Aufwertung der Rotalge Gracilaria gracilis durch einen Bioraffinerieansatz

Summary

Hier beschreiben wir verschiedene Protokolle, die auf eine integrierte Aufwertung von Gracilaria gracilis abzielen: Ernte von Wildarten, Eigenzucht und Extraktion von bioaktiven Inhaltsstoffen. Die antioxidative, antimikrobielle und zytotoxische Wirkung der Extrakte wird ebenso bewertet wie die Nährwert- und Stabilitätsbewertung von Lebensmitteln, die mit ganzer Algenbiomasse und Pigmenten angereichert sind.

Abstract

Das Interesse an Algen als reichlich vorhandener Rohstoff zur Gewinnung wertvoller und zielführender bioaktiver Inhaltsstoffe wächst kontinuierlich. In dieser Arbeit untersuchen wir das Potenzial von Gracilaria gracilis, einer essbaren Rotalge, die weltweit wegen ihres kommerziellen Interesses als Quelle für Agar und andere Inhaltsstoffe für kosmetische, pharmakologische, Lebensmittel- und Futtermittelanwendungen angebaut wird.

Die Wachstumsbedingungen von G. gracilis wurden durch vegetative Vermehrung und Sporulation optimiert, während die physikalisch-chemischen Bedingungen manipuliert wurden, um einen großen Biomassebestand zu erreichen. Grüne Extraktionsmethoden mit Ethanol und Wasser wurden über die Algenbiomasse durchgeführt. Das bioaktive Potenzial der Extrakte wurde durch eine Reihe von In-vitro-Assays hinsichtlich ihrer Zytotoxizität, ihrer antioxidativen und antimikrobiellen Eigenschaften bewertet. Darüber hinaus wurde getrocknete Algenbiomasse in Nudelformulierungen eingearbeitet, um den Nährwert der Lebensmittel zu erhöhen. Aus G. gracilis extrahierte Pigmente wurden auch als natürlicher Farbstoff in Joghurt eingearbeitet und ihre Stabilität bewertet. Beide Produkte wurden einer halbgeschulten sensorischen Jury unterzogen, die darauf abzielt, die beste Endformulierung zu erreichen, bevor sie auf den Markt kommen.

Die Ergebnisse belegen die Vielseitigkeit von G. gracilis , unabhängig davon, ob es als Gesamtbiomasse, Extrakte und/oder Pigmente angewendet wird. Durch die Implementierung mehrerer optimierter Protokolle ermöglicht diese Arbeit die Entwicklung von Produkten mit dem Potenzial, von den Lebensmittel-, Kosmetik- und Aquakulturmärkten zu profitieren und die ökologische Nachhaltigkeit und eine blaue Kreislaufwirtschaft zu fördern.

Darüber hinaus wird die verbleibende Algenbiomasse im Einklang mit einem Bioraffinerieansatz als Biostimulans für das Pflanzenwachstum verwendet oder in Kohlenstoffmaterialien umgewandelt, die bei der Wasseraufbereitung der hauseigenen Aquakultursysteme von MARE-Polytechnic in Leiria, Portugal, verwendet werden.

Introduction

Algen können als interessanter natürlicher Rohstoff angesehen werden, von dem die Pharma-, Lebensmittel-, Futtermittel- und Umweltbranche profitieren kann. Sie biosynthetisieren eine Vielzahl von Molekülen, von denen viele in terrestrischen Organismen nicht vorkommen und relevante biologische Eigenschaften aufweisen ^1,2. Es müssen jedoch Algen-optimierte Anbauprotokolle implementiert werden, um einen großen Biomassebestand zu gewährleisten.

Die Anbaumethoden müssen immer die Art der Algen-Thalli und die allgemeine Morphologie berücksichtigen. Gracilaria gracilis ist ein klonales Taxon, d.h. das Bindungsorgan produziert mehrere vegetative Achsen. Die Fortpflanzung durch Fragmentierung (vegetative Fortpflanzung) wird somit erreicht, da jede dieser Achsen vollständig in der Lage ist, ein unabhängiges Leben vom Hauptthallus³ anzunehmen. Klonale Taxa können mit einfachen und schnellen einstufigen Kultivierungsmethoden erfolgreich integriert werden, da große Mengen an Biomasse durch die Spaltung des Thallus in kleine Fragmente gewonnen werden, die sich schnell regenerieren und zu neuen, genetisch identischen Individuen heranwachsen. Dabei können sowohl haplontische als auch diplontische Thalli verwendet werden. Obwohl die Gattung einen komplexen haplo-diplontischen isomorphen triphasischen Lebenszyklus aufweist, ist eine Sporulation nur selten erforderlich, es sei denn, eine genetische Erneuerung der Bestände ist erforderlich, um verbesserte Ernten zu erzielen. In diesem Fall entstehen sowohl Tetrasporen (haplontische Sporen, die durch Meiose gebildet werden) als auch Carposporen (diplontische Sporen, die durch Mitose gebildet werden) makroskopische Thalli, die dann durch vegetative Vermehrung gezüchtet und vermehrt werden können⁴. Wachstumszyklen werden von den Umweltbedingungen und dem physiologischen Zustand der Individuen bestimmt, neben anderen biologischen Faktoren wie der Entstehung von Epiphyten und der Adhäsion anderer Organismen. Daher ist die Optimierung der Wachstumsbedingungen von entscheidender Bedeutung, um eine hohe Produktivität zu gewährleisten und Biomasse von guter Qualität zu produzieren⁵.

Die Extraktion bioaktiver Verbindungen aus Algen, einschließlich G. gracilis, kann durch verschiedene Methoden erreicht^{werden 6,7}. Die Wahl der Extraktionsmethode hängt von den spezifischen Verbindungen von Interesse, der Zielanwendung und den Eigenschaften der Algen ab. In dieser Studie konzentrierten wir uns auf die Lösungsmittelextraktion, bei der grüne Lösungsmittel wie Wasser oder Ethanol verwendet werden, um bioaktive Verbindungen aus der Algenbiomasse aufzulösen und zu extrahieren. Die Extraktion kann durch Mazeration vielseitig und effektiv durchgeführt werden und kann für eine Vielzahl von Verbindungen verwendet werden. Es handelt sich um eine einfache und weit verbreitete Methode, bei der Biomasse über einen längeren Zeitraum in einem Lösungsmittel eingeweicht wird, typischerweise bei Raum- oder leicht erhöhten Temperaturen. Das Lösungsmittel wird gerührt, um den Extraktionsprozess zu verbessern. Nach der gewünschten Extraktionszeit wird das Lösungsmittel durch Filtration oder Zentrifugation vom Feststoff getrennt.

Wasser ist aufgrund seiner Sicherheit, Verfügbarkeit und Kompatibilität mit einer Vielzahl von Lebensmitteln ein häufig verwendetes Lösungsmittel in Lebensmittelanwendungen. Die Wasserextraktion eignet sich für polare Verbindungen wie Polysaccharide, Peptide und bestimmte Phenole. Es kann jedoch sein, dass es unpolare Verbindungen nicht effektiv extrahiert. Ethanol ist auch ein weit verbreitetes Lösungsmittel in Lebensmittelanwendungen und kann für die Extraktion einer Vielzahl von bioaktiven Molekülen, einschließlich phenolischer Verbindungen, Flavonoide und bestimmter Pigmente, wirksam sein. Ethanol ist allgemein als sicher für die Verwendung in Lebensmitteln anerkannt und kann leicht verdampft werden, wobei die extrahierten Verbindungen zurückbleiben. Es ist erwähnenswert, dass bei der Wahl der Extraktionsmethode Faktoren wie Effizienz, Selektivität, Kosteneffizienz und Umweltauswirkungen berücksichtigt werden sollten. Die Optimierung von Extraktionsparametern wie Lösungsmittelkonzentration, Extraktionszeit, Temperatur und Druck ist entscheidend, um optimale Ausbeuten an bioaktiven Verbindungen aus G. gracilis oder anderen Algen zu erzielen.

Es wurde festgestellt, dass Algen eine antimikrobielle Aktivität gegen eine Vielzahl von Mikroorganismen aufweisen, darunter Bakterien, Pilze und Viren⁸. Diese Aktivität wird bioaktiven Komponenten zugeschrieben, darunter Phenole, Polysaccharide, Peptide und Fettsäuren. Mehrere Studien haben ihre Wirksamkeit gegen Krankheitserreger wie Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. und Pseudomonas aeruginosa unter anderem nachgewiesen⁹. Die antimikrobielle Aktivität von Algen wird auf das Vorhandensein bioaktiver Verbindungen zurückgeführt, die mikrobielle Zellwände, Membranen, Enzyme und Signalwege stören können¹⁰. Diese Verbindungen können das mikrobielle Wachstum stören, die Bildung von Biofilmen hemmen und die Immunantwort modulieren.

Rote Algen, auch Rhodophyten genannt, sind eine Gruppe von Algen, die eine antimikrobielle Aktivität gegen eine Vielzahl von Mikroorganismen aufweisen können. Innerhalb dieser Gruppe enthält G. gracilis verschiedene bioaktive Verbindungen, die zu seiner berichteten antimikrobiellen Aktivität beitragen können. Während die spezifischen Moleküle variieren können, sind die gemeinsamen Klassen, über die in G. gracilis berichtet wurde und antimikrobielle Eigenschaften besitzen können, Polysaccharide, Phenole, Terpenoide und Pigmente¹¹. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass das Vorhandensein und die Mengen dieser Komponenten je nach Faktoren wie dem Ort der Algensammlung, der Saisonalität, dem physiologischen Zustand des Thallis und den Umweltbedingungen variieren können. Daher können die spezifische Klasse und Konzentration der antimikrobiellen Verbindungen in G. gracilis entsprechend variieren.

Es wurde auch festgestellt, dass G. gracilis antioxidative Eigenschaften besitzt, die verschiedene phenolische Verbindungen enthalten, von denen gezeigt wurde, dass sie freie Radikale abfangen und oxidativen Stress reduzieren¹².Antioxidantien tragen dazu bei, die Zellen vor Schäden durch reaktive Sauerstoffspezies zu schützen und haben potenzielle gesundheitliche Vorteile. Die antioxidative Kapazität kann direkt durch verschiedene Methoden bewertet werden, einschließlich der 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)-Radikalfängeraktivität und indirekt durch die Quantifizierung des Gesamtpolyphenolgehalts (TPC)¹³.

Auch wenn ein Inhaltsstoff eine ausgeprägte Bioaktivität aufweist, ist seine Zytotoxizitätsbewertung bei der Bewertung natürlicher und synthetischer Substanzen, die in Kontakt mit lebenden Zellen oder Geweben verwendet werden sollen, unerlässlich. Es gibt mehrere Methoden zur Messung der Zytotoxizität, jede mit Vor- und Nachteilen. Insgesamt bieten sie eine Reihe von Möglichkeiten, die schädlichen Auswirkungen vieler Substanzen auf Zellen zu bewerten und gleichzeitig die Mechanismen von Zellschädigung und Zelltod zu untersuchen¹⁴.

In dieser Arbeit verwenden wir den 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay, eine kolorimetrische Methode, die von Mosmann (1983)¹⁵ eingeführt wurde. Diese Methode misst die Reduktion von Tetrazoliumsalzen zu einem violetten Formazanprodukt durch stoffwechselaktive Zellen. Je höher die Menge an Formazankristallen, desto höher ist die Anzahl lebensfähiger Zellen, was ein indirektes Maß für die Zytotoxizität darstellt¹⁴. Da in dieser Arbeit G. gracilis-Wasser und Ethanolextrakte in dermokosmetische Formulierungen eingearbeitet werden sollen, wird die in vitro Zytotoxizitätsbewertung in einer Keratinozyten (HaCaT)-Zelllinie durchgeführt.

In Bezug auf die Lebensmittelanwendung sind Algen im Allgemeinen kalorienarm und nährstoffreich an Ballaststoffen, essentiellen Elementen und Aminosäuren, Polysacchariden, mehrfach ungesättigten Fettsäuren, Polyphenolen und Vitaminen ^2,16. G. gracilis ist da keine Ausnahme und hat einen interessanten Nährwert. Freitas et al. (2021)⁴ fanden heraus, dass kultivierte G. gracilis im Vergleich zu wilden Algen einen höheren Protein- und Vitamin-C-Gehalt aufwies und den Gesamtlipidspiegel beibehielt. Dies kann einen wirtschaftlichen und ökologischen Vorteil darstellen, da die Produktion ernährungsphysiologisch der Ausbeutung wilder Ressourcen vorzuziehen ist. Darüber hinaus sind die Verbraucher zunehmend besorgt über die Art der Lebensmittel, die sie essen, daher ist es wichtig, neue Zutaten für die Anreicherung von Lebensmitteln einzuführen und neue Ressourcen zu verwenden, um Extrakte zu erhalten, die einem Produkt einen Mehrwert verleihen und ein "sauberes Etikett" beanspruchen können. Außerdem ist der derzeitige Markt sehr wettbewerbsintensiv und erfordert die Entwicklung neuer Produkte und innovativer Strategien, um die Hersteller von ihren Mitbewerbern abzuheben¹⁷.

Die Anreicherung von Produkten mit geringem Nährwert, wie z. B. Nudeln, mit Meeresressourcen, einschließlich Algen, ist eine Strategie, um diese Ressource als neues Lebensmittel einzuführen, und eine Marktdifferenzierungsstrategie durch ein Produkt mit ausgeprägtem Nährwert. Auf der anderen Seite ist G. gracilis eine Quelle für natürliche rote Pigmente wie Phycobiliproteine¹⁸, die ein hohes Potenzial für Anwendungen in der Lebensmittelindustrie haben. Diese Algen haben in mehreren Bereichen großes Interesse gezeigt, und ihre Anwendung kann mit den gesamten Algen, Extrakten und/oder der verbleibenden Biomasse erfolgen. In dieser Arbeit zeigen wir einige Beispiele für solche Anwendungen.

Protocol

1. Ernte und Aufbereitung von Biomasse

1. Ernten Sie die Proben von G. gracilis bei Ebbe und transportieren Sie sie schnell in dunklen, gekühlten Boxen ins Labor, um Trocknung, Licht und Lufteinwirkung zu vermeiden.
2. Waschen Sie jeden Thallus im Labor mit fließendem Meerwasser und reinigen Sie ihn gründlich, um Ablagerungen, nekrotische Teile, Epiphyten und andere Organismen von der Oberfläche zu entfernen.
3. Halten Sie die wilde Biomasse in konstant belüftetem Meerwasser (31-35 PSU) in einem Klimaraum (20 ± 1 °C) mit geringer Bestrahlungsstärke durch Tageslicht, kaltweiße Lampen und Leuchtstofflampen und photoperiodisch auf 16:08 Uhr (hell: dunkel) für 7 Tage. Während dieser Zeit dürfen keine Nährmedien zugeführt werden. So können sich die Algen langsam an die neuen Bedingungen im Innenraum gewöhnen.

2. Bestandspflege

1. Schneiden Sie nach der Eingewöhnungszeit gesunde Algenspitzen mit einer sterilen Klinge ab. In Anlehnung an Redmond et al. (2014)¹⁹ und unter sterilen Bedingungen wird jede Spitze durch ein zuvor in Petrischalen zubereitetes Agar-Gel (1,0 % bakteriologischer Agar, im Verhältnis 1:1 destilliertes Wasser/Meerwasser) gezogen, um alle verbleibenden Verunreinigungen zu entfernen. Führen Sie den Agar-Zug dreimal für jede Spitze durch und ziehen Sie die Spitze immer durch unbenutzte Teile des Agar-Gels.
2. Gläser in Salzsäurelösung (HCl, 15%) sauer waschen und gründlich mit destilliertem Wasser abspülen. Sterilisieren Sie alle Werkzeuge, Glaswaren, Agar, Meerwasser und destilliertes Wasser, die im Reinigungsprozess verwendet werden, im Autoklaven (121 °C, 15 min).
   ACHTUNG: Beachten Sie das vom Lieferanten gelieferte Sicherheitsdatenblatt von HCl.
3. Die Spitzen wachsen in sterilisiertem Meerwasser bei 35 psu, ergänzt mit Von Stosch Enriched Solution (VSE), die für rote Algen modifiziert wurde, nach Redmond et al. (2014)¹⁹. Geben Sie Germaniumdioxid (GeO₂) in das Medium (1 ml/L), um das Wachstum von epiphytischen Kieselalgen zu verhindern.
   ACHTUNG: Beachten Sie das vom Lieferanten gelieferte Sicherheitsdatenblatt von GeO₂ .
   HINWEIS: Spitzen, die einen Pigmentverlust aufweisen, wie er durch teilweise oder vollständige Verfärbungen beobachtet wird, stehen unter Stress oder sind bereits tot und sollten entsorgt werden.

3. Anbau und Scale-up

1. Nach der Akklimatisierungsphase werden nach dem Zufallsprinzip etwa 8-10 gesunde Spitzen in 250-ml-Flachbodenkolben in einem Klimaraum verteilt, der auf 20 ± 1 °C eingestellt ist, mit dem weißen kühlen Licht von 20 ± 0,5 μmol Photonen ^{m-2 s-1} (1500 Lux), einer Photoperiode von 16 h: 8 h (hell: dunkel) und sterilem Meerwasser, das mit VSE-Nährmedien angereichert ist, die jede Woche erneuert werden.
2. Führen Sie wöchentliche Gewichtsmessungen durch und vermeiden Sie es, die Thalli übermäßig zu belasten²⁰. Entfernen Sie dazu vorsichtig die Spitzen aus dem Nährmedium, spülen Sie sie vorsichtig ab und wiegen Sie die Milligramm auf einer Laborwaage ab.
   HINWEIS: Dieses Verfahren kann zusammen mit der wöchentlichen Erneuerung der Nährmedien durchgeführt werden.
3. Thalli kann in diesen Kolben bis zu einer Dichte von 2 g/L wachsen. Führen Sie an dieser Stelle eine Empfängerskalierung durch (250 ml, 1 l und 5 l). Füllen Sie den Anbau in offene weiße Behälter von 50 l und mehr im Freien, wenn das Volumen 5 l erreicht.
4. Berechnen Sie die relative Wachstumsrate (RGR) nach Patarra et al. (2017)²¹ :
   RGR (% vw/Tag) = ([Ln (fw) - Ln (iw)]/t) x 100
   Dabei sind iw und fw das Anfangs- bzw. Endfrischgewicht, ausgedrückt in Gramm, und t die Zeit in Tagen.
   HINWEIS: In diesem Laboraufbau erreicht die RGR Werte von bis zu 21 % pro Tag. Die Biomasseernte kann jederzeit durchgeführt werden. Biomasse muss schnell aufbereitet werden, um einen Abbau zu verhindern, entweder durch Ofentrocknung, Gefriertrocknung oder einfach gefroren (-20 °C), je nach Verwendungszweck. Die getrocknete Biomasse kann bei Raumtemperatur (RT) konserviert oder auch gefroren gelagert werden.

4. Extraktionsverfahren

HINWEIS: Um die In-vitro-Zytotoxizität, die antioxidativen und antimikrobiellen Eigenschaften von G. gracils-Extrakten zu bewerten, werden bei der Herstellung zwei verschiedene Parameter berücksichtigt: die Extraktionstemperatur und die Art des Lösungsmittels.

1. Um die Extraktionen durchzuführen, wird die Biomasse von G. gracilis im Ofen getrocknet und die Biomasse gemahlen (z. B. in einer Haushaltskaffeemühle), bis das Pulver durch ein 200-μm-Sieb läuft.
2. Die getrocknete Biomasse (10 g) wird gewogen und in 100 ml Lösungsmittel (absolutes Ethanol oder steriles Wasser) aufgelöst.
3. In einem lichtgeschützten Gefäß 30 min einrühren.
4. Führen Sie sequentielle Ethanol- > Wasser und Wasser- > Ethanolextraktionen bei RT, 40 °C und 70 °C durch.
5. Führen Sie für jede Temperatur die Extraktionen mit Ethanol und Wasser zweimal getrennt durch.
6. Trennen Sie die flüssigen Extrakte von der verbleibenden Biomasse durch Filtration durch Filterpapier (Whatman No.1), gefolgt von Zentrifugation bei 8000 x g für 10 min bei RT.
7. Verwenden Sie die verbleibende Algenbiomasse für die weitere Extraktion mit dem anderen Lösungsmittel wieder. Wenn eine Probe zuerst mit Ethanol extrahiert wurde, extrahieren Sie sie anschließend mit Wasser und umgekehrt.
8. Die wässrigen Extrakte werden gefriergetrocknet und die Ethanolextrakte in einem Rotationsverdampfer bei 40 °C eingedampft.
9. Lagern Sie die getrockneten Extrakte bei 4 °C.
10. Lösen Sie die Extrakte in einer Konzentration von 50 mg/ml (antimikrobielle Assays) oder 10 mg/ml (antioxidative Assays) auf. Die wässrigen Extrakte werden in sterilem Wasser und die ethanolischen Extrakte in absolutem Ethanol gelöst.

5. Antimikrobielle Aktivität

HINWEIS: Die ethanolischen und wässrigen Extrakte sollten einzeln gegen Bacillus subtilis subsp. spizizenii (DSM 347), Escherichia coli (DSM 5922) und Listonella anguillarum (DSM 21597) getestet werden. Antimikrobielle Tests müssen gemäß den Empfehlungen des National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2012)²² durchgeführt werden. Alle Kulturen stammen aus der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ). L. anguillarum wurde auf tryptischer Sojabrühe (TSB) oder tryptischem Sojaagar (TSA) gezüchtet, die mit 1 % Natriumchlorid (NaCl) ergänzt wurde. Die restlichen beiden Stämme wurden auf LB-Medium (VWR Chemicals) gezüchtet. Die Kulturen Bacillus subtilis subsp. spizizenii (DSM 347) und Listonella anguillarum (DSM 21597) wurden bei 30 °C inkubiert, während Escherichia coli (DSM 5922) bei 37 °C gemäß den Anweisungen des Lieferanten inkubiert wurde. Die Bouillon-Mikrodilutionsmethode kann zur Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität in einem flüssigen Medium verwendet werden, und dies sollte auf der Mikroskala durchgeführt werden, damit das antimikrobielle Potenzial schnell und effizient bestimmt werden kann. Diese kostengünstige Methode ermöglicht es, Ergebnisse in nur 24 Stunden zu erhalten, und eignet sich daher, um in einem frühen Stadium die besten Extraktionsbedingungen zu bestimmen, die es ermöglichen, für einen bestimmten mikrobiellen Stamm Ergebnisse in Bezug auf die wachstumshemmende Wirkung zu erzielen. Die Methodik erfordert jedoch die Verwendung steriler Mikrotiterplatten mit einem Deckel, der speziell für das mikrobielle Wachstum geeignet ist, sowie die Verfügbarkeit eines Mikroplatten-Readers für die Wellenlänge von 600 nm.

1. Führen Sie die Bouillon-Mikrodilutionstests mit unbehandelten und runden 96-Well-Mikrotiterplatten mit 170 μl Muller-Hinton-Bouillon (MHB) durch, die mit 10 μl standardisiertem Inokulum (bei 0,5 McFarland-Standard) und 20 μl jedes Extrakts (50 mg/ml) beimpft wurden.
2. Inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang bei der optimalen Temperatur für jeden Stamm.
3. Nachweis der antimikrobiellen Aktivität durch Verringerung der sichtbaren Trübung, gemessen durch Aufzeichnung der optischen Dichte (OD ₆₀₀) in einem Mikroplatten-Spektralphotometer bei 0 h und 24 h.
4. Drücken Sie die Ergebnisse als Prozentsatz der Hemmung aus:
   
   wobei Abs. ext die Differenz in der gemessenen Absorption zwischen 0 h und 24 h in den Vertiefungen ist, die einen Bakterienstamm enthalten, der in Gegenwart des Extrakts wächst, und Abs sich auf dasselbe Maß in Vertiefungen bezieht, die den Bakterienstamm und das Lösungsmittel enthalten.
5. Zu dieser Methode gehören Kontrollreaktionen, wobei Vertiefungen nur das Kulturmedium enthalten, das die Negativkontrolle darstellt, aber auch Vertiefungen mit Medium, das mit dem Standardstamm beimpft wurde, der dem Lösungsmittel (Ethanol oder Wasser) zugesetzt wurde, und Medium mit dem Bakterienstamm und dem Positivkontrollantibiotikum (Chloramphenicol).

6. Antioxidative Aktivität und Quantifizierung der Gesamtpolyphenole

1. Gesamtgehalt an Polyphenolen
   HINWEIS: Der Gesamtpolyphenolgehalt (TPC) wird mit der Folin-Ciocalteu-Methode²³ berechnet und an den Mikromaßstab angepasst.
   1. In jede Vertiefung einer lichtgeschützten 96-Well-Mikrotiterplatte werden 158 μl Reinstwasser, 2 μl der Probe und 10 μl Folin-Ciocalteu-Reagenz gegeben.
      ACHTUNG: Beachten Sie das Sicherheitsdatenblatt des vom Lieferanten gelieferten Folin-Ciocalteu-Reagenz.
   2. Nach 2 min werden 30 μl Na2CO3 (20 %) zugegeben.
   3. Nach 1 h Inkubation im Dunkeln bei RT werden die Proben spektrophotometrisch bei 755 nm gemessen.
   4. Verwenden Sie Gallussäure (mit der die Kalibrierungskurve gezeichnet werden kann) oder Reinstwasser (2 μl) als Kontrollen.
   5. Die Ergebnisse werden als Gallussäure-Äquivalente (mg GAE/g-Extrakt) ausgedrückt.
2. 2,2 Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) Radikalfängeraktivität
   HINWEIS: Die antioxidative Aktivität der Extrakte wird wie von Duan et al. (2006)²⁴ beschrieben bewertet, angepasst an die Mikroskala
   1. In eine lichtgeschützte 96-Well-Mikroplatte geben Sie 2 μl jeder Probe (in einer Konzentration von 10 mg/ml) und 198 μl DPPH, gelöst in absolutem Ethanol (0,1 mM).
      ACHTUNG: Beachten Sie das vom Lieferanten gelieferte Sicherheitsdatenblatt von DPPH.
   2. Lassen Sie die Reaktion 30 Minuten lang bei RT im Dunkeln laufen. Messen Sie die Absorption bei 517 nm in einem Mikroplatten-Spektralphotometer.
   3. Führen Sie eine Kontrollreaktion mit 2 μl absolutem Ethanol/destilliertem Wasser und 198 μl DPPH-Lösung durch. Führen Sie eine Blindmessung mit 2 μl Extrakt und 198 μl absolutem Ethanol durch.
   4. Drücken Sie die Ergebnisse als Prozentsatz der DPPH-Hemmung mit der folgenden Gleichung aus:
      
      wobei As die Absorption des Algenextrakts, Ab die Absorption der Blindproben und Ac die Absorption der Kontrolle ist.

7. Bewertung der Zytotoxizität in Epidermiszellen

HINWEIS: Die zytotoxische Wirkung der wässrigen und Ethanolextrakte von G. gracilis in vitro wird in menschlichen Keratinozyten (HaCaT-Zellen - 300493) durch den kolorimetrischen MTT-Assay untersucht, wie zuvor beschrieben²⁵. Die Zellen wurden von Cell Lines Services, Germany (CLS) erworben und die Methode wurde in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien und CLS-Anweisungen durchgeführt.
ACHTUNG: Siehe das vom Lieferanten gelieferte Sicherheitsdatenblatt von MTT)

1. Pflege von Zellkulturen
   1. Kultivierung von HaCaT-Zellen in Dulbecco's Modified Eagle High Glucose Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % antibiotischer/antimykotischer Lösung (Amphotericin B, 0,25 mM; Penicillin, 60 mM; Streptomycin, 100 mM).
   2. Verwenden Sie Trypsin-EDTA, um die Zellen zu dissoziieren.
      HINWEIS: Die Subkultur von HaCaT-Zellen wird durchgeführt, nachdem die Zellen eine vollständige Konfluenz erreicht haben.
   3. Die Zellen werden in einer Kammer bei 37 °C mit 5 %_CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit kultiviert.
   4. Subkulturieren Sie die Zellen gemäß den Anweisungen der Biobank, wenn die Kulturen eine Konfluenz von 80 % bis 85 % erreichen.
2. Bewertung der Zytotoxizität
   1. Nach der Aussaat der Zellen in 96-Well-Platten und der Inkubation über Nacht werden die HaCaT-Zellen (4 x 10⁴ Zellen/Well) mit den zuvor in DMSO (100 mg/ml) gelösten getrockneten Extrakten behandelt. Dann werden 2 μl der Extraktlösung zu 198 μl Medium gegeben und die Platten 24 h lang inkubiert.
   2. Entfernen Sie das Kulturmedium und geben Sie 100 μl MTT (0,5 mg/ml) zu den Zellen. Inkubieren Sie die Zellen für 30 Minuten im Dunkeln bei den oben genannten normalen Kulturbedingungen.
   3. Entfernen Sie die MTT-Lösung und lösen Sie die intrazellulären Formazankristalle mit 100 μl DMSO auf.
   4. Messen Sie die Absorption bei 570 nm mit einem Mikroplatten-Reader. Drücken Sie die Ergebnisse als Prozentsatz der unbehandelten Kontrollzellen aus.

8. Innovation in der Lebensmittelindustrie

1. Neues Lebensmittelprodukt: Nudeln mit Algen
   1. Auswahl der Zutaten und Pasta-Formulierung
      HINWEIS: Die Auswahl der Zutaten wurde in Zusammenarbeit mit einer Nudelfirma getroffen. Die Auswahl der Hauptzutaten (siehe Abschnitt 8.2) erfolgte unter Berücksichtigung ihrer leichten Zugänglichkeit und Kompatibilität mit den bestehenden Produktionslinien, wobei Meeresressourcen genutzt wurden, um Nudeln mit Mehrwert zu erhalten.
      1. Entwerfen Sie nach der Auswahl der Inhaltsstoffe die Formulierung nach dem beabsichtigten Nährwert (Quelle von Ballaststoffen, Vitaminen und Mineralstoffen, niedrig gesättigte Fette), indem Sie die theoretische chemische Zusammensetzung der Formulierungen mithilfe einer Tabelle analysieren.
      2. Wenn die theoretischen Voraussetzungen erfüllt sind, fahren Sie mit der Produktion im Labormaßstab fort, wie in Schritt 8.1.2 beschrieben.
      3. Führen Sie einen sensorischen Test mit einem halbgeschulten Panel (>10 Verkoster) durch, um die Notwendigkeit einer Neuformulierung oder die Akzeptanz der Formulierung für die folgenden Schritte zu validieren.
         HINWEIS: Das Gremium wurde zuvor für die Verkostung von Nudeln geschult und bewertete die vorgestellten Rezepturen hedonisch in Bezug auf Eigenschaften wie Aroma, Geschmack, Geruch, Textur und Aussehen.
   2. Herstellung von Teigwaren
      HINWEIS: Produzieren Sie Chifferi-Nudelproben mit einem Nudelextruder.
      1. Mischen Sie im Gerät zuvor definierte Portionen Reismehl, G. gracilis und Chlorella vulgaris und fügen Sie der Mischung etwa 30 % Wasser hinzu.
      2. Um trockene Teigwaren zu erhalten, trocknen Sie Chifferi 42 Minuten lang bei 68 °C, gefolgt von 5 h und 30 Minuten bei 76 °C, wobei ein industrieller Prozess simuliert wird.
      3. Zum Schluss verpacken und vakuumieren Sie die Proben und lagern sie bis zur weiteren Analyse an einem dunklen Ort bei RT.
   3. Nährwertanalyse
      HINWEIS: Für die Analyse des Nährwertprofils sind getrocknete und mazerierte Proben in dreifacher Ausführung zu verwenden.
      1. Rohproteingehalt: Führen Sie den Gesamtprotein-Assay nach der Kjeldahl-Methode durch, die von Duarte et al. (2022) ²⁶ übernommen wurde, und befolgen Sie die Schritte 8.1.3.2-8.1.3.6.
      2. 1,0 g der Probe (oder destilliertes Wasser für den Blind-Assay) genau abwiegen und mit zwei Kjeldahl-Tabletten und 25 ml_H2SO4 inAufschlussröhrchen mischen.
         ACHTUNG: Beachten Sie das vom Lieferanten gelieferte Sicherheitsdatenblatt von H2 SO₄.
      3. Führen Sie den Aufschluss der Proben in einem Kjeldahl-Fermenter bei 220 °C für 30 Minuten durch, gefolgt von 90 Minuten bei 400 °C.
      4. Nach dem Abkühlen auf RT fügt man 80 ml destilliertes Wasser hinzu und destilliert das gebildete Ammoniak zu 30 ml einer 4%igen_{H3BO3-Lösung}, die Bromkresolgrün und Methylrot enthält. Dieser Schritt erfolgt unter alkalischen Bedingungen (Destillation mit 40% NaOH mit einem Kjeldahl-Destilliergerät).
         VORSICHT: Beachten Sie das Sicherheitsdatenblatt der vom Lieferanten gelieferten H3_BO3-Lösung mit Bromkresolgrün, Methylrot und 40 % NaOH.
      5. Die destillierten Proben werden mit HCl 0,1 M titriert, bis ein Farbumschlag zu einem gräulichen Rosa beobachtet wird.
      6. Berechnen Sie den Rohproteingehalt, der durch den Stickstoffgehalt der Probe dargestellt wird, und drücken Sie ihn in g pro 100 g mit der folgenden Gleichung aus:
         
         wobei V_s dem HCl-Volumen (mL) entspricht, das bei der Probentitration verwendet wird; V_b entspricht dem Volumen, das im Rohling verwendet wird; N entspricht der HCl-Normalität; w entspricht dem Probengewicht (g).
      7. Gesamtfettgehalt: Bestimmen Sie den Gesamtfettgehalt mit der Folch-Methode, die von Folch et al. (1957)²⁷ übernommen wurde, nach den Schritten 8.1.3.8-8.1.3.14.
      8. Bereiten Sie das Folch-Reagenz vor, indem Sie CHCl₃ und MeOH in einem Verhältnis von 2:1 (v:v) mischen.
         VORSICHT: Beachten Sie das Sicherheitsdatenblatt des vom Lieferanten gelieferten Folch-Reagenzes.
      9. Zu Reagenzgläsern mit 1 g Aliquot Proben werden 5 ml Folch-Reagenz und 0,8 ml destilliertes Wasser hinzugefügt. 1 Min. in einem Wirbel mischen.
      10. Dann weitere 5 ml Folch-Reagenz hinzufügen und 5 Minuten lang homogenisieren. 1,2 ml 0,8%ige NaCl-Lösung hinzufügen und 2 Minuten lang homogenisieren_.
      11. Die Proben werden bei 7000 x g für 10 min zentrifugiert. Die organische Phase (untere Phase) wird durch hydrophile Baumwolle und wasserfreies Natriumsulfat in einen Glaskolben mit rundem Boden filtriert.
      12. Um Probenverluste zu vermeiden, wiederholen Sie die Schritte der Zugabe von 5 ml CHCl₃, der Homogenisierung, Zentrifugation und Filtration unter den gleichen Bedingungen.
      13. Das organische Lösungsmittel wird durch Niederdruckverdampfung aus den gesammelten organischen Phasen entfernt und 4 h bei 105 °C im Ofen gelassen. Kühlen Sie die Proben in einem Exsikkator ab.
      14. Berechnen Sie den Fettgehalt, ausgedrückt in g pro 100 g, mit der folgenden Gleichung:
          
          wobei W₁ das Gewicht des leeren Glaskolbens mit rundem Boden ist; W₂ ist das Ausgangsgewicht der Probe; W₃ ist der Glaskolben mit rundem Boden und dem Probengewicht.
      15. Rohfasergehalt: Bestimmung des Rohfasergehalts nach einer von ISO 6865 (2000) ²⁸ übernommenen Methode gemäß den Schritten 8.1.3.16-8.1.3.22.
      16. 1 g der Probe (W0) wird in einen Glastiegel mit Filterboden (Referenz P2) eingewogen und in den Faseranalysator gegeben.
      17. Der erste Schritt ist die Säurehydrolyse: 150 ml 1,25 %_H2SO4, vorgewärmt, und 2 ml Antischaummittel (n-Octanol) in die Säule jedes Tiegels geben; Bis zum Kochen erhitzen und 30 Minuten ruhen lassen.
      18. Nach dem Entfernen dieses Lösungsmittels dreimal mit deionisiertem Wasser waschen, um mit der basischen Hydrolyse fortzufahren. Geben Sie 150 ml 1,25 % vorgewärmtes NaOH und 5 ml Antischaummittel in die flüssigkeitsfreie Säule und führen Sie den gleichen Erhitzungsvorgang wie bei der Säurehydrolyse durch.
      19. Zum Schluss machen Sie eine dreifache Wäsche mit 150 ml Aceton für die Kaltextraktion.
      20. Nach diesem Vorgang werden die Tiegel vorsichtig aus dem System entnommen und für 1 h bei 150 °C in den Ofen gegeben. Notieren Sie das Endgewicht (W1).
      21. Die Tiegel werden für 3 h bei 500 °C in einen Muffelofen gestellt und anschließend das Endgewicht (W2) notiert.
      22. Berechnen Sie den Rohfasergehalt und drücken Sie die Ergebnisse in Prozent mit der folgenden Gleichung aus:
          % Rohfaser = 100 x (W1-W2)/W0
      23. Fettsäureprofil (FA): Bestimmen Sie das Fettsäureprofil gemäß Fernández et al.(2015)29, indem Sie die Schritte 8.1.3.24-8.1.3.29 befolgen.
          ANMERKUNG: Die Fettsäuremethylester (FAMEs) werden durch direkte säurekatalysierte Transmethylierung der gemahlenen gefriergetrockneten Proben gewonnen. Alle Analysen werden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.
      24. Zu einer 50 mg Probe werden 2 ml einer 2%igen_{H2SO4-Lösung} in Methanol gegeben und das Gemisch bei 80 °C 2 h lang unter ständigem Rühren eingegossen.
          ACHTUNG: Beachten Sie das Sicherheitsdatenblatt des vom Lieferanten gelieferten Methanols.
      25. Nach dem Abkühlen auf RT wird 1 ml Reinstwasser und 2 ml n-Heptan zu jeder Probe gegeben, das Gemisch 1 Minute lang gewirbelt und 5 Minuten lang zentrifugiert.
          ACHTUNG: Beachten Sie das vom Lieferanten gelieferte Sicherheitsdatenblatt von n-Heptan.
      26. Die obere n-Heptan-Phase (organisch), die die FAMEs enthält, wird zurückgewonnen und in Gaschromatographie-Fläschchen (GC) überführt.
      27. Die Analyse erfolgt in einem Gaschromatographen, der mit einer TR-FAME-Kapillarsäule (60 m × 0,25 mm ID, 0,25 μm Schichtdicke), einem Autosampler und einem Flammenionisationsdetektor (FID) ausgestattet ist.
      28. Stellen Sie den Injektor (Splitless-Modus) auf 250 °C und den Detektor auf 280 °C ein. Stellen Sie die Anfangstemperatur der Säule auf 75 °C ein und halten Sie sie 1 Minute lang. Dann bei 5 °C/min auf 170 °C erhöhen und 10 min halten. Dann bei 5 °C/min auf 190 °C erhöhen und weitere 10 min halten. Zum Schluss bei 2 °C/min auf 240 °C erhöhen und 10 min halten. Verwenden Sie Helium als Trägergas mit einer Durchflussrate von 1,5 ml/min. Zuluft und Wasserstoff mit Durchflussraten von 350 bzw. 35 ml/min.
      29. Bestimmen Sie das FA-Profil, indem Sie die resultierenden Retentionszeiten mit einem Standard vergleichen und die Ergebnisse als Prozentsatz des Gesamtfetts ausdrücken.
      30. Mineralelementprofil: Bestimmen Sie die mit ICP-OES analysierten Mineralelemente (Ca, P, Mg, Na, K, Fe, Cu, Mn, Zn) nach der von Pinto et al. (2022)³⁰ adaptierten Methode und befolgen Sie die Schritte 8.1.3.31-8.1.3.34.
      31. Wiegen Sie etwa 0,4 g jeder trockenen Probe genau ab und fügen Sie 7,5 ml HNO₃ und 2,5 ml HCl hinzu.
          ACHTUNG: Beachten Sie das vom Lieferanten gelieferte Sicherheitsdatenblatt von HNO₃ und HCl.
      32. Der Aufschluss erfolgt in zwei Schritten: Die Temperatur wird in 30 Minuten von RT auf 90 °C erhöht (und weitere 30 Minuten bei dieser Temperatur gehalten), gefolgt von 60 Minuten bei 105 °C.
      33. Kühlen Sie die Probenlösungen ab, verdünnen Sie sie auf 25 ml, filtern Sie sie und bewahren Sie sie in beschrifteten Röhrchen auf. Führen Sie bei jedem Aufschluss den gleichen Prozess mit einem Referenzmaterial und einem Rohling durch. Ermitteln Sie die Konzentration der verschiedenen Elemente mittels ICP-OES.
      34. Die Ergebnisse werden in mg pro 100 g fw ausgedrückt.
      35. Kohlenhydratgehalt: Berechnen Sie den Kohlenhydratgehalt gemäß den Schritten 8.1.3.36-8.1.3.37.
      36. Berechnen Sie den Gehalt an verfügbaren Kohlenhydraten (ohne Ballaststoffe) durch die Differenz der zuvor ermittelten Faktoren pro 100 g nach der folgenden Gleichung gemäß der Ernährungs- und Landwirtschaftsorganisation der Vereinten Nationen (FAO; 2003)³¹
          
      37. Die Ergebnisse werden in g pro 100 g angegeben.
      38. Feuchtigkeits- und Aschegehalt: Schätzen Sie den Feuchtigkeits- und Aschegehalt gemäß den Schritten 8.1.3.39-8.1.3.45.
      39. Porzellantiegel 3 h bei 105 °C inkubieren, in einem Exsikkator abkühlen und wiegen.
      40. 10 g der Probe werden in den Tiegel eingewogen und 3 Stunden lang bei 105 °C in einen Trockenschrank gestellt, bis die Werte der aufeinanderfolgenden Wägungen nicht mehr als 10 mg voneinander abweichen.
      41. Berechnen Sie den Feuchtigkeitsgehalt, ausgedrückt in g pro 100 g fw, mit der folgenden Gleichung:
          
          wobei_W1 das Gewicht des leeren Tiegels,_W2 das Gewicht des Tiegels mit der frischen Probe und W₃ das Gewicht des Tiegels mit der getrockneten Probe ist.
      42. Nach der Feuchtigkeitsgehaltsbestimmung werden die Tiegel mit den getrockneten Proben für 4 h in eine Verbrennungsanlage bei 525 °Cgegeben.
      43. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis sich die aufeinanderfolgenden Gewichtungen nicht mehr als 1 mg unterscheiden.
      44. Kühlen Sie die Proben in einem Exsikkator auf RT ab und wiegen Sie sie dann.
      45. Der Aschegehalt, ausgedrückt in g je 100 g fw, wird nach folgender Gleichung berechnet:
          
          wobei_W1 das Gewicht des leeren Tiegels,_W2 das Gewicht des Tiegels mit frischer Probe, W₃ das Gewicht des Tiegels mit Gewicht ist.
      46. Energiewert: Berechnen Sie den Energiewert gemäß den Schritten 8.1.3.47-8.1.3.48.
      47. Berechnen Sie den energetischen Wert der Proben gemäß der EU-Verordnung: Die Bereitstellung von Lebensmittelinformationen für Verbraucher (Verordnung 1169/2011)³² unter Verwendung der Gleichungen:
          Energie (kcal/ 100 g) = 4 x (g Proteine) + 4 x (g Kohlenhydrate) + 9 x (g Fett) + 2 x (g Ballaststoffe)
          Energie (kJ/ 100 g) = 17 x (g Proteine) + 17 x (g Kohlenhydrate) + 37 x (g Fett) + 8 x (g Ballaststoffe)
      48. Drücken Sie die Ergebnisse in Kilokalorien pro 100 g und Kilojoule pro 100 g aus.
   4. Verbraucherakzeptanz
      1. Bewerten Sie die Verbraucherakzeptanz anhand von Nudelproben, die 8 Minuten lang in destilliertem Wasser gekocht wurden.
      2. Führen Sie einen Verbraucherakzeptanztest durch: Bewerten Sie das visuelle Erscheinungsbild, die Farbe, die Textur, den Geruch, den Meeresgeschmack, den Gesamtgeschmack, die Gesamtbewertung und die Kaufabsicht der Proben.
         HINWEIS: Der Verbraucherakzeptanztest basiert auf hedonischen Tests, bei denen das visuelle Erscheinungsbild, die Farbe, die Textur, der Geruch, der Meeresgeschmack, der Gesamtgeschmack, die Gesamtbewertung und die Kaufabsicht auf einer Skala von 1 bis 9 bewertet werden, wobei 1 eine schlechte Bewertung und 9 eine sehr gute Bewertung ist.
      3. Durchführung von sensorischen Tests in einzelnen sensorischen Kabinen in einem sensorischen Analyselabor (mit Temperatur- und Lichtregelung). Stellen Sie Besteck, Servietten und Glasbecher mit Mineralwasser bereit, um den Gaumen zwischen den Proben zu reinigen.
         HINWEIS: Die Verkoster sind zwischen 16 und 64 Jahre alt und kommen aus allen Bereichen (n > 80).
2. Joghurt
   1. Pigment-Extraktion
      HINWEIS: Führen Sie die Pigmentextraktion mit der in Pereira et al. (2020)¹⁸ beschriebenen Methode durch.
      1. Das Extraktionslösungsmittel, Natriumphosphatpuffer, wird mit 0,1 M Natriumphosphat dibasisch (0,03 M) und einbasischem Natriumphosphat (0,07 M) hergestellt. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH oder HCl auf pH 6,8 ein.
      2. Wiegen Sie 1 g G. gracilis ab und fügen Sie 50 ml Natriumphosphatpuffer (pH 6,8) hinzu. 10 Minuten homogenisieren, gefolgt von 10 Minuten Mazeration mit Mörser und Stößel.
      3. Die Lösung wird in ein Röhrchen überführt und 20 Minuten lang bei 12.298 x g (4 °C) zentrifugiert.
      4. Den Überstand in einem Pool zusammenfassen und langsam 65% Ammoniumsulfat hinzufügen. Wenn das gesamte Ammoniumsulfat gelöst ist, wird die Lösung mit einem Aluminiumblech bedeckt und über Nacht bei 4 °C ausgefällt.
         ACHTUNG: Beachten Sie das vom Lieferanten gelieferte Sicherheitsdatenblatt von Ammoniumsulfat.
      5. Der Niederschlag wird 20 min lang bei 12.298 x g (4 °C) zentrifugiert. Das Pellet wird zurückgewonnen und in destilliertem Wasser (ca. 5 ml) aufgelöst.
      6. Dialyse des Extrakts mit einer Schlauchmembran (14 kDa) gegen Wasser für 24 Stunden, gefolgt von Gefriertrocknung. Lagern Sie den gefriergetrockneten Extrakt bis zur Verwendung lichtgeschützt bei 4 °C.
   2. Zubereitung von Joghurt
      1. Bereiten Sie Naturjoghurt zu, indem Sie 1 l pasteurisierte Milch, 120 g Naturjoghurt, 20 g Zucker und 50 g Milchpulver in einem Thermomixer 5 min, 50 °C, Stufe 3, mischen.
      2. Die Mischung im Thermomixer-Glas bei 37 °C für 12 h in einen Inkubator geben.
      3. Nehmen Sie den Extrakt auf, indem Sie ihn in einer Konzentration von 0,21 % in Joghurt mischen. Lagern Sie die Proben bis zur Analyse in einzelnen Glaskolben bei 4 °C.
      4. Einzelne Portionen Joghurt ohne Pigment (Kontrolle) bis zur Analyse bei 4 °C lagern.
   3. Farbstabilität
      HINWEIS: Bewerten Sie die Stabilität des Pigments in den Joghurts durch Farbanalyse für 12 Tage. Führen Sie eine Farbanalyse mit einem Reflexionskolorimeter, einem 2-Grad-Standardbeobachter und einer D65-Lichtart durch. Die Ergebnisse werden als CIELab-Koordinaten mit den Parametern L (Helligkeit, Schwarz-Weiß, 0 - 100), a* (Grün - Rot, -60 - 60) und b* (Blau - Gelb, -60 - 60) dargestellt. Parameter a* hat positive Werte für rötliche Farben und negative Werte für grünliche Farben. Parameter b* nimmt positive Werte für gelbliche Farben und negative Werte für bläuliche Farben an. L* ist der Parameter der Leuchtkraft, d. h. die Eigenschaft, nach der jede Farbe als äquivalent zu einem Element der Grauskala zwischen Schwarz und Weiß³³ angesehen werden kann.
      1. Kalibrieren Sie das Kolorimeter mit einer weißen Keramikplatte (L* 88,5, a* 0,32, b* 0,33), die vom Hersteller geliefert wird.
      2. Füllen Sie eine Zelle mit ca. 28 g der Probe (oder Kontrolle) und analysieren Sie die Farbe mit einer Farbdatenanalysesoftware.
         HINWEIS: Die für die Farbdatenanalyse verwendete Software war die SpectraMagic NX.
      3. Führen Sie 5 Messwerte in Proben-/Kontrolldreifachen durch.
   4. Sensorische Analyse
      HINWEIS: Führen Sie eine sensorische Bewertung von Joghurts mit Pigmenteinarbeitung mithilfe eines Dreieckstests (ISO 4120, 2004)³⁴ und einer hedonischen Bewertung von Farbe, Geschmack und Gesamtwertschätzung durch.
      1. Geben Sie den Panelisten für den Dreieckstest drei Proben (eine Probe Joghurt mit Pigment und zwei Proben der Kontrolle oder zwei Proben von Joghurt mit Pigment und eine Kontrolle) und bitten Sie sie, eine andere Probe basierend auf Aroma, Textur und Geschmack auszuwählen. Stellen Sie Proben in ähnlichen Volumina zur Verfügung, die mit zufälligen 3-Zahlen-Codes gekennzeichnet sind.
      2. Für die hedonische Bewertung des Joghurts mit Pigment geben Sie den Panelisten eine Probe von Joghurt mit Pigment und bitten Sie sie, die Farbe, den Geschmack und die allgemeine Wertschätzung anhand einer 9-stufigen hedonischen Skala (von extremer Abneigung bis extrem mögen) zu bewerten.

Representative Results

Antimikrobielle Aktivität

Bei der Interpretation der erzielten Ergebnisse ist zu berücksichtigen, dass je höher der Prozentsatz der Hemmung ist, desto größer ist die Wirksamkeit des Extrakts bei der Hemmung des Wachstums dieses spezifischen Stammes und desto interessanter ist der Extrakt folglich als antimikrobielles Mittel. Durch diese Methodik können wir schnell feststellen, welche Extrakte eine größere Aktivität auf bestimmte Bakterienstämme haben, und auch die interessantesten im Hinblick auf die zukünftige Verwendung identifizieren. Auf diese Weise können wir einen Ausgangspunkt für weitere Studien über denselben Extrakt haben.

Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse, die mit wässrigen Extrakten erzielt wurden, sowohl in der ersten als auch in der zweiten Extraktion unmittelbar nach der Trocknung der Biomasse (Abbildung 1A) und in der dritten und vierten Extraktion (Abbildung 1B), die nach den ethanolischen Extraktionen erzielt wurden, wodurch die Biomasse integral verwendet wurde. Wir können sehen, dass die interessantesten Ergebnisse, die der dritten und vierten wässrigen Extraktion entsprechen, eine höhere antimikrobielle Aktivität zeigen, insbesondere bei Extrakten, die bei 70 °C gewonnen werden. Die Konzentration des Extrakts in den Vertiefungen beträgt 5 mg/ml.

Abbildung 1: Wachstumshemmung von Bakterienarten in Gegenwart von wässrigen Extrakten von G. gracilis. Wachstumshemmung von 3 Bakterienarten (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Listonella anguillarum) nach 24 Stunden Wachstum in einem flüssigen Medium, in Gegenwart von wässrigen Extrakten (Aq) von G. gracilis, die bei verschiedenen Temperaturen, Raumtemperatur (RT), 40 °C (40) und 70 °C (70) gewonnen wurden. Die Positivkontrolle wurde mit Chloramphenicol (CHL) durchgeführt, und die Ergebnisse werden als Mittelwerte (n = 8) ausgedrückt. Die Daten beziehen sich auf die 4 aufeinanderfolgenden Extraktionsschritte (1., 2., 3^{., 4}.). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die ethanolischen Extrakte scheinen besonders wirksam bei der Hemmung des Wachstums von L. anguillarum zu sein, wie in Abbildung 2 dargestellt. Dies zeigt die Ergebnisse, die mit den ethanolischen Extrakten erzielt wurden, auch in der ersten und zweiten Extraktion (Abbildung 2A) und der dritten und vierten Extraktion (Abbildung 2B), die nach der ersten wässrigen Extraktion erhalten wurden.

Abbildung 2: Wachstumshemmung von Bakterienarten in Gegenwart von ethanolischen Extrakten von G. gracilis. Wachstumshemmung von 3 Bakterienarten (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Listonella anguillarum) nach 24 Stunden Wachstum in einem flüssigen Medium in Gegenwart von ethanolischen Extrakten (Et) von G. gracilis, erhalten bei verschiedenen Temperaturen, Raumtemperatur (RT), 40 °C (40) und 70 °C (70). Die Positivkontrolle wurde mit Chloramphenicol (CHL) durchgeführt, und die Ergebnisse wurden als Mittelwerte (n = 8) ausgedrückt. Die Daten beziehen sich auf die 4 aufeinanderfolgenden Extraktionsschritte (1., 2., 3^{., 4}.). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Antioxidative Aktivität

In Bezug auf die Ergebnisse, die das antioxidative Potenzial der verschiedenen Extrakte hervorheben, insbesondere im DPPH-Test, deuten die in Abbildung 3 ausgedrückten Ergebnisse darauf hin, dass die Temperatur von 40 °C am effektivsten war, was zu höheren Hemmwerten der Oxidationsaktivität führte als diejenigen, die bei Extrakten beobachtet wurden, die bei RT oder 70 °C erhalten wurden. Dies gilt für die Proben von G. gracilis , wobei es je nach den verwendeten Proben und den Algenwachstumsbedingungen große Schwankungen geben kann. Es wird daher empfohlen, Tests durchzuführen, um die besten Bedingungen für jede spezifische Art von Probe zu ermitteln.

Abbildung 3: Hemmung des DPPH-Radikals (%) in Gegenwart von Extrakten, die bei unterschiedlichen Temperaturen erhalten wurden. Die Extrakte wurden durch ethanolische (Et) oder wässrige (Aq) Extraktion gewonnen. Die 1. und 2. Extraktion wurden sequentiell aus trockener Biomasse durchgeführt^. Die übrigen (3. und 4^.) wurden mit Biomasse hergestellt, die zuvor mit dem alternativen Lösungsmittel extrahiert wurde^. RT bedeutet Raumtemperatur; 40, bei 40 °C gewonnener Extrakt; und 70, Extrakt erhalten bei 70 °C. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ähnliche Ergebnisse wurden in Bezug auf die Quantifizierung des Gesamtpolyphenols erzielt (Abbildung 4), wobei die Temperatur von 40 °C als die beste in Bezug auf die Extraktion antioxidativer Verbindungen angesehen wird. Dies zeigt, dass die antioxidative Aktivität mit den in den Extrakten vorhandenen phenolischen Komponenten korreliert zu sein scheint.

Abbildung 4: Quantifizierung des Gesamtpolyphenolgehalts (TPC) in Extrakten, die bei verschiedenen Temperaturen gewonnen wurden. Die Extrakte wurden durch ethanolische (Et) oder wässrige (Aq) Extraktion erhalten, wobei die 1. und 2. Extraktion nacheinander aus trockenen Algen und die restlichen (3. und 4^.) mit Biomasse hergestellt wurden, die zuvor mit einem anderen Lösungsmittel extrahiert wurde^. RT bedeutet Raumtemperatur; 40, bei 40 °C gewonnener Extrakt; und 70, Extrakt erhalten bei 70 °C. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Zytotoxizität in HaCat-Zellen

Der erste Schritt zur Bewertung der Sicherheit kosmetischer Inhaltsstoffe ist die Untersuchung ihrer In-vitro-Zytotoxizität in epidermalen und dermalen Zelllinien. Wie in Abbildung 5 zu sehen ist, wurden keine zytotoxischen Wirkungen auf Keratinozyten (HaCaT-Zellen) beobachtet, was darauf hindeutet, dass bei der maximalen untersuchten Konzentration (1 mg/ml) sowohl wässrige als auch Ethanolextrakte für die Anwendung auf der Haut sicher sind.

Abbildung 5: Zytotoxische Wirkung von Gracilaria gracilis-Extrakten (1 mg/ml) auf HaCaT-Zellen nach 24 h Behandlung. Die Werte in jeder Spalte werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) von drei unabhängigen Experimenten in dreifacher Ausführung ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Innovation in der Lebensmittelindustrie

Die endgültigen Pasta-Rezepturen wurden nach zahlreichen Versuchen zwischen theoretischer Formulierung und sensorischer Prüfung durch ein halbgeschultes Gremium erhalten. Nach diesem Schritt wurde auf die chemische Charakterisierung zugegriffen, einschließlich der Nährwertbewertung, der Profile von Fettsäuren und Mineralstoffen. Es war möglich, eine Nährwertcharakterisierung zu erstellen (Tabelle 1 und Tabelle 2) und das Vorhandensein erwarteter nährwertbezogener Angaben auf der Grundlage der europäischen Gesetzgebung (REG (EU) Nr. 1169/2011)³² zu überprüfen.

Nährwertangaben		durch 100 g Nudeln	% RDI
Energie		1478,90 kJ (348,74 kcal)	17
Lipide		1,06 ± 0,10 g	2
Wovon:
	Gesättigte Fettsäuren	0,38 ± 0,01 g	2
	Kohlenhydrate	72,59± 0,21 g	28
	Faser	3,84 ± 0,20 g
	Protein	10,29 ± 0,20 g	21
	Salz	0,22 ± 0,02 g	9

Tabelle 1: Nährwertangaben. Nährwertangaben der entwickelten Nudeln auf der Grundlage chemischer Analysen (n=3) der durch Berechnung erhaltenen Energie und Kohlenhydrate und des jeweiligen Prozentsatzes der empfohlenen Aufnahmedosis (n = 3).

Diese Pasta-Rezepturen wurden entwickelt, um einen Zielverbraucher anzusprechen, der eine gesündere Ernährung im Sinn hat, daher muss die Fettmenge pro 100 g eines Produkts so gering wie möglich sein. Eine detaillierte Analyse des Fettsäureprofils zeigt einen Wert von 0,38 g gesättigten Fettsäuren/100 g, der deutlich unter dem Grenzwert für Produkte mit niedrigem Gehalt an gesättigten Fettsäuren liegt und das ursprüngliche Ziel bei der Herstellung dieser Nudeln erfüllt. In Bezug auf den Ballaststoffgehalt war es auch möglich, diese Teigwarenformulierung gemäß den europäischen Vorschriften als Ballaststoffquelle zu beanspruchen.

In der Charakterisierung der Mineralelemente, die durch ICP-OES bestimmt und in Tabelle 2 dargestellt ist, wird der Wert von etwa 219 mg/100 g Na in 100 g dieses Produkts angegeben, so dass nicht überprüft werden kann, dass es sich um ein Produkt mit niedrigem Natriumgehalt (<0,12 g/100 g) handelt. Aufgrund des erhöhten Natriumgehalts, der von Natur aus in den Zutaten enthalten ist, erfordert dieses Produkt möglicherweise keinen Zusatz von Salz in seiner Konfektion.

Tabelle 2: Profil der mineralischen Elemente der Nudeln. Blau - hoher Gehalt an Elementen; Rot - Quelle eines bestimmten Elements (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Gemäß der genannten Verordnung der Europäischen Union und dem RDI% für jedes Element ist zu erkennen, dass dieses Produkt einen hohen Gehalt an K, P, Fe aufweist und auch eine Quelle für Zn ist. Es enthält Se, Mg und Ca in kleineren Mengen.

Für die Pasta-Abnahmetests wurden 86 Tester eingesetzt, davon 63 weiblich und 23 männlich im Alter von über 18 Jahren. Die Abnahmetests basierten auf hedonischen Skalen von 9 Punkten, wie sie in den Normen festgelegt sind. Der gesunde Teig erzielte auf einer hedonischen Skala von 1 bis 9 die Punkte 5 und 6 für die Parameter "Meeresgeschmack" bzw. "Visuelles Erscheinungsbild" (Abbildung 6).

Abbildung 6: Ergebnisse von sensorischen Verbraucherakzeptanztests . (A) Die hedonische Wahl für visuelles Erscheinungsbild, Farbe, Textur, Geruch, Meeresgeschmack und Gesamtgeschmack. (B) Die hedonische Wahl für die allgemeine Wertschätzung und Kaufabsicht. Skala 1-9, wobei 1 eine schlechte Bewertung und 9 eine sehr gute Bewertung ist (n = 86). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Nudeln erreichten die Punkte 5 und 6 auf einer hedonischen Skala von 1 bis 9 für die Parameter "Meeresgeschmack" bzw. "Visuelles Erscheinungsbild" (Abbildung 6A). Diese Nudeln erhielten einen niedrigen Wert auf dieser Skala in Bezug auf den Texturparameter (unter Berücksichtigung anderer bereits untersuchter Formulierungen), wahrscheinlich weil die Grundzutat Reismehl ist; Trotzdem erhielt sie Werte auf einer Skala von 1 bis 9, die von 4 bis 7 reichten, was eine gute Akzeptanz beim Durchschnittsverbraucher widerspiegelt. Auf einer hedonischen Skala von 1 bis 9 hatten die Nudeln als häufigste Antworten den Wert von 5 für die Kaufabsicht und den Wert von 6 für die allgemeine Wertsteigerung, wie in Abbildung 6B dargestellt. Es wurde festgestellt, dass etwa 65 % der Verkoster eine Antwort wählten, die gleich oder höher als die Punktzahl von 6 für die Gesamtbewertung dieser Pasta war. Die Farbstabilität der Joghurts mit Pigment wurde 12 Tage lang bei -4 °C bewertet, und die Ergebnisse sind in Abbildung 7 dargestellt.

Abbildung 7: Farbstabilität der Joghurts. (links) Kontrollieren Sie Joghurts und (richtige) Joghurts mit Gracilaria gracilis-Pigment während einer 12-tägigen Lagerung. Die Parameter a*, b* und L* sind dimensionslos. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die a*- und b*-Parameter über die Zeit stabil waren, während die L*-Werte eine höhere Varianz aufwiesen. Die Leichtigkeit zeigte nach 8 Tagen Lagerung höhere Werte. Während einige Unterschiede in den Helligkeitsparametern gefunden wurden, was darauf hindeutet, dass die Proben im Laufe der Zeit heller wurden, zeigten die Parameter Rötung (a*) und Blau (b*) eine gute Stabilität. Die Einarbeitung der Extrakte in Joghurts zeigte eine gute Farbbeständigkeit mit einem ΔE von 7,01 ± 2,36 nach 12 Tagen Lagerung. In Bezug auf die sensorische Bewertung des Joghurts identifizierten 9 von 13 Probanden die richtige Probe im Dreieckstest, was darauf hindeutet, dass es Unterschiede zwischen den Joghurts gab, die diese Unterscheidung ermöglichten. Die hedonischen Tests, die an der halbgeschulten Gruppe durchgeführt wurden, zeigten eine gute Akzeptanz des Produkts, was sich in Werten über 7 widerspiegelte (Abbildung 8). Der Modus der Punktzahl für jedes der drei getesteten Attribute war 9, was zu Durchschnittswerten über 8 führte. Die beste Bewertung erfolgte bei der Farbe, die eine hervorragende Akzeptanz durch die Jury widerspiegelt, ein aufschlussreiches Ergebnis.

Abbildung 8: Ergebnisse der hedonisch-sensorischen Bewertung des Joghurts mit dem Pigment Gracilaria gracilis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Die antimikrobiellen Aktivitätstests in einem flüssigen Medium werden verwendet, um die Wirksamkeit antimikrobieller Substanzen gegen Mikroorganismen zu bewerten, die in einem flüssigen Medium suspendiert sind, und werden in der Regel durchgeführt, um die Fähigkeit einer Substanz zu bestimmen, das Wachstum zu hemmen oder Mikroorganismen abzutöten^35,36,37,38. Sie werden verwendet, um die Empfindlichkeit von Mikroorganismen gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen zu bewerten, und werden in Reagenzgläsern oder Mikrotitrationsplatten durchgeführt, wo verschiedene Konzentrationen der antimikrobiellen Substanz gegen eine standardisierte Suspension des Zielmikroorganismus getestet werden²². Die antimikrobielle Aktivität wird durch Messung des mikrobiellen Wachstums oder des Vorhandenseins/Nichtvorhandenseins von Trübung im Nährmedium nach einer ordnungsgemäßen Inkubationszeit bewertet.

Es gibt verschiedene Techniken und Methoden, um diese Tests durchzuführen, wie z. B. die Bouillon-Verdünnungsmethode, die Agar-Diffusionsmethode (z. B. den Disc-Diffusionstest) und die Bouillon-Mikroverdünnungsmethode, die eine der am häufigsten verwendeten ist³⁸. Zu den kritischsten Punkten bei diesen Methoden gehören die richtige Vorbereitung des Inokulums, die Wahl des Nährmediums, die Qualität der verwendeten antimikrobiellen Mittel, die Standardisierung der Technik und eine effektive Kontaminationskontrolle. Das Inokulum, bei dem es sich um eine standardisierte Suspension von Mikroorganismen handelt, muss korrekt vorbereitet werden, um die Genauigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Dies beinhaltet eine geeignete Auswahl der mikrobiellen Kultur, eine geeignete Kultur reiner Stämme, eine Anpassung der Zellkonzentration und eine Standardisierung der Suspension, um eine geeignete optische Dichte oder Zellkonzentration zu erhalten.

Das verwendete Nährmedium sollte sorgfältig ausgewählt werden, um sicherzustellen, dass es die idealen Wachstumsbedingungen für den zu testenden Mikroorganismus bietet. Die chemische Zusammensetzung, der pH-Wert und andere Faktoren können die Testergebnisse beeinflussen. Es ist wichtig, die Empfehlungen des Herstellers für die Zubereitung des Nährmediums zu befolgen. Die Qualität der antimikrobiellen Wirkstoffe, die zur Kontrolle verwendet werden, ist von grundlegender Bedeutung, und es ist wichtig, sicherzustellen, dass diese rein, haltbar und korrekt gelagert sind. Die Kennzeichnung und das Verfallsdatum sollten immer nach den Anweisungen des Herstellers konsultiert werden. Die Standardisierung der Technik ist ebenfalls entscheidend, um die Genauigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Dazu gehören die Zugabe der getesteten Konzentrationen zum Nährmedium sowie die Aufrechterhaltung aseptischer Bedingungen während des gesamten Verfahrens. Darüber hinaus kann eine Kreuzkontamination von Mikroorganismen während des Tests zu falschen oder unzuverlässigen Ergebnissen führen. Es ist wichtig, während des gesamten Eingriffs strenge aseptische Praktiken einzuhalten, von der Manipulation des Inokulums bis zur Inkubation der Röhrchen oder Platten. Die Verwendung sauberer Arbeitsplatten, die richtige Pipettiertechnik und die ordnungsgemäße Entsorgung von Materialien sind wichtige Maßnahmen, um eine Kontamination zu vermeiden.

Die Liebe zum Detail und die strikte Einhaltung etablierter Protokolle und Richtlinien sind entscheidend, um Fehler zu minimieren und die Zuverlässigkeit der Ergebnisse bei Tests der antimikrobiellen Aktivität in einem flüssigen Medium zu gewährleisten. Außerdem weisen die Tests zur antimikrobiellen Aktivität einige Einschränkungen auf, die berücksichtigt werden sollten³⁷.

Faktoren wie pH-Wert, Temperatur, Vorhandensein von Blutbestandteilen und Wechselwirkungen mit dem Immunsystem werden bei diesen Tests nicht berücksichtigt, was die Fähigkeit einschränken kann, die Wirksamkeit eines antimikrobiellen Mittels in einem lebenden Organismus vorherzusagen. Außerdem messen Tests die Fähigkeit einer antimikrobiellen Substanz, das mikrobielle Wachstum zu hemmen oder Mikroorganismen abzutöten, und liefern keine detaillierten Informationen über den Wirkmechanismus des antimikrobiellen Mittels oder seine Selektivität gegen bestimmte Mikroorganismen. Es gibt Einschränkungen beim Nachweis von Resistenzen, da die verwendeten Methoden möglicherweise nicht den Nachweis oder die Vorhersage der Entwicklung von Resistenzen im Laufe der Zeit ermöglichen. Einige Mikroorganismen können als Reaktion auf eine längere Exposition gegenüber einem antimikrobiellen Mittel Resistenzmechanismen entwickeln, und diese Veränderungen können durch diese Tests möglicherweise nicht leicht nachgewiesen werden. Bei Tests der antimikrobiellen Aktivität in einem flüssigen Medium werden im Allgemeinen keine anderen Wirtsfaktoren berücksichtigt, die die Wirksamkeit eines antimikrobiellen Wirkstoffs beeinflussen können, wie z. B. das Vorhandensein von Biofilmen oder die Immunantwort des Wirts.

Es ist wichtig, diese Einschränkungen zu berücksichtigen und die Prüfung auf antimikrobielle Aktivität in einem flüssigen Medium durch andere Methoden und Ansätze zu ergänzen, wie z. B. In-vivo-Studien , Biofilmmodelle und andere³⁹. Im Bereich der Bioprospektion für bioaktive Makroalgenverbindungen können antimikrobielle Aktivitätstests verwendet werden, um das antimikrobielle Potenzial von Algenextrakten oder isolierten Verbindungen zu bewerten und Substanzen mit antimikrobieller Aktivität gegen bestimmte mikrobielle Krankheitserreger zu identifizieren, die in Bereichen wie der Herstellung von Arzneimitteln, Kosmetika, Lebensmitteln oder landwirtschaftlichen Produkten Anwendung finden können⁴⁰.

Antioxidative Aktivitätstests sind Methoden, die verwendet werden, um die Fähigkeit einer Verbindung oder eines Extrakts zu bewerten, freie Radikale zu neutralisieren oder oxidativen Stress zu reduzieren. Diese Tests werden häufig in der antioxidativen Forschung eingesetzt, sowohl in Lebensmitteln als auch in Naturprodukten wie z. B. Algen. Es gibt mehrere Methoden, um die antioxidative Aktivität zu bewerten, und eine der am häufigsten verwendeten ist die Absorptionskapazität freier Radikale. In diesem Test wird ein stabiles freies Radikal, das 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), verwendet, um die Fähigkeit einer Verbindung zu bewerten, ein Elektron abzugeben und das freie Radikal zu neutralisieren. Die antioxidative Aktivität wird gemessen, indem die violette Farbe von DPPH reduziert wird, die auftritt, wenn die antioxidative Verbindung ein Elektron an das freie Radikal abgibt. Andere Methoden sind die Sauerstoffradikal-Absorptionskapazität (ORAC), die Eisenreduktionskapazität (FRAP) oder die Radikal-Reduktionskapazität (ABTS)⁴¹.

Die Quantifizierung der Gesamtpolyphenole (QTP) hingegen ist keine direkte Methode zur Bestimmung der antioxidativen Aktivität, sondern liefert ein Maß für die Gesamtkonzentration von Polyphenolen in einer Probe, obwohl mehrere störende Substanzen die Ergebnisse beeinflussen können. Obwohl bekannt ist, dass viele Polyphenole antioxidative Eigenschaften haben, hängt die antioxidative Aktivität einer Verbindung mit mehreren Faktoren zusammen, wie z. B. ihrer chemischen Struktur, Konzentration, Fähigkeit, freie Radikale zu spenden oder einzufangen, und Wechselwirkungen mit anderen zellulären Komponenten⁴². Die einfache Quantifizierung der Gesamtpolyphenole kann keine Bewertung der antioxidativen Aktivität der Probe liefern. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass das Vorhandensein von Polyphenolen in einer Probe mit einer höheren Wahrscheinlichkeit einer antioxidativen Aktivität verbunden sein kann, da viele Polyphenole antioxidative Eigenschaften besitzen. Somit kann QTP als vorläufiger Indikator für das Vorhandensein von Polyphenolen in der Probe dienen, aber die Bestätigung der antioxidativen Aktivität erfordert Assays zur antioxidativen Aktivität. Polyphenole sind eine Klasse chemischer Verbindungen, die in der Natur weit verbreitet sind und in Lebensmitteln, Pflanzen, Obst, Gemüse und Algen vorkommen. Es gibt verschiedene Methoden zur Quantifizierung von Gesamtpolyphenolen, und die Folin-Ciocalteu-Methode ist eine der am häufigsten verwendeten. QTP gibt ein allgemeines Maß für die Konzentration von Polyphenolen an, spezifiziert jedoch nicht die einzelnen polyphenolischen Verbindungen, die in der Probe vorhanden sind. Es handelt sich also um eine quantitative, aber nicht um eine qualitative Methode. Darüber hinaus ist es wichtig zu berücksichtigen, dass verschiedene Polyphenole unterschiedliche antioxidative Kapazitäten und biologische Aktivitäten haben, so dass QTP keine detaillierten Informationen über die spezifischen funktionellen Eigenschaften der vorhandenen Polyphenole liefert.

Jede Methode hat ihre Vor- und Nachteile, und die Wahl eines bestimmten Tests hängt von den Eigenschaften der untersuchten Verbindung und dem Zweck der Analyse ab. Es ist wichtig, die spezifischen Anweisungen jeder Methode zu befolgen, um zuverlässige und vergleichbare Ergebnisse zu gewährleisten. Zu den häufigsten kritischen Schritten bei der Bestimmung der antioxidativen Kapazität gehört zunächst die Probenvorbereitung. Es ist wichtig, die Proben richtig vorzubereiten, um sicherzustellen, dass ausreichende Konzentrationen erreicht werden, und um eine Kontamination zu vermeiden. Dabei werden die Verbindungen oder Extrakte genau abgewogen und in geeigneten Lösungsmitteln gelöst. Es ist auch wichtig, die Stabilität der Verbindungen und Extrakte während des Prozesses der Zubereitung, Lagerung und Handhabung zu berücksichtigen. Alle Reagenzien, die in den antioxidativen Aktivitätstests verwendet werden, müssen ordnungsgemäß vorbereitet und standardisiert werden, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Dabei geht es um die korrekte Herstellung des Gallussäurestandards und die Genauigkeit der Volumina. Die Reaktionszeit ist ein kritischer Aspekt, um genaue Ergebnisse in Antioxidanstests zu erhalten. Es ist notwendig, die Inkubationszeit zu optimieren, um eine vollständige Reaktion zwischen der antioxidativen Verbindung und dem freien Radikal zu gewährleisten. Zu wenig Zeit kann zu einer Unterschätzung der antioxidativen Aktivität führen, während eine übermäßige Zeit zu einem Abbau der Verbindungen oder zu Störungen durch Sekundärreaktionen führen kann. Außerdem muss die Temperatur während der Tests genau und konsistent geregelt werden. Die Temperatur beeinflusst die Geschwindigkeit chemischer Reaktionen und kann die Ergebnisse beeinflussen. Es ist wichtig, die von den spezifischen Methoden empfohlenen Temperaturbedingungen einzuhalten und die Temperaturstabilität während des gesamten Eingriffs zu gewährleisten. Die Einbeziehung geeigneter Kontrollen ist unerlässlich, um die Ergebnisse von Antioxidanstests zu validieren. Dies kann Positivkontrollen (Verbindungen, von denen bekannt ist, dass sie eine antioxidative Aktivität haben) und Negativkontrollen (Proben ohne antioxidative Aktivität) umfassen. Kontrollen bieten eine Vergleichsgrundlage für die Interpretation der Ergebnisse und tragen dazu bei, die Genauigkeit der erhaltenen Daten zu gewährleisten. Um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, wird empfohlen, Tests der antioxidativen Aktivität an Replikaten durchzuführen und das Experiment mehrmals zu wiederholen, um die Signifikanz der Daten zu erhöhen und zuverlässigere und robustere Ergebnisse zu erhalten.

Testmethoden zur Prüfung der antioxidativen Aktivität weisen einige Einschränkungen auf, die bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden sollten, nämlich die Tatsache, dass sie in flüssigen Medien die Komplexität biologischer Systeme und Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Verbindungen, das breite Spektrum an antioxidativen Reaktionen, die auftreten können, den Zellstoffwechsel und Umweltfaktoren, die die antioxidative Aktivität beeinflussen können, möglicherweise nicht vollständig erfassen. Es sollten also unterschiedliche Tests verwendet werden. Man muss sich auch darüber im Klaren sein, dass es keinen direkten Zusammenhang mit gesundheitlichen Vorteilen gibt. Obwohl die antioxidative Aktivität oft mit gesundheitlichen Vorteilen verbunden ist, führt dies aufgrund vieler anderer Faktoren wie Bioverfügbarkeit, Stoffwechsel und Wechselwirkungen mit anderen biologischen Systemen nicht immer direkt zu gesundheitlichen Vorteilen in lebenden Organismen.

Es ist wichtig zu bedenken, dass antioxidative Aktivitätstests nützliche Instrumente für die erste Bewertung des antioxidativen Potenzials von Verbindungen und Extrakten sind, aber nicht als endgültiger Indikator für biologische Wirkungen oder gesundheitliche Vorteile angesehen werden sollten. Weitere Studien sind erforderlich, um die Auswirkungen von Antioxidantien auf den Körper vollständig zu verstehen.

Obwohl die Methoden zur Prüfung der antioxidativen Aktivität in flüssigem Medium in der Forschung weit verbreitet sind und ihre Vor- und Nachteile haben, können diese Methoden im Vergleich zu den Alternativen in Bezug auf Praktikabilität, Geschwindigkeit, Kosten und einfache Implementierung als gut angesehen werden. Einer der Hauptvorteile ist die Einfachheit und Schnelligkeit der Verfahren und ihre Eignung für die Erstforschung, das Screening von Wirkstoffen und groß angelegte Studien. Diese Methoden sind relativ schnell durchzuführen und können in kurzer Zeit Ergebnisse liefern, und zwar auf kostengünstigere Weise, und erfordern im Vergleich zu anderen Methoden weniger spezialisierte Geräte.

Algen sind bekannt für ihre Fähigkeit, bioaktive Verbindungen, einschließlich Antioxidantien, zu produzieren, die gesundheitsfördernde Eigenschaften haben können⁴³. Algenextrakte können aus verschiedenen Teilen der Algen hergestellt werden und können mit verschiedenen Lösungsmitteln wie Wasser, Ethanol, Methanol oder Aceton gewonnen werden. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die antioxidative Aktivität von Algenextrakten von mehreren Faktoren abhängen kann, wie z. B. der Algenart, der Extraktionsmethode und der Konzentration der vorhandenen bioaktiven Verbindungen. Daher wird empfohlen, antioxidative Aktivitätstests an Replikaten durchzuführen und Vergleiche mit geeigneten Kontrollen durchzuführen, um zuverlässigere Ergebnisse zu erhalten. Diese Methoden können als erstes Werkzeug beim Screening und der Auswahl von Algenextrakten mit antioxidativem Potenzial für weitere Studien verwendet werden.

Der MTT-Assay ist eine weit verbreitete Technik zur vorläufigen Bewertung der zytotoxischen Wirkung von Substanzen für den menschlichen und tierischen Gebrauch. Obwohl die Umwandlung von MTT in Formazan-Kristalle die am häufigsten verwendete Methode zum Testen der Zytotoxizität ist, wird sie von zahlreichen Faktoren wie der Stoffwechselrate und der Anzahl der Mitochondrien beeinflusst und ist nur auf adhärente Zellziele anwendbar¹⁴. Die wichtigsten kritischen Schritte des hier beschriebenen Protokolls beziehen sich auf das eventuelle Auftreten von Zellkulturkontaminationen, das Wachstum unerwünschter HaCaT-Zellen und einen geringen Prozentsatz der Zellkonfluenz. Es gibt andere Methoden, wie z. B. Laktatdehydrogenase (LDH), Adenosintriphosphat (ATP) und Koloniebildungsassays zur Messung der Zytotoxizität. Sie alle haben jedoch Vor- und Nachteile. Ghasemi et al. (2021)⁴⁴ untersuchten die Wirkung mehrerer Variablen auf die MTT-Assay-Messungen an einer Prostatakrebszelllinie (PC-3). Faktoren wie die Zellimpfdichte, die Konzentration von MTT, die Inkubationszeit nach MTT-Zugabe, Serumhunger, die Zusammensetzung der Zellkulturmedien, der freigesetzte intrazelluläre Inhalt und die Extrusion von Formazan in den extrazellulären Raum wurden analysiert. Aus dieser Studie wurden nützliche Empfehlungen zur Anwendung des Assays und eine Perspektive darauf gegeben, wo der Nutzen des Assays ein mächtiges Werkzeug ist, aber auch, wo er Grenzen hat. Nichtsdestotrotz ist der MTT-Assay eine schnelle, hochempfindliche und einfache Methodik, die als vorläufige Zytotoxizitätsbewertung vieler Substanzen mit potenzieller Anwendung in den Bereichen Therapie, Lebensmittel, Futtermittel, Landwirtschaft und Umwelt angewendet werden kann. Insbesondere der hier durchgeführte MTT-Assay zeigte, dass das Ethanol und die wässrigen Extrakte aus G. gracilis in den untersuchten Konzentrationen die Lebensfähigkeit der Keratinozyten nicht beeinträchtigten und für In-vivo-Assays fortgesetzt werden können, um sicherzustellen, dass sie für die Anwendung auf der Haut beim Menschen völlig sicher sind.

Die Verwendung von Meeresressourcen in Lebensmitteln hat einmal mehr gezeigt, dass sie das Potenzial hat, nicht nur Produkte mit Nährwert zu erhalten, sondern auch Produkte mit saubereren Etiketten zu finden. Die Zugabe von ganzen G. gracilis (Nudeln) oder Extrakt (als Lebensmittelfarbe) zeigt Marktpotenzial, und seine Anwendung könnte eine der Strategien für Unternehmen sein, um sich auf dem Markt abzuheben, die Ernährungsbedürfnisse der Verbraucher zu befriedigen und ihren Markttrends zu folgen.

Bei der Zugabe von Seetang zu den Teigwarenrezepturen wurde zunächst festgestellt, dass die Struktur verändert war und es nicht möglich war, die gewünschten Teigformen zu erhalten. Wir standen vor der Herausforderung, die Mengen anzupassen und andere Zutaten hinzuzufügen, die zuvor nicht vorgesehen waren, um die Textur der Nudeln zu erhalten. Neben der angemessenen Menge der einzelnen Zutaten wurde die Extrusionsmethode während der gesamten Entwicklung der Nudeln angepasst. Abgesehen von dieser Schwierigkeit basiert die Entwicklung neuer Produkte auf drei Grundprinzipien: Das Produkt muss sensorisch ansprechend sein (Textur, Geschmack, Geruch); Das Erzeugnis muss einen zusätzlichen Nährwert aufweisen; Und es muss maximal nachhaltige Inhaltsstoffe und Methoden nutzen. In diesem Sinne ist eine weitere große Herausforderung die Verwendung des sensorischen Panels, um eine möglichst ansprechende Formulierung zu erreichen. Die meisten physikalisch-chemischen Analysen, die an Teigwaren durchgeführt wurden, waren bereits für Lebensmittelmatrizen optimiert; In dieser Arbeit wurde jedoch die Probenvorbereitung so optimiert, dass sie effizient auf alle Analysemethoden angewendet werden kann.

In Bezug auf die Verwendung von G. gracilis-Pigment als Farbstoff wurde aufgrund der thermischen Empfindlichkeit dieses Molekültyps ein gekühltes Produkt gewählt⁴⁵. Da es sich bei der Joghurtherstellung um eine thermische Behandlung handelt, wurde das Pigment dem Endprodukt zugesetzt. Das Mischen des Pigments im Joghurt führte zu einem Produkt, das etwas flüssiger war als die Kontrolle ohne Pigment. Tatsächlich kommentierten einige Diskussionsteilnehmer am Ende des Dreieckstests, dass der einzige Unterschied zwischen den Proben die Textur sei. Dies ist ein gutes Ergebnis, da der Hauptzweck des Dreieckstests darin bestand, zu überprüfen, ob es auffällige Unterschiede zwischen Joghurt mit und ohne Pigment gibt, insbesondere Unterschiede in Geschmack und Geruch, da Algenextrakte Lebensmitteln einen unangenehmen Geschmack/Geruch verleihen können. Dabei handelte es sich um eine Vorstudie mit einem kleinen, halbgeschulten Panel. In weiteren Studien sollte eine größere Anzahl von Verkostern in Betracht gezogen werden, um zuverlässigere Marktergebnisse zu erzielen. Was die Bewertung der Pigmentstabilität in Joghurt betrifft, so könnten weitere Studien die Bewertung anderer physikalisch-chemischer Eigenschaften des Joghurts mit Pigment im Laufe der Zeit umfassen, wie z. B. pH-Wert, Wasseraktivität (aw) und Textur. Wünschenswert wäre auch eine sensorische Bewertung über die Zeit.

Zusammenfassend unterstreichen die hier beschriebenen Protokolle das Potenzial der Rotalge G. gracilis als Quelle für Inhaltsstoffe zur Entwicklung neuartiger Produkte mit potenziellen Anwendungen in der Pharma-, Dermokosmetik- und Lebensmittelindustrie. Darüber hinaus bleibt die nachextrahierte Restbiomasse ein wertvolles Material, das als Biostimulans für das Pflanzenwachstum, zur Bodenanreicherung, zur Fischfütterung oder zur Gewinnung von Biokohle und/oder funktionalisierten Kohlenstoffen für Wasserreinigungszwecke eingesetzt werden kann. Der hier beschriebene Bioraffinerieansatz kann auf andere Algenarten angewendet werden und fördert eine blaue Kreislaufwirtschaft und ökologische Nachhaltigkeit.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute Ethanol	Aga, Portugal	64-17-5
Ammonium Chloride	PanReac	12125-02-9
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	1397-89-3
Analytical scale balance	Sartorius, TE124S	22105307
Bacillus subtilis subsp. spizizenii	German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)	DSM 347
Biotin	Panreac AppliChem	58-85-5
Centrifuge	Eppendorf, 5810R	5811JH490481
Chloramphenicol	PanReac	56-75-7
CO2 Chamber	Memmert	N/A
Cool White Fluorescent Lamps	OSRAM Lumilux Skywhite	N/A
Densitometer McFarland	Grant Instruments	N/A
DMEM medium	Sigma-Aldrich	D5796
DMSO	Sigma-Aldrich	67-68-5
DPPH	Sigma, Steinheim, Germany	1898-66-4
Escherichia coli (DSM 5922)	German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)	DSM5922
Ethanol 96%	AGA-Portugal	64-17-5
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA)	J.T.Baker	6381-92-6
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524
Filter Paper (Whatman No.1)	Whatman	WHA1001320
Flasks	VWR International, Alcabideche, Portugal	N/A
Folin-Ciocalteu	VWR Chemicals	31360.264
Gallic Acid	Merck	149-91-7
Germanium (IV) Oxide, 99.999%	AlfaAesar	1310-53-8
HaCaT cells – 300493	CLS-Cell Lines Services, Germany	300493
Hot Plate Magnetic Stirrer	IKA, C-MAG HS7	06.090564
Iron Sulfate	VWR Chemicals	10124-49-9
Laminar flow hood	TelStar, Portugal	526013
LB Medium	VWR Chemicals	J106
Listonella anguillarum	German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)	DSM 21597
Manganese Chloride	VWR Chemicals	7773.01.5
Micropipettes	Eppendorf, Portugal	N/A
Microplates	VWR International, Alcabideche, Portugal	10861-666
Microplates	Greiner	738-0168
Microplates (sterile)	Fisher Scientific	10022403
Microplate reader	Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA	1611151E
MTT	Sigma-Aldrich	289-93-1
Muller-Hinton Broth (MHB)	VWR Chemicals	90004-658
Oven	Binder, FD115	12-04490
Oven	Binder, BD115	04-62615
Penicillin	Sigma-Aldrich	1406-05-9
pH meter Inolab	VWR International, Alcabideche, Portugal	15212099
Pippete tips	Eppendorf, Portugal	5412307
Pyrex Bottles Media Storage	VWR International, Alcabideche, Portugal	16157-169
Rotary Evaporator	Heidolph, Laborota 4000	80409287
Rotavapor	IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal	07.524254
Sodium Carbonate (Na2CO3)	Chem-Lab	497-19-8
Sodium Chloride (NaCl)	Normax Chem	7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic	Riedel-de Haën	7558-79-4
SpectraMagic NX	Konica Minolta, Japan		color data analysis software
Spectrophotometer	Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA	5A4T092004
Streptomycin	Sigma-Aldrich	57-92-1
Thiamine	Panreac AppliChem	59-43-8
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049
Tryptic Soy Agar (TSA)	VWR Chemicals	ICNA091010617
Tryptic Soy Broth (TSB)	VWR Chemicals	22091
Ultrapure water	Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany	F5HA17360B
Vacuum pump	Buchi, Switzerland	FIS05-402-103
Vitamin B12	Merck	68-19-9