Valorizzazione dell'alga rossa Gracilaria gracilis attraverso un approccio di bioraffineria

Summary

In questo articolo descriviamo diversi protocolli che mirano ad una valorizzazione integrata della Gracilaria gracilis: la raccolta di specie selvatiche, la crescita interna e l'estrazione di ingredienti bioattivi. Vengono valutati gli effetti antiossidanti, antimicrobici e citotossici degli estratti, insieme alla valutazione nutrizionale e della stabilità degli alimenti arricchiti con biomassa e pigmenti di alghe intere.

Abstract

L'interesse per le alghe marine come materia prima abbondante per ottenere ingredienti bioattivi preziosi e multitarget è in continua crescita. In questo lavoro, esploriamo il potenziale della Gracilaria gracilis, un'alga rossa commestibile coltivata in tutto il mondo per il suo interesse commerciale come fonte di agar e altri ingredienti per applicazioni cosmetiche, farmacologiche, alimentari e mangimistiche.

Le condizioni di crescita di G. gracilis sono state ottimizzate attraverso la propagazione vegetativa e la sporulazione, manipolando le condizioni fisico-chimiche per ottenere un ampio stock di biomassa. Le metodologie di estrazione verde con etanolo e acqua sono state eseguite sulla biomassa delle alghe. Il potenziale bioattivo degli estratti è stato valutato attraverso una serie di saggi in vitro riguardanti la loro citotossicità, le proprietà antiossidanti e antimicrobiche. Inoltre, la biomassa di alghe essiccate è stata incorporata nelle formulazioni della pasta per aumentare il valore nutrizionale degli alimenti. I pigmenti estratti da G. gracilis sono stati anche incorporati nello yogurt come colorante naturale ed è stata valutata la loro stabilità. Entrambi i prodotti sono stati sottoposti all'apprezzamento di un panel sensoriale semi-addestrato con l'obiettivo di ottenere la migliore formulazione finale prima di raggiungere il mercato.

I risultati confermano la versatilità di G. gracilis sia che venga applicato come biomassa intera, estratti e/o pigmenti. Attraverso l'implementazione di diversi protocolli ottimizzati, questo lavoro consente lo sviluppo di prodotti con il potenziale di profitto nei mercati alimentare, cosmetico e dell'acquacoltura, promuovendo la sostenibilità ambientale e un'economia circolare blu.

Inoltre, e in linea con un approccio di bioraffineria, la biomassa residua di alghe marine sarà utilizzata come biostimolante per la crescita delle piante o convertita in materiali di carbonio da utilizzare nella purificazione delle acque dei sistemi di acquacoltura interni del MARE-Politecnico di Leiria, in Portogallo.

Introduction

Le alghe possono essere considerate un'interessante materia prima naturale da trarre profitto dai settori farmaceutico, alimentare, dei mangimi e ambientale. Biosintetizzano una panoplia di molecole, molte delle quali non presenti negli organismi terrestri, con proprietà biologiche rilevanti ^1,2. Tuttavia, è necessario implementare protocolli di coltivazione ottimizzati per le alghe marine per garantire un ampio stock di biomassa.

I metodi di coltivazione devono sempre tenere conto della natura dei talli delle alghe e della morfologia complessiva. Gracilaria gracilis è un taxon clonale, il che significa che l'organo di attacco produce più assi vegetativi. Si ottiene così la propagazione per frammentazione (riproduzione vegetativa), in quanto ciascuno di questi assi è pienamente in grado di adottare una vita indipendente dal tallo principale³. I taxa clonali possono essere integrati con successo con metodologie di coltivazione semplici e veloci in un solo passaggio, poiché grandi quantità di biomassa si ottengono dividendo il tallo in piccoli frammenti che si rigenerano rapidamente e crescono in nuovi individui geneticamente identici. In questo processo possono essere utilizzati sia talli aplontici che diplonti. Sebbene il genere presenti un complesso ciclo vitale trifasico isomorfo aplo-diplontico, la sporulazione è raramente necessaria, tranne quando è necessario il rinnovamento genetico dei ceppi per ottenere raccolti migliori. In questo caso, sia le tetraspore (spore aplontiche formate dalla meiosi) che le carpospore (spore diplontiche formate dalla mitosi) danno origine a talli macroscopici che possono poi essere cresciuti e propagati per riproduzione vegetativa⁴. I cicli di crescita sono dettati dalle condizioni ambientali e dallo stato fisiologico degli individui, tra gli altri fattori biologici come l'emergere di epifite e l'adesione di altri organismi. Pertanto, l'ottimizzazione delle condizioni di coltivazione è fondamentale per garantire un'elevata produttività e produrre biomassa di buona qualità⁵.

L'estrazione di composti bioattivi dalle alghe, tra cui G. gracilis, può essere ottenuta attraverso vari metodi ^6,7. La scelta del metodo di estrazione dipende dai composti specifici di interesse, dall'applicazione target e dalle caratteristiche dell'alga. In questo studio, ci siamo concentrati sull'estrazione con solvente, che prevede l'utilizzo di solventi verdi, come acqua o etanolo, per sciogliere ed estrarre composti bioattivi dalla biomassa delle alghe. L'estrazione può essere effettuata tramite macerazione in modo versatile ed efficace e può essere utilizzata per una vasta gamma di composti. Si tratta di un metodo semplice e ampiamente utilizzato che prevede l'immersione della biomassa in un solvente per un periodo prolungato, in genere a temperatura ambiente o leggermente elevata. Il solvente viene mescolato per migliorare il processo di estrazione. Dopo il tempo di estrazione desiderato, il solvente viene separato dal materiale solido mediante filtrazione o centrifugazione.

L'acqua è un solvente comunemente usato nelle applicazioni alimentari grazie alla sua sicurezza, disponibilità e compatibilità con un'ampia gamma di prodotti alimentari. L'estrazione dell'acqua è adatta per composti polari come polisaccaridi, peptidi e alcuni fenolici. Tuttavia, potrebbe non estrarre efficacemente composti non polari. L'etanolo è anche un solvente ampiamente utilizzato nelle applicazioni alimentari e può essere efficace per estrarre una varietà di molecole bioattive, inclusi composti fenolici, flavonoidi e alcuni pigmenti. L'etanolo è generalmente riconosciuto come sicuro per l'uso negli alimenti e può essere facilmente evaporato, lasciando dietro di sé i composti estratti. Vale la pena notare che la scelta del metodo di estrazione dovrebbe considerare fattori come l'efficienza, la selettività, l'economicità e l'impatto ambientale. L'ottimizzazione dei parametri di estrazione, come la concentrazione del solvente, il tempo di estrazione, la temperatura e la pressione, è fondamentale per ottenere rese ottimali di composti bioattivi da G. gracilis o da altre alghe.

È stato riscontrato che le alghe mostrano attività antimicrobica contro un'ampia gamma di microrganismi, tra cui batteri, funghi e virus⁸. Questa attività è attribuita a componenti bioattivi, tra cui fenolici, polisaccaridi, peptidi e acidi grassi. Diversi studi hanno dimostrato la loro efficacia contro agenti patogeni come Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. e Pseudomonas aeruginosa, tra gli altri⁹. L'attività antimicrobica delle alghe è attribuita alla presenza di composti bioattivi che possono interferire con le pareti cellulari microbiche, le membrane, gli enzimi e le vie di segnalazione¹⁰. Questi composti possono interrompere la crescita microbica, inibire la formazione di biofilm e modulare le risposte immunitarie.

Le alghe rosse, note anche come rodofite, sono un gruppo di alghe che possono esibire attività antimicrobica contro una varietà di microrganismi. All'interno di questo gruppo, G. gracilis contiene vari composti bioattivi che possono contribuire alla sua attività antimicrobica segnalata. Mentre le molecole specifiche possono variare, le classi comuni che sono state riportate in G. gracilis e che possono possedere proprietà antimicrobiche sono polisaccaridi, fenolici, terpenoidi e pigmenti¹¹. Tuttavia, è importante notare che la presenza e la quantità di questi componenti possono variare a seconda di fattori come il luogo di raccolta delle alghe, la stagionalità, le condizioni fisiologiche dei talli e le condizioni ambientali. Pertanto, la classe specifica e la concentrazione di composti antimicrobici in G. gracilis possono variare di conseguenza.

È stato anche scoperto che G. gracilis ha proprietà antiossidanti, contenendo vari composti fenolici, che hanno dimostrato di eliminare i radicali liberi e ridurre lo stress ossidativo¹².Gli antiossidanti aiutano a proteggere le cellule dai danni causati dalle specie reattive dell'ossigeno e hanno potenziali benefici per la salute. La capacità antiossidante può essere valutata direttamente attraverso diversi metodi, tra cui l'attività di scavenging dei radicali liberi 2,2-difenil-1-picrilidrazile (DPPH) e, indirettamente, attraverso la quantificazione del contenuto polifenolico totale (TPC)¹³.

Anche se un ingrediente ha una bioattività prominente, la sua valutazione della citotossicità è indispensabile per valutare le sostanze naturali e sintetiche da utilizzare a contatto con cellule o tessuti viventi. Esistono diversi metodi per misurare la citotossicità, ognuno con vantaggi e limiti. Nel complesso, offrono una serie di opzioni per valutare gli effetti nocivi di molte sostanze sulle cellule e, allo stesso tempo, per studiare i meccanismi del danno e della morte cellulare¹⁴.

In questo lavoro, utilizziamo il saggio del bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), un metodo colorimetrico introdotto da Mosmann (1983)¹⁵. Questo metodo misura la riduzione dei sali di tetrazolio a un prodotto di formazano viola da parte di cellule metabolicamente attive. Maggiore è la quantità di cristalli di formazano, maggiore è il numero di cellule vitali, fornendo così una misura indiretta della citotossicità¹⁴. Poiché in questo lavoro l'acqua di G. gracilis e gli estratti di etanolo sono destinati ad essere incorporati in formulazioni dermocosmetiche, la valutazione della citotossicità in vitro viene eseguita in una linea cellulare di cheratinociti (HaCaT).

Per quanto riguarda l'applicazione alimentare, le alghe sono generalmente povere di calorie e nutrizionalmente ricche di fibre alimentari, elementi essenziali e aminoacidi, polisaccaridi, acidi grassi polinsaturi, polifenoli e vitamine ^2,16. G. gracilis non fa eccezione, avendo un interessante valore nutrizionale. Freitas et al. (2021)⁴ hanno scoperto che G. gracilis coltivato aveva livelli più elevati di proteine e vitamina C e manteneva il livello di lipidi totali rispetto alle alghe selvatiche. Questo può rappresentare un vantaggio economico e ambientale, in quanto dal punto di vista nutrizionale la produzione è preferibile allo sfruttamento delle risorse selvatiche. Inoltre, i consumatori sono sempre più preoccupati per il tipo di cibo che mangiano, quindi è importante introdurre nuovi ingredienti per l'arricchimento alimentare e utilizzare nuove risorse per ottenere estratti che possano aggiungere valore a un prodotto e rivendicare una "clean label". Inoltre, il mercato attuale è molto competitivo e richiede lo sviluppo di nuovi prodotti e strategie innovative per differenziare i produttori dai loro concorrenti¹⁷.

L'arricchimento di prodotti a basso valore nutrizionale, come la pasta, con risorse marine, tra cui le alghe, è una strategia per introdurre questa risorsa come nuovo alimento e una strategia di differenziazione del mercato attraverso un prodotto con un valore nutrizionale distinto. D'altra parte, G. gracilis è una fonte di pigmenti rossi naturali come le ficobiliproteine¹⁸, con un alto potenziale per applicazioni nell'industria alimentare. Quest'alga ha mostrato un grande interesse in diverse aree e la sua applicazione può essere effettuata utilizzando l'alga intera, gli estratti e/o la biomassa rimanente. In questo lavoro, dimostriamo alcuni esempi di tali applicazioni.

Protocol

1. Raccolta e preparazione della biomassa

1. Raccogli gli esemplari di G. gracilis durante la bassa marea e trasportali rapidamente in laboratorio in scatole buie e refrigerate per evitare l'essiccazione, la luce e l'esposizione all'aria.
2. In laboratorio, lavare ogni tallo con acqua di mare corrente e pulire accuratamente per rimuovere detriti, parti necrotiche, epifite e altri organismi dalla superficie.
3. Mantenere la biomassa selvatica in acqua di mare costantemente aerata (31-35 psu) in una stanza climatica (20 ± 1 °C) con basso irraggiamento fornito da luce diurna, bianco freddo e lampade fluorescenti e fotoperiodo impostato alle 16:08 (chiaro: scuro) per 7 giorni. Durante questo periodo, non fornire alcun mezzo nutritivo; Ciò consente alle alghe di adattarsi lentamente alle nuove condizioni interne.

2. Manutenzione delle scorte

1. Dopo il periodo di acclimatazione, tagliare le punte sane dei talli di alghe con una lama sterile. Seguendo Redmond et al. (2014)¹⁹ e in condizioni sterili, trascinare ogni punta attraverso un gel di agar precedentemente preparato in piastre di Petri (1,0% agar batteriologico, in rapporto 1:1 acqua distillata/acqua di mare) per rimuovere eventuali contaminanti rimanenti. Eseguire il trascinamento dell'agar tre volte per ogni punta e trascinare sempre la punta attraverso le porzioni inutilizzate del gel di agar.
2. Lavare con acido la vetreria in una soluzione di acido cloridrico (HCl, 15%) e risciacquare accuratamente con acqua distillata. Sterilizzare tutti gli strumenti, la vetreria, l'agar, l'acqua di mare e l'acqua distillata utilizzati nel processo di pulizia in autoclave (121 °C, 15 min).
   ATTENZIONE: Vedere la scheda di sicurezza dell'HCl fornita dal fornitore.
3. Le punte crescono in acqua di mare sterilizzata a 35 psu, integrata con soluzione arricchita di Von Stosch (VSE) modificata per le alghe rosse, secondo Redmond et al. (2014)¹⁹. Aggiungere biossido di germanio (GeO₂ ) al terreno (1 mL/L) per prevenire la crescita di diatomee epifite.
   ATTENZIONE: Vedere la scheda di sicurezza di GeO₂ fornita dal fornitore.
   NOTA: Le punte che mostrano perdita di pigmentazione, come osservato da uno scolorimento parziale o totale, sono sotto stress o sono già morte e dovrebbero essere scartate.

3. Coltivazione e scale-up

1. Dopo il periodo di acclimatazione, distribuire in modo casuale circa 8-10 puntali sani in palloni a fondo piatto da 250 mL in una camera climatica impostata a 20 ± 1 °C con la luce fredda bianca di 20 ± 0,5 μmol di fotoni ^{m-2 s-1} (1500 lux), un fotoperiodo impostato a 16 h: 8 h (chiaro: scuro) e acqua di mare sterile arricchita con terreni di coltura VSE rinnovati ogni settimana.
2. Eseguire misurazioni settimanali del peso, evitando di sforzare eccessivamente i talli²⁰. Per questo, rimuovere con cura le punte dal terreno di coltura, sciacquare delicatamente e pesare i milligrammi su una bilancia da laboratorio.
   NOTA: Questa procedura può essere eseguita insieme al rinnovo settimanale del terreno di coltura.
3. I talli possono crescere in questi palloni fino a una densità di 2 g/L. A questo punto, eseguire uno scale-up del destinatario (250 mL, 1 L e 5 L). Trasferite la coltivazione in contenitori bianchi aperti all'aperto da 50 L e più grandi quando il volume raggiunge i 5 L.
4. Calcolare il tasso di crescita relativo (RGR) secondo Patarra et al. (2017)²¹ :
   RGR (% fw/giorno) = ([Ln (fw) - Ln (iw)]/t) x 100
   dove iw e fw sono rispettivamente il peso fresco iniziale e finale, espressi in grammi, e t è il tempo in giorni.
   NOTA: In questa configurazione di laboratorio, l'RGR raggiunge valori fino al 21% al giorno. La raccolta della biomassa può essere effettuata in qualsiasi momento. La biomassa deve essere lavorata rapidamente per evitare la degradazione mediante essiccazione in forno, liofilizzazione o semplicemente congelata (-20 °C), a seconda dell'uso previsto. La biomassa essiccata può essere conservata a temperatura ambiente (RT) o conservata anche congelata.

4. Procedura di estrazione

NOTA: Per valutare la citotossicità, le proprietà antiossidanti e antimicrobiche in vitro degli estratti di G. gracils , la sua preparazione considera due diversi parametri: la temperatura di estrazione e il tipo di solvente.

1. Per effettuare le estrazioni, essiccare in forno la biomassa di G. gracilis e macinare la biomassa (ad esempio, in un macinacaffè domestico) fino a quando la polvere non passa attraverso un setaccio da 200 μm.
2. Pesare la biomassa essiccata (10 g) e scioglierla in 100 mL di solvente (etanolo assoluto o acqua sterile).
3. Mescolare in un recipiente al riparo dalla luce per 30 min.
4. Eseguire estrazioni sequenziali di etanolo > acqua e acqua > etanolo a RT, 40 °C e 70 °C.
5. Per ogni temperatura, eseguire le estrazioni con etanolo e acqua separatamente due volte.
6. Separare gli estratti liquidi dalla biomassa rimanente mediante filtrazione attraverso carta da filtro (Whatman No.1), seguita da centrifugazione a 8000 x g per 10 min a RT.
7. Riutilizzare la biomassa algale rimanente per un'ulteriore estrazione con l'altro solvente. Se un campione è stato estratto prima con etanolo, estrarlo successivamente con acqua e viceversa.
8. Liofilizzare gli estratti acquosi ed evaporare gli estratti di etanolo in un evaporatore rotante a 40 °C.
9. Conservare gli estratti secchi a 4 °C.
10. Sciogliere gli estratti a una concentrazione di 50 mg/mL (saggi antimicrobici) o 10 mg/mL (saggi antiossidanti). Sciogliere gli estratti acquosi in acqua sterile e gli estratti etanolici in etanolo assoluto.

5. Attività antimicrobica

NOTA: Gli estratti etanolici e acquosi devono essere testati singolarmente contro Bacillus subtilis subsp . spizizenii (DSM 347), Escherichia coli (DSM 5922) e Listonella anguillarum (DSM 21597). I test antimicrobici devono essere eseguiti secondo le raccomandazioni del National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2012)²². Tutte le colture sono state ottenute dalla Collezione tedesca di microrganismi e colture cellulari (DSMZ). L. anguillarum è stato coltivato su brodo di soia triptico (TSB) o agar di soia triptico (TSA) integrato con cloruro di sodio (NaCl) all'1%. I restanti due ceppi sono stati coltivati su terreno LB (VWR Chemicals). Le colture di Bacillus subtilis subsp . spizizenii (DSM 347) e Listonella anguillarum (DSM 21597) sono state incubate a 30 °C, mentre Escherichia coli (DSM 5922) è stata incubata a 37 °C, secondo le istruzioni del fornitore. Il metodo di microdiluizione del brodo può essere utilizzato per la determinazione dell'attività antimicrobica in un mezzo liquido, e questo dovrebbe essere effettuato su microscala, consentendo di determinare il potenziale antimicrobico in modo rapido ed efficiente. Questo metodo a basso costo permette di ottenere risultati in sole 24 h, risultando quindi adatto a determinare, in una fase precoce, le migliori condizioni di estrazione che permettono, per un determinato ceppo microbico, di ottenere risultati in termini di azione inibitoria della crescita. Tuttavia, la metodologia richiede l'uso di micropiastre sterili con un coperchio specifico per la crescita microbica, nonché la disponibilità di un lettore di micropiastre per la lunghezza d'onda di 600 nm.

1. Eseguire i test di microdiluizione del brodo utilizzando micropiastre a 96 pozzetti non trattate e a fondo tondo con 170 μL di Brodo Muller-Hinton (MHB), inoculati con 10 μL di inoculo standardizzato (a 0,5 standard McFarland) e 20 μL di ciascun estratto (50 mg/mL).
2. Incubare le piastre per 24 ore alla temperatura ottimale per ogni ceppo.
3. Rilevare l'attività antimicrobica mediante la riduzione della torbidità visibile misurata registrando la densità ottica (OD ₆₀₀) in uno spettrofotometro per micropiastre, a 0 h e 24 h.
4. Esprimere i risultati in percentuale di inibizione:
   
   dove Abs. ext è la differenza nell'assorbanza misurata, tra 0 h e 24 h, nei pozzetti che contengono ceppi batterici che crescono in presenza dell'estratto, e Abs si riferisce alla stessa misura nei pozzetti che contengono il ceppo batterico e il solvente.
5. In questo metodo, includere reazioni di controllo, con pozzetti contenenti solo terreno di coltura che sarà il controllo negativo, ma anche pozzetti con terreno inoculato con il ceppo standard aggiunto al solvente (etanolo o acqua) e terreno con il ceppo batterico e l'antibiotico di controllo positivo (cloramfenicolo).

6. Attività antiossidante e quantificazione dei polifenoli totali

1. Contenuto polifenolico totale
   NOTA: Il contenuto polifenolico totale (TPC) viene effettuato con il metodo Folin-Ciocalteu²³ e adattato alla microscala.
   1. Aggiungere a ciascun pozzetto di una micropiastra a 96 pozzetti, protetta dalla luce, 158 μL di acqua ultrapura, 2 μL del campione e 10 μL di reagente Folin-Ciocalteu.
      ATTENZIONE: Vedere la scheda di sicurezza del reagente Folin-Ciocalteu fornito dal fornitore.
   2. Dopo 2 minuti, aggiungere 30 μL di Na₂CO₃ (20%).
   3. Dopo l'incubazione al buio a RT per 1 ora, misurare i campioni spettrofotometricamente a 755 nm.
   4. Utilizzare l'acido gallico (che consente di tracciare la curva di calibrazione) o l'acqua ultrapura (2 μL) come controlli.
   5. Esprimere i risultati come equivalenti di acido gallico (mg di estratto GAE/g).
2. Attività di scavenging dei radicali 2,2 difenil-1-picrilidrazile (DPPH)
   NOTA: L'attività antiossidante degli estratti è valutata come descritto da Duan et al. (2006)²⁴, adattata alla microscala
   1. In una micropiastra a 96 pozzetti protetta dalla luce, posizionare 2 μL di ciascun campione (a una concentrazione di 10 mg/mL) e 198 μL di DPPH disciolto in etanolo assoluto (0,1 mM).
      ATTENZIONE: Vedere la scheda di sicurezza del DPPH fornita dal fornitore.
   2. Eseguire la reazione per 30 minuti a RT al buio. Misurare l'assorbanza a 517 nm in uno spettrofotometro per micropiastre.
   3. Eseguire una reazione di controllo con 2 μL di etanolo assoluto/acqua distillata e 198 μL di soluzione DPPH. Eseguire una misurazione in bianco con 2 μL di estratto e 198 μL di etanolo assoluto.
   4. Esprimere i risultati come percentuale di inibizione del DPPH utilizzando la seguente equazione:
      
      dove As è l'assorbanza dell'estratto algale, Ab è l'assorbanza dei campioni bianchi e Ac è l'assorbanza del controllo.

7. Valutazione della citotossicità nelle cellule epidermiche

NOTA: L'effetto citotossico in vitro degli estratti acquosi ed etanolici di G. gracilis è valutato nei cheratinociti umani (cellule HaCaT - 300493) attraverso il test colorimetrico MTT come descritto^{in precedenza 25}. Le cellule sono state acquisite da Cell Lines Services, Germania (CLS) e il metodo è stato eseguito in conformità con le linee guida istituzionali e le istruzioni CLS.
ATTENZIONE: Vedere la scheda di sicurezza di MTT fornita dal fornitore)

1. Mantenimento delle colture cellulari
   1. Colture di cellule HaCaT nel terreno ad alto contenuto di glucosio (DMEM) di Dulbecco Modified Eagle integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di soluzione antibiotica/antimicotica (amfotericina B, 0,25 mM; penicillina, 60 mM; streptomicina, 100 mM).
   2. Usa la tripsina-EDTA per dissociare le cellule.
      NOTA: La sottocoltura delle cellule HaCaT viene eseguita dopo che le cellule hanno raggiunto la confluenza totale.
   3. Coltivare le cellule in una camera a 37 °C con il 5% di CO₂ e il 95% di umidità.
   4. Subcoltura delle cellule secondo le istruzioni della biobanca ogni volta che le colture raggiungono l'80%-85% di confluenza.
2. Valutazione della citotossicità
   1. Dopo aver seminato le cellule in piastre da 96 pozzetti e l'incubazione per una notte, trattare le cellule HaCaT (4 x 10⁴ cellule/pozzetto) con gli estratti secchi precedentemente disciolti in DMSO (100 mg/mL). Quindi, aggiungere 2 μL della soluzione di estratto a 198 μL di terreno e incubare le piastre per 24 ore.
   2. Rimuovere il terreno di coltura e aggiungere 100 μL di MTT (0,5 mg/mL) alle cellule. Incubare le cellule per 30 minuti al buio nelle normali condizioni di coltura sopra menzionate.
   3. Rimuovere la soluzione di MTT e solubilizzare i cristalli intracellulari di formazano con 100 μL di DMSO.
   4. Misurare l'assorbanza a 570 nm utilizzando un lettore per micropiastre. Esprimere i risultati come percentuale di cellule di controllo non trattate.

8. Innovazione alimentare

1. Nuovo prodotto alimentare: Pasta alle alghe
   1. Selezione degli ingredienti e formulazione della pasta
      NOTA: La selezione degli ingredienti è stata effettuata in collaborazione con un'azienda di pasta. La scelta degli ingredienti chiave (descritti al paragrafo 8.2) è stata fatta considerando la loro facile accessibilità e compatibilità con le linee di produzione esistenti, utilizzando le risorse marine per ottenere pasta con valore nutrizionale aggiunto.
      1. Dopo la scelta degli ingredienti, progettare la formulazione seguendo il valore nutrizionale previsto (fonte di fibre, vitamine ed elementi minerali, basso contenuto di grassi saturi) analizzando la composizione chimica teorica delle formulazioni utilizzando un foglio di calcolo.
      2. Una volta soddisfatti i requisiti teorici, procedere con la produzione su scala di laboratorio come descritto al punto 8.1.2.
      3. Eseguire un test sensoriale con un panel semi-addestrato (>10 assaggiatori) per convalidare la necessità di riformulazione o l'accettazione della formulazione per le fasi successive.
         NOTA: Il panel è stato precedentemente addestrato per l'assaggio della pasta e ha valutato edonicamente le formulazioni presentate per quanto riguarda attributi come sapore, gusto, odore, consistenza e aspetto.
   2. Produzione di pasta
      NOTA: Produrre campioni di pasta Chifferi utilizzando un estrusore per pasta.
      1. Nell'apparecchiatura, mescolare porzioni precedentemente definite di farina di riso, G. gracilis e Chlorella vulgaris e aggiungere circa il 30% di acqua alla miscela.
      2. Per ottenere pasta secca, essiccare Chifferi a 68 °C per 42 min, seguiti da 5 h, 30 min a 76 °C, simulando un processo industriale.
      3. Infine, confezionare e sigillare sottovuoto i campioni e conservarli in un luogo buio a RT fino a ulteriori analisi.
   3. Analisi nutrizionale
      NOTA: Per l'analisi del profilo nutrizionale, utilizzare campioni essiccati e macerati in triplice copia.
      1. Contenuto di proteine grezze: eseguire il dosaggio delle proteine totali attraverso il metodo Kjeldahl , adattato da Duarte et al. (2022)²⁶, seguendo i passaggi 8.1.3.2-8.1.3.6.
      2. Pesare accuratamente 1,0 g di campione (o acqua distillata per il saggio in bianco) e miscelare con due compresse di Kjeldahl e 25 mL di H₂SO₄ in provette per digestione.
         ATTENZIONE: Vedere la scheda di sicurezza di H₂SO₄ fornita dal fornitore.
      3. Eseguire la digestione dei campioni in un digestore Kjeldahl a 220 °C per 30 minuti, seguiti da 90 minuti a 400 °C.
      4. Dopo il raffreddamento a RT, aggiungere 80 mL di acqua distillata e distillare l'ammoniaca formata in 30 mL di una soluzione al 4%H 3 BO₃ contenente verde bromocresolo e rosso metile. Questa fase avviene in condizioni alcaline (distillazione con il 40% di NaOH utilizzando un distillatore Kjeldahl.
         ATTENZIONE: Vedere la scheda di sicurezza della soluzione H 3BO₃ contenente verde bromocresolo, rosso metile e NaOH al 40% fornita dal fornitore.
      5. Titolare i campioni distillati con HCl 0,1 M fino a quando non si osserva un cambiamento di colore in un rosa grigiastro.
      6. Calcolare il contenuto di proteina grezza, rappresentato dal contenuto di azoto del campione, ed esprimerlo in g per 100 g utilizzando la seguente equazione:
         
         dove V_s corrisponde al volume di HCl (mL) utilizzato nella titolazione del campione; V_b corrisponde al volume utilizzato nel bianco; N corrisponde alla normalità dell'HCl; w corrisponde al peso del campione (g).
      7. Contenuto totale di grassi: determinare il contenuto totale di grassi utilizzando il metodo di Folch, adattato da Folch et al. (1957)²⁷, seguendo i passaggi 8.1.3.8-8.1.3.14.
      8. Preparare il reagente di Folch mescolando CHCl₃ e MeOH in proporzione di 2:1 (v:v).
         ATTENZIONE: Vedere la scheda di sicurezza del reagente di Folch fornito dal fornitore.
      9. Alle provette contenenti aliquote di 1 g di campioni, aggiungere 5 mL di reagente di Folch e 0,8 mL di acqua distillata. Mescolare in un vortice per 1 min.
      10. Quindi, aggiungere altri 5 mL di reagente Folch e omogeneizzare per 5 min. Aggiungere 1,2 mL di soluzione di NaCl allo 0,8% e omogeneizzare per 2 min_.
      11. Centrifugare i campioni a 7000 x g per 10 min. Filtrare la fase organica (fase inferiore) attraverso cotone idrofilo e solfato di sodio anidro in un pallone di vetro a fondo tondo.
      12. Per evitare la perdita di campione, ripetere le fasi di aggiunta di 5 mL di CHCl₃, omogeneizzazione, centrifugazione e filtrazione nelle stesse condizioni.
      13. Rimuovere il solvente organico dalle fasi organiche raccolte mediante evaporazione a bassa pressione e lasciare in forno a 105 °C per 4 h. Raffreddare i campioni in un essiccatore.
      14. Calcolare il contenuto di grassi, espresso in g per 100 g, utilizzando la seguente equazione:
          
          dove W₁ è il peso vuoto del pallone di vetro a fondo tondo; W₂ è il peso iniziale del campione; W₃ è il pallone di vetro a fondo tondo con il peso del campione.
      15. Contenuto di fibra grezza: determinare il contenuto di fibra grezza utilizzando una metodologia adattata dalla norma ISO 6865 (2000)²⁸, seguendo le fasi 8.1.3.16-8.1.3.22.
      16. Pesare 1 g del campione (W0) in un crogiolo di vetro con fondo filtrante (riferimento P2) e inserirlo nell'analizzatore di fibre.
      17. Il primo passo è l'idrolisi acida: aggiungere 150 mL di H 2 SO₄ all'1,25%, preriscaldato, e₂mL di agente antischiuma (n-ottanolo) alla colonna di ciascun crogiolo; Scaldare fino a ebollizione e conservare per 30 min.
      18. Dopo aver rimosso questo solvente, lavare tre volte con acqua deionizzata per procedere all'idrolisi basica. Aggiungere 150 mL di NaOH all'1,25%, preriscaldato, e 5 mL di agente antischiuma alla colonna priva di liquidi ed eseguire la stessa procedura di riscaldamento dell'idrolisi acida.
      19. Infine, effettuare un triplo lavaggio con 150 mL di acetone per l'estrazione a freddo.
      20. Dopo questo processo, rimuovere con cura i crogioli dal sistema e metterli in forno a 150 °C per 1 h. Registrare il peso finale (W1).
      21. Porre i crogioli in un forno a muffola a 500 °C per 3 ore e poi registrare il peso finale (W2).
      22. Calcolare il contenuto di fibra grezza ed esprimere i risultati in percentuali utilizzando la seguente equazione:
          % fibra grezza = 100 x (W1-W2)/W0
      23. Profilo degli acidi grassi (FA): determinare il profilo degli acidi grassi secondo Fernández et al.(2015)29, seguendo i passaggi 8.1.3.24-8.1.3.29.
          NOTA: Gli esteri metilici degli acidi grassi (FAME) sono ottenuti mediante transmetilazione diretta catalizzata da acido dei campioni liofilizzati macinati. Tutte le analisi sono fatte in triplice copia.
      24. Aggiungere 2 mL di una soluzione di H 2 SO₄ al 2% (v/v) in metanolo a un campione da 50 mg e versare la miscela a 80 °C per₂ore agitando continuamente.
          ATTENZIONE: Vedere la scheda di sicurezza del metanolo fornita dal fornitore.
      25. Dopo il raffreddamento a RT, aggiungere 1 mL di acqua ultrapura e 2 mL di n-eptano a ciascun campione, vorticare la miscela per 1 minuto e centrifugarla per 5 minuti.
          ATTENZIONE: Vedere la scheda di sicurezza dell'n-eptano fornita dal fornitore.
      26. Recuperare la fase superiore di n-eptano (organica) contenente i FAME e trasferirla in fiale di gascromatografia (GC).
      27. Eseguire l'analisi in un gascromatografo dotato di una colonna capillare TR-FAME (60 m × 0,25 mm ID, 0,25 μm di spessore del film), un autocampionatore e un rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID).
      28. Impostare l'iniettore (modalità splitless) a 250 °C e il rilevatore a 280 °C. Impostare la temperatura iniziale della colonna a 75 °C e mantenerla per 1 min. Quindi aumentare a 5 °C/min a 170 °C e tenere premuto per 10 min. Quindi aumentare a 5 °C/min a 190 °C e mantenere la temperatura per altri 10 min. Infine, portare a 2 °C/min a 240 °C e tenere premuto per 10 min. Utilizzare l'elio come gas di trasporto a una portata di 1,5 mL/min. Aria di alimentazione e idrogeno a portate rispettivamente di 350 e 35 mL/min.
      29. Determinare il profilo FA confrontando i tempi di ritenzione risultanti con uno standard ed esprimere i risultati come percentuale di grasso totale.
      30. Profilo degli elementi minerali: Determinare gli elementi minerali (Ca, P, Mg, Na, K, Fe, Cu, Mn, Zn) analizzati da ICP-OES, seguendo il metodo adattato da Pinto et al. (2022)³⁰, seguendo i passaggi 8.1.3.31-8.1.3.34.
      31. Pesare accuratamente circa 0,4 g di ciascun campione secco e aggiungere 7,5 mL di HNO₃ e 2,5 mL di HCl.
          ATTENZIONE: Vedere la scheda di sicurezza di HNO₃ e HCl fornita dal fornitore.
      32. La digestione segue un processo in due fasi: aumentare la temperatura da RT a 90 °C in 30 minuti (e mantenere altri 30 minuti a questa temperatura) seguita da 60 minuti a 105 °C.
      33. Raffreddare le soluzioni campione, diluirle a 25 mL, filtrarle e conservarle in provette etichettate. In ogni digestione, eseguire lo stesso processo con un materiale di riferimento e un bianco. Ottenere la concentrazione dei diversi elementi mediante ICP-OES.
      34. Esprimere i risultati in mg per 100 g di fw.
      35. Contenuto di carboidrati: Calcolare il contenuto di carboidrati seguendo i passaggi 8.1.3.36-8.1.3.37.
      36. Calcolare il contenuto di carboidrati disponibili (fibre escluse) dalla differenza dei fattori precedentemente determinati per 100 g, utilizzando la seguente equazione, secondo l'Organizzazione delle Nazioni Unite per l'alimentazione e l'agricoltura (FAO; 2003)³¹
          
      37. Esprimere i risultati in g per 100 g.
      38. Contenuto di umidità e ceneri: Stimare il contenuto di umidità e ceneri seguendo i passaggi 8.1.3.39-8.1.3.45.
      39. Incubare i crogioli di porcellana per 3 ore a 105 °C, raffreddarli in un essiccatore e pesarli.
      40. Pesare 10 g del campione nel crogiolo e metterlo in un forno di essiccazione a 105 °C per cicli di 3 ore fino a quando i valori delle pesate successive non differiscono di oltre 10 mg.
      41. Calcolare il contenuto di umidità, espresso in g per 100 g di fw, utilizzando la seguente equazione:
          
          dove W₁ è il peso del crogiolo vuoto, W₂ è il peso del crogiolo con il campione fresco e W₃ è il peso del crogiolo con il campione essiccato.
      42. Dopo il dosaggio del contenuto di umidità, porre i crogioli con i campioni essiccati in un inceneritore a 525 °Cper 4 ore.
      43. Ripetere questa procedura fino a quando le pesate successive non differiscono di più di 1 mg.
      44. Raffreddare i campioni in RT in un essiccatore e poi pesarli.
      45. Calcolare il contenuto di ceneri, espresso in g per 100 g di fw, utilizzando la seguente equazione:
          
          dove W₁ è il peso del crogiolo vuoto, W₂ è il peso del crogiolo con campione fresco, W₃ è il peso del crogiolo con peso.
      46. Valore energetico: Calcolare il valore energetico seguendo i passaggi 8.1.3.47-8.1.3.48.
      47. Calcolare il valore energetico dei campioni secondo il regolamento UE:La fornitura di informazioni sugli alimenti ai consumatori (Regolamento 1169/2011)³², utilizzando le equazioni:
          Energia (kcal/ 100 g) = 4 x (g di proteine) + 4 x (g di carboidrati) + 9 x (g di grassi) + 2 x (g di fibre)
          Energia (kJ/ 100 g) = 17 x (g di proteine) + 17 x (g di carboidrati) + 37 x (g di grassi) + 8 x (g di fibre)
      48. Esprimere i risultati in chilocalorie per 100 g e kilojoule per 100 g.
   4. Accettazione da parte dei consumatori
      1. Valutare l'accettazione da parte dei consumatori utilizzando campioni di pasta cotti in acqua distillata per 8 minuti.
      2. Eseguire il test di accettazione da parte dei consumatori: valutare l'aspetto visivo, il colore, la consistenza, l'odore, il sapore del mare, il gusto generale, la valutazione complessiva e l'intenzione di acquisto dei campioni.
         NOTA: Il test di accettazione da parte dei consumatori si basa su test edonistici che valutano l'aspetto visivo, il colore, la consistenza, l'odore, il sapore del mare, il gusto generale, la valutazione complessiva e l'intenzione di acquisto su una scala da 1 a 9, dove 1 è una valutazione scarsa e 9 è una valutazione molto buona.
      3. Eseguire test sensoriali in cabine sensoriali individuali in un laboratorio di analisi sensoriale (con controllo della temperatura e dell'illuminazione). Fornisci posate, tovaglioli e tazze di vetro di acqua minerale per pulire il palato tra un campione e l'altro.
         NOTA: Gli assaggiatori hanno un'età compresa tra i 16 e i 64 anni e provengono da tutti i contesti (n > 80).
2. Yogurt
   1. Estrazione del pigmento
      NOTA: Eseguire l'estrazione del pigmento attraverso la metodologia descritta in Pereira et al. (2020)¹⁸.
      1. Preparare il solvente di estrazione, tampone fosfato di sodio a 0,1 M, con fosfato di sodio bibasico (0,03 M) e fosfato di sodio monobasico (0,07 M). Impostare il pH a pH 6,8 utilizzando NaOH o HCl.
      2. Pesare 1 g di G. gracilis e aggiungere 50 mL di tampone fosfato di sodio (pH 6,8). Omogeneizzare per 10 min, a cui seguono 10 min di macerazione con mortaio e pestello.
      3. Trasferire la soluzione in una provetta e centrifugare per 20 minuti a 12.298 x g (4 °C).
      4. Mettere in comune il surnatante e aggiungere lentamente il 65% di solfato di ammonio. Quando tutto il solfato di ammonio è sciolto, coprire la soluzione con un foglio di alluminio e lasciarla precipitare a 4 °C per una notte.
         ATTENZIONE: Vedere la scheda di sicurezza del solfato di ammonio fornita dal fornitore.
      5. Centrifugare il precipitato per 20 minuti a 12.298 x g (4 °C). Recuperare il pellet e scioglierlo in acqua distillata (circa 5 mL).
      6. Eseguire la dialisi dell'estratto utilizzando una membrana tubolare (14 kDa) contro l'acqua per 24 ore, seguita da liofilizzazione. Conservare l'estratto liofilizzato al riparo dalla luce a 4 °C fino al momento dell'utilizzo.
   2. Preparazione dello yogurt
      1. Preparare lo yogurt naturale mescolando 1 L di latte pastorizzato, 120 g di yogurt naturale, 20 g di zucchero e 50 g di latte in polvere in un termomixer per 5 min, 50 °C, velocità 3.
      2. Mettere il composto nel vaso del termomixer in un'incubatrice a 37 °C per 12 h.
      3. Incorporare l'estratto mescolandolo allo yogurt ad una concentrazione dello 0,21%. Conservare i campioni in matracci di vetro individuali a 4 °C fino all'analisi.
      4. Conservare le singole porzioni di yogurt senza pigmento (controllo) a 4 °C fino all'analisi.
   3. Stabilità del colore
      NOTA: Valutare la stabilità del pigmento negli yogurt attraverso l'analisi del colore per 12 giorni. Eseguire l'analisi del colore utilizzando un colorimetro a riflettanza, utilizzando un osservatore standard a 2 gradi e un illuminante D65. I risultati sono presentati come coordinate CIELab con i parametri L (luminosità, nero - bianco, 0 - 100), a* (verde - rosso, -60 - 60) e b* (blu - giallo, -60 - 60). Il parametro a* ha valori positivi per i colori rossastri e valori negativi per i colori verdastri. Il parametro b* accetta valori positivi per i colori giallastri e valori negativi per i colori bluastri. L* è il parametro di luminosità, che è la proprietà secondo la quale ogni colore può essere considerato equivalente a un membro della scala di grigi tra il bianco e il nero³³.
      1. Calibrare il colorimetro utilizzando una piastra in ceramica bianca (L* 88.5, a* 0.32, b* 0.33) fornita dal produttore.
      2. Riempire una cella con circa 28 g di campione (o controllo) e analizzare il colore utilizzando un software di analisi dei dati cromatici.
         NOTA: Il software utilizzato per l'analisi dei dati cromatici è stato SpectraMagic NX.
      3. Eseguire le letture 5 volte in triplicati campioni/controlli.
   4. Analisi sensoriale
      NOTA: Eseguire la valutazione sensoriale degli yogurt con incorporazione di pigmenti utilizzando un test triangolare (ISO 4120, 2004)³⁴ e una valutazione edonica del colore, del gusto e dell'apprezzamento generale.
      1. Per il test del triangolo, dai ai relatori tre campioni (un campione di yogurt con pigmento e due campioni di controllo, o due campioni di yogurt con pigmento e un controllo) e chiedi loro di scegliere un campione diverso in base all'aroma, alla consistenza e al gusto. Fornire campioni in volumi simili identificati con codici casuali a 3 numeri.
      2. Per la valutazione edonica dello yogurt con pigmento, date ai relatori un campione di yogurt con pigmento e chiedete loro di valutare il colore, il gusto e l'apprezzamento generale utilizzando una scala edonica a 9 punti (da estremamente antipatia a estremamente simile).

Representative Results

Attività antimicrobica

Nell'interpretare i risultati ottenuti, occorre tenere presente che maggiore è la percentuale di inibizione, maggiore è l'efficacia dell'estratto nell'inibire la crescita di quello specifico ceppo e, di conseguenza, più l'estratto è interessante come antimicrobico. Attraverso questa metodologia, possiamo individuare rapidamente quali estratti hanno maggiore attività su determinati ceppi batterici, individuando anche quelli più interessanti in termini di utilizzo futuro. Possiamo così avere un punto di partenza per ulteriori studi su quello stesso estratto.

La Figura 1 mostra i risultati ottenuti con gli estratti acquosi, sia nella prima che nella seconda estrazione, immediatamente dopo l'essiccazione della biomassa (Figura 1A) e nella terza e quarta estrazione (Figura 1B), ottenuti dopo le estrazioni etanoliche, utilizzando quindi la biomassa integralmente. Possiamo notare che i risultati più interessanti, corrispondenti alla terza e quarta estrazione acquosa, rivelano attività antimicrobiche più elevate, in particolare negli estratti ottenuti a 70 °C. La concentrazione di estratto nei pozzetti è di 5 mg/mL.

Figura 1: Inibizione della crescita di specie batteriche in presenza di estratti acquosi di G. gracilis. Inibizione della crescita di 3 specie batteriche (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Listonella anguillarum) dopo 24 h di crescita in ambiente liquido, in presenza di estratti acquosi (Aq) di G. gracilis ottenuti a diverse temperature, temperatura ambiente (RT), 40 °C (40) e 70 °C (70). Il controllo positivo è stato effettuato con cloramfenicolo (CHL) e i risultati sono espressi come valori medi (n = 8). I dati si riferiscono alle 4 fasi di estrazione sequenziale (1°, 2°, 3°, 4^°). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli estratti etanolici sembrano essere particolarmente efficaci nell'inibire la crescita di L. anguillarum, come mostrato nella Figura 2. Questo mostra i risultati ottenuti con gli estratti etanolici, anche nella prima e nella seconda estrazione (Figura 2A) e nella terza e quarta estrazione (Figura 2B), ottenuti dopo la prima estrazione acquosa.

Figura 2: Inibizione della crescita di specie batteriche in presenza di estratti etanolici di G. gracilis. Inibizione della crescita di 3 specie batteriche (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Listonella anguillarum) dopo 24 h di crescita, in ambiente liquido, in presenza di estratti etanolici (Et) di G. gracilis, ottenuti a diverse temperature, temperatura ambiente (RT), 40 °C (40) e 70 °C (70). Il controllo positivo è stato effettuato con cloramfenicolo (CHL) e i risultati sono stati espressi come valori medi (n = 8). I dati si riferiscono alle 4 fasi di estrazione sequenziale (1°, 2°, 3°, 4^°). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Attività antiossidante

Per quanto riguarda i risultati che evidenziano il potenziale antiossidante dei vari estratti, in particolare nel test DPPH, i risultati espressi in Figura 3 indicano che la temperatura di 40 °C è risultata la più efficace, determinando valori di inibizione dell'attività ossidante più elevati, rispetto a quelli osservati negli estratti ottenuti a RT o 70 °C. Questo vale per i campioni di G. gracilis e ci possono essere grandi variazioni a seconda dei campioni utilizzati e delle condizioni di crescita delle alghe. Pertanto, si raccomanda di effettuare prove per indicare le condizioni migliori per ogni tipo specifico di campione.

Figura 3: Inibizione del radicale DPPH (%) in presenza di estratti ottenuti a diverse temperature. Gli estratti sono stati ottenuti attraverso l'estrazione etanolica (Et) o acquosa (Aq). La 1ª e la^2ª estrazione sono state effettuate da biomassa secca in sequenza. I restanti (3° e 4^°) sono stati realizzati con biomassa precedentemente estratta con il solvente alternativo. RT significa temperatura ambiente; 40, estratto ottenuto a 40 °C; e 70, estratto ottenuto a 70 °C. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Risultati simili sono stati ottenuti in termini di quantificazione dei polifenoli totali (Figura 4), con la temperatura di 40 °C considerata la migliore in termini di estrazione di composti antiossidanti. Ciò dimostra che l'attività antiossidante sembra essere correlata con le componenti fenoliche presenti negli estratti.

Figura 4: Quantificazione del contenuto di polifenoli totali (TPC) in estratti ottenuti a diverse temperature. Gli estratti sono stati ottenuti mediante estrazione etanolica (Et) o acquosa (Aq), dove la 1ª e la 2ª estrazione sono state effettuate in sequenza da alghe secche e le restanti (3ª e ^4ª) sono state effettuate con biomassa precedentemente estratta con un altro solvente. RT significa temperatura ambiente; 40, estratto ottenuto a 40 °C; e 70, estratto ottenuto a 70 °C. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Citotossicità nelle cellule HaCat

Il primo passo per valutare la sicurezza degli ingredienti cosmetici è lo studio della loro citotossicità in vitro in linee cellulari epidermiche e dermiche. Come si può vedere nella Figura 5, non sono stati osservati effetti citotossici sui cheratinociti (cellule HaCaT), suggerendo che, alla concentrazione massima analizzata (1 mg/mL), sia gli estratti acquosi che quelli di etanolo sono sicuri per l'uso cutaneo.

Figura 5: Effetto citotossico degli estratti di Gracilaria gracilis (1 mg/mL) sulle cellule HaCaT dopo 24 ore di trattamento. I valori in ciascuna colonna sono espressi come la media ± l'errore standard della media (SEM) di tre esperimenti indipendenti in triplice copia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Innovazione alimentare

Le formulazioni finali della pasta sono state ottenute dopo numerose prove tra formulazione teorica e test sensoriali da parte di un panel semi-addestrato. Dopo questa fase, si è accede alla caratterizzazione chimica, compresa la valutazione nutrizionale, i profili degli acidi grassi e degli elementi minerali. E' stato possibile costruire una caratterizzazione nutrizionale (Tabella 1 e Tabella 2) e verificare l'esistenza di claim nutrizionali attesi in base alla normativa europea (REG (UE) n. 1169/2011)³².

Nutrizionali		da 100 g di Pasta	% RDI
Energia		1478.90 kJ (348.74 kcal)	17
Lipidi		1,06 ± 0,10 g	2
Da cosa:
	Acidi grassi saturi	0,38 ± 0,01 g	2
	Carboidrati	72,59± 0,21 grammi	28
	Fibra	3,84 ± 0,20 g
	Proteina	10,29 ± 0,20 g	21
	Sale	0,22 ± 0,02 g	9

Tabella 1: Valori nutrizionali. Valori nutrizionali della pasta sviluppata basati su analisi chimiche (n=3) di energia e carboidrati ottenuti mediante calcolo e rispettiva percentuale di dose di dose raccomandata assunta (n=3).

Queste formulazioni di pasta sono state studiate per rivolgersi a un target di consumatori che ha in mente un'alimentazione più sana, quindi la quantità di grassi per 100 g di prodotto deve essere la più piccola possibile. L'analisi dettagliata del profilo degli acidi grassi mostra un valore di 0,38 g di acidi grassi saturi/100 g, che è ben al di sotto del limite per i prodotti a basso contenuto di grassi saturi, raggiungendo l'obiettivo iniziale nella produzione di questa pasta. Per quanto riguarda il contenuto di fibre, è stato anche possibile, in conformità con le normative europee, rivendicare questa formulazione di pasta come fonte di fibre.

Nella caratterizzazione degli elementi minerali, determinata mediante ICP-OES e presentata in Tabella 2, è riportato il valore di circa 219 mg/100 g di Na presente in 100 g di questo prodotto, pertanto non è possibile verificare che si tratti di un prodotto a basso contenuto di sodio (<0,12 g/100 g). A causa dell'elevato contenuto di sodio naturalmente presente negli ingredienti, questo prodotto potrebbe non richiedere l'aggiunta di sale nella sua confezione.

Tabella 2: Profilo degli elementi minerali della pasta. Blu - alto contenuto di elemento; Rosso - fonte di un certo elemento (n = 3). Clicca qui per scaricare questa tabella.

Secondo il regolamento dell'Unione Europea di riferimento e la percentuale RDI per ogni elemento, si può notare che questo prodotto ha un alto contenuto di K, P, Fe ed è anche una fonte di Zn. Ha Se, Mg e Ca presenti in quantità minori.

Per i test di accettazione della pasta sono stati utilizzati 86 tester, di cui 63 femmine e 23 maschi, di età superiore ai 18 anni. I test di accettazione si sono basati su scale edoniche di 9 punti, come previsto dalle norme. L'impasto Healthy ha ottenuto un punteggio di 5 e 6 su una scala edonica da 1 a 9 rispettivamente per i parametri "Sapore di mare" e "Aspetto visivo" (Figura 6).

Figura 6: Risultati dei test sensoriali di accettazione da parte dei consumatori . (A) La scelta edonica per l'aspetto visivo, il colore, la consistenza, l'odore, il sapore del mare e il gusto generale. (B) La scelta edonica per l'apprezzamento generale e l'intenzione di acquisto. Scala 1-9, dove 1 è una valutazione scarsa e 9 è una valutazione molto buona (n = 86). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La pasta ha ottenuto un punteggio di 5 e 6 su una scala edonica da 1 a 9 rispettivamente per i parametri "Sapore di mare" e "Aspetto visivo" (Figura 6A). Questa pasta ha ottenuto un valore basso su questa scala per quanto riguarda il parametro della tessitura (considerando altre formulazioni già studiate), probabilmente perché l'ingrediente base è la farina di riso; Nonostante ciò, ha ottenuto valori su una scala da 1 a 9, che va da 4 a 7 che riflette una buona accettazione da parte del consumatore medio. Su una scala edonica da 1 a 9, la pasta ha avuto come risposte più frequenti il valore di 5 per l'intenzione di acquisto e il valore di 6 per l'apprezzamento complessivo, come mostrato nella Figura 6B. È emerso che circa il 65% degli assaggiatori ha scelto una risposta uguale o superiore al punteggio di 6 per la valutazione complessiva di questa pasta. La stabilità del colore degli yogurt con pigmento è stata valutata per 12 giorni a -4 °C e i risultati sono presentati nella Figura 7.

Figura 7: Stabilità del colore degli yogurt. (a sinistra) Controllare gli yogurt e gli yogurt (a destra) con pigmento Gracilaria gracilis durante i 12 giorni di conservazione. I parametri a*, b* e L* sono adimensionali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I risultati indicano che i parametri a* e b* sono rimasti stabili nel tempo, mentre i valori di L* hanno mostrato una varianza più elevata. La leggerezza ha dimostrato valori più elevati dopo 8 giorni di conservazione. Mentre sono state riscontrate alcune differenze nei parametri di luminosità, indicando che i campioni erano più chiari nel tempo, i parametri di rossore (a*) e blu (b*) hanno mostrato una buona stabilità. L'incorporazione degli estratti negli yogurt ha mostrato una buona ritenzione del colore, con un ΔE di 7,01 ± 2,36 dopo 12 giorni di conservazione. Per quanto riguarda la valutazione sensoriale dello yogurt, 9 panelisti su 13 hanno identificato correttamente il campione corretto nel test del triangolo, suggerendo che c'erano differenze tra gli yogurt che consentivano questa distinzione. I test edonistici effettuati sul panel semi-addestrato hanno mostrato una buona accettazione del prodotto, che si riflette in punteggi superiori a 7 (Figura 8). La modalità del punteggio per uno qualsiasi dei tre attributi sottoposti al test è stata 9, portando a medie di punteggio superiori a 8. La valutazione migliore è stata fatta per il colore, che riflette un'ottima accettazione da parte del panel, un risultato rivelatore.

Figura 8: Risultati della valutazione sensoriale edonica dello yogurt con pigmento Gracilaria gracilis. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

I test di attività antimicrobica in un mezzo liquido sono utilizzati per valutare l'efficacia delle sostanze antimicrobiche contro i microrganismi sospesi in un mezzo liquido e vengono solitamente eseguiti per determinare la capacità di una sostanza di inibire la crescita o uccidere i microrganismi^35,36,37,38. Sono utilizzati per valutare la sensibilità dei microrganismi agli agenti antimicrobici e sono condotti in provette o piastre di microtitolazione, dove diverse concentrazioni della sostanza antimicrobica vengono testate rispetto a una sospensione standardizzata del microrganismo bersaglio²². L'attività antimicrobica viene valutata misurando la crescita microbica o la presenza/assenza di torbidità nel terreno di coltura dopo un adeguato periodo di incubazione.

Esistono diverse tecniche e metodi per eseguire questi test, come il metodo di diluizione del brodo, il metodo di diffusione dell'agar (come il test di diffusione del disco) e il metodo della microdiluizione del brodo, che è uno dei più utilizzati³⁸. Alcuni dei punti più critici di questi metodi includono la corretta preparazione dell'inoculo, la scelta del terreno di coltura, la qualità degli antimicrobici utilizzati, la standardizzazione della tecnica e un efficace controllo della contaminazione. L'inoculo, che è una sospensione standardizzata di microrganismi, deve essere preparato correttamente per garantire l'accuratezza dei risultati. Ciò comporta un'appropriata selezione della coltura microbica, una corretta coltura di ceppi puri, la regolazione della concentrazione cellulare e la standardizzazione della sospensione per ottenere un'adeguata densità ottica o concentrazione cellulare.

Il terreno di coltura utilizzato deve essere selezionato con cura per garantire che fornisca le condizioni di crescita ideali per il microrganismo in esame. La composizione chimica, il pH e altri fattori possono influenzare i risultati del test. È importante seguire le raccomandazioni del produttore per la preparazione del terreno di coltura. La qualità degli agenti antimicrobici utilizzati come controllo è fondamentale ed è importante garantire che questi siano puri, entro la durata di conservazione e conservati correttamente. L'etichettatura e le date di scadenza devono essere sempre consultate, seguendo le istruzioni del produttore. Anche la standardizzazione della tecnica è fondamentale per garantire l'accuratezza dei risultati. Ciò include l'aggiunta delle concentrazioni testate al terreno di coltura, nonché il mantenimento delle condizioni asettiche durante tutta la procedura. Inoltre, la contaminazione incrociata dei microrganismi durante i test può portare a risultati falsi o inaffidabili. È essenziale seguire rigorose pratiche asettiche durante tutta la procedura, dalla manipolazione dell'inoculo all'incubazione delle provette o delle piastre. L'uso di piani di lavoro puliti, tecniche di pipettaggio adeguate e un corretto smaltimento dei materiali sono misure importanti per evitare la contaminazione.

L'attenzione ai dettagli e il rigoroso rispetto dei protocolli e delle linee guida stabiliti sono fondamentali per ridurre al minimo gli errori e garantire l'affidabilità dei risultati nei test di attività antimicrobica in un mezzo liquido. Inoltre, i test di attività antimicrobica presentano alcune limitazioni che dovrebbero essere considerate³⁷.

Fattori come il pH, la temperatura, la presenza di componenti del sangue e le interazioni con il sistema immunitario non sono considerati in questi test, il che può limitare la capacità di prevedere l'efficacia di un agente antimicrobico in un organismo vivente. Inoltre, i test misurano la capacità di una sostanza antimicrobica di inibire la crescita microbica o uccidere i microrganismi e non forniscono informazioni dettagliate sul meccanismo d'azione dell'antimicrobico o sulla sua selettività nei confronti di microrganismi specifici. Ci sono limitazioni nel rilevamento della resistenza, in quanto i metodi impiegati potrebbero non consentire il rilevamento o la previsione dello sviluppo della resistenza nel tempo. Alcuni microrganismi possono sviluppare meccanismi di resistenza in risposta all'esposizione prolungata a un antimicrobico e questi cambiamenti potrebbero non essere facilmente rilevati attraverso questi test. I test dell'attività antimicrobica in un mezzo liquido generalmente non considerano altri fattori dell'ospite che possono influenzare l'efficacia di un agente antimicrobico, come la presenza di biofilm o la risposta immunitaria dell'ospite.

È importante considerare queste limitazioni e integrare i test per l'attività antimicrobica in un mezzo liquido con altri metodi e approcci, come gli studi in vivo , i modelli di biofilm e altri³⁹. Nell'ambito della bioprospezione di composti bioattivi di macroalghe, i test di attività antimicrobica possono essere utilizzati per valutare il potenziale antimicrobico di estratti di alghe o composti isolati, identificando sostanze con attività antimicrobica contro specifici patogeni microbici, che possono avere applicazioni in campi come la produzione di medicinali, cosmetici, prodotti alimentari o agricoli⁴⁰.

I test di attività antiossidante sono metodi utilizzati per valutare la capacità di un composto o di un estratto di neutralizzare i radicali liberi o ridurre lo stress ossidativo. Questi test sono ampiamente utilizzati nella ricerca antiossidante, sia negli alimenti che nei prodotti naturali come le alghe, ad esempio. Esistono diversi metodi per valutare l'attività antiossidante e uno dei più comunemente utilizzati è la capacità di assorbimento dei radicali liberi. In questo test, un radicale libero stabile, il 2,2-difenil-1-picrilidrazile (DPPH), viene utilizzato per valutare la capacità di un composto di donare un elettrone e neutralizzare il radicale libero. L'attività antiossidante viene misurata riducendo il colore viola del DPPH, che si verifica quando il composto antiossidante dona un elettrone al radicale libero. Altri metodi includono la capacità di assorbimento dei radicali dell'ossigeno (ORAC), la capacità di riduzione del ferro (FRAP) o la capacità di riduzione dei radicali liberi (ABTS)⁴¹.

La quantificazione dei polifenoli totali (QTP), d'altra parte, non è un metodo diretto per determinare l'attività antiossidante ma fornisce una misura della concentrazione totale di polifenoli in un campione, sebbene diverse sostanze interferenti possano influenzare i risultati. Sebbene molti polifenoli siano noti per avere proprietà antiossidanti, l'attività antiossidante di un composto è correlata a diversi fattori, come la sua struttura chimica, la concentrazione, la capacità di donare o catturare i radicali liberi e le interazioni con^{altri componenti cellulari}. La semplice quantificazione dei polifenoli totali non può fornire una valutazione dell'attività antiossidante del campione. Tuttavia, è importante notare che la presenza di polifenoli in un campione può essere associata a una maggiore probabilità di attività antiossidante poiché molti polifenoli possiedono proprietà antiossidanti. Pertanto, il QTP può fungere da indicatore preliminare della presenza di polifenoli nel campione, ma la conferma dell'attività antiossidante richiede saggi di attività antiossidante. I polifenoli sono una classe di composti chimici ampiamente distribuiti in natura, che si trovano negli alimenti, nelle piante, nella frutta, nella verdura e nelle alghe. Esistono diversi metodi per la quantificazione dei polifenoli totali, e il metodo Folin-Ciocalteu è uno dei più utilizzati. La QTP fornisce una misura generale della concentrazione di polifenoli, ma non specifica i singoli composti polifenolici presenti nel campione. Si tratta quindi di un metodo quantitativo ma non qualitativo. Inoltre, è importante considerare che polifenoli diversi hanno capacità antiossidanti e attività biologiche diverse, quindi QTP non fornisce informazioni dettagliate sulle proprietà funzionali specifiche dei polifenoli presenti.

Ogni metodo ha i suoi vantaggi e i suoi limiti, e la scelta di un determinato test dipende dalle caratteristiche del composto oggetto di studio e dallo scopo dell'analisi. È importante seguire le istruzioni specifiche di ciascun metodo per garantire risultati affidabili e comparabili. Quando si determina la capacità antiossidante, alcuni dei passaggi critici comuni includono, in primo luogo, la preparazione del campione. È importante preparare correttamente i campioni, assicurandosi di ottenere concentrazioni adeguate ed evitando contaminazioni. Ciò comporta la pesatura precisa dei composti o degli estratti e la loro dissoluzione in solventi appropriati. È anche importante considerare la stabilità dei composti e degli estratti durante il processo di preparazione, conservazione e manipolazione. Tutti i reagenti utilizzati nei test di attività antiossidante devono essere adeguatamente preparati e standardizzati per garantire la riproducibilità dei risultati. Ciò comporta la corretta preparazione dello standard dell'acido gallico e l'accuratezza dei volumi. Il tempo di reazione è un aspetto fondamentale per ottenere risultati accurati nei test antiossidanti. È necessario ottimizzare il tempo di incubazione per garantire una reazione completa tra il composto antiossidante e il radicale libero. Un tempo insufficiente può portare a una sottostima dell'attività antiossidante, mentre un tempo eccessivo può provocare la degradazione dei composti o l'interferenza di reazioni secondarie. Inoltre, la temperatura durante i test deve essere controllata in modo accurato e coerente. La temperatura influenza la velocità delle reazioni chimiche e può influenzare i risultati. È importante seguire le condizioni di temperatura consigliate dai metodi specifici e garantire la stabilità della temperatura durante tutta la procedura. L'inclusione di controlli appropriati è essenziale per convalidare i risultati dei test antiossidanti. Ciò può includere controlli positivi (composti noti per avere attività antiossidante) e controlli negativi (campioni senza attività antiossidante). I controlli forniscono una base di confronto per l'interpretazione dei risultati e contribuiscono a garantire l'accuratezza dei dati ottenuti. Per ottenere risultati affidabili, si consiglia di eseguire test di attività antiossidante sulle repliche e ripetere l'esperimento più volte per aumentare la significatività dei dati e ottenere risultati più affidabili e robusti.

I metodi di analisi dell'attività antiossidante hanno alcune limitazioni che dovrebbero essere considerate quando si interpretano i risultati, vale a dire, il fatto che, in mezzi liquidi, potrebbero non catturare completamente la complessità dei sistemi biologici e le interazioni tra diversi composti, l'ampia gamma di reazioni antiossidanti che possono verificarsi, il metabolismo cellulare e i fattori ambientali che possono influenzare l'attività antiossidante. Quindi, dovrebbero essere utilizzati test diversi. Bisogna anche essere consapevoli della mancanza di correlazione diretta con i benefici per la salute; Sebbene l'attività antiossidante sia spesso associata a benefici per la salute, questo non sempre si traduce direttamente in benefici per la salute negli organismi viventi a causa di molti altri fattori, come la biodisponibilità, il metabolismo e le interazioni con altri sistemi biologici.

È importante tenere presente che i test di attività antiossidante sono strumenti utili per la valutazione iniziale del potenziale antiossidante di composti ed estratti ma non devono essere considerati un indicatore definitivo di effetti biologici o benefici per la salute. Sono necessari ulteriori studi per comprendere appieno l'impatto degli antiossidanti sul corpo.

Sebbene i metodi per testare l'attività antiossidante in mezzo liquido siano ampiamente utilizzati nella ricerca e abbiano i loro vantaggi e limiti, rispetto alle alternative, questi metodi possono essere considerati buoni in termini di praticità, velocità, costo e facilità di implementazione. Uno dei principali vantaggi è la semplicità e la velocità delle procedure e la loro idoneità per la ricerca iniziale, lo screening dei composti e gli studi su larga scala. Questi metodi sono relativamente veloci da eseguire e possono fornire risultati in un breve periodo, in modo più economico e richiedono attrezzature meno specializzate rispetto ad altri metodi.

Le alghe sono note per la loro capacità di produrre composti bioattivi, compresi gli antiossidanti, che possono avere proprietà benefiche per la salute⁴³. Gli estratti di alghe possono essere preparati da diverse parti delle alghe e possono essere ottenuti utilizzando diversi solventi, come acqua, etanolo, metanolo o acetone, tra gli altri. È importante ricordare che l'attività antiossidante degli estratti di alghe può variare a seconda di diversi fattori, come la specie di alghe, la metodologia di estrazione e la concentrazione dei composti bioattivi presenti. Pertanto, si raccomanda di eseguire test di attività antiossidante sulle repliche e di eseguire confronti con controlli appropriati per ottenere risultati più affidabili. Questi metodi possono essere utilizzati come strumento iniziale nello screening e nella selezione di estratti di alghe con potenziale antiossidante per ulteriori studi.

Il saggio MTT è una tecnica ampiamente utilizzata per una valutazione preliminare degli effetti citotossici in vitro di sostanze per uso umano e animale. Tuttavia, nonostante sia il metodo più utilizzato per testare la citotossicità, la conversione dell'MTT in cristalli di formazano è influenzata da numerosi fattori come il tasso metabolico e il numero di mitocondri ed è applicabile solo ai bersagli cellulari aderenti¹⁴. I principali passaggi critici del protocollo qui descritto sono legati all'eventuale insorgenza di contaminazioni da colture cellulari, alla crescita indesiderata di cellule HaCaT e a una bassa percentuale di confluenza cellulare. Esistono altri metodi, come la lattato deidrogenasi (LDH), l'adenosina trifosfato (ATP) e i saggi di formazione delle colonie per misurare la citotossicità. Tuttavia, tutti hanno vantaggi e vincoli. Ghasemi et al. (2021)⁴⁴ hanno valutato l'effetto di diverse variabili sulle misurazioni del test MTT su una linea cellulare di cancro alla prostata (PC-3). Sono stati analizzati fattori come la densità di semina cellulare, la concentrazione di MTT, il tempo di incubazione dopo l'aggiunta di MTT, la fame di siero, la composizione dei terreni di coltura cellulare, il contenuto intracellulare rilasciato e l'estrusione di formazano nello spazio extracellulare. Da questo studio, questi autori hanno delineato utili raccomandazioni su come applicare il test e una prospettiva su dove l'utilità del test è uno strumento potente, ma anche dove ha dei limiti. Ciononostante, il test MTT è una metodologia rapida, altamente sensibile e semplice che può essere applicata come valutazione preliminare della citotossicità di molte sostanze con potenziale applicazione in ambito terapeutico, alimentare, mangimistico, agricolo e ambientale. In particolare, il test MTT qui eseguito ha evidenziato che l'etanolo e gli estratti acquosi di G. gracilis , nelle concentrazioni analizzate, non hanno influenzato la vitalità dei cheratinociti e possono procedere per saggi in vivo per garantire che siano completamente sicuri per l'uso cutaneo umano.

L'uso delle risorse marine nei prodotti alimentari ha dimostrato, ancora una volta, il suo potenziale non solo per ottenere prodotti con valore nutrizionale aggiunto, ma anche per trovare prodotti con un'etichetta più pulita. L'aggiunta di G. gracilis intero (pasta) o estratto (come colorante alimentare) mostra il potenziale del mercato e la sua applicazione potrebbe essere una delle strategie per le aziende per distinguersi sul mercato, soddisfare le esigenze nutrizionali dei consumatori e seguire le tendenze del mercato.

Quando le alghe sono state aggiunte alle formulazioni di pasta, inizialmente si è riscontrato che la struttura era alterata e che non era possibile ottenere le forme di impasto desiderate. Abbiamo avuto la sfida di regolare le quantità e aggiungere altri ingredienti non previsti in precedenza, con l'obiettivo di mantenere la consistenza della pasta. Oltre alla quantità appropriata di ogni ingrediente, il metodo di estrusione è stato adattato durante lo sviluppo della pasta. Al di là di questa difficoltà, lo sviluppo di nuovi prodotti si basa su tre principi fondamentali: il prodotto deve essere sensorialmente accattivante (consistenza, sapore, odore); il prodotto deve avere un valore nutrizionale aggiunto; e deve sfruttare al massimo ingredienti e metodologie sostenibili. In questo senso, un'altra grande sfida è l'uso del pannello sensoriale per ottenere la formulazione più accattivante. La maggior parte delle analisi fisico-chimiche effettuate sulla pasta erano già ottimizzate per matrici alimentari; Tuttavia, in questo lavoro, la preparazione del campione è stata ottimizzata in modo da poter essere applicata in modo efficiente a tutti i metodi di analisi.

Per quanto riguarda l'utilizzo del pigmento G. gracilis come colorante, è stato scelto un prodotto refrigerato per la sensibilità termica di questo tipo di molecola⁴⁵. Poiché la preparazione dello yogurt comporta un trattamento termico, il pigmento è stato aggiunto al prodotto finale. Mescolando il pigmento nello yogurt si otteneva un prodotto leggermente più fluido rispetto al controllo senza pigmento. Infatti, alla fine del test del triangolo, alcuni relatori hanno commentato che l'unica differenza tra i campioni era la consistenza. Si tratta di un buon risultato poiché lo scopo principale del test del triangolo era quello di verificare se ci fossero differenze evidenti tra lo yogurt con e senza pigmento, in particolare le differenze nel gusto e nell'odore, poiché gli estratti di alghe possono conferire un sapore/odore sgradevole ai prodotti alimentari. Si è trattato di uno studio preliminare che ha coinvolto un piccolo gruppo di esperti semi-addestrati. In ulteriori studi, un numero maggiore di assaggiatori dovrebbe essere preso in considerazione per ottenere risultati di mercato più affidabili. Per quanto riguarda la valutazione della stabilità del pigmento nello yogurt, ulteriori studi potrebbero includere la valutazione di altre proprietà fisico-chimiche dello yogurt con pigmento nel tempo, come il pH, l'attività dell'acqua (aw) e la consistenza. Sarebbe auspicabile anche una valutazione sensoriale nel tempo.

In conclusione, i protocolli qui descritti evidenziano il potenziale dell'alga rossa G. gracilis come fonte di ingredienti per sviluppare nuovi prodotti con potenziali applicazioni nell'industria farmaceutica, dermocosmetica e alimentare. Inoltre, la biomassa residua post-estratta rimane un materiale prezioso da applicare come biostimolante per la crescita delle piante, arricchimento del suolo, alimentazione dei pesci o materia prima per ottenere biochar e/o carboni funzionalizzati per scopi di purificazione delle acque. L'approccio della bioraffineria qui descritto può essere applicato ad altre specie di alghe, promuovendo un'economia circolare blu e la sostenibilità ambientale.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute Ethanol	Aga, Portugal	64-17-5
Ammonium Chloride	PanReac	12125-02-9
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	1397-89-3
Analytical scale balance	Sartorius, TE124S	22105307
Bacillus subtilis subsp. spizizenii	German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)	DSM 347
Biotin	Panreac AppliChem	58-85-5
Centrifuge	Eppendorf, 5810R	5811JH490481
Chloramphenicol	PanReac	56-75-7
CO2 Chamber	Memmert	N/A
Cool White Fluorescent Lamps	OSRAM Lumilux Skywhite	N/A
Densitometer McFarland	Grant Instruments	N/A
DMEM medium	Sigma-Aldrich	D5796
DMSO	Sigma-Aldrich	67-68-5
DPPH	Sigma, Steinheim, Germany	1898-66-4
Escherichia coli (DSM 5922)	German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)	DSM5922
Ethanol 96%	AGA-Portugal	64-17-5
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA)	J.T.Baker	6381-92-6
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524
Filter Paper (Whatman No.1)	Whatman	WHA1001320
Flasks	VWR International, Alcabideche, Portugal	N/A
Folin-Ciocalteu	VWR Chemicals	31360.264
Gallic Acid	Merck	149-91-7
Germanium (IV) Oxide, 99.999%	AlfaAesar	1310-53-8
HaCaT cells – 300493	CLS-Cell Lines Services, Germany	300493
Hot Plate Magnetic Stirrer	IKA, C-MAG HS7	06.090564
Iron Sulfate	VWR Chemicals	10124-49-9
Laminar flow hood	TelStar, Portugal	526013
LB Medium	VWR Chemicals	J106
Listonella anguillarum	German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)	DSM 21597
Manganese Chloride	VWR Chemicals	7773.01.5
Micropipettes	Eppendorf, Portugal	N/A
Microplates	VWR International, Alcabideche, Portugal	10861-666
Microplates	Greiner	738-0168
Microplates (sterile)	Fisher Scientific	10022403
Microplate reader	Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA	1611151E
MTT	Sigma-Aldrich	289-93-1
Muller-Hinton Broth (MHB)	VWR Chemicals	90004-658
Oven	Binder, FD115	12-04490
Oven	Binder, BD115	04-62615
Penicillin	Sigma-Aldrich	1406-05-9
pH meter Inolab	VWR International, Alcabideche, Portugal	15212099
Pippete tips	Eppendorf, Portugal	5412307
Pyrex Bottles Media Storage	VWR International, Alcabideche, Portugal	16157-169
Rotary Evaporator	Heidolph, Laborota 4000	80409287
Rotavapor	IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal	07.524254
Sodium Carbonate (Na2CO3)	Chem-Lab	497-19-8
Sodium Chloride (NaCl)	Normax Chem	7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic	Riedel-de Haën	7558-79-4
SpectraMagic NX	Konica Minolta, Japan		color data analysis software
Spectrophotometer	Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA	5A4T092004
Streptomycin	Sigma-Aldrich	57-92-1
Thiamine	Panreac AppliChem	59-43-8
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049
Tryptic Soy Agar (TSA)	VWR Chemicals	ICNA091010617
Tryptic Soy Broth (TSB)	VWR Chemicals	22091
Ultrapure water	Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany	F5HA17360B
Vacuum pump	Buchi, Switzerland	FIS05-402-103
Vitamin B12	Merck	68-19-9