילה.
        התראה: עיין בגיליון נתוני הבטיחות של אמוניום סולפט שסופק על-ידי הספק.
      5. צנטריפוגה את המשקע במשך 20 דקות ב 12,298 x גרם (4 ° C). לשחזר את הגלולה ולהמיס במים מזוקקים (כ 5 מ"ל).
      6. יש לבצע דיאליזה של התמצית באמצעות קרום צינור (14 kDa) כנגד מים למשך 24 שעות, ולאחר מכן לייבוש בהקפאה. יש לאחסן את התמצית המיובשת בהקפאה המוגנת מפני אור בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
    2. הכנת יוגורט
      1. הכינו יוגורט טבעי על ידי ערבוב 1 ליטר חלב מפוסטר, 120 גרם יוגורט טבעי, 20 גרם סוכר ו 50 גרם אבקת חלב בתרמיקסר במשך 5 דקות, 50 מעלות צלזיוס, מהירות 3.
      2. מניחים את התערובת בצנצנת התרמיקסר באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.
      3. שלבו את התמצית על ידי ערבובה ביוגורט בריכוז של 0.21%. אחסנו את הדגימות בצלוחיות זכוכית בודדות בטמפרטורה של 4°C עד לניתוח.
      4. יש לאחסן מנות בודדות של יוגורט ללא פיגמנט (בקרה) ב-4°C עד לניתוח.
    3. יציבות צבע
      הערה: להעריך את יציבות הפיגמנט ביוגורטים באמצעות ניתוח צבע במשך 12 ימים. בצע ניתוח צבע באמצעות מד צבעים מחזיר אור, באמצעות צופה סטנדרטי של 2 מעלות ומאיר D65. התוצאות מוצגות כקואורדינטות CIELab עם L (בהירות, שחור - לבן, 0 - 100), a* (ירוק - אדום, -60 - 60) ו- b* (כחול - צהוב, -60 - 60) פרמטרים. לפרמטר a* יש ערכים חיוביים לצבעים אדמדמים וערכים שליליים לצבעים ירקרקים. הפרמטר b* מקבל ערכים חיוביים לצבעים צהבהבים וערכים שליליים לצבעים כחלחלים. L* הוא הפרמטר של בהירות, שהוא התכונה לפיה כל צבע יכול להיחשב שווה ערך לאיבר בגווני אפור בין שחורללבן 33.
      1. כייל את מד הצבעים באמצעות לוח קרמי לבן (L* 88.5, a* 0.32, b* 0.33) שסופק על-ידי היצרן.
      2. מלא תא בכ- 28 גרם של הדגימה (או הפקד) ונתח את הצבע באמצעות תוכנה לניתוח נתוני צבע.
        הערה: התוכנה ששימשה לניתוח נתוני צבע הייתה SpectraMagic NX.
      3. בצע קריאות 5 פעמים בטריפליקטים של דגימה/בקרה.
    4. אנליזה חושית
      הערה: בצע הערכה חושית של יוגורטים עם שילוב פיגמנט באמצעות בדיקת משולש (ISO 4120, 2004)34 והערכה הדונית של צבע, טעם והערכה כללית.
      1. עבור מבחן המשולש, תנו לחברי הפאנל שלוש דוגמאות (דגימה אחת של יוגורט עם פיגמנט ושתי דגימות של ביקורת, או שתי דגימות של יוגורט עם פיגמנט ואחת ביקורת) ובקשו מהם לבחור דגימה אחרת בהתבסס על הארומה, המרקם והטעם. ספק דוגמאות בנפחים דומים המזוהים עם קודים אקראיים של 3 מספרים.
      2. להערכה הדונית של יוגורט עם פיגמנט, תנו לחברי הפאנל דגימה של יוגורט עם פיגמנט ובקשו מהם להעריך את הצבע, הטעם וההערכה הכללית באמצעות סולם נהנתני בן 9 נקודות (מסלידה קיצונית לדומה מאוד).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פעילות מיקרוביאלית

כאשר מפרשים את התוצאות המתקבלות, יש לזכור כי ככל שאחוז העיכוב גבוה יותר, כך גדלה יעילות התמצית בעיכוב הצמיחה של אותו זן ספציפי, וכתוצאה מכך, כך התמצית מעניינת יותר כאנטי מיקרוביאלית. באמצעות מתודולוגיה זו, אנו יכולים לזהות במהירות אילו תמציות יש פעילות גדולה יותר על זנים חיידקיים מסוימים, גם לזהות את המעניין ביותר במונחים של שימוש עתידי. כך יכולה להיות לנו נקודת מוצא למחקרים נוספים על אותה תמצית.

איור 1 מראה את התוצאות שהתקבלו עם תמציות מימיות, גם במיצוי הראשון וגם בשני, מיד לאחר ייבוש הביומסה (איור 1A) ובמיצוי השלישי והרביעי (איור 1B), שהתקבלו לאחר המיצויים האתנוליים, ובכך השתמשו בביומסה באופן אינטגרלי. אנו יכולים לראות כי התוצאות המעניינות ביותר, המקבילות למיצוי המימי השלישי והרביעי, חושפות פעילויות אנטי-מיקרוביאליות גבוהות יותר, במיוחד בתמציות המתקבלות ב -70 מעלות צלזיוס. ריכוז התמצית בבארות הוא 5 מ"ג/מ"ל.

Figure 1
איור 1: עיכוב גדילה של מיני חיידקים בנוכחות תמציות מימיות של G. gracilis. עיכוב גדילה של 3 מיני חיידקים (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Listonella anguillarum) לאחר 24 שעות של צמיחה בתווך נוזלי, בנוכחות תמציות מימיות (Aq) של G. gracilis המתקבלות בטמפרטורות שונות, טמפרטורת החדר (RT), 40 ° C (40) ו 70 ° C (70). הבקרה החיובית נעשתה עם כלוראמפניקול (CHL), והתוצאות מבוטאות כערכים ממוצעים (n = 8). הנתונים מתייחסים לארבעת שלבי החילוץ הרציפים (1 st, 2nd, 3rd, 4th). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

נראה כי התמציות האתנוליות יעילות במיוחד בעיכוב הצמיחה של L. anguillarum, כפי שמוצג באיור 2. זה מראה את התוצאות שהתקבלו עם התמציות האתנוליות, גם במיצוי הראשון והשני (איור 2A) ובמיצוי השלישי והרביעי (איור 2B), שהתקבלו אחרי המיצוי המימי הראשון.

Figure 2
איור 2: עיכוב גדילה של מיני חיידקים בנוכחות תמציות אתנוליות של G. gracilis. עיכוב גדילה של 3 מיני חיידקים (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Listonella anguillarum) לאחר 24 שעות של גידול, בתווך נוזלי, בנוכחות תמציות אתנוליות (Et) של G. gracilis, המתקבלות בטמפרטורות שונות, טמפרטורת החדר (RT), 40 ° C (40) ו 70 ° C (70). בקרה חיובית נעשתה עם chloramphenicol (CHL), והתוצאות בוטאו כערכים ממוצעים (n = 8). הנתונים מתייחסים לארבעת שלבי החילוץ הרציפים (1 st, 2nd, 3rd, 4th). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

פעילות נוגדת חמצון

באשר לתוצאות המדגישות את הפוטנציאל נוגד החמצון של התמציות השונות, כלומר במבחן DPPH, התוצאות המובעות באיור 3 מצביעות על כך שהטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס הייתה היעילה ביותר, וכתוצאה מכך ערכי עיכוב גבוהים יותר של פעילות המחמצן, בהשוואה לאלה שנצפו בתמציות שהתקבלו ב-RT או ב-70°C. זה תקף עבור דגימות G. gracilis , וייתכנו שינויים גדולים בהתאם לדגימות בשימוש ואת תנאי הגידול אצות. לכן, מומלץ לבצע בדיקות כדי לציין את התנאים הטובים ביותר עבור כל סוג מסוים של דגימה.

Figure 3
איור 3: עיכוב רדיקל DPPH (%) בנוכחות תמציות המתקבלות בטמפרטורות שונות. התמציות הושגו באמצעות מיצוי אתנולי (Et) או מימי (Aq). מיצויים 1ו -2נעשו מביומסה יבשה ברצף. הנותרים (3rd ו-4) נעשו עם ביומסה שהופקה בעבר עם הממס החלופי. RT פירושו טמפרטורת החדר; 40, תמצית המתקבלת ב 40 °C; ו 70, תמצית המתקבלת ב 70 ° C. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות דומות התקבלו במונחים של כימות פוליפנולים כולל (איור 4), כאשר הטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס נחשבת לטובה ביותר במונחים של מיצוי תרכובות נוגדות חמצון. זה מראה כי נראה כי הפעילות נוגדת החמצון מתואמת עם המרכיבים הפנוליים הקיימים בתמציות.

Figure 4
איור 4: כימות תכולת הפוליפנולים הכוללת (TPC) בתמציות שהתקבלו בטמפרטורות שונות. התמציות התקבלו על ידי מיצוי אתנולי (Et) או מימי (Aq), כאשר מיצוי 1st ו -2nd נעשו ברצף מאצות יבשות והשאר (3rd ו-4 th) נעשו עם ביומסה שהופקה בעבר עם ממס אחר. RT פירושו טמפרטורת החדר; 40, תמצית המתקבלת ב 40 °C; ו 70, תמצית המתקבלת ב 70 ° C. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ציטוטוקסיות בתאי HaCat

הצעד הראשון להערכת בטיחותם של מרכיבים קוסמטיים הוא חקר ציטוטוקסיות החוץ גופית שלהם בקווי תאי האפידרמיס והעור. כפי שניתן לראות באיור 5, לא נצפו השפעות ציטוטוקסיות על קרטינוציטים (תאי HaCaT), דבר המצביע על כך שבריכוז המרבי שנבחן (1 מ"ג/מ"ל), גם תמציות מימיות וגם תמציות אתנול בטוחות לשימוש עורי.

Figure 5
איור 5: ההשפעה ציטוטוקסית של תמציות Gracilaria gracilis (1 מ"ג/מ"ל) על תאי HaCaT לאחר 24 שעות של טיפול. הערכים בכל עמודה מבוטאים כממוצע ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM) של שלושה ניסויים בלתי תלויים במשולש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

חדשנות בתחום המזון

נוסחאות הפסטה הסופיות התקבלו לאחר ניסויים רבים בין ניסוח תיאורטי לבדיקה חושית על ידי פאנל מאומן למחצה. לאחר שלב זה, בוצעה גישה לאפיון הכימי, כולל הערכה תזונתית, חומצות שומן ופרופילי יסודות מינרליים. ניתן היה לבנות אפיון תזונתי (טבלה 1 וטבלה 2) ולאמת את קיומן של טענות תזונתיות צפויות על בסיס החקיקה האירופית (REG (EU) No. 1169/2011)32.

עובדות תזונה על ידי 100 גרם של פסטה % RDI
אנרגיה 1478.90 ק"ג (348.74 קק"ל) 17
שומנים 1.06 ± 0.10 גרם 2
ממה:
חומצות שומן רוויות 0.38 ± 0.01 גרם 2
פחמימות 72.59± 0.21 גרם 28
סיבים 3.84 ± 0.20 גרם
חלבון 10.29 ± 0.20 גרם 21
מלח 0.22 ± 0.02 גרם 9

טבלה 1: עובדות תזונתיות. עובדות תזונתיות של פסטה מפותחת מבוססות על ניתוחים כימיים (n=3) של אנרגיה ופחמימות המתקבלות בחישוב ובאחוז המתאים של צריכת המינון המומלצת (n = 3).

נוסחאות פסטה אלה תוכננו כדי לפנות לצרכן היעד שיש לו תזונה בריאה יותר בראש, ולכן כמות השומן לכל 100 גרם של מוצר חייב להיות קטן ככל האפשר. ניתוח מפורט של פרופיל חומצות השומן מראה ערך של 0.38 גרם חומצות שומן רוויות / 100 גרם, שהוא הרבה מתחת לגבול עבור מוצרים דלי שומן רווי, עמידה במטרה הראשונית בייצור פסטה זו. לגבי תכולת הסיבים, ניתן היה, בהתאם לתקנות האירופיות, לטעון כי נוסחת פסטה זו היא מקור לסיבים.

באפיון היסוד המינרלי, שנקבע על ידי ICP-OES ומוצג בטבלה 2, מדווח על ערך של כ-219 מ"ג/100 גרם Na הקיים ב-100 גרם של מוצר זה, כך שלא ניתן לאמת שמדובר במוצר בעל תכולת נתרן נמוכה (<0.12 גרם ל-100 גרם). בשל תכולת נתרן גבוהה באופן טבעי נוכח המרכיבים, מוצר זה לא יכול לדרוש תוספת של מלח ממתקים שלה.

Table 2

טבלה 2: פרופיל אלמנטים מינרליים של פסטה. כחול - תוכן גבוה של אלמנט; אדום - מקור של אלמנט מסוים (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

על פי תקנות האיחוד האירופי שהופנו ואת RDI% עבור כל אלמנט, ניתן לראות כי מוצר זה יש תוכן גבוה של K, P, Fe, והוא גם מקור של Zn. יש לו Se, Mg, ו- Ca נוכחים בכמויות קטנות יותר.

במבחני הקבלה לפסטה נעשה שימוש ב-86 בודקים, מתוכם 63 נשים ו-23 גברים, מעל גיל 18. מבחני הקבלה התבססו על סולמות הדוניים של 9 נקודות, כפי שנקבע בתקנים. הבצק הבריא קיבל ציון 5 ו-6 בסולם נהנתני מ-1 עד 9 עבור הפרמטרים "טעם ים" ו"מראה חזותי", בהתאמה (איור 6).

Figure 6

איור 6: תוצאות מבחני קבלה של צרכנים חושיים . (A) הבחירה הנהנתנית למראה חזותי, צבע, מרקם, ריח, טעם ים וטעם כללי. (ב) הבחירה הנהנתנית להערכה כוללת וכוונת רכישה. סולם 1-9, כאשר 1 הוא הערכה גרועה, ו-9 הוא הערכה טובה מאוד (n = 86). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הפסטה קיבלה ציון 5 ו-6 בסולם נהנתני מ-1 עד 9 עבור הפרמטרים "טעם ים" ו"מראה חזותי", בהתאמה (איור 6A). פסטה זו קיבלה ערך נמוך בסולם זה לגבי פרמטר המרקם (בהתחשב בפורמולציות אחרות שכבר נחקרו), כנראה משום שמרכיב הבסיס הוא קמח אורז; למרות זאת, הוא השיג ערכים בסולם מ 1 עד 9, החל מ 4 עד 7 אשר משקף קבלה טובה על ידי הצרכן הממוצע. בסולם נהנתני מ-1 עד 9, לפסטה היו התשובות השכיחות ביותר הערך של 5 עבור כוונת רכישה והערך של 6 עבור הערכה כוללת, כפי שניתן לראות באיור 6B. נמצא כי כ-65% מהטועמים בחרו בתשובה שווה או גבוהה מהציון 6 להערכה הכוללת של פסטה זו. יציבות הצבע של יוגורטים עם פיגמנט הוערכה במשך 12 ימים ב -4 מעלות צלזיוס, והתוצאות מוצגות באיור 7.

Figure 7
איור 7: יציבות הצבע של היוגורטים. (משמאל) שליטה ביוגורטים ויוגורטים (מימין) עם פיגמנט Gracilaria gracilis במהלך 12 ימי אחסון. הפרמטרים a*, b* ו- L* הם חסרי ממד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

התוצאות מצביעות על כך שהפרמטרים a* ו- b* היו יציבים לאורך זמן, בעוד שערכי L* הראו שונות גבוהה יותר. הקלילות הדגימה ערכים גבוהים יותר לאחר 8 ימי אחסון. בעוד שנמצאו הבדלים מסוימים בפרמטרים של הבהירות, המצביעים על כך שהדגימות היו בהירות יותר לאורך זמן, הפרמטרים של אדמומיות (a*) וכחול (b*) הראו יציבות טובה. שילוב התמציות ביוגורטים הראה שימור צבע טוב, עם ΔE של 7.01 ± 2.36 לאחר 12 ימי אחסון. באשר להערכה החושית של היוגורט, 9 מתוך 13 משתתפי הפאנל זיהו נכונה את הדגימה הנכונה במבחן המשולש, מה שמרמז על כך שהיו הבדלים בין היוגורטים שאפשרו הבחנה זו. הבדיקות הדוניות שנעשו לפאנל המיומן למחצה הראו קבלה טובה של המוצר, שבאה לידי ביטוי בציונים מעל 7 (תרשים 8). אופן הציון של כל אחת משלוש התכונות שנבחנו היה 9, מה שהוביל לממוצע ציונים מעל 8. ההערכה הטובה ביותר נעשתה לצבע, המשקף קבלה מצוינת של הפאנל, תוצאה חושפנית.

Figure 8
איור 8: תוצאות הערכה חושית הדונית של יוגורט עם פיגמנט Gracilaria gracilis. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בדיקות הפעילות האנטי-מיקרוביאלית בתווך נוזלי משמשות להערכת יעילותם של חומרים אנטי-מיקרוביאליים כנגד מיקרואורגניזמים המרחפים בתווך נוזלי ומבוצעות בדרך כלל כדי לקבוע את יכולתו של חומר לעכב גדילה או להרוג מיקרואורגניזמים 35,36,37,38. הם משמשים להערכת רגישותם של מיקרואורגניזמים לסוכנים אנטי-מיקרוביאליים ומתבצעים במבחנות או בצלחות מיקרוטיטרציה, שם נבדקים ריכוזים שונים של החומר האנטי-מיקרוביאלי כנגד השעיה מתוקננת של מיקרואורגניזם היעד22. פעילות אנטי-מיקרוביאלית מוערכת על ידי מדידת גדילה מיקרוביאלית או נוכחות/היעדר עכירות בתווך התרבית לאחר תקופת דגירה נאותה.

ישנן מספר טכניקות ושיטות לביצוע בדיקות אלו, כגון שיטת דילול המרק, שיטת דיפוזיית אגר (כגון בדיקת דיפוזיית דיסק), ושיטת מיקרודילוציית המרק, שהיא אחת38 הנפוצות ביותר. חלק מהנקודות הקריטיות ביותר בשיטות אלה כוללות הכנה נכונה של החיסון, בחירת מדיום התרבית, איכות האנטי-מיקרוביאלים המשמשים, סטנדרטיזציה של הטכניקה ובקרת זיהום יעילה. החיסון, שהוא השעיה סטנדרטית של מיקרואורגניזמים, חייב להיות מוכן כראוי כדי להבטיח את הדיוק של התוצאות. זה כרוך בבחירה מתאימה של תרבית מיקרוביאלית, תרבית נכונה של זנים טהורים, התאמה של ריכוז התא, וסטנדרטיזציה של התרחיף כדי להשיג צפיפות אופטית מתאימה או ריכוז תאים.

יש לבחור בקפידה את מדיום התרבית המשמש כדי להבטיח שהוא מספק את תנאי הגידול האידיאליים עבור המיקרואורגניזם הנבדק. הרכב כימי, pH וגורמים אחרים יכולים להשפיע על תוצאות הבדיקה. חשוב לעקוב אחר המלצות היצרן להכנת מדיום התרבות. איכות החומרים האנטי-מיקרוביאליים המשמשים לבקרה היא בסיסית, וחשוב לוודא שהם טהורים, בתוך חיי מדף, ומאוחסנים כראוי. יש תמיד לבדוק את תאריכי הסימון והתפוגה, בהתאם להוראות היצרן. הסטנדרטיזציה של הטכניקה היא גם חיונית כדי להבטיח את הדיוק של התוצאות. זה כולל את הוספת הריכוזים שנבדקו למדיום התרבית, כמו גם שמירה על תנאים אספטיים לאורך כל ההליך. בנוסף, זיהום צולב של מיקרואורגניזמים במהלך הבדיקה יכול להוביל לתוצאות כוזבות או לא אמינות. זה חיוני כדי לעקוב אחר שיטות אספטיות קפדניות לאורך כל ההליך, מן מניפולציה של החיסון כדי הדגירה של צינורות או צלחות. שימוש במשטחי עבודה נקיים, טכניקות צנרת נכונות וסילוק נכון של חומרים הם אמצעים חשובים למניעת זיהום.

תשומת לב לפרטים והקפדה על פרוטוקולים והנחיות שנקבעו חיוניים כדי למזער טעויות ולהבטיח את אמינות התוצאות בבדיקות פעילות מיקרוביאלית בתווך נוזלי. כמו כן, בדיקות פעילות מיקרוביאלית יש כמה מגבלות כי צריך להיחשב37.

גורמים כגון pH, טמפרטורה, נוכחות של מרכיבי דם, ואינטראקציות עם המערכת החיסונית אינם נלקחים בחשבון בבדיקות אלה, אשר יכול להגביל את היכולת לחזות את היעילות של סוכן מיקרוביאלי באורגניזם חי. כמו כן, בדיקות מודדות את יכולתו של חומר אנטי-מיקרוביאלי לעכב צמיחה מיקרוביאלית או להרוג מיקרואורגניזמים ואינן מספקות מידע מפורט על מנגנון הפעולה של האנטי-מיקרוביאלית או על הסלקטיביות שלה נגד מיקרואורגניזמים ספציפיים. ישנן מגבלות בזיהוי התנגדות, שכן השיטות הננקטות עשויות שלא לאפשר זיהוי או חיזוי של התפתחות התנגדות לאורך זמן. חלק מהמיקרואורגניזמים עשויים לפתח מנגנוני עמידות בתגובה לחשיפה ממושכת לחומר אנטי-מיקרוביאלי, ושינויים אלה עשויים שלא להיות מזוהים בקלות באמצעות בדיקות אלה. בדיקות של פעילות מיקרוביאלית בתווך נוזלי בדרך כלל אינן לוקחות בחשבון גורמים מארחים אחרים שעשויים להשפיע על יעילותו של סוכן אנטי-מיקרוביאלי, כגון נוכחות של ביופילמים או התגובה החיסונית של המארח.

חשוב לקחת בחשבון מגבלות אלה ולהשלים את בדיקת הפעילות האנטי-מיקרוביאלית במצע נוזלי עם שיטות וגישות אחרות, כגון מחקרי in vivo , מודלים של ביופילם ואחרים39. בתחום החיפוש הביולוגי אחר תרכובות מקרו-אצות ביו-אקטיביות, ניתן להשתמש בבדיקות פעילות אנטי-מיקרוביאלית כדי להעריך את הפוטנציאל האנטי-מיקרוביאלי של תמציות אצות או תרכובות מבודדות, תוך זיהוי חומרים בעלי פעילות אנטי-מיקרוביאלית כנגד פתוגנים מיקרוביאליים ספציפיים, שיכולים להיות להם יישומים בתחומים כגון ייצור תרופות, קוסמטיקה, מזון או מוצרים חקלאיים40.

בדיקות פעילות נוגדת חמצון הן שיטות המשמשות להערכת היכולת של תרכובת או תמצית לנטרל רדיקלים חופשיים או להפחית עקה חמצונית. בדיקות אלה נמצאות בשימוש נרחב במחקר נוגד חמצון, הן במזונות והן במוצרים טבעיים כגון אצות, למשל. ישנן מספר שיטות להעריך את הפעילות נוגדת החמצון, ואחת השיטות הנפוצות ביותר היא יכולת ספיגת רדיקלים חופשיים. בבדיקה זו, רדיקל חופשי יציב, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), משמש להערכת היכולת של תרכובת לתרום אלקטרון ולנטרל את הרדיקל החופשי. פעילות נוגדת חמצון נמדדת על ידי הפחתת הצבע הסגול של DPPH, המתרחשת כאשר התרכובת נוגדת החמצון תורמת אלקטרון לרדיקלים החופשיים. שיטות אחרות כוללות את יכולת ספיגת רדיקלי החמצן (ORAC), יכולת הפחתת הברזל (FRAP) או יכולת הפחתת רדיקלים חופשיים (ABTS)41.

כימות סך הפוליפנולים (QTP), לעומת זאת, אינו שיטה ישירה לקביעת הפעילות נוגדת החמצון אלא מספק מדד לריכוז הכולל של פוליפנולים בדגימה, אם כי מספר חומרים מפריעים יכולים להשפיע על התוצאות. למרות שפוליפנולים רבים ידועים כבעלי תכונות נוגדות חמצון, הפעילות נוגדת החמצון של תרכובת קשורה למספר גורמים, כגון המבנה הכימי שלה, ריכוזה, יכולתה לתרום או ללכוד רדיקלים חופשיים, ואינטראקציות עם רכיבים תאיים אחרים42. הכימות הפשוט של סך הפוליפנולים אינו יכול לספק הערכה של הפעילות נוגדת החמצון של הדגימה. עם זאת, חשוב לציין כי נוכחות של פוליפנולים במדגם עשויה להיות קשורה עם סבירות גבוהה יותר של פעילות נוגדת חמצון שכן פוליפנולים רבים יש תכונות נוגדות חמצון. לפיכך, QTP יכול לשמש אינדיקטור ראשוני לנוכחות פוליפנולים בדגימה, אך אישור לפעילות נוגדת חמצון דורש בדיקות פעילות נוגדת חמצון. פוליפנולים הם קבוצה של תרכובות כימיות הנפוצות בטבע, המצויות במזונות, צמחים, פירות, ירקות ואצות. ישנן שיטות שונות לכימות של פוליפנולים הכולל, ואת שיטת Folin-Ciocalteu היא אחת הנפוצות ביותר. QTP נותן מדד כללי של ריכוז הפוליפנולים, אך אינו מציין את התרכובות הפוליפנוליות הבודדות הקיימות בדגימה. לכן, זוהי שיטה כמותית אך לא איכותית. יתר על כן, חשוב לקחת בחשבון שלפוליפנולים שונים יש יכולות נוגדות חמצון שונות ופעילויות ביולוגיות שונות, ולכן QTP אינו מספק מידע מפורט על התכונות הפונקציונליות הספציפיות של הפוליפנולים הנוכחים.

לכל שיטה יתרונות ומגבלות, והבחירה בבדיקה נתונה תלויה במאפייני התרכובת הנחקרת ובמטרת הניתוח. חשוב לעקוב אחר ההוראות הספציפיות של כל שיטה כדי להבטיח תוצאות אמינות ודומות. בעת קביעת היכולת נוגדת החמצון, חלק מהשלבים הקריטיים הנפוצים כוללים, ראשית, את הכנת המדגם. חשוב להכין את הדגימות כראוי, להבטיח כי ריכוזים נאותים מתקבלים ולמנוע זיהום. זה כרוך בשקילה מדויקת של תרכובות או תמציות ומסתם בממסים מתאימים. כמו כן, חשוב לקחת בחשבון את יציבות התרכובות והתמציות בתהליך ההכנה, האחסון והטיפול. כל הריאגנטים המשמשים בבדיקות הפעילות נוגדת החמצון חייבים להיות מוכנים כראוי וסטנדרטיים כדי להבטיח את יכולת השחזור של התוצאות. זה כרוך הכנה נכונה של תקן חומצה גאלית ואת הדיוק של כרכים. זמן תגובה הוא היבט קריטי לקבלת תוצאות מדויקות בבדיקות נוגדות חמצון. יש צורך לייעל את זמן הדגירה כדי להבטיח תגובה מלאה בין התרכובת נוגדת החמצון לבין רדיקל חופשי. זמן לא מספיק יכול להוביל להערכת חסר של פעילות נוגדת חמצון, בעוד זמן מוגזם יכול לגרום לפירוק של תרכובות או הפרעה מתגובות משניות. כמו כן, הטמפרטורה במהלך הבדיקות חייבת להיות מבוקרת באופן מדויק ועקבי. הטמפרטורה משפיעה על מהירות התגובות הכימיות ויכולה להשפיע על התוצאות. חשוב לעקוב אחר תנאי הטמפרטורה המומלצים בשיטות הספציפיות ולהבטיח יציבות טמפרטורה לאורך כל ההליך. הכללת בקרות מתאימות חיונית כדי לאמת את התוצאות של בדיקות נוגדות חמצון. זה יכול לכלול בקרות חיוביות (תרכובות הידועות כבעלות פעילות נוגדת חמצון) ושליליות (דגימות ללא פעילות נוגדת חמצון). בקרות מספקות בסיס להשוואה לפרשנות התוצאות ומסייעות להבטיח את דיוק הנתונים המתקבלים. כדי לקבל תוצאות אמינות, מומלץ לבצע בדיקות של פעילות נוגדת חמצון על עותקים משוכפלים ולחזור על הניסוי מספר פעמים כדי להעלות את משמעות הנתונים ולקבל תוצאות אמינות וחזקות יותר.

לשיטות בדיקת פעילות נוגדת חמצון יש כמה מגבלות שיש לקחת בחשבון כאשר מפרשים את התוצאות, כלומר, העובדה שבמדיה נוזלית הן עשויות שלא ללכוד באופן מלא את המורכבות של מערכות ביולוגיות ואינטראקציות בין תרכובות שונות, המגוון הרחב של תגובות נוגדות חמצון שיכולות להתרחש, מטבוליזם תאי וגורמים סביבתיים שיכולים להשפיע על פעילות נוגדי חמצון. לכן, יש להשתמש בבדיקות שונות. יש להיות מודעים גם להיעדר קשר ישיר עם יתרונות בריאותיים; למרות שפעילות נוגדת חמצון נקשרת לעתים קרובות ליתרונות בריאותיים, זה לא תמיד מתורגם ישירות ליתרונות בריאותיים באורגניזמים חיים בגלל גורמים רבים אחרים, כגון זמינות ביולוגית, חילוף חומרים ואינטראקציות עם מערכות ביולוגיות אחרות.

חשוב לזכור כי בדיקות פעילות נוגדת חמצון הן כלים שימושיים להערכה ראשונית של הפוטנציאל נוגד החמצון של תרכובות ותמציות, אך אין לראות בהן אינדיקטור מוחלט להשפעות ביולוגיות או יתרונות בריאותיים. נדרשים מחקרים נוספים כדי להבין באופן מלא את ההשפעה של נוגדי חמצון על הגוף.

למרות שהשיטות לבדיקת הפעילות נוגדת החמצון בתווך נוזלי נמצאות בשימוש נרחב במחקר ויש להן יתרונות ומגבלות, בהשוואה לאלטרנטיבות, שיטות אלה יכולות להיחשב טובות מבחינת מעשיות, מהירות, עלות וקלות יישום. אחד היתרונות העיקריים הוא פשטות ומהירות ההליכים והתאמתם למחקר ראשוני, סינון מורכב ומחקרים רחבי היקף. שיטות אלו מהירות יחסית לביצוע ויכולות לספק תוצאות בתקופה קצרה, בצורה משתלמת יותר, ודורשות פחות ציוד ייעודי בהשוואה לשיטות אחרות.

אצות ידועות ביכולתן לייצר תרכובות ביו-אקטיביות, כולל נוגדי חמצון, שעשויות להיות בעלות סגולות בריאותיות מועילות43 . ניתן להכין תמציות אצות מחלקים שונים של האצות וניתן להשיג אותן באמצעות ממסים שונים, כגון מים, אתנול, מתנול או אצטון, בין היתר. חשוב לזכור כי הפעילות נוגדת החמצון של תמציות אצות יכולה להשתנות בהתאם למספר גורמים, כגון מיני האצות, מתודולוגיית המיצוי וריכוז התרכובות הביו-אקטיביות הקיימות. לכן, מומלץ לבצע בדיקות פעילות נוגדת חמצון על משכפלים ולבצע השוואות עם בקרות מתאימות כדי לקבל תוצאות אמינות יותר. שיטות אלה יכולות לשמש ככלי ראשוני בסינון ובחירה של תמציות אצות בעלות פוטנציאל נוגד חמצון למחקרים נוספים.

בדיקת MTT היא טכניקה נפוצה להערכה ראשונית של השפעות ציטוטוקסיות במבחנה של חומרים לשימוש בני אדם ובעלי חיים. עם זאת, למרות היותה השיטה הנפוצה ביותר לבדיקת ציטוטוקסיות, ההמרה של MTT לגבישי פורמזן מושפעת מגורמים רבים כמו קצב חילוף החומרים ומספר המיטוכונדריה, והיא ישימה רק למטרות תאים דבקים14. השלבים הקריטיים העיקריים של הפרוטוקול המתואר כאן קשורים בסופו של דבר להתרחשות של זיהומים בתרביות תאים, גדילה לא רצויה של תאי HaCaT ואחוז נמוך של מפגש תאים. ישנן שיטות אחרות, כגון לקטט דהידרוגנאז (LDH), אדנוזין טריפוספט (ATP), ומבחני היווצרות מושבה למדידת ציטוטוקסיות. עם זאת, לכולם יש יתרונות ואילוצים. Ghasemi et al. (2021)44 העריכו את ההשפעה של מספר משתנים על מדידות בדיקת MTT על קו תאי סרטן הערמונית (PC-3). נבדקו גורמים כגון צפיפות זריעת תאים, ריכוז MTT, זמן הדגירה לאחר הוספת MTT, רעב בסרום, הרכב המדיה של תרביות תאים, תוכן תוך-תאי ששוחרר ושחול של פורמזן לחלל החוץ תאי. ממחקר זה, המלצות שימושיות כיצד ליישם את הבדיקה ופרספקטיבה על המקום שבו התועלת של הבדיקה היא כלי רב עוצמה, אך כמו כן היכן יש לו מגבלות, תוארו על ידי מחברים אלה. עם זאת, בדיקת MTT היא מתודולוגיה מהירה, רגישה מאוד וקלה שניתן ליישם כהערכה ציטוטוקסית ראשונית של חומרים רבים עם יישום פוטנציאלי בתחומים הטיפוליים, מזון, הזנה, חקלאות וסביבה. בפרט, בדיקת MTT שבוצעה כאן הראתה כי אתנול ותמציות מימיות מ G. gracilis , בריכוזים שנבדקו, לא השפיעו על כדאיות קרטינוציטים והוא יכול להמשיך לבדיקות in vivo כדי להבטיח שהם בטוחים לחלוטין לשימוש עורי אנושי.

השימוש במשאבים ימיים במוצרי מזון הוכיח שוב את הפוטנציאל שלו לא רק להשיג מוצרים בעלי ערך תזונתי מוסף, אלא גם למצוא מוצרים בעלי תווית נקייה יותר. תוספת של שלם G. gracilis (פסטה) או תמצית (כמו צבע מאכל) מראה פוטנציאל השוק, ואת היישום שלה יכול להיות אחת האסטרטגיות עבור חברות להתבלט בשוק, לספק את הצרכים התזונתיים של הצרכנים, ולעקוב אחר מגמות השוק שלהם.

כאשר הוסיפו אצות לנוסחאות הפסטה, נמצא תחילה כי המבנה השתנה וכי לא ניתן לקבל את צורות הבצק הרצויות. היה לנו אתגר להתאים כמויות ולהוסיף מרכיבים אחרים שלא צפינו מראש, במטרה לשמור על מרקם הפסטה. מלבד הכמות המתאימה של כל מרכיב, שיטת האקסטרוזיה הותאמה לאורך כל התפתחות הפסטה. מלבד קושי זה, פיתוח מוצרים חדשים מבוסס על שלושה עקרונות יסוד: המוצר חייב להיות מושך חושית (מרקם, טעם, ריח); המוצר חייב להיות בעל ערך תזונתי מוסף; והיא חייבת לעשות שימוש מרבי במרכיבים ובמתודולוגיות בנות קיימא. במובן זה, אתגר מרכזי נוסף הוא השימוש בלוח החושים כדי להשיג את הניסוח המושך ביותר. רוב הניתוחים הפיזיקוכימיים שבוצעו על פסטה כבר היו מותאמים למטריצות מזון; עם זאת, בעבודה זו, הכנת המדגם היה אופטימלי, כך שניתן ליישם אותו ביעילות על כל שיטות הניתוח.

לגבי השימוש בפיגמנט G. gracilis כצבען, נבחר מוצר קירור בשל הרגישות התרמית של סוג זה של מולקולה45. מכיוון שהכנת יוגורט כרוכה בעיבוד תרמי, הפיגמנט נוסף למוצר הסופי. ערבוב הפיגמנט ביוגורט הביא למוצר מעט יותר נוזלי מהביקורת ללא פיגמנט. למעשה, בסוף מבחן המשולש, חלק מחברי הפאנל העירו כי ההבדל היחיד בין הדגימות הוא המרקם. זוהי תוצאה טובה מכיוון שהמטרה העיקרית של בדיקת המשולש הייתה לוודא אם יש הבדלים ניכרים בין יוגורט עם וללא פיגמנט, במיוחד הבדלים בטעם ובריח, שכן תמציות אצות עלולות להקנות טעם/ריח לא נעים למוצרי מזון. זה היה מחקר ראשוני שכלל פאנל קטן מאומן למחצה. במחקרים נוספים, יש לשקול מספר גדול יותר של טועמים כדי להשיג תוצאות שוק אמינות יותר. באשר להערכת יציבות פיגמנט ביוגורט, מחקרים נוספים יכולים לכלול הערכה של תכונות פיסיקוכימיות אחרות של יוגורט עם פיגמנט לאורך זמן, כגון pH, פעילות מים (aw) ומרקם. הערכה חושית לאורך זמן תהיה גם רצויה.

לסיכום, הפרוטוקולים המתוארים כאן מדגישים את הפוטנציאל של אצות האצות האדומות G. gracilis כמקור מרכיבים לפיתוח מוצרים חדשניים עם יישומים פוטנציאליים בתעשיות התרופות, הדרמוקוסמטיקה והמזון. יתר על כן, הביומסה השיורית שלאחר מיצוי נותרה חומר יקר ערך שיש ליישם כביוסטימולנט גידול צמחים, העשרת קרקע, הזנת דגים או חומרי הזנה להשגת ביו-פחם ו / או פחמן פונקציונלי למטרות טיהור מים. גישת הזיקוק הביולוגי המתוארת כאן יכולה להיות מיושמת על מיני אצות אחרים, תוך קידום כלכלה מעגלית כחולה וקיימות סביבתית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הפורטוגזית למדע וטכנולוגיה (FCT) באמצעות פרויקטים אסטרטגיים שהוענקו למרכז MARE-Marine and Environmental Sciences Centre (UIDP/04292/2020 ו- UIDB/04292/2020), ולמעבדה עמיתה ARNET (LA/P/0069/2020). FCT גם מימנה את מענקי הדוקטורט האישיים שהוענקו למרתה ו. פרייטס (UI/BD/150957/2021) וטטיאנה פריירה (2021. 07791. ב"ד). עבודה זו נתמכה כספית גם על ידי פרויקט HP4A - פסטה בריאה לכולם (קידום משותף מס '039952), במימון משותף של ERDF - הקרן האירופית לפיתוח אזורי, במסגרת תוכנית פורטוגל 2020, באמצעות COMPETE 2020 - תחרותיות ובינאום תוכנית תפעולית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute Ethanol Aga, Portugal 64-17-5
Ammonium Chloride PanReac 12125-02-9
Amphotericin B Sigma-Aldrich 1397-89-3
Analytical scale balance Sartorius, TE124S 22105307
Bacillus subtilis subsp. spizizenii German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) DSM 347
Biotin Panreac AppliChem 58-85-5
Centrifuge Eppendorf, 5810R 5811JH490481
Chloramphenicol PanReac 56-75-7
CO2 Chamber Memmert N/A
Cool White Fluorescent Lamps OSRAM Lumilux Skywhite N/A
Densitometer McFarland Grant Instruments N/A
DMEM medium Sigma-Aldrich D5796
DMSO Sigma-Aldrich 67-68-5
DPPH Sigma, Steinheim, Germany 1898-66-4
Escherichia coli (DSM 5922) German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) DSM5922
Ethanol 96% AGA-Portugal 64-17-5
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA) J.T.Baker 6381-92-6
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Filter Paper (Whatman No.1) Whatman WHA1001320
Flasks VWR International, Alcabideche, Portugal  N/A
Folin-Ciocalteu VWR Chemicals 31360.264
Gallic Acid  Merck 149-91-7
Germanium (IV) Oxide, 99.999% AlfaAesar 1310-53-8
HaCaT cells – 300493 CLS-Cell Lines Services, Germany  300493
Hot Plate Magnetic Stirrer IKA, C-MAG HS7 06.090564
Iron Sulfate VWR Chemicals 10124-49-9
Laminar flow hood TelStar, Portugal 526013
LB Medium  VWR Chemicals J106
Listonella anguillarum German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)  DSM 21597
Manganese Chloride VWR Chemicals 7773.01.5
Micropipettes  Eppendorf, Portugal N/A
Microplates VWR International, Alcabideche, Portugal  10861-666
Microplates Greiner 738-0168
Microplates (sterile) Fisher Scientific 10022403
Microplate reader  Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA 1611151E
MTT Sigma-Aldrich 289-93-1
Muller-Hinton Broth (MHB) VWR Chemicals 90004-658
Oven Binder, FD115 12-04490
Oven Binder, BD115 04-62615
Penicillin Sigma-Aldrich 1406-05-9
pH meter Inolab  VWR International, Alcabideche, Portugal  15212099
Pippete tips Eppendorf, Portugal 5412307
Pyrex Bottles Media Storage  VWR International, Alcabideche, Portugal  16157-169
Rotary Evaporator Heidolph, Laborota 4000 80409287
Rotavapor IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal 07.524254
Sodium Carbonate (Na2CO3) Chem-Lab 497-19-8
Sodium Chloride (NaCl)  Normax Chem 7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic Riedel-de Haën 7558-79-4
SpectraMagic NX Konica Minolta, Japan color data analysis software
Spectrophotometer Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA 5A4T092004
Streptomycin Sigma-Aldrich 57-92-1
Thiamine Panreac AppliChem 59-43-8
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4049
Tryptic Soy Agar (TSA) VWR Chemicals ICNA091010617
Tryptic Soy Broth (TSB)  VWR Chemicals 22091
Ultrapure water  Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany F5HA17360B
Vacuum pump Buchi, Switzerland FIS05-402-103
Vitamin B12 Merck 68-19-9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Charoensiddhi, S., Abraham, R. E., Su, P., Zhang, W. Seaweed and seaweed-derived metabolites as prebiotics. Advances in Food and Nutrition Research. 91, 97-156 (2020).
  2. Roohinejad, S., Koubaa, M., Barba, F. J., Saljoughian, S., Amid, M., Greiner, R. Application of seaweeds to develop new food products with enhanced shelf-life, quality, and health-related beneficial properties. Food Research International. 99, 1066-1083 (2017).
  3. Hurd, C. L., Harrison, P. J., Bischof, K., Lobban, C. S. Seaweed Ecology and Physiology. (second). , Cambridge University Press, UK. (2014).
  4. Freitas, M. V., Mouga, T., Correia, A. P., Afonso, C., Baptista, T. New insights on the sporulation, germination, and nutritional profile of Gracilaria gracilis (Rhodophyta) grown under controlled conditions. Journal of Marine Science and Engineering. 9 (6), 562 (2021).
  5. Friedlander, M. Advances in cultivation of Gelidiales. Journal of Applied Phycology. 20 (5), 451-456 (2008).
  6. Matos, G. S., Pereira, S. G., Genisheva, Z. A., Gomes, A. M., Teixeira, J. A., Rocha, C. M. R. Advances in extraction methods to recover added-value compounds from seaweeds: Sustainability and functionality. Foods. 10, 516 (2021).
  7. Ummat, V., Sivagnanam, S. P., Rajauria, G., O'Donnell, C., Tiwari, B. K. Advances in pre-treatment techniques and green extraction technologies for bioactives from seaweeds. Trends in Food Science & Technology. 110, 90-106 (2021).
  8. Pérez, M. J., Falqué, E., Domínguez, H. Seaweed Antimicrobials, Present Status and Future Perspectives. Handbook of Algal Technologies andPhytochemicals:Volume I Food, Health and Nutraceutical Applications. Ravishankar, G., Ambati, R. R. , 1st ed, CRC Press, Boca Raton, Florida. (2019).
  9. Cavallo, R. A., Acquaviva, M. I., Stabili, L., Cecere, E., Petrocelli, A., Narracci, M. Antibacterial activity of marine macroalgae against fish pathogenic Vibrio species. Central European Journal of Biology. 8, 646-653 (2013).
  10. Shannon, E., Abu-Ghannam, N. Antibacterial derivatives of marine algae: An overview of pharmacological mechanisms and applications. Marine Drugs. 14 (4), 81 (2016).
  11. Capillo, G., et al. New insights into the culture method and antibacterial potential of Gracilaria gracilis. Marine Drugs. 16 (12), 492 (2018).
  12. Francavilla, M., Franchi, M., Monteleone, M., Caroppo, C. The red seaweed Gracilaria gracilis as a multi products source. Marine Drugs. 11 (10), 3754-3776 (2013).
  13. Sánchez-Ayora, H., Pérez-Jiménez, J. Antioxidant Capacity of Seaweeds: In Vitro and In Vivo Assessment. Marine Phenolic Compounds. Pérez-Correa, J. R., Mateos, R., Domínguez, R. , Elsevier. 299-341 (2023).
  14. Anil, S., Sweety, V. K., Vikas, B., Betsy-Joseph, B. Cytotoxicity and Cell Viability Assessment of Biomaterials. Cytotoxicity. , Intechopen. 111822 (2023).
  15. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  16. Roleda, M. Y., et al. Variations in polyphenol and heavy metal contents of wild-harvested and cultivated seaweed bulk biomass: Health risk assessment and implication for food applications. Food Control. 95, 121-134 (2019).
  17. Souza, K. D., et al. Gastronomy and the development of new food products: Technological prospection. International Journal of Gastronomy and Food Science. 33, 100769 (2023).
  18. Pereira, T., et al. Optimization of phycobiliprotein pigments extraction from red algae Gracilaria gracilis for substitution of synthetic food colorants. Food Chemistry. 321, 126688 (2020).
  19. Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. New England Seaweed Culture Handbook-Nursery Systems. Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. , Connecticut Sea Grant, University of Connecticut. (2014).
  20. Yong, Y. S., Yong, W. T. L., Anton, A. Analysis of formulae for determination of seaweed growth rate. Journal of Applied Phycology. 25 (6), 1831-1834 (2013).
  21. Patarra, R. F., Carreiro, A. S., Lloveras, A. A., Abreu, M. H., Buschmann, A. H., Neto, A. I. Effects of light, temperature and stocking density on Halopteris scoparia growth. Journal of Applied Phycology. 29 (1), 405-411 (2017).
  22. NCCLS, National Committee for Clinical Laboratory Standards, Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests: Approved Standard. 32, 11th ed, Wayne, PA, USA. M02-M11 (2012).
  23. Singleton, V. L., Rossi, J. A. J. Colorimetry to total phenolics with phosphomolybdic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
  24. Duan, X. J., Zhang, W. W., Li, X. M., Wang, B. G. Evaluation of antioxidant property of extract and fractions obtained from a red alga, Polysiphonia urceolata. Food Chemistry. 95 (1), 37-43 (2006).
  25. Freitas, R., et al. Highlighting the biological potential of the brown seaweed Fucus spiralis for skin applications. Antioxidants. 9 (7), 611 (2020).
  26. Duarte, A., et al. Seasonal study of the nutritional composition of unexploited and low commercial value fish species from the Portuguese coast. Food Science and Nutrition. 10 (10), 3368-3379 (2020).
  27. Folch, J., Lees, M., Stanley, G. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  28. ISO 6865. Animal feeding stuffs - Determination of crude fibre content - Method with intermediate filtration. Bureau of Indian Standards (BIS). , (2000).
  29. Fernández, A., Grienke, U., Soler-Vila, A., Guihéneuf, F., Stengel, D. B., Tasdemir, D. Seasonal and geographical variations in the biochemical composition of the blue mussel (Mytilus edulis L.) from Ireland. Food Chemistry. 177, 43-52 (2015).
  30. Pinto, F., et al. Annual variations in the mineral element content of five fish species from the Portuguese coast. Food Research International. 158, 111482 (2022).
  31. FAO. Food energy - methods of analysis and conversion factors. , FAO Food and Nutrition Paper 77 at https://www.fao.org/fileadmin/templates/food_composition/documents/book_abstracts/Food_energy.pdf (2003).
  32. Regulation (EU) Nr. 1169/2011 of the European Parliament and of the Council of 25 -10-2011. 25, https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/?uri=CELEX%3A32011R1169 (2011).
  33. Pathare, P. B., Opara, U. L., Al-Said, F. A. J. Colour measurement and analysis in fresh and processed foods: A review. Food and Bioprocess Technology. 6 (1), 36-60 (2013).
  34. ISO 4120. Sensory analysis - Methodology - Triangle test. International Standard. , https://www.iso.org/standard/33495.html (2004).
  35. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: A review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  36. Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
  37. Gajic, I., et al. Antimicrobial susceptibility testing: A comprehensive review of currently used methods. Antibiotics. 11 (4), 427 (2022).
  38. Gonzalez-Pastor, R., et al. Current landscape of methods to evaluate antimicrobial activity of natural extracts. Molecules. 28 (3), 1068 (2023).
  39. Li, J., et al. Antimicrobial activity and resistance: Influencing factors. Frontiers in Pharmacology. 13 (8), 364 (2017).
  40. Silva, A., et al. Macroalgae as a source of valuable antimicrobial compounds: Extraction and applications. Antibiotics. 9 (10), 642 (2020).
  41. Munteanu, I. G., Apetrei, C. Analytical methods used in determining antioxidant activity: A review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3380 (2021).
  42. Ma, S., et al. Comparison of common analytical methods for the quantification of total polyphenols and flavanols in fruit juices and ciders. Journal of Food Science. 84 (8), 2147-2158 (2019).
  43. Tziveleka, L. A., Tammam, M. A., Tzakou, O., Roussis, V., Ioannou, E. Metabolites with antioxidant activity from marine macroalgae. Antioxidants. 10 (9), 1431 (2021).
  44. Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
  45. Pereira, T., Barroso, S., Mendes, S., Gil, M. M. Stability, kinetics, and application study of phycobiliprotein pigments extracted from red algae Gracilaria gracilis. Journal of Food Science. 85 (10), 3400-3405 (2020).

Tags

ביולוגיה גיליון 201
הערכה של אצה אדומה <em>Gracilaria gracilis</em> באמצעות גישה של זיקוק ביולוגי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martins, A., Pinto, F. R., Barroso,… More

Martins, A., Pinto, F. R., Barroso, S., Pereira, T., Mouga, T., Afonso, C., Freitas, M. V., Pinteus, S., Pedrosa, R., Gil, M. M. Valorization of the Red Seaweed Gracilaria gracilis Through a Biorefinery Approach. J. Vis. Exp. (201), e65923, doi:10.3791/65923 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter