Summary
ここでは、 Gracilaria gracilisの統合的な価値化を目的としたいくつかのプロトコル(野生種の収穫、自社栽培、生物活性成分の抽出)について説明します。抽出物の抗酸化作用、抗菌作用、細胞毒性作用が評価され、海藻バイオマスと色素が豊富に含まれた食品の栄養と安定性の評価も行われます。
Abstract
海藻は、貴重でマルチターゲットの生物活性成分を得るための豊富な原料として、継続的に高まっています。本研究では、化粧品、薬理学、食品、飼料用途の寒天やその他の原料の供給源として商業的に利益を得るために世界中で養殖されている食用紅海藻である Gracilaria gracilisの可能性を探ります。
G. gracilis の生育条件は、栄養繁殖と胞子形成によって最適化され、物理化学的条件を操作して大量のバイオマスストックを達成しました。エタノールと水を用いた緑色抽出法は、海藻バイオマスに対して実施されました。抽出物の生理活性の可能性は、細胞毒性、抗酸化性、および抗菌特性に関する一連の in vitro アッセイを通じて評価されました。さらに、乾燥海藻バイオマスをパスタの配合に取り入れ、食品の栄養価を高めました。 また、G. gracilis から抽出した色素は、天然着色料としてヨーグルトに配合され、その安定性が評価されました。どちらの製品も、市場に出る前に最高の最終処方を達成することを目指して、半訓練された官能パネルの評価に提出されました。
結果は、 G. gracilis がバイオマス全体、抽出物および/または色素として適用されるかどうかにかかわらず、その多様性を裏付けています。この作業は、いくつかの最適化されたプロトコルを実装することで、食品、化粧品、水産養殖市場に利益をもたらす可能性のある製品の開発を可能にし、環境の持続可能性とブルーサーキュラーエコノミーを促進します。
さらに、バイオリファイナリーのアプローチに沿って、残留海藻バイオマスは植物成長のためのバイオスティミュラントとして使用されたり、ポルトガルのレイリアにあるMARE-Polytechnicの社内養殖システムの水質浄化に使用される炭素材料に変換されます。
Introduction
海藻類は、医薬品、食品、飼料、環境分野で利益を得るための興味深い天然原料と見なすことができます。それらは、関連する生物学的特性を持つ、陸生生物には見られない多くの分子を生合成します1,2。しかし、大量のバイオマスストックを確保するためには、海藻に最適化された培養プロトコルを実施する必要があります。
養殖方法は、海藻の性質と全体的な形態を常に考慮する必要があります。 Gracilaria gracilis はクローン分類群であり、付着器官は複数の栄養軸を生成します。このようにして、断片化による伝播(栄養繁殖)が達成され、これらの軸のそれぞれが主葉状体3から独立した生命を完全に採用することができる。クローン分類群は、葉状体を小さな断片に分割することで大量のバイオマスが得られ、それが急速に再生し、遺伝的に同一の新しい個体に成長するため、単純で迅速なワンステップ培養方法とうまく統合できます。このプロセスでは、ハプロンティックタリーとディプロンティックタリーの両方を使用できます。この属は複雑なハプロ-ディプロンティック同型三相性生活環を示すが、改良作物を達成するために株の遺伝的更新が必要な場合を除き、胞子形成はめったに必要ではない。この場合、四胞子(減数分裂によって形成されるハプロン胞子)と手肉胞子(有糸分裂によって形成される双発胞子)の両方が巨視的なタリーを生じさせ、栄養繁殖によって成長および繁殖することができる4。成長サイクルは、着生植物の出現や他の生物の付着などの他の生物学的要因の中でも、環境条件と個体の生理学的状態によって決定されます。したがって、高い生産性を確保し、良質なバイオマスを生産するためには、生育条件の最適化が不可欠です5。
G. gracilisを含む海藻からの生理活性化合物の抽出は、さまざまな方法で達成できます6,7。抽出方法の選択は、対象化合物、目的とする用途、海藻の特性によって異なります。本研究では、海藻バイオマスから水やエタノールなどの緑色溶媒を用いて生理活性物質を溶解・抽出する溶媒抽出に着目しました。抽出は、多用途で効果的な方法でマセラシオンによって行うことができ、幅広い化合物に使用できます。これは、バイオマスを溶媒に長時間浸す、通常は室温またはわずかに高温で行う、シンプルで広く使用されている方法です。溶媒を攪拌して、抽出プロセスを強化します。所望の抽出時間の後、溶媒は濾過または遠心分離によって固体材料から分離される。
水は、その安全性、入手可能性、および幅広い食品との適合性により、食品用途で一般的に使用される溶媒です。水抽出は、多糖類、ペプチド、特定のフェノール類などの極性化合物に適しています。ただし、非極性化合物を効果的に抽出できない場合があります。エタノールは、食品用途でも広く使用されている溶媒であり、フェノール化合物、フラボノイド、特定の色素など、さまざまな生理活性分子の抽出に効果的です。エタノールは一般的に食品に安全に使用できると認識されており、簡単に蒸発して抽出された化合物を残します。抽出方法の選択では、効率、選択性、費用対効果、環境への影響などの要因を考慮する必要があることは注目に値します。溶媒濃度、抽出時間、温度、圧力などの抽出パラメータの最適化は、 G. gracilis やその他の海藻由来の生理活性化合物の最適な収量を達成するために重要です。
海藻類は、細菌、真菌、ウイルスなど、幅広い微生物に対して抗菌活性を示すことがわかっています8。この活性は、フェノール類、多糖類、ペプチド、脂肪酸などの生理活性成分に起因します。いくつかの研究は、 大腸菌、 黄色ブドウ球菌、 サルモネラ 属菌、 緑膿菌などの病原体に対する有効性を実証しています9。海藻の抗菌活性は、微生物の細胞壁、膜、酵素、およびシグナル伝達経路を妨害する可能性のある生理活性化合物の存在に起因します10。これらの化合物は、微生物の増殖を阻害し、バイオフィルムの形成を阻害し、免疫応答を調節する可能性があります。
紅海藻は、シャク植物とも呼ばれ、さまざまな微生物に対して抗菌活性を示すことができる藻類のグループです。このグループ内では、 G. gracilis には、報告されている抗菌活性に寄与する可能性のあるさまざまな生理活性化合物が含まれています。特定の分子はさまざまですが、 G. gracilis で報告され、抗菌特性を持つ可能性のある一般的なクラスは、多糖類、フェノール類、テルペノイド、および色素です11。ただし、これらの成分の存在と量は、海藻の収集場所、季節性、タリーの生理学的条件、環境条件などの要因によって異なる可能性があることに注意することが重要です。したがって、 G. gracilis の抗菌化合物の特定のクラスと濃度は、それに応じて異なる場合があります。
G. gracilis は、フリーラジカルを除去し、酸化ストレスを軽減することが示されているさまざまなフェノール化合物を含む抗酸化特性を保持することもわかっています12。抗酸化物質は、活性酸素種によって引き起こされる損傷から細胞を保護するのに役立ち、潜在的な健康上の利点があります。抗酸化能は、2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル(DPPH)フリーラジカル捕捉活性など、さまざまな方法で直接評価でき、間接的には総ポリフェノール含有量(TPC)の定量化を通じて評価できます13。
成分は顕著な生理活性を有すると報告されていますが、その細胞毒性評価は、生きた細胞や組織と接触して使用される天然および合成物質を評価するために不可欠です。細胞毒性の測定にはいくつかの方法があり、それぞれに利点と限界があります。全体として、それらは、細胞に対する多くの物質の有害な影響を評価すると同時に、細胞の損傷と死のメカニズムを調査するためのさまざまなオプションを提供します14。
この研究では、Mosmann (1983)15によって導入された比色法である3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド(MTT)アッセイを使用します。この方法は、代謝活性細胞によるテトラゾリウム塩の紫色のホルマザン生成物への還元を測定します。ホルマザン結晶の量が多いほど、生細胞の数が多くなり、細胞毒性の間接的な測定値が得られます14。この研究では、 G. gracilis の水とエタノール抽出物を皮膚化粧品の製剤に組み込むことを意図しているため、 in vitro 細胞毒性評価はケラチノサイト(HaCaT)細胞株で行われます。
食品用途に関しては、海藻は一般的に低カロリーで、食物繊維、必須元素、アミノ酸、多糖類、多価不飽和脂肪酸、ポリフェノール、ビタミンが豊富です2,16。G. gracilisも例外ではなく、興味深い栄養価を持っています。Freitas et al. (2021)4 は、養殖された G. gracilis は、野生の海藻と比較して、タンパク質とビタミン C のレベルが高く、総脂質のレベルを維持することを発見しました。これは、栄養学的に言えば、野生資源の開発よりも生産が好ましいため、経済的および環境的利点を表す可能性があります。さらに、消費者は自分が食べる食品の種類にますます関心を持っているため、食品を豊かにするための新しい成分を導入し、新しいリソースを使用して、製品に付加価値を与え、「クリーンラベル」を主張できる抽出物を入手することが重要です。その上、現在の市場は非常に競争が激しく、メーカーを競合他社と差別化するための新製品と革新的な戦略の開発が必要です17。
パスタなどの栄養価の低い商品に海藻などの水産資源を豊富に含め、新たな食品として導入する戦略であり、栄養価の異なる商品による市場の差別化戦略です。一方、 G. gracilis はフィコビリタンパク質18などの天然赤色色素の供給源であり、食品産業への応用が期待されています。この海藻はいくつかの分野で高い関心を示しており、その適用は海藻全体、抽出物、および/または残りのバイオマスを使用して行うことができます。この作業では、そのようなアプリケーションの例をいくつか示します。
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Protocol
1. バイオマスの収穫と調製
- G. gracilisの標本は干潮時に収穫し、乾燥、光、空気への暴露を避けるために、暗くて冷やした箱に入れて実験室にすばやく輸送します。
- 実験室では、各葉状体を流水で洗浄し、完全に洗浄して、破片、壊死部分、着生植物、およびその他の生物を表面から取り除きます。
- 野生バイオマスを常時曝気した海水(31-35 psu)中の気候室(20±1°C)で、日光、涼しい白色、蛍光灯、日長を16:08(明:暗)に設定して7日間保管します。この期間中は、栄養培地を供給しないでください。これにより、海藻は新しい室内条件にゆっくりと順応することができます。
2. 在庫管理
- 馴化期間の後、海藻の健康な先端を滅菌刃で切ります。Redmond et al. (2014)19 に従い、無菌条件下で、ペトリ皿(1.0%の細菌学的寒天培地、蒸留水/海水比1:1)で事前に調製した寒天ゲルに各チップを通し、残っている汚染物質を除去します。各チップに対して寒天ドラッグを3回実行し、常に寒天ゲルの未使用部分にチップをドラッグします。
- ガラス器具を塩酸溶液(HCl、15%)で酸洗浄し、蒸留水で十分にすすいでください。洗浄工程で使用するすべての工具、ガラス器具、寒天、海水、蒸留水をオートクレーブ(121°C、15分)で滅菌します。
注意: サプライヤーから提供されたHClの安全データシートを参照してください。 - Redmond et al. (2014)19によると、チップは35 psuの滅菌海水で成長し、紅海藻用に修飾されたフォン・ストッシュ濃縮溶液(VSE)を添加した。二酸化ゲルマニウム(GeO2)を培地(1 mL/L)に添加し、着生珪藻の増殖を防ぎます。
注意: サプライヤーから提供されたGeO2 の安全データシートを参照してください。
注意: 部分的または全体的な変色によって観察される色素沈着の喪失を示すチップは、ストレスを受けているか、すでに死んでいるため、廃棄する必要があります。
3. 栽培とスケールアップ
- 馴化期間後、20±1°Cに設定された気候室で、約8〜10個の健康なチップを250mLの平底フラスコにランダムに分配し、20±0.5μmol光子m-2 s-1 (1500ルクス)、16時間:8時間(明:暗)に設定した日長、および毎週更新されるVSE培地で濃縮された滅菌海水。
- 毎週の体重測定を行い、タリーに過度に負担をかけないようにします20。このためには、培地からチップを慎重に取り出し、静かにすすぎ、実験室スケールでミリグラムの重量を量ります。
注:この手順は、培養培地の毎週の更新と一緒に実行できます。 - タリは、これらのフラスコ内で最大2 g / Lの密度まで成長する可能性があります。この時点で、レシピエントのスケールアップ(250 mL、1 L、5 L)を行います。容量が5Lに達したら、培養液を50L以上の屋外の開いた白い容器に移します。
- Patarra et al. (2017)21 に従って相対成長率 (RGR) を計算します。
RGR (% fw/day) = ([Ln (fw) - Ln (iw)]/t) x 100
ここで、IWとFWはそれぞれグラム単位で表される最初と最後の生鮮重量であり、tは日単位の時間です。
注:この実験室のセットアップでは、RGRは1日あたり最大21%の値に達します。バイオマス収穫はいつでも行うことができます。バイオマスは、使用目的に応じて、オーブン乾燥、凍結乾燥、または単に冷凍保存(-20°C)のいずれかによって、分解を防ぐために迅速に処理する必要があります。乾燥したバイオマスは、室温(RT)で保存することも、冷凍保存することもできます。
4. 抽出手順
注:G. gracils抽出物のin vitro細胞毒性、抗酸化性、および抗菌性を評価するために、その調製では、抽出温度と溶媒の種類という2つの異なるパラメータが考慮されます。
- 抽出を行うには、 G. gracilis バイオマスをオーブン乾燥し、粉末が200μmのふるいを通過するまでバイオマスを粉砕します(家庭用コーヒーグラインダーなど)。
- 乾燥バイオマス(10g)を秤量し、100mLの溶媒(無水エタノールまたは滅菌水)に溶解します。
- 光から保護された容器で30分間攪拌します。
- 室温、40°C、70°Cで水>エタノール抽出および水>エタノール抽出を連続して行います。
- 各温度について、エタノールと水で別々に2回抽出を行います。
- 濾紙(Whatman No.1)でろ過して残りのバイオマスから液体抽出物を分離し、続いて室温で8000 x g で10分間遠心分離します。
- 残りの藻類バイオマスは、他の溶媒でさらに抽出するために再利用します。サンプルを最初にエタノールで抽出した場合は、次に水で抽出し、その逆も同様です。
- 水性抽出物を凍結乾燥し、40°Cのロータリーエバポレーターでエタノール抽出物を蒸発させます。
- 乾燥抽出物は4°Cで保存します。
- 抽出物を50 mg/mL(抗菌アッセイ)または10 mg/mL(抗酸化アッセイ)の濃度で溶解します。水性抽出物を滅菌水に溶解し、エタノール抽出物を無水エタノールに溶解します。
5.抗菌活性
注:エタノール抽出物と水性抽出物は、 枯草菌(Bacillus subsp . spizizenii )(DSM 347)、 大腸菌 (DSM 5922)、 およびListonella anguillarum (DSM 21597)に対して個別に試験する必要があります。抗菌薬検査は、National Committee for Clinical Laboratory Standards(NCCLS、2012)22の推奨事項に従って実施する必要があります。すべての培養物は、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(DSMZ)から入手しました。 L. anguillarum は、1%塩化ナトリウム(NaCl)を添加したトリプシン大豆ブロス(TSB)またはトリプシン大豆寒天(TSA)で増殖しました。残りの2株はLB培地(VWRケミカルズ)で増殖させた。枯草菌(Bacillus subsp . spizizenii )(DSM 347)および Listonella anguillarum (DSM 21597)の培養物は30°Cでインキュベートし、 大腸菌 (DSM 5922)は37°Cでインキュベートしました。ブロス微量希釈法は、液体培地中の抗菌活性の測定に使用でき、これはミクロスケールで実施し、抗菌ポテンシャルを迅速かつ効率的に決定できるようにする必要があります。この低コストの方法は、わずか24時間で結果を得ることができるため、特定の微生物株に対して、成長阻害作用の観点から結果を得ることができる最良の抽出条件を早期に決定するのに適しています。ただし、この方法論では、微生物の増殖に特異的な蓋を備えた滅菌マイクロプレートの使用と、600 nm波長用のマイクロプレートリーダーの可用性が必要です。
- 170 μL の Muller-Hinton Broth (MHB) を添加し、10 μL の標準化接種物 (0.5 McFarland 標準試料) と 20 μL の各抽出物 (50 mg/mL) を接種した、未処理の丸底 96 ウェルマイクロプレートを使用して、ブロスの微量希釈試験を実施します。
- プレートを各菌株に最適な温度で24時間インキュベートします。
- 0時間および24時間でマイクロプレート分光光度計で光学濃度( OD600)を記録して測定した可視濁度の減少により、抗菌活性を検出します。
- 結果を阻害のパーセンテージで表す:
ここで、Abs. ext は、抽出物の存在下で増殖する細菌株を含むウェルで測定された吸光度の差 (0 時間から 24 時間の間) であり、Abs は、細菌株と溶媒を含むウェルで測定された同じ測定値を指します。 - この方法では、ネガティブコントロールとなる培地のみを含むウェルだけでなく、溶媒(エタノールまたは水)に添加した標準菌株を接種した培地と、細菌株とポジティブコントロール抗生物質(クロラムフェニコール)を培地で接種したウェルを含む対照反応を含めます。
6. 抗酸化作用と総ポリフェノールの定量
- 総ポリフェノール含有量
注:総ポリフェノール含有量(TPC)は、Folin-Ciocalteu法23 を使用して実施され、マイクロスケールに適合しています。- 光から保護した96ウェルマイクロプレートの各ウェルに、158 μLの超純水、2 μLのサンプル、および10 μLのFolin-Ciocalteu試薬を加えます。
注意:サプライヤーから提供されたFolin-Ciocalteu試薬の安全データシートを参照してください。 - 2分後、30μLのNa2CO3(20%)を添加する。
- 室温で暗所で1時間インキュベートした後、サンプルを755 nmで分光光度法で測定します。
- 没食子酸(検量線をプロットできる)または超純水(2 μL)をコントロールとして使用します。
- 結果は没食子酸当量(mg GAE/g抽出物)で表します。
- 光から保護した96ウェルマイクロプレートの各ウェルに、158 μLの超純水、2 μLのサンプル、および10 μLのFolin-Ciocalteu試薬を加えます。
- 2,2ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル(DPPH)ラジカル捕捉活性
注:抽出物の抗酸化活性は、Duan et al.(2006)24によって記述されているように評価され、マイクロスケールに適合しています- 光から保護された 96 ウェルマイクロプレートに、各サンプル 2 μL(濃度 10 mg/mL)と無水エタノール(0.1 mM)に溶解した DPPH 198 μL を入れます。
注意: サプライヤーから提供されたDPPHの安全データシートを参照してください。 - 暗闇のRTで30分間反応を実行します。マイクロプレート分光光度計で517nmの吸光度を測定します。
- 2 μL の無水エタノール/蒸留水と 198 μL の DPPH 溶液でコントロール反応を行います。抽出物2 μLと無水エタノール198 μLでブランク測定を行います。
- 結果は、次の式を使用してDPPH阻害の割合として表されます。
ここで、Asは藻類抽出物の吸光度、Abはブランクサンプルの吸光度、Acはコントロールの吸光度です。
- 光から保護された 96 ウェルマイクロプレートに、各サンプル 2 μL(濃度 10 mg/mL)と無水エタノール(0.1 mM)に溶解した DPPH 198 μL を入れます。
7. 表皮細胞における細胞毒性評価
注:G. gracilisの水性およびエタノール抽出物のin vitro細胞毒性効果は、前述のようにMTT比色アッセイを通じてヒトケラチノサイト(HaCaT細胞-300493)で評価されます25。細胞はCell Lines Services, Germany(CLS)から入手し、この方法は施設のガイドラインおよびCLSの指示に従って実施しました。
注意: サプライヤーから提供されたMTTの安全データシートを参照してください)
- 細胞培養の維持
- 10%ウシ胎児血清(FBS)と1%抗生物質/抗真菌剤溶液(アムホテリシンB、0.25 mM、ペニシリン、60 mM、ストレプトマイシン、100 mM)を添加したダルベッコ改変イーグル高グルコース培地(DMEM)でHaCaT細胞を培養します。
- トリプシン-EDTAを使用して細胞を解離します。
注:HaCaT細胞の継代培養は、細胞が全合流に達した後に行われます。 - 37°C、5%CO2 、湿度95%のチャンバーで細胞を培養します。
- 培養が80%〜85%のコンフルエンスに達するたびに、バイオバンクの指示に従って細胞を継代培養します。
- 細胞毒性評価
- 細胞を96ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした後、HaCaT細胞(4 x 104 細胞/ウェル)をDMSO(100 mg/mL)に溶解した乾燥抽出物で処理します。次に、抽出液2 μLを培地198 μLに加え、プレートを24時間インキュベートします。
- 培地を除去し、100 μLのMTT(0.5 mg/mL)を細胞に加えます。細胞を上記の通常の培養条件で暗所で30分間インキュベートします。
- MTT溶液を除去し、細胞内ホルマザン結晶を100μLのDMSOで可溶化します。
- マイクロプレートリーダーを使用して570nmの吸光度を測定します。結果をコントロールの未処理細胞のパーセンテージとして表します。
8. フード・イノベーション
- 新食品:海藻パスタ
- 材料の選択とパスタの配合
注:材料の選択は、パスタ会社と共同で行われました。主要食材(セクション8.2で説明)の選択は、アクセスのしやすさと既存の生産ラインとの互換性を考慮して行われ、海洋資源を使用して栄養価の高いパスタを入手しました。- 成分を選択したら、スプレッドシートを使用して製剤の理論化学組成を分析し、意図した栄養価(食物繊維、ビタミン、ミネラル元素の供給源、低飽和脂肪)に従って配合を設計します。
- 理論上の要件が満たされたら、ステップ8.1.2で説明されているように、ラボスケールの生産に進みます。
- 半訓練されたパネル(>10人のテイスター)で官能試験を実施し、次のステップで再調合の必要性または調合の受け入れを検証します。
注:パネルは以前にパスタの試飲について訓練を受けており、風味、味、匂い、食感、外観などの属性に関して提示された配合を快楽的に評価しました。
- パスタ製造
注:パスタ押出機を使用して Chifferi パスタサンプルを製造します。- 装置で、米粉、 G.グラシリス、 クロレラ尋 常性クロレラの事前に定義された部分を混合し、混合物に約30%の水を加えます。
- 乾燥パスタを得るには、 Chifferi を68°Cで42分間乾燥させ、続いて76°Cで5時間30分間乾燥させ、工業プロセスをシミュレートします。
- 最後に、サンプルを梱包して真空シールし、さらに分析するまで室温の暗い場所に保管します。
- 栄養分析
注:栄養プロファイル分析には、乾燥および浸軟したサンプルを三重に使用してください。- 粗タンパク質含有量:Duarte et al.(2022)26から適応したKjeldahl法により、ステップ8.1.3.2-8.1.3.6に従って総タンパク質アッセイを実行します。
- 1.0gのサンプル(またはブランクアッセイ用の蒸留水)を正確に秤量し、消化チューブ内で2つのケルダール錠と25 mLのH2SO4 と混合します。
注意: サプライヤーから提供されたH2SO4の安全データシートを参照してください。 - ケルダール消化槽で220°Cで30分間、続いて400°Cで90分間サンプルを分解します。
- 室温まで冷却した後、80mLの蒸留水を加え、形成したアンモニアをブロモクレゾールグリーンおよびメチルレッドを含む4%H3BO3溶液30mLに蒸留する。このステップは、アルカリ性条件下で行われます(ケルダール蒸留器を使用して40%NaOHで蒸留します。
注意: サプライヤーから提供されたブロモクレゾールグリーン、メチルレッド、および40%NaOHを含むH 3 BO3溶液の安全データシートを参照してください。 - 灰色がかったピンク色への色の変化が観察されるまで、蒸留サンプルをHCl 0.1 Mで滴定します。
- サンプルの窒素含有量で表される粗タンパク質含有量を計算し、次の式を使用して100 gあたりのgとして表します。
ここで、Vs はサンプル滴定に使用されるHCl容量(mL)に対応します。Vb はブランクで使用される体積に対応します。N は HCl 正規性に対応します。wは試料重量(g)に相当します。 - 総脂肪含有量:Folch et al.(1957)27から適応したFolch法を使用して、手順8.1.3.8-8.1.3.14に従って総脂肪含有量を決定します。
- CHCl3 と MeOH を 2:1 (v:v) の割合で混合して Folch 試薬を調製します。
注意:サプライヤーから提供されたFolch試薬の安全データシートを参照してください。 - 1 gのサンプルが入った試験管には、5 mLのFolch試薬と0.8 mLの蒸留水を加えます。渦の中で1分間混ぜます。
- 次に、さらに 5 mL の Folch 試薬を加えて 5 分間ホモジナイズし、1.2 mL の 0.8% NaCl 溶液を加えて 2 分間ホモジナイズします。
- サンプルを 7000 x g で 10 分間遠心分離します。有機相(下相)を親水性綿と無水硫酸ナトリウムでろ過し、丸底のガラスフラスコに入れます。
- サンプルの損失を避けるために、5 mLのCHCl3の添加、均質化、遠心分離、およびろ過のステップを同じ条件で繰り返します。
- 低圧蒸発により回収した有機相から有機溶媒を除去し、105°Cのオーブンで4時間放置する。デシケーターでサンプルを冷却します。
- 次の式を使用して、100 gあたりのgとして表される脂肪含有量を計算します。
ここで、W1 は空の丸底ガラスフラスコの重量です。W2 はサンプルの初期重量です。W3 は、試料重量を有する丸底ガラスフラスコである。 - 粗繊維含有量:ISO 6865(2000)28から適応された方法論を使用して、手順8.1.3.16-8.1.3.22に従って粗繊維含有量を決定します。
- サンプル(W0)1gをフィルター底付きのガラスるつぼ(基準P2)に秤量し、ファイバー分析装置に入れます。
- 最初のステップは酸加水分解です:予熱した1.25%H2SO4の150mLと2mLの消泡剤(n-オクタノール)を各るつぼのカラムに加えます。沸騰するまで加熱し、30分間保持します。
- この溶媒を除去した後、脱イオン水で3回洗浄して塩基性加水分解に進みます。予熱した1.25%NaOH150mLと消泡剤5mLを無液カラムに加え、酸加水分解と同様の加熱手順を行います。
- 最後に、150 mLのアセトンで3回洗浄して低温抽出します。
- このプロセスの後、るつぼをシステムから慎重に取り外し、150°Cのオーブンに1時間入れます。最終的な重量 (W1) を記録します。
- るつぼをマッフル炉に500°Cで3時間置き、最終重量(W2)を記録します。
- 粗繊維含有量を計算し、次の式を使用して結果をパーセンテージで表します。
粗繊維の割合 = 100 x (W1-W2)/W0 - 脂肪酸(FA)プロファイル:Fernández et al.(2015)29に従って、手順8.1.3.24-8.1.3.29に従って脂肪酸プロファイルを決定します。
注:脂肪酸メチルエステル(FAME)は、粉砕された凍結乾燥サンプルの直接酸触媒によるトランスメチル化によって得られます。すべての分析は三重に行われます。 - メタノール中の2%(v/v)H2SO4 溶液2 mLを50 mgのサンプルに加え、混合物を80°Cで2時間、連続撹拌しながら注ぎます。
注意: サプライヤーから提供されたメタノールの安全データシートを参照してください。 - 室温まで冷却した後、各サンプルに超純水1 mLとノル マルヘプタン2 mLを加え、混合物を1分間ボルテックスし、5分間遠心分離します。
注意: サプライヤーから提供されたn-ヘプタンの安全データシートを参照してください。 - FAME を含む上層 n-ヘプタン相(有機)を回収し、ガスクロマトグラフィー(GC)バイアルに移します。
- TR-FAMEキャピラリーカラム(内径60m×0.25mm、膜厚0.25μm)、オートサンプラー、フレームイオン化検出器(FID)を搭載したガスクロマトグラフで分析します。
- インジェクター(スプリットレスモード)を 250 °C に設定し、検出器を 280 °C に設定します。 カラムの初期温度を 75 °C に設定し、1 分間保持します。その後、5°C/minで170°Cまで昇降させ、10分間保持します。その後、5°C/minで190°Cまで昇降させ、さらに10分間保持します。最後に、2°C/minで240°Cまで昇温し、10分間保持します。ヘリウムをキャリアガスとして、流速1.5mL/minで使用します。空気と水素をそれぞれ350mL/minと35mL/minの流量で供給します。
- 得られた保持時間を標準値と比較することによりFAプロファイルを決定し、その結果を総脂肪に対する割合で表します。
- 鉱物元素プロファイル:Pinto et al.(2022)30から採用された方法に従い、8.1.3.31-8.1.3.34の手順に従って、ICP-OESによって分析された鉱物元素(Ca、P、Mg、Na、K、Fe、Cu、Mn、Zn)を決定します。
- 各乾燥サンプルの約 0.4 g を正確に秤量し、7.5 mL の HNO3 と 2.5 mL の塩酸を加えます。
注意: サプライヤーから提供されたHNO3 およびHClの安全データシートを参照してください。 - 分解は、30分で室温から90°Cまで温度を上げ(この温度でさらに30分維持)、続いて105°Cで60分という2段階のプロセスに従います。
- サンプル溶液を冷却し、25 mLに希釈し、ろ過してラベル付きチューブに保管します。各分解では、標準物質とブランクを使用して同じプロセスを実行します。ICP-OESによって異なる元素の濃度を取得します。
- 結果は、fw 100 g あたり mg で表します。
- 炭水化物含有量:手順8.1.3.36-8.1.3.37に従って炭水化物含有量を計算します。
- 国連食糧農業機関(FAO;2003)31に従って、次の式を使用して、100 gあたり以前に決定された係数の差によって利用可能な炭水化物(繊維を除く)含有量を計算します31
- 結果は 100 g あたりの g で表します。
- 水分と灰分:手順8.1.3.39-8.1.3.45に従って水分と灰分を推定します。
- 磁器るつぼを105°Cで3時間インキュベートし、デシケーターで冷却し、秤量します。
- 10 gのサンプルをるつぼに秤量し、連続する重み付けの値が10 mgを超えて異なることがなくなるまで、105°Cの乾燥オーブンに3時間サイクル入れます。
- 次の式を使用して、fw 100 g あたり g で表される水分含有量を計算します。
ここで、W1 は空のるつぼの重量、W2 は新鮮なサンプルを含むるつぼの重量、W3 は乾燥サンプルのるつぼの重量です。 - 含水率アッセイ後、乾燥したサンプルを入れたるつぼを525°Cの焼却炉に4時間入れます。
- 連続する重み付けの差が1 mgを超えなくなるまで、この手順を繰り返します。
- サンプルをデシケーターでRTに冷却し、秤量します。
- 次の式を使用して、fw 100 g あたり g として表される灰分を計算します。
ここで、W1 は空のるつぼの重量、W2 は新鮮なサンプルを含むるつぼの重量、W3 は重量のあるるつぼの重量です。 - エネルギー値: 手順 8.1.3.47-8.1.3.48 に従ってエネルギー値を計算します。
- 次の式を使用して、EU規制:消費者への食品情報の提供(規則1169/2011)32に従って、サンプルのエネルギー値を計算します。
エネルギー(kcal/100g)= 4×(タンパク質g)+ 4×(炭水化物g)+ 9×(脂肪g)+ 2×(食物繊維)
エネルギー(kJ / 100 g)= 17 x(gタンパク質)+ 17 x(g炭水化物)+ 37 x(g脂肪)+ 8 x(g繊維) - 結果を100gあたりのキロカロリーと100gあたりのキロジュールで表します。
- 消費者の受容
- 蒸留水で8分間調理したパスタサンプルを使用して、消費者の受容性を評価します。
- 消費者受け入れテストの実施:サンプルの外観、色、食感、匂い、海の味、全体的な味、全体的な評価、および購入意向を評価します。
注:消費者受容テストは、外観、色、食感、匂い、海の味、全体的な味、全体的な評価、および購入意向を1〜9のスケールで評価するヘドニックテストに基づいており、1は悪い評価、9は非常に良い評価です。 - 官能分析ラボの個々の官能ブースで官能試験を実施します(温度と照明の制御付き)。カトラリー、ナプキン、ミネラルウォーターの入ったガラスカップを用意して、サンプル間の口蓋をきれいにします。
注:テイスターは、すべてのバックグラウンド(n > 80)の16〜64歳です。
- 材料の選択とパスタの配合
- ヨーグルト
- 色素抽出
注:色素抽出は、Pereira et al.(2020)18に記載されている方法で行ってください。- 抽出溶媒であるリン酸ナトリウム緩衝液を、二塩基性リン酸ナトリウム(0.03 M)およびリン酸ナトリウム一塩基性(0.07 M)とともに調製します。NaOHまたはHClを使用してpHをpH6.8に設定します。
- G. gracilis1 gを秤量し、50 mLのリン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.8)を加えます。10分間均質化した後、乳鉢と乳棒で10分間浸軟します。
- 溶液をチューブに移し、12,298 x g (4°C)で20分間遠心分離します。
- 上清をプールし、65%硫酸アンモニウムをゆっくりと加えます。硫酸アンモニウムがすべて溶解したら、溶液をアルミニウムシートで覆い、4°Cで一晩沈殿させます。
注意: サプライヤーから提供された硫酸アンモニウムの安全データシートを参照してください。 - 沈殿物を12,298 x g (4°C)で20分間遠心分離します。ペレットを回収し、蒸留水(約5mL)に溶解します。
- チューブメンブレン(14 kDa)を用いて抽出物を水に対して24時間透析した後、凍結乾燥します。凍結乾燥抽出物は、使用するまで4°Cで光から保護して保管してください。
- ヨーグルトの作り方
- 低温殺菌牛乳1L、ナチュラルヨーグルト120g、砂糖20g、粉乳50gをサーモミキサーで5分間、50°C、速度3で混合してナチュラルヨーグルトを調製します。
- 混合物をサーモミキサージャーに入れ、37°Cのインキュベーターで12時間加熱します。
- 抽出物を0.21%の濃度でヨーグルトに混ぜて配合します。サンプルは、分析するまで4°Cのガラスフラスコに保管してください。
- ヨーグルトの個々の部分を色素なしで保存(コントロール)し、分析するまで4°Cで保存します。
- 色の安定性
注:ヨーグルト中の色素の安定性を12日間色分析して評価します。反射率比色計、2 度の標準オブザーバー、および D65 光源を使用して色分析を実行します。結果は、L (明度、黒 - 白、0 - 100)、a* (緑 - 赤、-60 - 60)、b* (青 - 黄、-60 - 60) パラメーターを持つ CIELab 座標として表示されます。パラメータ a* は、赤みがかった色には正の値、緑がかった色には負の値があります。パラメータ b* は、黄色がかった色には正の値を取り、青みがかった色には負の値を取ります。L*は明度のパラメータであり、各色が黒と白の間のグレースケールのメンバーと同等と見なすことができる特性です33。- メーカーが提供する白いセラミックプレート(L * 88.5、a * 0.32、b * 0.33)を使用して測色計を校正します。
- セルに約 28 g のサンプル(またはコントロール)を充填し、カラーデータ解析ソフトウェアを使用して色を分析します。
注:カラーデータ解析に使用したソフトウェアはSpectraMagic NXでした。 - サンプル/コントロールの3回に分けて5回読み取りを行います。
- 官能分析
注:トライアングルテスト(ISO 4120、2004)34 および色、味、および全体的な鑑賞の快楽的評価を使用して、色素を組み込んだヨーグルトの官能評価を実行します。- トライアングルテストでは、パネリストに3つのサンプル(色素入りヨーグルト1サンプルと対照サンプル2サンプル、または色素入りヨーグルト2サンプルと対照1サンプル)を渡し、香り、食感、味に基づいて別のサンプルを選択してもらいます。ランダムな 3 桁のコードで識別された類似量のサンプルを提供します。
- 色素入りヨーグルトの快楽的評価では、パネリストに色素入りヨーグルトのサンプルを渡し、9段階の快楽的尺度(極端に嫌いから極端に好き)を用いて、色、味、全体的な評価を評価してもらいます。
- 色素抽出
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Representative Results
抗菌活性
得られた結果を解釈する際には、阻害の割合が高いほど、その特定の菌株の増殖を阻害する抽出物の有効性が高くなり、その結果、抽出物が抗菌剤としてより興味深いものになることに留意する必要があります。この方法論により、特定の細菌株に対してより大きな活性を持つ抽出物を迅速に特定し、将来の使用に関して最も興味深いものを特定することもできます。したがって、同じ抽出物に関するさらなる研究の出発点を持つことができます。
図1は、第1および第2の抽出において、バイオマス乾燥直後(図1A)および第3および第4の抽出(図1B)において、エタノール抽出後に得られた水性抽出物で得られた結果を示しており、したがって、バイオマスを一体的に使用する。3回目と4回目の水性抽出に対応する最も興味深い結果は、特に70°Cで得られた抽出物において、より高い抗菌活性を明らかにしていることがわかります。 ウェル中の抽出物の濃度は 5 mg/mL です。
図1:G. gracilisの水性抽出物の存在下での細菌種の増殖阻害。異なる温度、室温(RT)、40°C(40)および70°C(70)で得られたG.グラシリスの水性抽出物(Aq)の存在下で、液体培地中で24時間増殖した後の3つの細菌種(枯草菌、大腸菌、Listonella anguillarum)の成長阻害。ポジティブコントロールはクロラムフェニコール(CHL)で行われ、結果は平均値(n = 8)として表されます。データは、4つの連続抽出ステップ(1st、2nd、3rd、4th)を参照しています。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
エタノール抽出物は、図2に示すように、L. anguillarumの増殖を阻害するのに特に効果的であるようです。これは、エタノール抽出物を用いて得られた結果を示しており、また、第1および第2の抽出(図2A)および第3および第4の抽出(図2B)において、第1の水性抽出後に得られた。
図2:G. gracilisのエタノール抽出物の存在下での細菌種の増殖阻害。3つの細菌種(枯草菌、大腸菌、Listonella anguillarum)の増殖阻害は、液体培地中で、異なる温度、室温(RT)、40°C(40)および70°C(70)で得られたG.gracilisのエタノール抽出物(Et)の存在下での24時間の成長。ポジティブコントロールはクロラムフェニコール(CHL)で行い、結果は平均値(n = 8)で表しました。データは、4つの連続抽出ステップ(1st、2nd、3rd、4th)を参照しています。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
抗酸化作用
DPPH試験において、各種抽出物の抗酸化能を浮き彫りにした結果については、 図3 に示す結果は、40°Cの温度が最も効果的であり、室温または70°Cで得られた抽出物で観察されたものよりも酸化活性の阻害値が高いことを示しています。 これは G. gracilis のサンプルにも当てはまり、使用するサンプルや藻類の生育条件によって大きなばらつきが生じる可能性があります。したがって、特定の種類のサンプルごとに最適な条件を示すためにテストを実行することをお勧めします。
図3: 異なる温度で得られた抽出物の存在下でのDPPHラジカルの阻害(%)。 抽出物は、エタノール(Et)または水性(Aq)抽出によって得られました。第1回 および第2回の 抽出は、乾燥バイオマスから順次行った。残りのもの(3番目 と4番目)は、以前に代替溶媒で抽出されたバイオマスで作られました。RTは室温を意味します。40、40°Cで得られた抽出物;70、70°Cで得られた抽出物。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
ポリフェノールの総定量に関しても同様の結果が得られ(図4)、抗酸化化合物の抽出に関しては40°Cの温度が最適であると考えられました。これは、抗酸化活性が抽出物中に存在するフェノール成分と相関しているように見えることを示しています。
図4:異なる温度で得られた抽出物中の総ポリフェノール含有量(TPC)の定量。抽出物は、エタノール(Et)または水性(Aq)抽出によって得られ、1番目と2番目の抽出は乾燥藻類から順次行われ、残り(3番目と4番目)は以前に別の溶媒で抽出されたバイオマスで作られました。RTは室温を意味します。40、40°Cで得られた抽出物;70、70°Cで得られた抽出物。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
HaCat細胞における細胞毒性
化粧品成分の安全性を評価するための最初のステップは、表皮および真皮細胞株における in vitro 細胞毒性の研究です。 図5に見られるように、ケラチノサイト(HaCaT細胞)には細胞毒性効果は観察されず、最大アッセイ濃度(1 mg/mL)では、水性抽出物とエタノール抽出物の両方が皮膚での使用に安全であることが示唆されています。
図5:Gracilaria gracilis抽出物(1 mg/mL)の24時間処理後のHaCaT細胞に対する細胞毒性効果。各列の値は、3つの独立した実験の平均±標準誤差(SEM)として表されます。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
食のイノベーション
最終的なパスタの調合は、半訓練を受けたパネルによる理論的な調合と官能試験の間の多数の試行の後に得られました。このステップの後、栄養評価、脂肪酸、ミネラル元素プロファイルなどの化学的特性評価にアクセスしました。栄養特性評価(表1 および 表2)を構築し、欧州の法律(REG(EU)No.1169/2011)32に基づいて予想される栄養表示の存在を検証することができました。
| 栄養成分 | パスタ100gで | %RDIの | |
| エネルギー | 1478.90 kJ (348.74 kcal) | 17 | |
| 脂質 | 1.06 ± 0.10 グラム | 2 | |
| 何から： | |||
| 飽和脂肪酸 | 0.38 ± 0.01 グラム | 2 | |
| 炭水化物 | 72.59± 0.21 グラム | 28 | |
| 繊維 | 3.84 ± 0.20グラム | ||
| 蛋白質 | 10.29 ± 0.20グラム | 21 | |
| 塩 | 0.22 ± 0.02 グラム | 9 | |
表1: 栄養成分。計算によって得られたエネルギーと炭水化物の化学分析(n = 3)と推奨用量摂取量のそれぞれの割合(n = 3)に基づく開発パスタの栄養成分。
これらのパスタの配合は、より健康的な食生活を念頭に置いているターゲット消費者にアピールするように設計されているため、製品100 gあたりの脂肪の量はできるだけ少なくする必要があります。脂肪酸プロファイルを詳細に分析したところ、飽和脂肪酸100gあたり0.38gという値が得られ、これは低飽和脂肪製品の限界値をはるかに下回っており、このパスタの製造における当初の目標を達成しています。繊維含有量に関しては、ヨーロッパの規制に従って、このパスタ配合を繊維源として主張することも可能でした。
ICP-OESで測定した表 2に示す鉱物元素の特性評価では、本品100g中に存在するNaが約219mg/100gと報告されており、ナトリウム含有量の少ない製品(<0.12g/100g)とは確認できない。成分に自然に存在するナトリウム含有量が高いため、この製品は菓子に塩を添加する必要がない場合があります。
表2:パスタのミネラル元素プロファイル。 青 - 元素の含有量が高い。赤 - 特定の要素のソース(n = 3)。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
参照された欧州連合の規制と各元素のRDI%によると、この製品はK、P、Feの含有量が高く、Znの供給源でもあることがわかります。Se、Mg、Caが少量存在します。
パスタ受入試験には、86人のテスターが使用され、そのうち63人が女性、23人が18歳以上の男性でした。受け入れテストは、基準で規定されているように、9ポイントの快楽スケールに基づいて行われました。ヘルシーな生地は、1から9までの快楽スケールで、「海の味」と「外観」のパラメータでそれぞれ5と6を獲得しました(図6)。
図6:消費者の官能受容テストの結果。 (A)視覚的な外観、色、質感、匂い、海の味、および全体的な味の快楽的な選択。(B)全体的な評価と購入意向のための快楽的な選択。スケール 1 から 9 で、1 は悪い評価、9 は非常に良い評価です (n = 86)。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
パスタは、「海の味」と「見た目」のパラメータについて、1から9までの快楽スケールでそれぞれ5と6を獲得しました(図6A)。このパスタは、おそらくベース成分が米粉であるため、食感パラメータに関してこのスケールで低い値を得ました(すでに研究されている他の処方を考慮してください)。それにもかかわらず、平均的な消費者による良好な受容を反映した4から7の範囲の1から9までのスケールで値を取得しました。1から9までの快楽的尺度では、 図6Bに示すように、パスタは購入意向の5の値と全体的な評価の6の値が最も頻繁でした。テイスターの約65%が、このパスタの総合評価で6点以上の回答を選択したことがわかりました。色素を含むヨーグルトの色安定性を-4°Cで12日間評価し、その結果を 図7に示します。
図7: ヨーグルトの色の安定性。 (写真左)ヨーグルトと(右)ヨーグルトをグラシ ラリア・グラシリス 色素で12日間保存した。a*、b*、および L* パラメーターは無次元です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
結果は、a*パラメータとb*パラメータが経時的に安定しているのに対し、L*値はより高い分散を示していることを示しています。軽さは、8日間の保管後により高い値を示しました。明度パラメータにはいくつかの違いが見られ、サンプルが時間の経過とともに明るくなっていることが示されましたが、赤み(a*)と青(b*)のパラメータは良好な安定性を示しました。抽出物をヨーグルトに組み込んだところ、12日間の保存後のΔEは7.01±2.36で、良好な色保持が示されました。ヨーグルトの官能評価については、13人中9人のパネリストがトライアングルテストで正しいサンプルを正しく識別しており、この区別を可能にするヨーグルト間に違いがあることが示唆されました。半訓練されたパネルに対して行われた快楽テストは、7を超えるスコアに反映され、製品の良好な受容性を示しました(図8)。テスト対象の 3 つの属性のいずれかのスコアの最頻値は 9 であり、スコアの平均は 8 を超えました。最も評価が高かったのは色で、パネルによる優れた受容を反映しており、明らかな結果となりました。
図8:Gracilaria gracilis色素を用いたヨーグルトの快楽官能評価結果。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
液体培地中の抗菌活性試験は、液体培地に懸濁した微生物に対する抗菌物質の有効性を評価するために使用され、通常、微生物の成長を阻害または殺す物質の能力を決定するために実行されます35、36、37、38.それらは、抗菌剤に対する微生物の感受性を評価するために使用され、試験管または微量滴定プレートで実施され、そこでは、異なる濃度の抗菌物質が標的微生物の標準化された懸濁液に対して試験される22。抗菌活性は、適切なインキュベーション期間後の培地中の微生物の増殖または濁りの有無を測定することによって評価されます。
これらの試験を実施するには、ブロス希釈法、寒天拡散法(ディスク拡散試験など)、および最も使用されている38の1つであるブロス微量希釈法など、いくつかの技術と方法があります。これらの方法の最も重要なポイントには、接種物の適切な調製、培地の選択、使用する抗菌薬の品質、技術の標準化、効果的な汚染管理などがあります。微生物の標準化された懸濁液である接種物は、結果の正確性を確保するために正しく調製されなければなりません。これには、微生物培養の適切な選択、純粋な菌株の適切な培養、細胞濃度の調整、および適切な光学密度または細胞濃度を得るための懸濁液の標準化が含まれます。
使用する培地は、試験中の微生物にとって理想的な増殖条件を提供するように慎重に選択する必要があります。化学組成、pH、およびその他の要因がテスト結果に影響を与える可能性があります。培地の調製については、メーカーの推奨事項に従うことが重要です。防除に使用される抗菌剤の品質は基本であり、これらが純粋で、保存期間内であり、正しく保管されていることを確認することが重要です。ラベルと有効期限は、製造元の指示に従って、常に参照する必要があります。また、結果の精度を確保するためには、技術の標準化も重要です。これには、試験濃度の培地への添加、および手順全体の無菌状態の維持が含まれます。さらに、試験中の微生物の二次汚染は、誤った結果や信頼性の低い結果につながる可能性があります。接種液の操作からチューブやプレートのインキュベーションまで、手順全体を通して厳格な無菌慣行に従うことが不可欠です。清潔なカウンタートップの使用、適切なピペッティング技術、および材料の適切な廃棄は、汚染を回避するための重要な手段です。
細部にまで注意を払い、確立されたプロトコルとガイドラインを厳守することは、液体培地での抗菌活性試験におけるエラーを最小限に抑え、結果の信頼性を確保するために重要です。また、抗菌活性試験には、考慮すべきいくつかの制限があります37。
これらの試験では、pH、温度、血液成分の存在、免疫系との相互作用などの要因が考慮されないため、生体における抗菌剤の有効性を予測する能力が制限される可能性があります。また、試験は、抗菌物質が微生物の増殖を阻害または殺す能力を測定するものであり、抗菌剤の作用機序や特定の微生物に対する選択性に関する詳細な情報は提供されません。採用された方法では、時間の経過に伴う抵抗の発現を検出または予測できない場合があるため、抵抗の検出には制限があります。一部の微生物は、抗菌剤への長期曝露に反応して耐性メカニズムを発達させる可能性があり、これらの変化はこれらのテストでは簡単に検出できない場合があります。液体培地中の抗菌活性の試験では、一般に、バイオフィルムの存在や宿主の免疫応答など、抗菌剤の有効性に影響を与える可能性のある他の宿主因子は考慮されません。
これらの限界を考慮し、in vivo 研究、バイオフィルムモデルなど、他の方法やアプローチで液体培地中の抗菌活性の試験を補完することが重要です39。生物活性大型藻類化合物のバイオプロスペクティングの分野では、抗菌活性試験を使用して、藻類抽出物または単離された化合物の抗菌性を評価し、医薬品、化粧品、食品、農産物などの分野で応用できる特定の微生物病原体に対して抗菌活性を有する物質を特定することができます40。
抗酸化活性試験は、化合物または抽出物がフリーラジカルを中和したり、酸化ストレスを軽減したりする能力を評価するために使用される方法です。これらの試験は、食品や藻類などの天然物など、抗酸化物質の研究で広く使用されています。抗酸化活性を評価する方法はいくつかありますが、最も一般的に使用される方法の1つはフリーラジカル吸収能力です。この試験では、安定したフリーラジカルである2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル(DPPH)を使用して、化合物が電子を供与し、フリーラジカルを中和する能力を評価します。抗酸化活性は、抗酸化化合物がフリーラジカルに電子を供与するときに発生するDPPHの紫色を減少させることによって測定されます。他の方法には、酸素ラジカル吸収能(ORAC)、鉄還元能(FRAP)、フリーラジカル還元能(ABTS)などがあります41。
一方、総ポリフェノールの定量(QTP)は、抗酸化活性を決定するための直接的な方法ではありませんが、サンプル中のポリフェノールの総濃度の尺度を提供しますが、いくつかの干渉物質が結果に影響を与える可能性があります。多くのポリフェノールは抗酸化特性を有することが知られているが、化合物の抗酸化活性は、その化学構造、濃度、フリーラジカルを供与または捕捉する能力、および他の細胞成分との相互作用など、いくつかの要因に関連している42。総ポリフェノールの単純な定量では、サンプルの抗酸化活性を評価することはできません。ただし、多くのポリフェノールは抗酸化特性を持っているため、サンプル中のポリフェノールの存在は抗酸化活性の可能性が高くなる可能性があることに注意することが重要です。したがって、QTPはサンプル中のポリフェノールの存在の予備的な指標として機能し得るが、抗酸化活性の確認には抗酸化活性アッセイが必要である。ポリフェノールは、自然界に広く分布する化合物の一種で、食品、植物、果物、野菜、藻類に含まれています。総ポリフェノールの定量にはさまざまな方法があり、Folin-Ciocalteu法は最もよく使用される方法の1つです。QTPは、ポリフェノールの濃度の一般的な尺度を提供しますが、サンプル中に存在する個々のポリフェノール化合物を特定するものではありません。したがって、これは定量的方法であり、定性的方法ではありません。さらに、ポリフェノールが異なれば抗酸化能や生物活性も異なることを考慮することが重要であるため、QTPは存在するポリフェノールの特定の機能特性に関する詳細な情報を提供していません。
各方法には利点と制限があり、特定のテストの選択は、研究中の化合物の特性と分析の目的によって異なります。信頼性が高く比較可能な結果を得るために、各方法の特定の指示に従うことが重要です。抗酸化能を決定する際、一般的な重要なステップには、まずサンプルの調製が含まれます。サンプルを正しく調製し、適切な濃度が得られるようにし、汚染を回避することが重要です。これには、化合物または抽出物を正確に計量し、適切な溶媒に溶解することが含まれます。また、調製、保管、取り扱いの過程での化合物や抽出物の安定性を考慮することも重要です。抗酸化活性試験で使用されるすべての試薬は、結果の再現性を確保するために適切に調製され、標準化されなければなりません。これには、没食子酸標準試料の正しい調製と容量の正確さが含まれます。反応時間は、抗酸化試験で正確な結果を得るための重要な側面です。抗酸化化合物とフリーラジカルの完全な反応を確実にするために、インキュベーション時間を最適化する必要があります。時間が足りないと抗酸化活性が過小評価され、時間が長すぎると化合物の分解や二次反応による干渉につながる可能性があります。また、試験中の温度は正確かつ一貫して制御する必要があります。温度は化学反応の速度に影響を与え、結果に影響を与える可能性があります。特定の方法で推奨される温度条件に従い、手順全体を通して温度安定性を確保することが重要です。抗酸化試験の結果を検証するには、適切なコントロールを含めることが不可欠です。これには、ポジティブコントロール(抗酸化活性を有することが知られている化合物)およびネガティブコントロール(抗酸化活性を持たないサンプル)が含まれます。コントロールは、結果の解釈のための比較の基礎を提供し、得られたデータの正確性を確保するのに役立ちます。信頼性の高い結果を得るには、繰り返しで抗酸化活性の試験を行い、実験を数回繰り返して、データの有意性を高め、より信頼性が高く堅牢な結果を得ることをお勧めします。
抗酸化活性試験法には、結果を解釈する際に考慮すべきいくつかの制限があります、すなわち、液体培地では、生物学的システムの複雑さと異なる化合物間の相互作用、発生する可能性のある幅広い抗酸化反応、細胞代謝、および抗酸化活性に影響を与える可能性のある環境要因を完全に捉えていない可能性があるという事実。したがって、別のテストを使用する必要があります。また、健康上の利点との直接的な相関関係がないことにも注意する必要があります。抗酸化活性はしばしば健康上の利点と関連していますが、バイオアベイラビリティ、代謝、他の生物学的システムとの相互作用など、他の多くの要因により、これは必ずしも生体の健康上の利点に直接変換されるとは限りません。
抗酸化活性試験は、化合物や抽出物の抗酸化能を初期評価するための有用なツールですが、生物学的効果や健康上の利点の決定的な指標と見なされるべきではないことに留意することが重要です。抗酸化物質が体に及ぼす影響を完全に理解するには、さらなる研究が必要です。
液体培地中の抗酸化活性を試験する方法は研究で広く使用されており、利点と制限がありますが、代替方法と比較すると、これらの方法は実用性、速度、コスト、および実装の容易さの点で優れていると見なすことができます。主な利点の1つは、手順のシンプルさとスピード、および初期研究、化合物スクリーニング、および大規模な研究への適合性です。これらの方法は比較的迅速に実行でき、他の方法と比較して、より手頃な方法で短期間で結果を得ることができ、必要な特殊機器が少なくて済みます。
藻類は、抗酸化物質を含む生理活性化合物を生産する能力で知られており、有益な健康特性を持っている可能性があります43。藻類抽出物は、藻類のさまざまな部分から調製することができ、水、エタノール、メタノール、アセトンなどのさまざまな溶媒を使用して得ることができます。藻類抽出物の抗酸化活性は、藻類の種類、抽出方法、存在する生理活性化合物の濃度など、いくつかの要因によって異なる可能性があることを覚えておくことが重要です。したがって、より信頼性の高い結果を得るために、繰り返しに対して抗酸化活性試験を実施し、適切なコントロールとの比較を行うことをお勧めします。これらの方法は、さらなる研究のために、抗酸化能を有する藻類抽出物のスクリーニングおよび選択における最初のツールとして使用できます。
MTTアッセイは、ヒトおよび動物用の物質の in vitro 細胞毒性効果の予備評価に広く使用されている技術です。しかし、細胞毒性を試験するために最もよく使用される方法であるにもかかわらず、MTTのホルマザン結晶への変換は、代謝率やミトコンドリアの数などの多くの要因の影響を受け、接着細胞の標的にのみ適用できます14。ここで説明するプロトコールの主な重要なステップは、細胞培養のコンタミネーション、望ましくないHaCaT細胞の増殖、および細胞のコンフルエント率の低さの最終的な発生に関連しています。細胞毒性を測定するための乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)、アデノシン三リン酸(ATP)、コロニー形成アッセイなど、他の方法もあります。ただし、それらすべてに利点と制約があります。Ghasemi et al.(2021)44 は、前立腺がん細胞株(PC-3)のMTTアッセイ測定に対するいくつかの変数の影響を評価しました。細胞播種密度、MTT濃度、MTT添加後のインキュベーション時間、血清飢餓、細胞培養培地の組成、放出された細胞内内容物、細胞外空間へのホルマザンの押し出しなどの要因を分析しました。この研究から、アッセイの適用方法に関する有用な推奨事項と、アッセイの有用性が強力なツールであるが、同様に限界がある場合についての視点が、これらの著者によって概説されました。それにもかかわらず、MTTアッセイは迅速で高感度かつ簡単な方法論であり、治療、食品、飼料、農業、および環境分野での応用が見込まれる多くの物質の予備的な細胞毒性評価として適用できます。特に、ここで実施されたMTTアッセイは、アッセイされた濃度の G.gracilis からのエタノールおよび水性抽出物がケラチノサイトの生存率に影響を与えず、in vivo アッセイに進むことができ、ヒトの皮膚使用に対して完全に安全であることを保証するために行うことができることを証明しました。
水産資源を食品に利用することで、栄養価の高い製品を得るだけでなく、よりクリーンなラベルの製品を見つける可能性を改めて示しています。 G.グラシリス (パスタ)または抽出物(食品着色料として)の添加は市場の可能性を示しており、その適用は、企業が市場で際立っており、消費者の栄養ニーズを満たし、市場動向を追うための戦略の1つになる可能性があります。
海藻をパスタの配合物に加えると、当初、構造が変化し、所望の生地形状が得られないことが分かった。パスタの食感を保つために、量を調整したり、今まで想定していなかった具材を加えたりという課題がありました。各材料の適切な量に加えて、パスタの開発全体を通して押し出し方法が適応されました。この難しさとは別に、新製品の開発は3つの基本原則に基づいています。製品には栄養価が付加されている必要があります。そして、持続可能な原料と方法論を最大限に活用する必要があります。この意味で、もう一つの大きな課題は、最も魅力的な処方を実現するための官能パネルの使用です。パスタで実施された物理化学的分析のほとんどは、すでに食品マトリックスに最適化されています。しかし、この研究では、すべての分析法に効率的に適用できるように、サンプル調製を最適化しました。
着色剤としての G. gracilis 色素の使用に関しては、この種の分子の熱感受性のために冷蔵製品が選択された45。ヨーグルトの調製には熱処理が含まれるため、最終製品に顔料を添加しました。ヨーグルトに色素を混合すると、色素を含まない対照群よりもわずかに流動性の高い製品が得られました。実際、トライアングルテストの最後に、何人かのパネリストは、サンプル間の唯一の違いはテクスチャーであるとコメントしました。トライアングルテストの主な目的は、海藻抽出物が食品に不快な味/匂いを与える可能性があるため、色素の有無にかかわらず、ヨーグルトの違い、特に味と匂いの違いが顕著であるかどうかを確認することであったため、これは良い結果です。これは、少人数の半訓練パネルを含む予備研究でした。さらなる研究では、より信頼性の高い市場結果を達成するために、より多くのテイスターを検討する必要があります。ヨーグルト中の色素安定性の評価については、pH、水分活性(aw)、食感など、色素を含むヨーグルトのその他の物理化学的特性の経時的な評価がさらなる研究に含まれる可能性があります。経時的な官能評価も望ましいでしょう。
結論として、ここで説明するプロトコルは、製薬、皮膚化粧品、および食品業界での潜在的な用途を持つ新規製品を開発するための成分源としての紅海藻 G.gracilis の可能性を強調しています。さらに、抽出 後の残留バイオマスは、植物成長のバイオスティミュラント、土壌強化、魚の餌、または水質浄化の目的でバイオ炭および/または機能化炭素を得るための原料として適用される貴重な材料であり続けています。ここで説明するバイオリファイナリーのアプローチは、他の海藻種にも適用でき、ブルーサーキュラーエコノミーと環境の持続可能性を促進します。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
この研究は、MARE-Marine and Environmental Sciences Centre(UIDP/04292/2020およびUIDB/04292/2020)およびAssociate Laboratory ARNET(LA/P/0069/2020)に付与された戦略的プロジェクトを通じて、ポルトガル科学技術財団(FCT)の支援を受けました。FCTはまた、Marta V. Freitas(UI/BD/150957/2021)とTatiana Pereira(2021.07791. BD)。この作業は、ポルトガル2020プログラムの下でERDF(欧州地域開発基金)が共同出資するプロジェクトHP4A(すべての人のための健康的なパスタ)(共同プロモーション番号039952)によっても財政的に支援され、COMPETE 2020 - 競争力と国際化運用プログラムを通じて行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute Ethanol | Aga, Portugal | 64-17-5 | |
| Ammonium Chloride | PanReac | 12125-02-9 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| Analytical scale balance | Sartorius, TE124S | 22105307 | |
| Bacillus subtilis subsp. spizizenii | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 347 | |
| Biotin | Panreac AppliChem | 58-85-5 | |
| Centrifuge | Eppendorf, 5810R | 5811JH490481 | |
| Chloramphenicol | PanReac | 56-75-7 | |
| CO2 Chamber | Memmert | N/A | |
| Cool White Fluorescent Lamps | OSRAM Lumilux Skywhite | N/A | |
| Densitometer McFarland | Grant Instruments | N/A | |
| DMEM medium | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | |
| DPPH | Sigma, Steinheim, Germany | 1898-66-4 | |
| Escherichia coli (DSM 5922) | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM5922 | |
| Ethanol 96% | AGA-Portugal | 64-17-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA) | J.T.Baker | 6381-92-6 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Filter Paper (Whatman No.1) | Whatman | WHA1001320 | |
| Flasks | VWR International, Alcabideche, Portugal | N/A | |
| Folin-Ciocalteu | VWR Chemicals | 31360.264 | |
| Gallic Acid | Merck | 149-91-7 | |
| Germanium (IV) Oxide, 99.999% | AlfaAesar | 1310-53-8 | |
| HaCaT cells – 300493 | CLS-Cell Lines Services, Germany | 300493 | |
| Hot Plate Magnetic Stirrer | IKA, C-MAG HS7 | 06.090564 | |
| Iron Sulfate | VWR Chemicals | 10124-49-9 | |
| Laminar flow hood | TelStar, Portugal | 526013 | |
| LB Medium | VWR Chemicals | J106 | |
| Listonella anguillarum | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 21597 | |
| Manganese Chloride | VWR Chemicals | 7773.01.5 | |
| Micropipettes | Eppendorf, Portugal | N/A | |
| Microplates | VWR International, Alcabideche, Portugal | 10861-666 | |
| Microplates | Greiner | 738-0168 | |
| Microplates (sterile) | Fisher Scientific | 10022403 | |
| Microplate reader | Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA | 1611151E | |
| MTT | Sigma-Aldrich | 289-93-1 | |
| Muller-Hinton Broth (MHB) | VWR Chemicals | 90004-658 | |
| Oven | Binder, FD115 | 12-04490 | |
| Oven | Binder, BD115 | 04-62615 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1406-05-9 | |
| pH meter Inolab | VWR International, Alcabideche, Portugal | 15212099 | |
| Pippete tips | Eppendorf, Portugal | 5412307 | |
| Pyrex Bottles Media Storage | VWR International, Alcabideche, Portugal | 16157-169 | |
| Rotary Evaporator | Heidolph, Laborota 4000 | 80409287 | |
| Rotavapor | IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal | 07.524254 | |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Chem-Lab | 497-19-8 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Normax Chem | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Riedel-de Haën | 7558-79-4 | |
| SpectraMagic NX | Konica Minolta, Japan | color data analysis software | |
| Spectrophotometer | Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA | 5A4T092004 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | 57-92-1 | |
| Thiamine | Panreac AppliChem | 59-43-8 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tryptic Soy Agar (TSA) | VWR Chemicals | ICNA091010617 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | VWR Chemicals | 22091 | |
| Ultrapure water | Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany | F5HA17360B | |
| Vacuum pump | Buchi, Switzerland | FIS05-402-103 | |
| Vitamin B12 | Merck | 68-19-9 |
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