Valorisation de l’algue rouge Gracilaria gracilis par une approche de bioraffinage

Summary

Nous décrivons ici plusieurs protocoles visant à une valorisation intégrée de Gracilaria gracilis : récolte d’espèces sauvages, culture en interne et extraction de principes bioactifs. Les effets antioxydants, antimicrobiens et cytotoxiques des extraits sont évalués, ainsi que l’évaluation nutritionnelle et de la stabilité des aliments enrichis en biomasse et pigments d’algues entières.

Abstract

L’intérêt pour les algues en tant que matière première abondante pour obtenir des ingrédients bioactifs précieux et multicibles ne cesse de croître. Dans ce travail, nous explorons le potentiel de Gracilaria gracilis, une algue rouge comestible cultivée dans le monde entier pour son intérêt commercial en tant que source d’agar et d’autres ingrédients pour des applications cosmétiques, pharmacologiques, alimentaires et animales.

Les conditions de croissance de G. gracilis ont été optimisées par la multiplication végétative et la sporulation tout en manipulant les conditions physico-chimiques pour obtenir un stock de biomasse important. Des méthodologies d’extraction verte à l’éthanol et à l’eau ont été réalisées sur la biomasse d’algues. Le potentiel bioactif des extraits a été évalué à l’aide d’un ensemble de tests in vitro concernant leur cytotoxicité, leurs propriétés antioxydantes et antimicrobiennes. De plus, la biomasse d’algues séchées a été incorporée dans les formulations de pâtes alimentaires pour augmenter la valeur nutritionnelle des aliments. Des pigments extraits de G. gracilis ont également été incorporés dans le yogourt en tant que colorant naturel, et leur stabilité a été évaluée. Les deux produits ont été soumis à l’appréciation d’un panel sensoriel semi-entraîné visant à obtenir la meilleure formulation finale avant d’arriver sur le marché.

Les résultats confirment la polyvalence de G. gracilis , qu’il soit appliqué sous forme de biomasse entière, d’extraits et/ou de pigments. Grâce à la mise en œuvre de plusieurs protocoles optimisés, ce travail permet le développement de produits ayant le potentiel de profiter aux marchés de l’alimentation, des cosmétiques et de l’aquaculture, en promouvant la durabilité environnementale et une économie circulaire bleue.

De plus, et conformément à une approche de bioraffinerie, la biomasse résiduelle d’algues sera utilisée comme biostimulant pour la croissance des plantes ou convertie en matériaux carbonés pour être utilisée dans la purification de l’eau des systèmes d’aquaculture internes de MARE-Polytechnic de Leiria, au Portugal.

Introduction

Les algues peuvent être considérées comme une matière première naturelle intéressante dont profitent les secteurs pharmaceutique, alimentaire, alimentaire et environnemental. Ils biosynthétisent une panoplie de molécules, dont beaucoup ne se trouvent pas dans les organismes terrestres, avec des propriétés biologiques pertinentes ^1,2. Cependant, des protocoles de culture optimisés pour les algues doivent être mis en place pour assurer un stock de biomasse important.

Les méthodes de culture doivent toujours tenir compte de la nature des thalles d’algues et de leur morphologie générale. Gracilaria gracilis est un taxon clonal, c’est-à-dire que l’organe d’attache produit plusieurs axes végétatifs. La multiplication par fragmentation (reproduction végétative) est ainsi réalisée, car chacun de ces axes est tout à fait capable d’adopter une vie indépendante du thalle principal³. Les taxons clonaux peuvent être intégrés avec succès avec des méthodologies de culture simples et rapides en une seule étape, car de grandes quantités de biomasse sont obtenues en divisant le thalle en petits fragments qui se régénèrent rapidement et se développent en de nouveaux individus génétiquement identiques. Les thalles haplontiques et diplontiques peuvent être utilisés dans ce processus. Bien que le genre présente un cycle de vie triphasique isomorphe haplo-diplonique complexe, la sporulation est rarement nécessaire, sauf lorsque le renouvellement génétique des stocks est nécessaire pour obtenir des cultures améliorées. Dans ce cas, les tétraspores (spores haplontiques formées par méiose) et les carpospores (spores diplontiques formées par mitose) donnent naissance à des thalles macroscopiques qui peuvent ensuite être cultivés et multipliés par reproduction végétative⁴. Les cycles de croissance sont dictés par les conditions environnementales et l’état physiologique des individus, entre autres facteurs biologiques tels que l’émergence d’épiphytes et l’adhésion d’autres organismes. Par conséquent, l’optimisation des conditions de croissance est cruciale pour assurer une productivité élevée et produire une biomasse de bonne qualité⁵.

L’extraction des composés bioactifs des algues, y compris G. gracilis, peut être réalisée par diverses méthodes ^6,7. Le choix de la méthode d’extraction dépend des composés spécifiques d’intérêt, de l’application cible et des caractéristiques de l’algue. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur l’extraction par solvant, qui consiste à utiliser des solvants verts, tels que l’eau ou l’éthanol, pour dissoudre et extraire les composés bioactifs de la biomasse d’algues. L’extraction peut être réalisée par macération de manière polyvalente et efficace et peut être utilisée pour une large gamme de composés. Il s’agit d’une méthode simple et largement utilisée qui consiste à faire tremper la biomasse dans un solvant pendant une période prolongée, généralement à température ambiante ou légèrement élevée. Le solvant est agité pour améliorer le processus d’extraction. Après le temps d’extraction souhaité, le solvant est séparé de la matière solide par filtration ou centrifugation.

L’eau est un solvant couramment utilisé dans les applications alimentaires en raison de sa sécurité, de sa disponibilité et de sa compatibilité avec une large gamme de produits alimentaires. L’extraction à l’eau convient aux composés polaires tels que les polysaccharides, les peptides et certains composés phénoliques. Cependant, il peut ne pas extraire efficacement les composés non polaires. L’éthanol est également un solvant largement utilisé dans les applications alimentaires et peut être efficace pour extraire une variété de molécules bioactives, y compris les composés phénoliques, les flavonoïdes et certains pigments. L’éthanol est généralement reconnu comme sûr pour une utilisation dans les aliments et peut être facilement évaporé, laissant derrière lui les composés extraits. Il convient de noter que le choix de la méthode d’extraction doit tenir compte de facteurs tels que l’efficacité, la sélectivité, la rentabilité et l’impact environnemental. L’optimisation des paramètres d’extraction, tels que la concentration en solvant, le temps d’extraction, la température et la pression, est cruciale pour obtenir des rendements optimaux de composés bioactifs de G. gracilis ou d’autres algues.

Il a été constaté que les algues présentent une activité antimicrobienne contre un large éventail de micro-organismes, y compris les bactéries, les champignons et les virus⁸. Cette activité est attribuée à des composants bioactifs, notamment des composés phénoliques, des polysaccharides, des peptides et des acides gras. Plusieurs études ont démontré leur efficacité contre des agents pathogènes tels que Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. et Pseudomonas aeruginosa, entre autres⁹. L’activité antimicrobienne des algues est attribuée à la présence de composés bioactifs qui peuvent interférer avec les parois cellulaires microbiennes, les membranes, les enzymes et les voies de signalisation¹⁰. Ces composés peuvent perturber la croissance microbienne, inhiber la formation de biofilm et moduler les réponses immunitaires.

Les algues rouges, également connues sous le nom de rhodophytes, sont un groupe d’algues qui peuvent présenter une activité antimicrobienne contre une variété de micro-organismes. Au sein de ce groupe, G. gracilis contient divers composés bioactifs qui peuvent contribuer à son activité antimicrobienne signalée. Bien que les molécules spécifiques puissent varier, les classes communes qui ont été signalées chez G. gracilis et qui peuvent posséder des propriétés antimicrobiennes sont les polysaccharides, les composés phénoliques, les terpénoïdes et les pigments¹¹. Cependant, il est important de noter que la présence et les quantités de ces composants peuvent varier en fonction de facteurs tels que l’emplacement de la collecte des algues, la saisonnalité, l’état physiologique des thalles et les conditions environnementales. Par conséquent, la classe et la concentration spécifiques de composés antimicrobiens chez G. gracilis peuvent varier en conséquence.

Il a également été démontré que G. gracilis possède des propriétés antioxydantes, contenant divers composés phénoliques, dont il a été démontré qu’ils éliminent les radicaux libres et réduisent le stress oxydatif¹².Les antioxydants aident à protéger les cellules contre les dommages causés par les espèces réactives de l’oxygène et ont des avantages potentiels pour la santé. La capacité antioxydante peut être évaluée directement par différentes méthodes, y compris l’activité de piégeage des radicaux libres du 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH) et, indirectement, par la quantification de la teneur totale en polyphénols (TPC)¹³.

Même si l’on rapporte qu’un ingrédient a une bioactivité importante, son évaluation de la cytotoxicité est indispensable pour évaluer les substances naturelles et synthétiques à utiliser en contact avec des cellules ou des tissus vivants. Il existe plusieurs méthodes de mesure de la cytotoxicité, chacune ayant des avantages et des limites. Dans l’ensemble, ils offrent une gamme d’options pour évaluer les effets nocifs de nombreuses substances sur les cellules et, en même temps, pour étudier les mécanismes de l’endommagement et de la mort cellulaires¹⁴.

Dans ce travail, nous utilisons le dosage du bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT), une méthode colorimétrique introduite par Mosmann (1983)¹⁵. Cette méthode mesure la réduction des sels de tétrazolium en un produit de formazan violet par des cellules métaboliquement actives. Plus la quantité de cristaux de formazan est élevée, plus le nombre de cellules viables est élevé, fournissant ainsi une mesure indirecte de la cytotoxicité¹⁴. Étant donné que dans ce travail, l’eau de G. gracilis et les extraits d’éthanol sont destinés à être incorporés dans des formulations dermo-cosmétiques, l’évaluation de la cytotoxicité in vitro est réalisée dans une lignée cellulaire de kératinocytes (HaCaT).

En ce qui concerne l’application alimentaire, les algues sont généralement faibles en calories et nutritionnellement riches en fibres alimentaires, en éléments essentiels et en acides aminés, en polysaccharides, en acides gras polyinsaturés, en polyphénols et en vitamines ^2,16. G. gracilis ne fait pas exception, ayant une valeur nutritionnelle intéressante. Freitas et al. (2021)⁴ ont constaté que le G. gracilis cultivé avait des niveaux plus élevés de protéines et de vitamine C et maintenait le niveau de lipides totaux par rapport aux algues sauvages. Cela peut représenter un avantage économique et environnemental, car nutritionnellement parlant, la production est préférable à l’exploitation des ressources sauvages. De plus, les consommateurs sont de plus en plus préoccupés par le type d’aliments qu’ils consomment, il est donc important d’introduire de nouveaux ingrédients pour l’enrichissement des aliments et d’utiliser de nouvelles ressources pour obtenir des extraits qui peuvent ajouter de la valeur à un produit et revendiquer un « clean label ». En outre, le marché actuel est très concurrentiel, ce qui nécessite le développement de nouveaux produits et de stratégies innovantes pour différencier les fabricants de leurs concurrents¹⁷.

L’enrichissement de produits à faible valeur nutritionnelle, tels que les pâtes, avec des ressources marines, y compris les algues, est une stratégie visant à introduire cette ressource en tant que nouvel aliment et une stratégie de différenciation du marché grâce à un produit à valeur nutritionnelle distincte. D’autre part, G. gracilis est une source de pigments rouges naturels tels que les phycobiliprotéines¹⁸, ayant un fort potentiel d’applications dans l’industrie alimentaire. Cette algue a montré un grand intérêt dans plusieurs domaines, et son application peut être faite en utilisant l’algue entière, des extraits et/ou la biomasse restante. Dans ce travail, nous montrons quelques exemples de telles applications.

Protocol

1. Récolte et préparation de la biomasse

1. Récoltez les spécimens de G. gracilis à marée basse et transportez-les rapidement au laboratoire dans des boîtes sombres et réfrigérées pour éviter le dessèchement, la lumière et l’exposition à l’air.
2. En laboratoire, lavez chaque thalle à l’eau de mer courante et nettoyez-le soigneusement pour éliminer les débris, les parties nécrotiques, les épiphytes et autres organismes de la surface.
3. Conservez la biomasse sauvage dans de l’eau de mer constamment aérée (31-35 psu) dans une pièce climatique (20 ± 1 °C) avec une faible irradiance fournie par la lumière du jour, des lampes blanches froides et fluorescentes et une photopériode réglée à 16h08 (lumière : obscurité) pendant 7 jours. Pendant cette période, ne pas fournir de milieu nutritif ; Cela permet aux algues de s’adapter lentement aux nouvelles conditions intérieures.

2. Entretien des stocks

1. Après la période d’acclimatation, coupez les extrémités saines des thalles d’algues avec une lame stérile. À la suite de Redmond et al. (2014)¹⁹ et dans des conditions stériles, faites glisser chaque pointe dans un gel de gélose préalablement préparé dans des boîtes de Pétri (gélose bactériologique à 1,0 %, dans un rapport eau distillée/eau de mer de 1 :1) pour éliminer tout contaminant restant. Effectuez le glissement de gélose trois fois pour chaque pointe et faites toujours glisser la pointe à travers les parties inutilisées du gel d’agar-agar.
2. Lavez la verrerie à l’acide dans une solution d’acide chlorhydrique (HCl, 15 %) et rincez-la abondamment à l’eau distillée. Stériliser tous les outils, la verrerie, la gélose, l’eau de mer et l’eau distillée utilisés dans le processus de nettoyage par autoclave (121 °C, 15 min).
   ATTENTION : Voir la fiche de données de sécurité de HCl livrée par le fournisseur.
3. Les pointes poussent dans de l’eau de mer stérilisée à 35 psu, complétée par une solution enrichie de Von Stosch (VSE) modifiée pour les algues rouges, selon Redmond et al. (2014)¹⁹. Ajouter du dioxyde de germanium (GeO₂) au milieu (1 mL/L) pour empêcher la croissance de diatomées épiphytes.
   ATTENTION : Voir la fiche de données de sécurité du GeO₂ livrée par le fournisseur.
   REMARQUE : Les pointes qui présentent une perte de pigmentation, telle qu’observée par une décoloration partielle ou totale, sont soumises à un stress ou sont déjà mortes et doivent être jetées.

3. Culture et mise à l’échelle

1. Après la période d’acclimatation, répartir au hasard environ 8 à 10 pointes saines dans des flacons à fond plat de 250 ml dans une pièce climatique réglée à 20 ± 1 °C avec la lumière blanche froide de 20 ± 0,5 μmol photons ^{m-2 s-1} (1500 lux), une photopériode réglée à 16 h : 8 h (lumière : obscurité) et de l’eau de mer stérile enrichie de milieux de culture VSE renouvelée chaque semaine.
2. Effectuez des mesures de poids hebdomadaires, en évitant de fatiguer excessivement les thalles²⁰. Pour cela, retirez soigneusement les pointes du milieu de culture, rincez doucement et pesez les milligrammes sur une balance de laboratoire.
   REMARQUE : Cette procédure peut être effectuée en même temps que le renouvellement hebdomadaire des milieux de culture.
3. Les thalles peuvent se développer dans ces flacons jusqu’à une densité de 2 g/L. À ce stade, effectuez une mise à l’échelle du receveur (250 mL, 1 L et 5 L). Transférez la culture dans des récipients blancs ouverts en plein air de 50 L et plus lorsque le volume atteint 5 L.
4. Calculer le taux de croissance relatif (RGR) selon Patarra et al. (2017)²¹ :
   RGR (% fw/jour) = ([Ln (fw) - Ln (iw)]/t) x 100
   où iw et fw sont respectivement le poids frais initial et final, exprimé en grammes, et t est le temps en jours.
   REMARQUE : Dans cette configuration de laboratoire, RGR atteint des valeurs allant jusqu’à 21% par jour. La récolte de la biomasse peut être effectuée à tout moment. La biomasse doit être traitée rapidement pour éviter sa dégradation, soit par séchage au four, soit par lyophilisation, soit simplement stockée congelée (-20 °C), selon l’utilisation prévue. La biomasse séchée peut être conservée à température ambiante (RT) ou conservée congelée.

4. Procédure d’extraction

REMARQUE : Pour évaluer la cytotoxicité in vitro , les propriétés antioxydantes et antimicrobiennes des extraits de G. gracils , sa préparation prend en compte deux paramètres différents : la température d’extraction et le type de solvant.

1. Pour effectuer les extractions, séchez la biomasse de G. gracilis au four et broyez-la (par exemple, dans un moulin à café domestique) jusqu’à ce que la poudre passe à travers un tamis de 200 μm.
2. Peser la biomasse séchée (10 g) et la dissoudre dans 100 mL de solvant (éthanol absolu ou eau stérile).
3. Remuer dans un récipient à l’abri de la lumière pendant 30 min.
4. Effectuer des extractions séquentielles d’éthanol > d’eau et d’eau > d’éthanol à RT, 40 °C et 70 °C.
5. Pour chaque température, effectuez les extractions avec de l’éthanol et de l’eau séparément deux fois.
6. Séparer les extraits liquides de la biomasse restante par filtration à travers du papier filtre (Whatman n°1), suivie d’une centrifugation à 8000 x g pendant 10 min à RT.
7. Réutiliser la biomasse algale restante pour une extraction ultérieure avec l’autre solvant. Si un échantillon a d’abord été extrait avec de l’éthanol, extrayez-le ensuite avec de l’eau, et vice-versa.
8. Lyophiliser les extraits aqueux et évaporer les extraits d’éthanol dans un évaporateur rotatif à 40 °C.
9. Conservez les extraits secs à 4 °C.
10. Dissoudre les extraits à une concentration de 50 mg/mL (dosages antimicrobiens) ou 10 mg/mL (dosages antioxydants). Dissoudre les extraits aqueux dans de l’eau stérile et les extraits éthanoliques dans de l’éthanol absolu.

5. Activité antimicrobienne

REMARQUE : Les extraits éthanolique et aqueux doivent être testés individuellement contre Bacillus subtilis subsp. spizizenii (DSM 347), Escherichia coli (DSM 5922) et Listonella anguillarum (DSM 21597). Les tests antimicrobiens doivent être effectués conformément aux recommandations du National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2012)²². Toutes les cultures ont été obtenues à partir de la collection allemande de micro-organismes et de cultures cellulaires (DSMZ). L. anguillarum a été cultivé sur du bouillon de soja tryptique (TSB) ou de la gélose tryptique de soja (TSA) additionnée de chlorure de sodium (NaCl) à 1 %. Les deux souches restantes ont été cultivées sur un milieu LB (VWR Chemicals). Les cultures de Bacillus subtilis subsp. spizizenii (DSM 347) et de Listonella anguillarum (DSM 21597) ont été incubées à 30 °C, tandis que les cultures d’Escherichia coli (DSM 5922) ont été incubées à 37 °C, selon les instructions du fournisseur. La méthode de microdilution du bouillon peut être utilisée pour la détermination de l’activité antimicrobienne dans un milieu liquide, et cela doit être effectué à l’échelle microscopique, ce qui permet de déterminer le potentiel antimicrobien rapidement et efficacement. Cette méthode peu coûteuse permet d’obtenir des résultats en seulement 24 h, ce qui permet de déterminer, à un stade précoce, les meilleures conditions d’extraction qui permettent, pour une souche microbienne donnée, d’obtenir des résultats en termes d’action inhibitrice de croissance. Cependant, la méthodologie nécessite l’utilisation de microplaques stériles avec un couvercle spécifique pour la croissance microbienne, ainsi que la disponibilité d’un lecteur de microplaques pour la longueur d’onde de 600 nm.

1. Effectuer les essais de microdilution du bouillon à l’aide de microplaques à 96 puits à fond rond non traitées contenant 170 μL de bouillon Muller-Hinton (MHB), inoculées avec 10 μL d’inoculum normalisé (à 0,5 norme McFarland) et 20 μL de chaque extrait (50 mg/mL).
2. Incubez les plaques pendant 24 h à la température optimale pour chaque souche.
3. Détecter l’activité antimicrobienne par la réduction de la turbidité visible mesurée par l’enregistrement de la densité optique (OD ₆₀₀) dans un spectrophotomètre à microplaques, à 0 h et 24 h.
4. Exprimez les résultats en pourcentage d’inhibition :
   
   où Abs. ext est la différence d’absorbance mesurée, entre 0 h et 24 h, dans les puits qui contiennent une souche bactérienne qui se développe en présence de l’extrait, et Abs se réfère à la même mesure dans les puits qui contiennent la souche bactérienne et le solvant.
5. Dans cette méthode, inclure des réactions témoins, avec des puits contenant uniquement un milieu de culture qui sera le témoin négatif, mais aussi des puits avec un milieu inoculé avec la souche standard ajoutée au solvant (éthanol ou eau) et un milieu avec la souche bactérienne et l’antibiotique témoin positif (chloramphénicol).

6. Activité antioxydante et quantification des polyphénols totaux

1. Teneur totale en polyphénols
   NOTE : La teneur en polyphénols totaux (TPC) est réalisée selon la méthode Folin-Ciocalteu²³ et adaptée à l’échelle microscopique.
   1. Ajouter à chaque puits d’une microplaque à 96 puits, à l’abri de la lumière, 158 μL d’eau ultrapure, 2 μL de l’échantillon et 10 μL de réactif Folin-Ciocalteu.
      ATTENTION : Voir la fiche de données de sécurité du réactif Folin-Ciocalteu livré par le fournisseur.
   2. Au bout de 2 min, ajouter 30 μL de Na₂CO₃ (20 %).
   3. Après incubation dans l’obscurité à RT pendant 1 h, mesurer les échantillons par spectrophotométrie à 755 nm.
   4. Utilisez de l’acide gallique (qui permet de tracer la courbe d’étalonnage) ou de l’eau ultrapure (2 μL) comme témoins.
   5. Exprimez les résultats sous forme d’équivalents d’acide gallique (mg GAE/g d’extrait).
2. Activité de piégeage des radicaux 2,2 diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH)
   NOTE : L’activité antioxydante des extraits est évaluée telle que décrite par Duan et al. (2006)²⁴, adaptée à l’échelle microscopique
   1. Dans une microplaque à 96 puits à l’abri de la lumière, placer 2 μL de chaque échantillon (à une concentration de 10 mg/mL) et 198 μL de DPPH dissous dans de l’éthanol absolu (0,1 mM).
      ATTENTION : Voir la fiche de données de sécurité de DPPH livrée par le fournisseur.
   2. Exécutez la réaction pendant 30 minutes à RT dans l’obscurité. Mesurer l’absorbance à 517 nm dans un spectrophotomètre à microplaques.
   3. Effectuer une réaction de contrôle avec 2 μL d’éthanol/eau distillée absolue et 198 μL de solution DPPH. Effectuez une mesure à blanc avec 2 μL d’extrait et 198 μL d’éthanol absolu.
   4. Exprimez les résultats sous forme de pourcentage d’inhibition de la DPPH à l’aide de l’équation suivante :
      
      où As est l’absorbance de l’extrait d’algue, Ab est l’absorbance des échantillons blancs et Ac est l’absorbance du témoin.

7. Évaluation de la cytotoxicité dans les cellules épidermiques

NOTE : L’effet cytotoxique in vitro des extraits aqueux et éthanols de G. gracilis est évalué dans les kératinocytes humains (cellules HaCaT - 300493) par le test colorimétrique MTT comme décrit précédemment²⁵. Les cellules ont été acquises auprès de Cell Lines Services, Allemagne (CLS) et la méthode a été réalisée conformément aux directives institutionnelles et aux instructions du CLS.
ATTENTION : Voir la fiche de données de sécurité de MTT livrée par le fournisseur)

1. Maintenance de la culture cellulaire
   1. Cultivez des cellules HaCaT dans le milieu hyperglycémique (DMEM) de Dulbecco Modified Eagle complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % de solution antibiotique/antimycosique (amphotéricine B, 0,25 mM ; pénicilline, 60 mM ; streptomycine, 100 mM).
   2. Utilisez la trypsine-EDTA pour dissocier les cellules.
      REMARQUE : La sous-culture des cellules HaCaT est réalisée après que les cellules ont atteint la confluence totale.
   3. Cultiver les cellules dans une chambre à 37 °C avec 5 % de CO₂ et 95 % d’humidité.
   4. Sous-culture des cellules selon les instructions de la biobanque chaque fois que les cultures atteignent 80 % à 85 % de confluence.
2. Évaluation de la cytotoxicité
   1. Après avoir ensemencé les cellules dans des plaques de 96 puits et les avoir incubées pendant la nuit, traiter les cellules HaCaT (4 x 10⁴ cellules/puits) avec les extraits séchés préalablement dissous dans du DMSO (100 mg/mL). Ensuite, ajouter 2 μL de la solution d’extrait à 198 μL de milieu et incuber les plaques pendant 24 h.
   2. Retirez le milieu de culture et ajoutez 100 μL de MTT (0,5 mg/mL) aux cellules. Incuber les cellules pendant 30 min dans l’obscurité dans les conditions de culture normales mentionnées ci-dessus.
   3. Retirer la solution de MTT et solubiliser les cristaux intracellulaires de formazan avec 100 μL de DMSO.
   4. Mesurer l’absorbance à 570 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. Exprimez les résultats en pourcentage de cellules témoins non traitées.

8. L’innovation alimentaire

1. Nouveau produit alimentaire : Pâtes aux algues
   1. Sélection des ingrédients et formulation des pâtes
      NOTE : La sélection des ingrédients a été faite en collaboration avec une entreprise de pâtes. Le choix des ingrédients clés (décrits dans la section 8.2) a été fait en tenant compte de leur facilité d’accès et de leur compatibilité avec les lignes de production existantes, en utilisant les ressources marines pour obtenir des pâtes à valeur nutritionnelle ajoutée.
      1. Après le choix des ingrédients, concevez la formulation en fonction de la valeur nutritionnelle souhaitée (source de fibres, de vitamines et d’éléments minéraux, faibles graisses saturées) en analysant la composition chimique théorique des formulations à l’aide d’un tableur.
      2. Lorsque les exigences théoriques sont satisfaites, procédez à la production à l’échelle du laboratoire comme décrit à l’étape 8.1.2.
      3. Réaliser un test sensoriel avec un panel semi-formé (>10 dégustateurs) pour valider la nécessité d’une reformulation ou l’acceptation de la formulation pour les étapes suivantes.
         REMARQUE : Le panel a été préalablement formé pour la dégustation de pâtes et a évalué hédoniquement les formulations présentées en fonction d’attributs tels que la saveur, le goût, l’odeur, la texture et l’apparence.
   2. Production de pâtes
      REMARQUE : Produisez des échantillons de pâtes Chifferi à l’aide d’une extrudeuse de pâtes.
      1. Dans l’équipement, mélangez des portions préalablement définies de farine de riz, de G. gracilis et de Chlorella vulgaris, et ajoutez environ 30% d’eau au mélange.
      2. Pour obtenir des pâtes sèches, séchez Chifferi à 68 °C pendant 42 min, puis 5 h, 30 min à 76 °C, simulant un processus industriel.
      3. Enfin, emballez et scellez sous vide les échantillons et conservez-les dans un endroit sombre à RT jusqu’à une analyse plus approfondie.
   3. Analyse nutritionnelle
      REMARQUE : Pour les analyses du profil nutritionnel, utiliser des échantillons séchés et macérés en trois exemplaires.
      1. Teneur en protéines brutes : Effectuer le dosage des protéines totales par la méthode de Kjeldahl , adaptée de Duarte et al. (2022)²⁶, en suivant les étapes 8.1.3.2-8.1.3.6.
      2. Peser avec précision 1,0 g d’échantillon (ou d’eau distillée pour l’essai à blanc) et mélanger avec deux comprimés de Kjeldahl et 25 mL de H₂SO₄ dans des tubes de digestion.
         ATTENTION : Voir la fiche de données de sécurité de H₂SO₄ livrée par le fournisseur.
      3. Effectuer la digestion des échantillons dans un digesteur Kjeldahl à 220 °C pendant 30 min, puis 90 min à 400 °C.
      4. Après avoir refroidi jusqu’à RT, ajouter 80 mL d’eau distillée et distiller l’ammoniac formé dans 30 mL d’une solution à 4 %H 3 BO₃ contenant du vert de bromocrésol et du rouge de méthyle. Cette étape s’effectue dans des conditions alcalines (distillation avec 40% de NaOH à l’aide d’un distillateur Kjeldahl.
         ATTENTION : Voir la fiche de données de sécurité de lasolution H 3 BO₃ contenant du vert de bromocrésol, du rouge de méthyle et 40 % de NaOH livrée par le fournisseur.
      5. Titrer les échantillons distillés avec HCl 0,1 M jusqu’à ce qu’un changement de couleur vers un rose grisâtre soit observé.
      6. Calculez la teneur en protéines brutes, représentée par la teneur en azote de l’échantillon, et exprimez-la en g pour 100 g à l’aide de l’équation suivante :
         
         où V_s correspond au volume de HCl (mL) utilisé pour le titrage de l’échantillon ; V_b correspond au volume utilisé dans l’ébauche ; N correspond à la normalité de HCl ; w correspond au poids de l’échantillon (g).
      7. Teneur totale en matières grasses : Déterminer la teneur totale en matières grasses à l’aide de la méthode de Folch, adaptée de Folch et coll. (1957)²⁷, en suivant les étapes 8.1.3.8 à 8.1.3.14.
      8. Préparer le réactif de Folch en mélangeant le CHCl₃ et le MeOH dans une proportion de 2 :1 (v :v).
         ATTENTION : Voir la fiche de données de sécurité du réactif Folch livré par le fournisseur.
      9. Pour tester des tubes contenant 1 g d’aliquotes d’échantillons, ajouter 5 mL de réactif Folch et 0,8 mL d’eau distillée. Mélangez dans un vortex pendant 1 min.
      10. Ensuite, ajouter 5 mL de réactif Folch et homogénéiser pendant 5 min. Ajouter 1,2 mL de solution de NaCl à 0,8 % et homogénéiser pendant 2 min_.
      11. Centrifuger les échantillons à 7000 x g pendant 10 min. Filtrez la phase organique (phase inférieure) à travers du coton hydrophile et du sulfate de sodium anhydre dans une fiole en verre à fond rond.
      12. Pour éviter la perte d’échantillon, répétez les étapes d’ajout de 5 mL de_{CHCl 3}, d’homogénéisation, de centrifugation et de filtration dans les mêmes conditions.
      13. Éliminer le solvant organique des phases organiques collectées par évaporation à basse pression et laisser enfourner à 105 °C pendant 4 h. Refroidir les échantillons dans un dessiccateur.
      14. Calculer la teneur en matières grasses, exprimée en g pour 100 g, à l’aide de l’équation suivante :
          
          où W₁ est le poids de la fiole en verre vide à fond rond ; W₂ est le poids initial de l’échantillon ; W₃ est le flacon en verre à fond rond avec le poids de l’échantillon.
      15. Teneur en fibres brutes : Déterminer la teneur en fibres brutes à l’aide d’une méthodologie adaptée de l’ISO 6865 (2000)²⁸, en suivant les étapes 8.1.3.16 à 8.1.3.22.
      16. Peser 1 g de l’échantillon (W0) dans un creuset en verre avec un fond filtrant (référence P2) et le placer dans l’analyseur de fibres.
      17. La première étape est l’hydrolyse acide : Ajouter 150 mL de 1,25 % H 2 SO₄, préchauffé, et₂mL d’agent anti-mousse (n-octanol) dans la colonne de chaque creuset ; Chauffer jusqu’à ébullition et garder pendant 30 min.
      18. Après avoir éliminé ce solvant, laver trois fois avec de l’eau déminéralisée pour procéder à l’hydrolyse de base. Ajouter 150 mL de NaOH à 1,25 %, préchauffé, et 5 mL d’agent anti-mousse dans la colonne sans liquide, et effectuer la même procédure de chauffage que pour l’hydrolyse acide.
      19. Enfin, faites un triple lavage avec 150 mL d’acétone pour l’extraction à froid.
      20. Après ce processus, retirez délicatement les creusets du système et placez-les dans un four à 150 °C pendant 1 h. Notez le poids final (W1).
      21. Placer les creusets dans un four à moufle à 500 °C pendant 3 h, puis noter le poids final (W2).
      22. Calculez la teneur en fibres brutes et exprimez les résultats en pourcentages à l’aide de l’équation suivante :
          % de fibres brutes = 100 x (W1-W2)/W0
      23. Profil d’acides gras (AG) : Déterminer le profil d’acides gras selon Fernández et al.(2015)29, en suivant les étapes 8.1.3.24 à 8.1.3.29.
          REMARQUE : Les esters méthyliques d’acides gras (EMAG) sont obtenus par transméthylation directe catalysée par l’acide des échantillons lyophilisés broyés. Toutes les analyses sont effectuées en trois exemplaires.
      24. Ajouter 2 mL d’une solution_H2SO₄ à 2 % (v/v) dans du méthanol à un échantillon de 50 mg et verser le mélange à 80 °C pendant 2 h en agitant continuellement.
          ATTENTION : Voir la fiche de données de sécurité du méthanol livrée par le fournisseur.
      25. Après refroidissement à RT, ajoutez 1 mL d’eau ultra-pure et 2 mL de n-heptane à chaque échantillon, faites tourbillonner le mélange pendant 1 min et centrifugez-le pendant 5 min.
          ATTENTION : Voir la fiche de données de sécurité du n-heptane livrée par le fournisseur.
      26. Récupérer la phase supérieure n-heptane (organique) contenant les EMAG et la transférer dans des flacons de chromatographie en phase gazeuse (GC).
      27. Analysez dans un chromatographe en phase gazeuse équipé d’une colonne capillaire TR-FAME (60 m × 0,25 mm de diamètre intérieur, 0,25 μm d’épaisseur de film), d’un échantillonneur automatique et d’un détecteur à ionisation de flamme (FID).
      28. Réglez l’injecteur (mode splitless) à 250 °C et le détecteur à 280 °C. Réglez la température initiale de la colonne à 75 °C et maintenez-la pendant 1 min. Augmenter ensuite à 5 °C/min à 170 °C et maintenir pendant 10 min. Augmenter ensuite à 5 °C/min à 190 °C et maintenir encore 10 min. Enfin, augmenter à 2 °C/min à 240 °C et maintenir pendant 10 min. Utilisez l’hélium comme gaz vecteur à un débit de 1,5 mL/min. Fournir de l’air et de l’hydrogène à des débits respectifs de 350 et 35 mL/min.
      29. Déterminer le profil de l’AG en comparant les temps de rétention qui en résultent avec une norme et exprimer les résultats en pourcentage de la graisse totale.
      30. Profil des éléments minéraux : Déterminer les éléments minéraux (Ca, P, Mg, Na, K, Fe, Cu, Mn, Zn) analysés par l’ICP-OES, en suivant la méthode adaptée de Pinto et al. (2022)³⁰, en suivant les étapes 8.1.3.31-8.1.3.34.
      31. Peser avec précision environ 0,4 g de chaque échantillon sec et ajouter 7,5 mL de HNO₃ et 2,5 mL de HCl.
          ATTENTION : Voir la fiche de données de sécurité de HNO₃ et HCl livrée par le fournisseur.
      32. La digestion suit un processus en deux étapes : augmenter la température de RT à 90 °C en 30 min (et maintenir 30 min supplémentaires à cette température) suivie de 60 min à 105 °C.
      33. Refroidissez les solutions d’échantillonnage, diluez-les à 25 ml, filtrez-les et conservez-les dans des tubes étiquetés. À chaque digestion, effectuez le même processus avec un matériau de référence et un blanc. Obtenir la concentration des différents éléments par ICP-OES.
      34. Exprimez les résultats en mg pour 100 g de poids corporel.
      35. Teneur en glucides : Calculez la teneur en glucides en suivant les étapes 8.1.3.36-8.1.3.37.
      36. Calculer la teneur en glucides disponibles (à l’exclusion des fibres) par la différence des facteurs précédemment déterminés pour 100 g, à l’aide de l’équation suivante, selon l’Organisation des Nations Unies pour l’alimentation et l’agriculture (FAO ; 2003)³¹
          
      37. Exprimez les résultats en g pour 100 g.
      38. Teneur en humidité et en cendres : Estimez la teneur en humidité et en cendres en suivant les étapes 8.1.3.39 à 8.1.3.45.
      39. Incuber les creusets en porcelaine pendant 3 h à 105 °C, les refroidir dans un dessiccateur et les peser.
      40. Peser 10 g de l’échantillon dans le creuset et le placer dans une étuve de séchage à 105 °C pendant des cycles de 3 h jusqu’à ce que les valeurs des pondérations successives ne diffèrent pas de plus de 10 mg.
      41. Calculer la teneur en eau, exprimée en g par 100 g de poids corporel, à l’aide de l’équation suivante :
          
          où W₁ est le poids du creuset vide, W₂ est le poids du creuset avec l’échantillon frais et W₃ est le poids du creuset avec l’échantillon séché.
      42. Après le dosage de la teneur en humidité, placer les creusets avec les échantillons séchés dans un incinérateur à 525 °Cpendant 4 h.
      43. Répétez cette procédure jusqu’à ce que les pondérations successives ne diffèrent pas de plus de 1 mg.
      44. Refroidissez les échantillons jusqu’à ce qu’ils soient RT dans un dessiccateur, puis pesez-les.
      45. Calculer la teneur en cendres, exprimée en g pour 100 g de poids corporel, à l’aide de l’équation suivante :
          
          où W₁ est le poids du creuset vide, W₂ est le poids du creuset avec l’échantillon frais, W₃ est le poids du creuset avec le poids.
      46. Valeur énergétique : Calculez la valeur énergétique en suivant les étapes 8.1.3.47 à 8.1.3.48.
      47. Calculer la valeur énergétique des échantillons selon le règlement de l’UE :La fourniture d’informations alimentaires aux consommateurs (règlement 1169/2011)³², à l’aide des équations suivantes :
          Énergie (kcal/ 100 g) = 4 x (g de protéines) + 4 x (g de glucides) + 9 x (g de lipides) + 2 x (g de fibres)
          Énergie (kJ/ 100 g) = 17 x (g protéines) + 17 x (g glucides) + 37 x (g lipides) + 8 x (g fibres)
      48. Exprimez les résultats en kilocalories pour 100 g et en kilojoules pour 100 g.
   4. Acceptation par les consommateurs
      1. Évaluez l’acceptation par les consommateurs à l’aide d’échantillons de pâtes cuites dans de l’eau distillée pendant 8 minutes.
      2. Effectuer un test d’acceptation par le consommateur : évaluez l’apparence visuelle, la couleur, la texture, l’odeur, le goût marin, le goût général, l’évaluation globale et l’intention d’achat des échantillons.
         REMARQUE : Le test d’acceptation par le consommateur est basé sur des tests hédoniques évaluant l’apparence visuelle, la couleur, la texture, l’odeur, le goût de la mer, le goût général, l’évaluation globale et l’intention d’achat sur une échelle de 1 à 9, où 1 est une mauvaise évaluation et 9 est une très bonne évaluation.
      3. Effectuer des tests sensoriels dans des cabines sensorielles individuelles dans un laboratoire d’analyse sensorielle (avec contrôle de la température et de l’éclairage). Fournissez des couverts, des serviettes et des tasses en verre d’eau minérale pour nettoyer le palais entre les échantillons.
         NOTE : Les dégustateurs sont âgés de 16 à 64 ans et viennent de tous les horizons (n > 80).
2. Yaourt
   1. Extraction de pigments
      REMARQUE : Effectuez l’extraction du pigment selon la méthodologie décrite dans Pereira et al. (2020)¹⁸.
      1. Préparer le solvant d’extraction, tampon de phosphate de sodium à 0,1 M, avec du phosphate de sodium dibasique (0,03 M) et du phosphate de sodium monobasique (0,07 M). Réglez le pH à un pH de 6,8 à l’aide de NaOH ou de HCl.
      2. Peser 1 g de G. gracilis et ajouter 50 mL de tampon phosphate de sodium (pH 6,8). Homogénéiser pendant 10 min, suivi de 10 min de macération au mortier et au pilon.
      3. Transvaser la solution dans un tube et centrifuger pendant 20 min à 12 298 x g (4 °C).
      4. Mettez le surnageant en commun et ajoutez lentement 65 % de sulfate d’ammonium. Lorsque tout le sulfate d’ammonium est dissous, couvrez la solution d’une feuille d’aluminium et laissez-la précipiter à 4 °C pendant la nuit.
         ATTENTION : Voir la fiche de données de sécurité du sulfate d’ammonium livrée par le fournisseur.
      5. Centrifuger le précipité pendant 20 min à 12 298 x g (4 °C). Récupérer la pastille et la dissoudre dans de l’eau distillée (environ 5 ml).
      6. Effectuer la dialyse de l’extrait à l’aide d’une membrane tubulaire (14 kDa) contre l’eau pendant 24 h, suivie d’une lyophilisation. Conservez l’extrait lyophilisé à l’abri de la lumière à 4 °C jusqu’à utilisation.
   2. Préparation du yogourt
      1. Préparez le yaourt nature en mélangeant 1 L de lait pasteurisé, 120 g de yaourt nature, 20 g de sucre et 50 g de lait en poudre dans un thermomélangeur pendant 5 min, 50 °C, vitesse 3.
      2. Placez le mélange dans le bocal du thermomélangeur dans un incubateur à 37 °C pendant 12 h.
      3. Incorporez l’extrait en le mélangeant à du yogourt à une concentration de 0,21%. Conserver les échantillons dans des flacons individuels en verre à 4 °C jusqu’à l’analyse.
      4. Conserver des portions individuelles de yogourt sans pigment (témoin) à 4 °C jusqu’à l’analyse.
   3. Stabilité des couleurs
      REMARQUE : Évaluez la stabilité du pigment dans les yaourts par une analyse de la couleur pendant 12 jours. Effectuez une analyse des couleurs à l’aide d’un colorimètre à réflectance, d’un observateur standard à 2 degrés et d’un illuminant D65. Les résultats sont présentés sous forme de coordonnées CIELab avec les paramètres L (luminosité, noir - blanc, 0 - 100), a* (vert - rouge, -60 - 60) et b* (bleu - jaune, -60 - 60). Le paramètre a* a des valeurs positives pour les couleurs rougeâtres et des valeurs négatives pour les couleurs verdâtres. Le paramètre b* prend des valeurs positives pour les couleurs jaunâtres et des valeurs négatives pour les couleurs bleuâtres. L* est le paramètre de luminosité, qui est la propriété selon laquelle chaque couleur peut être considérée comme équivalente à un membre de l’échelle de gris entre le noir et le blanc³³.
      1. Calibrer le colorimètre à l’aide d’une plaque en céramique blanche (L* 88,5, a* 0,32, b* 0,33) fournie par le fabricant.
      2. Remplissez une cellule avec environ 28 g de l’échantillon (ou du témoin) et analysez la couleur à l’aide d’un logiciel d’analyse des données de couleur.
         REMARQUE : Le logiciel utilisé pour l’analyse des données de couleur était le SpectraMagic NX.
      3. Effectuer des lectures 5 fois en trois exemplaires d’échantillonnage/contrôle.
   4. Analyse sensorielle
      REMARQUE : Effectuer une évaluation sensorielle des yogourts avec incorporation de pigments à l’aide d’un test triangulaire (ISO 4120, 2004)³⁴ et d’une évaluation hédonique de la couleur, du goût et de l’appréciation globale.
      1. Pour le test triangulaire, donnez aux panélistes trois échantillons (un échantillon de yogourt avec pigment et deux échantillons de témoin, ou deux échantillons de yogourt avec pigment et un témoin) et demandez-leur de choisir un échantillon différent en fonction de l’arôme, de la texture et du goût. Fournir des échantillons dans des volumes similaires identifiés par des codes aléatoires à 3 chiffres.
      2. Pour l’évaluation hédonique du yogourt avec pigment, donnez aux panélistes un échantillon de yogourt avec pigment et demandez-leur d’évaluer la couleur, le goût et l’appréciation globale à l’aide d’une échelle hédonique à 9 points (de l’aversion extrême à l’appréciation extrême).

Representative Results

Activité antimicrobienne

Lors de l’interprétation des résultats obtenus, il convient de garder à l’esprit que plus le pourcentage d’inhibition est élevé, plus l’efficacité de l’extrait pour inhiber la croissance de cette souche spécifique est grande et, par conséquent, plus l’extrait est intéressant en tant qu’antimicrobien. Grâce à cette méthodologie, nous pouvons rapidement identifier les extraits qui ont la plus grande activité sur certaines souches bactériennes, en identifiant également les plus intéressants en termes d’utilisation future. Nous pouvons ainsi avoir un point de départ pour d’autres études sur ce même extrait.

La figure 1 montre les résultats obtenus avec les extraits aqueux, tant dans la première que dans la deuxième extractions, immédiatement après le séchage de la biomasse (figure 1A) et dans les troisième et quatrième extractions (figure 1B), obtenus après les extractions éthanoliques, utilisant ainsi la biomasse intégralement. On constate que les résultats les plus intéressants, correspondant aux troisième et quatrième extractions aqueuses, révèlent des activités antimicrobiennes plus élevées, en particulier dans les extraits obtenus à 70 °C. La concentration d’extrait dans les puits est de 5 mg/mL.

Figure 1 : Inhibition de la croissance d’espèces bactériennes en présence d’extraits aqueux de G. gracilis. Inhibition de la croissance de 3 espèces bactériennes (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Listonella anguillarum) après 24 h de croissance en milieu liquide, en présence d’extraits aqueux (Aq) de G. gracilis obtenus à différentes températures, température ambiante (RT), 40 °C (40) et 70 °C (70). Le contrôle positif a été effectué avec du chloramphénicol (CHL), et les résultats sont exprimés en valeurs moyennes (n = 8). Les données se réfèrent aux 4 étapes d’extraction séquentielles (1^er, 2 ème, 3 ème, 4^ème). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les extraits éthanoliques semblent être particulièrement efficaces pour inhiber la croissance de L. anguillarum, comme le montre la figure 2. Ceci montre les résultats obtenus avec les extraits éthanoliques, également dans les première et deuxième extractions (Figure 2A) et les troisième et quatrième extractions (Figure 2B), obtenues après la première extraction aqueuse.

Figure 2 : Inhibition de la croissance d’espèces bactériennes en présence d’extraits éthanoliques de G. gracilis. Inhibition de la croissance de 3 espèces bactériennes (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Listonella anguillarum) après 24 h de croissance, en milieu liquide, en présence d’extraits éthanoliques (Et) de G. gracilis, obtenus à différentes températures, température ambiante (RT), 40 °C (40) et 70 °C (70). Le contrôle positif a été effectué avec le chloramphénicol (CHL) et les résultats ont été exprimés en valeurs moyennes (n = 8). Les données se réfèrent aux 4 étapes d’extraction séquentielles (1^er, 2 ème, 3 ème, 4^ème). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Activité antioxydante

En ce qui concerne les résultats qui mettent en évidence le potentiel antioxydant des différents extraits, notamment dans le test DPPH, les résultats exprimés dans la figure 3 indiquent que la température de 40 °C était la plus efficace, ce qui a entraîné des valeurs d’inhibition de l’activité oxydante plus élevées que celles observées dans les extraits obtenus à RT ou 70 °C. Cela est valable pour les échantillons de G. gracilis , et il peut y avoir de grandes variations selon les échantillons utilisés et les conditions de croissance des algues. Ainsi, il est recommandé d’effectuer des tests pour indiquer les meilleures conditions pour chaque type d’échantillon spécifique.

Figure 3 : Inhibition du radical DPPH (%) en présence d’extraits obtenus à différentes températures. Les extraits ont été obtenus par extraction éthanolique (Et) ou aqueuse (Aq). Les 1^ère et 2^ème extractions ont été réalisées à partir de biomasse sèche de manière séquentielle. Les autres (3^ème et 4^ème) ont été réalisés avec de la biomasse préalablement extraite avec le solvant alternatif. RT signifie température ambiante ; 40, extrait obtenu à 40 °C ; et 70, extrait obtenu à 70 °C. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Des résultats similaires ont été obtenus en termes de quantification des polyphénols totaux (Figure 4), la température de 40 °C étant considérée comme la meilleure en termes d’extraction des composés antioxydants. Cela montre que l’activité antioxydante semble être corrélée avec les composants phénoliques présents dans les extraits.

Figure 4 : Quantification de la teneur en polyphénols totaux (TPC) dans des extraits obtenus à différentes températures. Les extraits ont été obtenus par extraction éthanolique (Et) ou aqueuse (Aq), où les 1^ère et 2^ème extractions ont été faites séquentiellement à partir d’algues sèches et le reste (^{3ème et} 4ème^{) a} été réalisé avec de la biomasse préalablement extraite avec un autre solvant. RT signifie température ambiante ; 40, extrait obtenu à 40 °C ; et 70, extrait obtenu à 70 °C. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Cytotoxicité dans les cellules HaCat

La première étape pour évaluer l’innocuité des ingrédients cosmétiques est l’étude de leur cytotoxicité in vitro dans les lignées cellulaires épidermiques et dermiques. Comme on peut le voir sur la figure 5, aucun effet cytotoxique n’a été observé sur les kératinocytes (cellules HaCaT), ce qui suggère qu’à la concentration maximale mesurée (1 mg/mL), les extraits aqueux et éthanol sont sans danger pour une utilisation cutanée.

Figure 5 : Effet cytotoxique des extraits de Gracilaria gracilis (1 mg/mL) sur les cellules HaCaT après 24 h de traitement. Les valeurs de chaque colonne sont exprimées sous la forme de la moyenne ± de l’erreur type de la moyenne (SEM) de trois expériences indépendantes en trois exemplaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’innovation alimentaire

Les formulations finales des pâtes ont été obtenues après de nombreux essais entre formulation théorique et test sensoriel par un panel semi-formé. Après cette étape, la caractérisation chimique a été accessible, y compris l’évaluation nutritionnelle, les profils d’acides gras et d’éléments minéraux. Il a été possible de construire une caractérisation nutritionnelle (tableau 1 et tableau 2) et de vérifier l’existence d’allégations nutritionnelles attendues sur la base de la législation européenne (REG (UE) n° 1169/2011)³².

Valeur nutritive		par 100 g de Pâtes	% RDI
Énergie		1478.90 kJ (348.74 kcal)	17
Lipide		1,06 ± 0,10 g	2
De quoi:
	Acides gras saturés	0,38 ± 0,01 g	2
	Glucides	72,59± 0,21 gramme	28
	Fibre	3,84 ± 0,20 g
	Protéine	10,29 ± 0,20 g	21
	Sel	0,22 ± 0,02 g	9

Tableau 1 : Valeurs nutritionnelles. Valeurs nutritionnelles des pâtes élaborées sur la base d’analyses chimiques (n = 3) de l’énergie et des glucides obtenus par calcul et du pourcentage respectif de la dose recommandée (n = 3).

Ces formulations de pâtes ont été conçues pour plaire à un consommateur cible qui a une alimentation plus saine à l’esprit, de sorte que la quantité de matières grasses pour 100 g d’un produit doit être aussi faible que possible. L’analyse détaillée du profil d’acides gras montre une valeur de 0,38 g d’acides gras saturés/100 g, ce qui est bien inférieur à la limite pour les produits à faible teneur en graisses saturées, atteignant ainsi l’objectif initial de production de ces pâtes. En ce qui concerne la teneur en fibres, il était également possible, conformément à la réglementation européenne, de revendiquer cette formulation de pâtes comme source de fibres.

Dans la caractérisation des éléments minéraux, déterminée par l’ICP-OES et présentée dans le tableau 2, il est indiqué que la valeur d’environ 219 mg/100 g de Na est présente dans 100 g de ce produit, de sorte qu’il n’est pas possible de vérifier qu’il s’agit d’un produit à faible teneur en sodium (<0,12 g/100 g). En raison de la teneur élevée en sodium naturellement présente dans les ingrédients, ce produit peut ne pas nécessiter l’ajout de sel dans sa confection.

Tableau 2 : Profil des éléments minéraux des pâtes. Bleu - teneur élevée en élément ; Rouge - source d’un certain élément (n = 3). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Selon le règlement de l’Union européenne mentionné et le RDI% pour chaque élément, on peut voir que ce produit a une teneur élevée en K, P, Fe, et est également une source de Zn. Il contient du Se, du Mg et du Ca en plus petites quantités.

Pour les tests d’acceptation des pâtes, 86 testeurs ont été utilisés, dont 63 femmes et 23 hommes, âgés de plus de 18 ans. Les tests d’acceptation étaient basés sur des échelles hédoniques de 9 points, comme stipulé dans les normes. La pâte saine a obtenu des scores de 5 et 6 sur une échelle hédonique de 1 à 9 pour les paramètres « goût de la mer » et « aspect visuel », respectivement (figure 6).

Figure 6 : Résultats des tests d’acceptation sensorielle par les consommateurs. (A) Le choix hédonique pour l’apparence visuelle, la couleur, la texture, l’odeur, le goût de la mer et le goût général. (B) Le choix hédonique de l’appréciation globale et de l’intention d’achat. Échelle de 1 à 9, où 1 correspond à une mauvaise évaluation et 9 à une très bonne évaluation (n = 86). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les pâtes ont obtenu des scores de 5 et 6 sur une échelle hédonique de 1 à 9 pour les paramètres « goût de la mer » et « aspect visuel », respectivement (figure 6A). Ces pâtes ont obtenu une faible valeur sur cette échelle en ce qui concerne le paramètre de texture (compte tenu d’autres formulations déjà étudiées), probablement parce que l’ingrédient de base est la farine de riz ; Malgré cela, il a obtenu des valeurs sur une échelle de 1 à 9, allant de 4 à 7, ce qui reflète une bonne acceptation par le consommateur moyen. Sur une échelle hédonique de 1 à 9, les pâtes avaient comme réponses les plus fréquentes la valeur de 5 pour l’intention d’achat et la valeur de 6 pour l’appréciation globale, comme le montre la figure 6B. Il a été constaté qu’environ 65 % des dégustateurs ont choisi une réponse égale ou supérieure à la note de 6 pour l’évaluation globale de ces pâtes. La stabilité de la couleur des yaourts pigmentés a été évaluée pendant 12 jours à -4 °C, et les résultats sont présentés à la figure 7.

Figure 7 : Stabilité de la couleur des yaourts. (à gauche) Contrôlez les yaourts et les yaourts (à droite) avec le pigment Gracilaria gracilis pendant 12 jours de stockage. Les paramètres a*, b* et L* sont sans dimension. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les résultats indiquent que les paramètres a* et b* sont stables dans le temps, tandis que les valeurs L* montrent une variance plus élevée. La légèreté a démontré des valeurs plus élevées après 8 jours de stockage. Bien que certaines différences aient été constatées dans les paramètres de luminosité, indiquant que les échantillons étaient plus clairs au fil du temps, les paramètres de rougeur (a*) et de bleu (b*) ont montré une bonne stabilité. L’incorporation des extraits dans les yaourts a montré une bonne conservation de la couleur, avec un ΔE de 7,01 ± 2,36 après 12 jours de stockage. En ce qui concerne l’évaluation sensorielle du yogourt, 9 panélistes sur 13 ont correctement identifié le bon échantillon dans le test triangulaire, ce qui suggère qu’il y avait des différences entre les yogourts qui permettaient cette distinction. Les tests hédoniques effectués sur le panel semi-entraîné ont montré une bonne acceptation du produit, reflétée par des scores supérieurs à 7 (Figure 8). Le mode de score pour l’un ou l’autre des trois attributs testés était de 9, ce qui a conduit à des scores moyens supérieurs à 8. La meilleure évaluation a été faite à la couleur, ce qui reflète une excellente acceptation par le jury, un résultat révélateur.

Figure 8 : Résultats de l’évaluation sensorielle hédonique du yaourt avec le pigment Gracilaria gracilis. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les tests d’activité antimicrobienne en milieu liquide sont utilisés pour évaluer l’efficacité des substances antimicrobiennes contre les micro-organismes en suspension dans un milieu liquide et sont généralement effectués pour déterminer la capacité d’une substance à inhiber la croissance ou à tuer les micro-organismes^35,36,37,38. Ils sont utilisés pour évaluer la sensibilité des micro-organismes aux agents antimicrobiens et sont effectués dans des tubes à essai ou des plaques de microtitrage, où différentes concentrations de la substance antimicrobienne sont testées par rapport à une suspension normalisée du micro-organisme cible²². L’activité antimicrobienne est évaluée en mesurant la croissance microbienne ou la présence ou l’absence de turbidité dans le milieu de culture après une période d’incubation appropriée.

Il existe plusieurs techniques et méthodes pour effectuer ces tests, telles que la méthode de dilution du bouillon, la méthode de diffusion de la gélose (comme le test de diffusion du disque) et la méthode de microdilution du bouillon, qui est l’une des plus utilisées³⁸. Parmi les points les plus critiques de ces méthodes, citons la préparation correcte de l’inoculum, le choix du milieu de culture, la qualité des antimicrobiens utilisés, la standardisation de la technique et un contrôle efficace de la contamination. L’inoculum, qui est une suspension normalisée de micro-organismes, doit être préparé correctement pour assurer l’exactitude des résultats. Cela implique une sélection appropriée de la culture microbienne, une culture appropriée des souches pures, un ajustement de la concentration cellulaire et une normalisation de la suspension pour obtenir une densité optique ou une concentration cellulaire appropriée.

Le milieu de culture utilisé doit être choisi avec soin pour s’assurer qu’il offre les conditions de croissance idéales pour le micro-organisme testé. La composition chimique, le pH et d’autres facteurs peuvent affecter les résultats des tests. Il est important de suivre les recommandations du fabricant pour la préparation du milieu de culture. La qualité des agents antimicrobiens utilisés comme contrôle est fondamentale, et il est important de s’assurer qu’ils sont purs, qu’ils respectent leur durée de conservation et qu’ils sont stockés correctement. L’étiquetage et les dates de péremption doivent toujours être consultés, en suivant les instructions du fabricant. La standardisation de la technique est également cruciale pour assurer la précision des résultats. Cela comprend l’ajout des concentrations testées au milieu de culture, ainsi que le maintien de conditions d’asepsie tout au long de la procédure. De plus, la contamination croisée des micro-organismes pendant les tests peut entraîner des résultats faux ou peu fiables. Il est essentiel de suivre des pratiques aseptiques strictes tout au long de la procédure, de la manipulation de l’inoculum à l’incubation des tubes ou des plaques. L’utilisation de comptoirs propres, de techniques de pipetage appropriées et l’élimination appropriée des matériaux sont des mesures importantes pour éviter la contamination.

Le souci du détail et le strict respect des protocoles et directives établis sont essentiels pour minimiser les erreurs et assurer la fiabilité des résultats des tests d’activité antimicrobienne en milieu liquide. De plus, les tests d’activité antimicrobienne présentent certaines limites qui doivent être prises en compte³⁷.

Des facteurs tels que le pH, la température, la présence de composants sanguins et les interactions avec le système immunitaire ne sont pas pris en compte dans ces tests, ce qui peut limiter la capacité de prédire l’efficacité d’un agent antimicrobien dans un organisme vivant. De plus, les tests mesurent la capacité d’une substance antimicrobienne à inhiber la croissance microbienne ou à tuer les micro-organismes et ne fournissent pas d’informations détaillées sur le mécanisme d’action de l’antimicrobien ou sa sélectivité contre des micro-organismes spécifiques. Il y a des limites à la détection de la résistance, car les méthodes employées peuvent ne pas permettre la détection ou la prédiction de l’évolution de la résistance au fil du temps. Certains micro-organismes peuvent développer des mécanismes de résistance en réponse à une exposition prolongée à un antimicrobien, et ces changements peuvent ne pas être facilement détectés par ces tests. Les tests d’activité antimicrobienne en milieu liquide ne tiennent généralement pas compte d’autres facteurs de l’hôte qui peuvent influencer l’efficacité d’un agent antimicrobien, tels que la présence de biofilms ou la réponse immunitaire de l’hôte.

Il est important de tenir compte de ces limites et de compléter les tests d’activité antimicrobienne dans un milieu liquide par d’autres méthodes et approches, telles que des études in vivo , des modèles de biofilm et d’autres³⁹. Dans le domaine de la bioprospection de composés bioactifs de macroalgues, les tests d’activité antimicrobienne peuvent être utilisés pour évaluer le potentiel antimicrobien d’extraits d’algues ou de composés isolés, en identifiant des substances ayant une activité antimicrobienne contre des agents pathogènes microbiens spécifiques, qui peuvent avoir des applications dans des domaines tels que la production de médicaments, de cosmétiques, d’aliments ou de produits agricoles⁴⁰.

Les tests d’activité antioxydante sont des méthodes utilisées pour évaluer la capacité d’un composé ou d’un extrait à neutraliser les radicaux libres ou à réduire le stress oxydatif. Ces tests sont largement utilisés dans la recherche sur les antioxydants, tant dans les aliments que dans les produits naturels tels que les algues, par exemple. Il existe plusieurs méthodes pour évaluer l’activité antioxydante, et l’une des plus couramment utilisées est la capacité d’absorption des radicaux libres. Dans ce test, un radical libre stable, le 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH), est utilisé pour évaluer la capacité d’un composé à donner un électron et à neutraliser le radical libre. L’activité antioxydante est mesurée en réduisant la couleur violette du DPPH, qui se produit lorsque le composé antioxydant donne un électron au radical libre. D’autres méthodes incluent la capacité d’absorption des radicaux oxygénés (ORAC), la capacité de réduction du fer (FRAP) ou la capacité de réduction des radicaux libres (ABTS)⁴¹.

La quantification des polyphénols totaux (QTP), en revanche, n’est pas une méthode directe pour déterminer l’activité antioxydante, mais fournit une mesure de la concentration totale de polyphénols dans un échantillon, bien que plusieurs substances interférentes puissent affecter les résultats. Bien que de nombreux polyphénols soient connus pour avoir des propriétés antioxydantes, l’activité antioxydante d’un composé est liée à plusieurs facteurs, tels que sa structure chimique, sa concentration, sa capacité à donner ou à capturer des radicaux libres et ses interactions avec d’autres^composants cellulaires. La simple quantification des polyphénols totaux ne permet pas d’évaluer l’activité antioxydante de l’échantillon. Cependant, il est important de noter que la présence de polyphénols dans un échantillon peut être associée à une probabilité plus élevée d’activité antioxydante, car de nombreux polyphénols possèdent des propriétés antioxydantes. Ainsi, le QTP peut servir d’indicateur préliminaire de la présence de polyphénols dans l’échantillon, mais la confirmation de l’activité antioxydante nécessite des tests d’activité antioxydante. Les polyphénols sont une classe de composés chimiques largement répandus dans la nature, que l’on trouve dans les aliments, les plantes, les fruits, les légumes et les algues. Il existe différentes méthodes pour quantifier les polyphénols totaux, et la méthode de Folin-Ciocalteu est l’une des plus utilisées. Le QTP donne une mesure générale de la concentration en polyphénols, mais ne précise pas les composés polyphénoliques individuels présents dans l’échantillon. Il s’agit donc d’une méthode quantitative mais pas qualitative. De plus, il est important de considérer que différents polyphénols ont des capacités antioxydantes et des activités biologiques différentes, de sorte que le QTP ne fournit pas d’informations détaillées sur les propriétés fonctionnelles spécifiques des polyphénols présents.

Chaque méthode a ses avantages et ses limites, et le choix d’un essai donné dépend des caractéristiques du composé étudié et de l’objectif de l’analyse. Il est important de suivre les instructions spécifiques de chaque méthode pour garantir des résultats fiables et comparables. Lors de la détermination de la capacité antioxydante, certaines des étapes critiques courantes comprennent, tout d’abord, la préparation de l’échantillon. Il est important de préparer correctement les échantillons, en veillant à ce que des concentrations adéquates soient obtenues et en évitant la contamination. Il s’agit de peser avec précision les composés ou les extraits et de les dissoudre dans des solvants appropriés. Il est également important de tenir compte de la stabilité des composés et des extraits pendant le processus de préparation, de stockage et de manipulation. Tous les réactifs utilisés dans les tests d’activité antioxydante doivent être correctement préparés et normalisés pour assurer la reproductibilité des résultats. Il s’agit de la préparation correcte de l’étalon d’acide gallique et de la précision des volumes. Le temps de réaction est un aspect essentiel pour obtenir des résultats précis dans les tests d’antioxydants. Il est nécessaire d’optimiser le temps d’incubation pour assurer une réaction complète entre le composé antioxydant et le radical libre. Un temps insuffisant peut conduire à une sous-estimation de l’activité antioxydante, tandis qu’un temps excessif peut entraîner une dégradation des composés ou une interférence des réactions secondaires. De plus, la température pendant les tests doit être contrôlée avec précision et cohérence. La température influence la vitesse des réactions chimiques et peut affecter les résultats. Il est important de suivre les conditions de température recommandées par les méthodes spécifiques et d’assurer la stabilité de la température tout au long de la procédure. L’inclusion de contrôles appropriés est essentielle pour valider les résultats des tests antioxydants. Il peut s’agir de témoins positifs (composés connus pour avoir une activité antioxydante) et de témoins négatifs (échantillons sans activité antioxydante). Les contrôles fournissent une base de comparaison pour l’interprétation des résultats et permettent de s’assurer de l’exactitude des données obtenues. Pour obtenir des résultats fiables, il est recommandé d’effectuer des tests d’activité antioxydante sur des répétitions et de répéter l’expérience plusieurs fois pour augmenter la signification des données et obtenir des résultats plus fiables et robustes.

Les méthodes de test de l’activité antioxydante ont certaines limites qui doivent être prises en compte lors de l’interprétation des résultats, à savoir le fait que, dans les milieux liquides, elles peuvent ne pas saisir pleinement la complexité des systèmes biologiques et des interactions entre différents composés, le large éventail de réactions antioxydantes qui peuvent se produire, le métabolisme cellulaire et les facteurs environnementaux qui peuvent influencer l’activité antioxydante. Il convient donc d’utiliser différents tests. Il faut également être conscient de l’absence de corrélation directe avec les avantages pour la santé ; Bien que l’activité antioxydante soit souvent associée à des bienfaits pour la santé, cela ne se traduit pas toujours directement par des avantages pour la santé des organismes vivants en raison de nombreux autres facteurs, tels que la biodisponibilité, le métabolisme et les interactions avec d’autres systèmes biologiques.

Il est important de garder à l’esprit que les tests d’activité antioxydante sont des outils utiles pour l’évaluation initiale du potentiel antioxydant des composés et des extraits, mais ne doivent pas être considérés comme un indicateur définitif des effets biologiques ou des avantages pour la santé. Des études supplémentaires sont nécessaires pour bien comprendre l’impact des antioxydants sur le corps.

Bien que les méthodes de test de l’activité antioxydante en milieu liquide soient largement utilisées dans la recherche et présentent leurs avantages et leurs limites, par rapport aux alternatives, ces méthodes peuvent être considérées comme bonnes en termes de praticité, de rapidité, de coût et de facilité de mise en œuvre. L’un des principaux avantages est la simplicité et la rapidité des procédures et leur adéquation à la recherche initiale, au criblage de composés et aux études à grande échelle. Ces méthodes sont relativement rapides à réaliser et peuvent fournir des résultats en peu de temps, de manière plus abordable, et nécessitent moins d’équipement spécialisé par rapport à d’autres méthodes.

Les algues sont connues pour leur capacité à produire des composés bioactifs, y compris des antioxydants, qui peuvent avoir des propriétés bénéfiques pour la santé⁴³. Les extraits d’algues peuvent être préparés à partir de différentes parties de l’algue et peuvent être obtenus à l’aide de différents solvants, tels que l’eau, l’éthanol, le méthanol ou l’acétone, entre autres. Il est important de se rappeler que l’activité antioxydante des extraits d’algues peut varier en fonction de plusieurs facteurs, tels que l’espèce d’algue, la méthodologie d’extraction et la concentration des composés bioactifs présents. Par conséquent, il est recommandé d’effectuer des tests d’activité antioxydante sur des répétitions et d’effectuer des comparaisons avec des témoins appropriés pour obtenir des résultats plus fiables. Ces méthodes peuvent être utilisées comme outil initial dans le criblage et la sélection d’extraits d’algues ayant un potentiel antioxydant pour des études ultérieures.

Le test MTT est une technique largement utilisée pour une évaluation préliminaire des effets cytotoxiques in vitro de substances à usage humain et animal. Cependant, bien qu’il s’agisse de la méthode la plus utilisée pour tester la cytotoxicité, la conversion du MTT en cristaux de formazan est influencée par de nombreux facteurs tels que le taux métabolique et le nombre de mitochondries, et elle n’est applicable qu’aux cibles cellulaires adhérentes¹⁴. Les principales étapes critiques du protocole décrit ici sont liées à l’apparition éventuelle de contaminations de cultures cellulaires, à la croissance indésirable de cellules HaCaT et à un faible pourcentage de confluence cellulaire. Il existe d’autres méthodes, telles que la lactate déshydrogénase (LDH), l’adénosine triphosphate (ATP) et les tests de formation de colonies pour mesurer la cytotoxicité. Cependant, tous ont des avantages et des contraintes. Ghasemi et al. (2021)⁴⁴ ont évalué l’effet de plusieurs variables sur les mesures du test MTT sur une lignée cellulaire de cancer de la prostate (PC-3). Des facteurs tels que la densité d’ensemencement cellulaire, la concentration de MTT, le temps d’incubation après l’ajout de MTT, la privation de sérum, la composition des milieux de culture cellulaire, le contenu intracellulaire libéré et l’extrusion de formazan dans l’espace extracellulaire ont été analysés. À partir de cette étude, ces auteurs ont formulé des recommandations utiles sur la façon d’appliquer le test et une perspective sur les domaines où l’utilité du test est un outil puissant, mais aussi sur les endroits où il a des limites. Néanmoins, le test MTT est une méthodologie rapide, très sensible et facile qui peut être appliquée comme évaluation préliminaire de la cytotoxicité de nombreuses substances avec une application potentielle dans les domaines thérapeutiques, alimentaires, alimentaires, agricoles et environnementaux. En particulier, l’analyse MTT effectuée ici a montré que l’éthanol et les extraits aqueux de G. gracilis , dans les concentrations dosées, n’affectaient pas la viabilité des kératinocytes et peuvent procéder à des essais in vivo pour s’assurer qu’ils sont totalement sûrs pour l’utilisation cutanée humaine.

L’utilisation des ressources marines dans les produits alimentaires a, une fois de plus, montré son potentiel non seulement pour obtenir des produits à valeur ajoutée nutritionnelle, mais aussi pour trouver des produits de marque plus propre. L’ajout de G. gracilis entier (pâtes) ou d’extrait (comme colorant alimentaire) présente un potentiel de marché, et son application pourrait être l’une des stratégies permettant aux entreprises de se démarquer sur le marché, de satisfaire les besoins nutritionnels des consommateurs et de suivre les tendances de leur marché.

Lorsque des algues ont été ajoutées aux formulations de pâtes, il a d’abord été constaté que la structure était altérée et qu’il n’était pas possible d’obtenir les formes de pâte souhaitées. Nous avons dû relever le défi d’ajuster les quantités et d’ajouter d’autres ingrédients qui n’avaient pas été prévus auparavant, dans le but de conserver la texture des pâtes. Outre la quantité appropriée de chaque ingrédient, la méthode d’extrusion a été adaptée tout au long du développement des pâtes. En dehors de cette difficulté, le développement de nouveaux produits repose sur trois principes fondamentaux : le produit doit être sensoriel (texture, saveur, odeur) ; le produit doit avoir une valeur nutritionnelle ajoutée ; Et il doit utiliser au maximum des ingrédients et des méthodologies durables. En ce sens, un autre défi majeur est l’utilisation du panel sensoriel pour obtenir la formulation la plus attrayante. La plupart des analyses physico-chimiques réalisées sur les pâtes étaient déjà optimisées pour les matrices alimentaires ; Cependant, dans ce travail, la préparation de l’échantillon a été optimisée afin qu’elle puisse être appliquée efficacement à toutes les méthodes d’analyse.

En ce qui concerne l’utilisation du pigment de G. gracilis comme colorant, un produit réfrigéré a été choisi en raison de la sensibilité thermique de ce type de molécule⁴⁵. Étant donné que la préparation du yogourt implique un traitement thermique, le pigment a été ajouté au produit final. Le mélange du pigment dans le yogourt a permis d’obtenir un produit légèrement plus fluide que le témoin sans pigment. En fait, à la fin du test du triangle, certains panélistes ont fait remarquer que la seule différence entre les échantillons était la texture. Il s’agit d’un bon résultat puisque l’objectif principal du test triangulaire était de vérifier s’il y avait des différences notables entre le yogourt avec et sans pigment, en particulier les différences de goût et d’odeur, car les extraits d’algues peuvent conférer un goût/une odeur désagréable aux produits alimentaires. Il s’agissait d’une étude préliminaire impliquant un petit groupe semi-formé. Dans d’autres études, un plus grand nombre de dégustateurs devrait être envisagé pour obtenir des résultats plus fiables sur le marché. En ce qui concerne l’évaluation de la stabilité des pigments dans le yogourt, d’autres études pourraient inclure l’évaluation d’autres propriétés physico-chimiques du yogourt avec pigment au fil du temps, telles que le pH, l’activité de l’eau (aw) et la texture. Une évaluation sensorielle au fil du temps serait également souhaitable.

En conclusion, les protocoles décrits ici mettent en évidence le potentiel de l’algue rouge G. gracilis en tant que source d’ingrédients pour développer de nouveaux produits ayant des applications potentielles dans les industries pharmaceutiques, dermocosmétiques et alimentaires. De plus, la biomasse résiduelle post-extraite reste un matériau précieux à appliquer comme biostimulant de la croissance des plantes, enrichissement du sol, alimentation des poissons ou matière première pour obtenir du biochar et/ou des carbones fonctionnalisés à des fins de purification de l’eau. L’approche de bioraffinage décrite ici peut être appliquée à d’autres espèces d’algues, favorisant ainsi une économie circulaire bleue et la durabilité environnementale.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute Ethanol	Aga, Portugal	64-17-5
Ammonium Chloride	PanReac	12125-02-9
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	1397-89-3
Analytical scale balance	Sartorius, TE124S	22105307
Bacillus subtilis subsp. spizizenii	German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)	DSM 347
Biotin	Panreac AppliChem	58-85-5
Centrifuge	Eppendorf, 5810R	5811JH490481
Chloramphenicol	PanReac	56-75-7
CO2 Chamber	Memmert	N/A
Cool White Fluorescent Lamps	OSRAM Lumilux Skywhite	N/A
Densitometer McFarland	Grant Instruments	N/A
DMEM medium	Sigma-Aldrich	D5796
DMSO	Sigma-Aldrich	67-68-5
DPPH	Sigma, Steinheim, Germany	1898-66-4
Escherichia coli (DSM 5922)	German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)	DSM5922
Ethanol 96%	AGA-Portugal	64-17-5
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA)	J.T.Baker	6381-92-6
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524
Filter Paper (Whatman No.1)	Whatman	WHA1001320
Flasks	VWR International, Alcabideche, Portugal	N/A
Folin-Ciocalteu	VWR Chemicals	31360.264
Gallic Acid	Merck	149-91-7
Germanium (IV) Oxide, 99.999%	AlfaAesar	1310-53-8
HaCaT cells – 300493	CLS-Cell Lines Services, Germany	300493
Hot Plate Magnetic Stirrer	IKA, C-MAG HS7	06.090564
Iron Sulfate	VWR Chemicals	10124-49-9
Laminar flow hood	TelStar, Portugal	526013
LB Medium	VWR Chemicals	J106
Listonella anguillarum	German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)	DSM 21597
Manganese Chloride	VWR Chemicals	7773.01.5
Micropipettes	Eppendorf, Portugal	N/A
Microplates	VWR International, Alcabideche, Portugal	10861-666
Microplates	Greiner	738-0168
Microplates (sterile)	Fisher Scientific	10022403
Microplate reader	Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA	1611151E
MTT	Sigma-Aldrich	289-93-1
Muller-Hinton Broth (MHB)	VWR Chemicals	90004-658
Oven	Binder, FD115	12-04490
Oven	Binder, BD115	04-62615
Penicillin	Sigma-Aldrich	1406-05-9
pH meter Inolab	VWR International, Alcabideche, Portugal	15212099
Pippete tips	Eppendorf, Portugal	5412307
Pyrex Bottles Media Storage	VWR International, Alcabideche, Portugal	16157-169
Rotary Evaporator	Heidolph, Laborota 4000	80409287
Rotavapor	IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal	07.524254
Sodium Carbonate (Na2CO3)	Chem-Lab	497-19-8
Sodium Chloride (NaCl)	Normax Chem	7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic	Riedel-de Haën	7558-79-4
SpectraMagic NX	Konica Minolta, Japan		color data analysis software
Spectrophotometer	Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA	5A4T092004
Streptomycin	Sigma-Aldrich	57-92-1
Thiamine	Panreac AppliChem	59-43-8
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049
Tryptic Soy Agar (TSA)	VWR Chemicals	ICNA091010617
Tryptic Soy Broth (TSB)	VWR Chemicals	22091
Ultrapure water	Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany	F5HA17360B
Vacuum pump	Buchi, Switzerland	FIS05-402-103
Vitamin B12	Merck	68-19-9