Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Valorisering av Red Seaweed Gracilaria gracilis gjennom en bioraffineri tilnærming

Published: November 21, 2023 doi: 10.3791/65923
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1, 1, 1
1MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, ESTM, Polytechnic University of Leiria, 2MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, Department of Life Sciences, University of Coimbra

Summary

Her beskriver vi flere protokoller som tar sikte på en integrert valorisering av Gracilaria gracilis: høsting av ville arter, intern vekst og utvinning av bioaktive ingredienser. Ekstraktenes antioksidanter, antimikrobielle og cytotoksiske effekter evalueres, sammen med ernærings- og stabilitetsvurdering av mat beriket med hel tangbiomasse og pigmenter.

Abstract

Interessen for tang og tare som et rikt råstoff for å oppnå verdifulle og multitarget bioaktive ingredienser vokser kontinuerlig. I dette arbeidet undersøker vi potensialet til Gracilaria gracilis, en spiselig rød tang dyrket over hele verden for sin kommersielle interesse som en kilde til agar og andre ingredienser for kosmetiske, farmakologiske, mat og fôrapplikasjoner.

G. gracilis-vekstforholdene ble optimalisert gjennom vegetativ forplantning og sporulering mens man manipulerte de fysisk-kjemiske forholdene for å oppnå en stor biomassebestand. Grønne ekstraksjonsmetoder med etanol og vann ble utført over tangbiomassen. Det bioaktive potensialet til ekstrakter ble vurdert gjennom et sett in vitro-analyser vedrørende deres cytotoksisitet, antioksidanter og antimikrobielle egenskaper. I tillegg ble tørket tangbiomasse inkorporert i pastaformuleringer for å øke matens næringsverdi. Pigmenter ekstrahert fra G. gracilis har også blitt innlemmet i yoghurt som et naturlig fargestoff, og deres stabilitet ble evaluert. Begge produktene ble sendt til takknemlighet for et halvtrent sensorisk panel med sikte på å oppnå den beste endelige formuleringen før de nådde markedet.

Resultatene støtter allsidigheten til G. gracilis enten den brukes som en hel biomasse, ekstrakter og / eller pigmenter. Gjennom implementering av flere optimaliserte protokoller, gjør dette arbeidet det mulig å utvikle produkter med potensial til å tjene mat-, kosmetikk- og akvakulturmarkedene, fremme miljømessig bærekraft og en blå sirkulær økonomi.

Videre, og i tråd med en bioraffineritilnærming, vil den gjenværende tangbiomassen bli brukt som biostimulant for plantevekst eller omdannes til karbonmaterialer som skal brukes i vannrensing av de interne akvakultursystemene til MARE-Polytechnic i Leiria, Portugal.

Introduction

Tang og tare kan betraktes som et interessant naturlig råmateriale som skal profitteres av farmasøytiske, mat-, fôr- og miljøsektorer. De biosyntetiserer en rekke molekyler, mange som ikke finnes i terrestriske organismer, med relevante biologiske egenskaper 1,2. Imidlertid må tangoptimaliserte dyrkingsprotokoller implementeres for å sikre en stor biomassebestand.

Dyrkingsmetoder må alltid ta hensyn til tangens thalli og generell morfologi. Gracilaria gracilis er et klonalt takson, noe som betyr at festeorganet produserer flere vegetative akser. Forplantning ved fragmentering (vegetativ reproduksjon) oppnås dermed, da hver av disse aksene er fullt i stand til å vedta et uavhengig liv fra hovedthallus3. Klonal taxa kan med hell integreres med enkle og raske ett-trinns dyrkingsmetoder, da store mengder biomasse oppnås ved å splitte thallus i små fragmenter som raskt regenererer og vokser til nye, genetisk identiske individer. Både haplontiske og diplontiske thalli kan brukes i denne prosessen. Selv om slekten viser en kompleks haplo-diplontisk isomorf trifasisk livssyklus, er sporulering sjelden nødvendig, bortsett fra når genetisk fornyelse av bestandene er nødvendig for å oppnå forbedrede avlinger. I dette tilfellet gir både tetrasporer (haplontiske sporer dannet av meiose) og karposporer (diplontiske sporer dannet av mitose) opphav til makroskopiske talli som deretter kan dyrkes og forplantes ved vegetativ reproduksjon4. Vekstsykluser dikteres av miljøforhold og individets fysiologiske tilstand, blant annet biologiske faktorer som fremveksten av epifytter og adhesjon av andre organismer. Derfor er optimalisering av vekstforhold avgjørende for å sikre høy produktivitet og produsere biomasse av god kvalitet5.

Ekstraksjon av bioaktive forbindelser fra tang, inkludert G. gracilis, kan oppnås ved ulike metoder 6,7. Valget av ekstraksjonsmetoden avhenger av de spesifikke forbindelsene av interesse, målapplikasjonen og egenskapene til tangen. I denne studien fokuserte vi på løsningsmiddelekstraksjon, som innebærer bruk av grønne løsningsmidler, som vann eller etanol, for å oppløse og trekke ut bioaktive forbindelser fra tangbiomassen. Ekstraksjonen kan utføres gjennom maserasjon på en allsidig og effektiv måte og kan brukes til et bredt spekter av forbindelser. Det er en enkel og mye brukt metode som involverer bløtlegging av biomasse i et løsningsmiddel i en lengre periode, vanligvis ved rom- eller litt forhøyede temperaturer. Oppløsningsvæsken omrøres for å forbedre ekstraksjonsprosessen. Etter ønsket ekstraksjonstid separeres løsningsmidlet fra det faste materialet ved filtrering eller sentrifugering.

Vann er et vanlig løsningsmiddel i næringsmiddelapplikasjoner på grunn av dets sikkerhet, tilgjengelighet og kompatibilitet med et bredt spekter av matvarer. Vannekstraksjon er egnet for polare forbindelser som polysakkarider, peptider og visse fenoler. Det kan imidlertid ikke effektivt trekke ut ikke-polare forbindelser. Etanol er også et mye brukt løsningsmiddel i matapplikasjoner og kan være effektivt for å ekstrahere en rekke bioaktive molekyler, inkludert fenolforbindelser, flavonoider og visse pigmenter. Etanol er generelt anerkjent som trygt for bruk i mat og kan lett fordampes, etterlater de ekstraherte forbindelsene. Det er verdt å merke seg at valg av utvinningsmetode bør ta hensyn til faktorer som effektivitet, selektivitet, kostnadseffektivitet og miljøpåvirkning. Optimalisering av ekstraksjonsparametere, som løsningsmiddelkonsentrasjon, ekstraksjonstid, temperatur og trykk, er avgjørende for å oppnå optimale utbytter av bioaktive forbindelser fra G. gracilis eller andre tang.

Tang har vist seg å vise antimikrobiell aktivitet mot et bredt spekter av mikroorganismer, inkludert bakterier, sopp og virus8. Denne aktiviteten tilskrives bioaktive komponenter, inkludert fenoler, polysakkarider, peptider og fettsyrer. Flere studier har vist sin effekt mot patogener som Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. og Pseudomonas aeruginosa, blant andre9. Den antimikrobielle aktiviteten til tang tilskrives tilstedeværelsen av bioaktive forbindelser som kan forstyrre mikrobielle cellevegger, membraner, enzymer og signalveier10. Disse forbindelsene kan forstyrre mikrobiell vekst, hemme biofilmdannelse og modulere immunresponser.

Røde tang, også kjent som rhodophytes, er en gruppe alger som kan utvise antimikrobiell aktivitet mot en rekke mikroorganismer. Innenfor denne gruppen inneholder G. gracilis forskjellige bioaktive forbindelser som kan bidra til den rapporterte antimikrobielle aktiviteten. Mens de spesifikke molekylene kan variere, er de vanlige klassene som er rapportert i G. gracilis og kan ha antimikrobielle egenskaper, polysakkarider, fenoler, terpenoider og pigmenter11. Det er imidlertid viktig å merke seg at tilstedeværelsen og mengdene av disse komponentene kan variere avhengig av faktorer som plasseringen av tangsamling, sesongmessighet, fysiologisk tilstand av thalli og miljøforhold. Derfor kan den spesifikke klassen og konsentrasjonen av antimikrobielle forbindelser i G. gracilis variere tilsvarende.

G. gracilis har også blitt funnet å holde antioksidantegenskaper, som inneholder forskjellige fenolforbindelser, som har vist seg å scavenge frie radikaler og redusere oksidativt stress12.Antioksidanter bidrar til å beskytte celler mot skade forårsaket av reaktive oksygenarter og har potensielle helsemessige fordeler. Antioksidantkapasiteten kan evalueres direkte gjennom forskjellige metoder, inkludert 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) renseaktivitet for frie radikaler og indirekte gjennom kvantifisering av totalt polyfenolisk innhold (TPC)13.

Selv om en ingrediens er rapportert å ha en fremtredende bioaktivitet, er cytotoksisitetsvurderingen uunnværlig for å vurdere naturlige og syntetiske stoffer som skal brukes i kontakt med levende celler eller vev. Det finnes flere metoder for måling av cytotoksisitet, hver med fordeler og begrensninger. Samlet sett tilbyr de en rekke alternativer for å evaluere de skadelige effektene av mange stoffer på celler og samtidig undersøke mekanismene for celleskader og død14.

I dette arbeidet bruker vi 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT)-analysen, en kolorimetrisk metode introdusert av Mosmann (1983)15. Denne metoden måler reduksjonen av tetrazoliumsalter til et lilla formazanprodukt av metabolsk aktive celler. Jo høyere mengden formazankrystaller, desto høyere er antall levedyktige celler, og gir dermed et indirekte mål for cytotoksisitet14. Siden G. gracilis vann- og etanolekstrakter i dette arbeidet er ment å bli inkorporert i dermo-kosmetiske formuleringer, utføres in vitro cytotoksisitetsevalueringen i en keratinocytt (HaCaT) cellelinje.

Når det gjelder matapplikasjonen, er tang generelt lavt i kalorier og ernæringsmessig rik på kostfibre, essensielle elementer og aminosyrer, polysakkarider, flerumettede fettsyrer, polyfenoler og vitaminer 2,16. G. gracilis er ikke noe unntak, og har en interessant næringsverdi. Freitas et al. (2021)4 fant at dyrket G. gracilis hadde høyere nivåer av protein og vitamin C og opprettholdt nivået av totale lipider sammenlignet med vill tang. Dette kan representere en økonomisk og miljømessig fordel, da næringsmessig sett er produksjon å foretrekke fremfor utnyttelse av ville ressurser. I tillegg er forbrukerne i økende grad opptatt av hvilken type mat de spiser, så det er viktig å introdusere nye ingredienser for matberikelse og bruke nye ressurser for å skaffe ekstrakter som kan tilføre verdi til et produkt og kreve en "ren etikett." Dessuten er dagens marked svært konkurransedyktig, og krever utvikling av nye produkter og innovative strategier for å skille produsenter fra sine konkurrenter17.

Berikelse av produkter med dårlig næringsverdi, som pasta, med marine ressurser, inkludert tang, er en strategi for å introdusere denne ressursen som en ny matvare og en markedsdifferensieringsstrategi gjennom et produkt med tydelig næringsverdi. På den annen side er G. gracilis en kilde til naturlige røde pigmenter som phycobiliproteins18, som har stort potensial for applikasjoner i næringsmiddelindustrien. Denne tangen har vist stor interesse på flere områder, og anvendelsen kan gjøres ved hjelp av hele tangen, ekstrakter og/eller den gjenværende biomassen. I dette arbeidet viser vi noen eksempler på slike applikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Biomasse høsting og forberedelse

  1. Høst prøvene av G. gracilis under lavvann og transporter dem raskt til laboratoriet i mørke, avkjølte bokser for å unngå tørking, lys og lufteksponering.
  2. I laboratoriet, vask hver tallus med rennende sjøvann og rengjør grundig for å fjerne rusk, nekrotiske deler, epifytter og andre organismer fra overflaten.
  3. Oppbevar villbiomassen i konstant luftet sjøvann (31-35 psu) i et klimarom (20 ± 1 °C) med lav innstråling fra dagslys, kjølig, hvitt og lysrør og fotoperiode satt til 16:08 (lys: mørkt) i 7 dager. I løpet av denne perioden må du ikke levere noen næringsmedier; Dette gjør at tangen sakte kan tilpasse seg de nye innendørsforholdene.

2. Vedlikehold av lager

  1. Etter akklimatiseringsperioden, kutt sunne tips av tang thalli med et sterilt blad. Etter Redmond et al. (2014) 19 og under sterile forhold, dra hver spiss gjennom en agargel som tidligere er tilberedt i petriskåler (1,0% bakteriologisk agar, i 1: 1 destillert vann / sjøvannsforhold) for å fjerne eventuelle gjenværende forurensninger. Utfør agardraget tre ganger for hver spiss og dra alltid spissen gjennom ubrukte deler av agargelen.
  2. Syrevask glass i en saltsyreoppløsning (HCl, 15%) og skyll grundig med destillert vann. Steriliser alt verktøy, glass, agar, sjøvann og destillert vann som brukes i rengjøringsprosessen med autoklav (121 °C, 15 min).
    FORSIKTIG: Se sikkerhetsdatabladet til HCl levert av leverandøren.
  3. Tips vokser i sterilisert sjøvann ved 35 psu, supplert med Von Stosch Beriket løsning (VSE) modifisert for røde tang, ifølge Redmond et al. (2014) ) 19. Tilsett germaniumdioksid (GeO2) til mediet (1 ml / L) for å forhindre vekst av epifytiske diatomer.
    FORSIKTIG: Se sikkerhetsdatabladet til GeO2 levert av leverandøren.
    MERK: Tips som viser tap av pigmentering, som observert ved delvis eller total misfarging, er under stress eller er allerede døde og bør kastes.

3. Dyrking og oppskalering

  1. Etter akklimatiseringsperioden fordeler du tilfeldig ca. 8-10 sunne tupper i 250 ml flatbunnskolber i et klimarom satt til 20 ± 1 °C med det hvite, kjølige lyset på 20 ± 0,5 μmol fotoner m-2 s-1 (1500 lux), en fotoperiode satt til 16 timer: 8 timer (lys: mørk), og sterilt sjøvann beriket med VSE-kulturmedier fornyes hver uke.
  2. Utfør ukentlige vektmålinger, unngå å belaste thalli formye 20. For dette, fjern forsiktig tipsene fra kulturmediet, skyll forsiktig og vei milligrammene på en laboratorieskala.
    MERK: Denne prosedyren kan utføres sammen med kulturmediets ukentlige fornyelse.
  3. Thalli kan vokse i disse kolbene opp til en tetthet på 2 g/l. På dette tidspunktet utfører du en mottakeroppskalering (250 ml, 1 l og 5 l). Overfør dyrkingen til utendørs åpne hvite beholdere på 50 L og større når volumet når 5 L.
  4. Beregn relativ vekstrate (RGR) i henhold til Patarra et al. (2017) 21 :
    RGR (% fw/dag) = ([Ln (fw) - Ln (iw)]/t) x 100
    hvor IW og Fw er henholdsvis den opprinnelige og endelige ferskvekten, uttrykt i gram, og T er tiden i dager.
    MERK: Under dette laboratorieoppsettet når RGR verdier opptil 21% per dag. Biomasse høsting kan utføres når som helst. Biomasse må behandles raskt for å forhindre nedbrytning ved enten ovntørking, frysetørking eller bare lagret frossen (-20 ° C), avhengig av tiltenkt bruk. Den tørkede biomassen kan konserveres ved romtemperatur (RT) eller lagres frosset også.

4. Utvinning prosedyre

MERK: For å vurdere in vitro cytotoksisitet, antioksidant og antimikrobielle egenskaper av G. gracils ekstrakter, vurderer preparatet to forskjellige parametere: ekstraksjonstemperaturen og typen løsningsmiddel.

  1. For å utføre ekstraksjonene, ovntørk G. gracilis-biomassen og mal biomassen (f.eks. i en husholdnings kaffekvern) til pulveret passerer gjennom en 200 μm sil.
  2. Vei den tørkede biomassen (10 g) og oppløs den i 100 ml løsningsmiddel (absolutt etanol eller sterilt vann).
  3. Rør inn et kar beskyttet mot lys i 30 minutter.
  4. Utføre sekvensiell etanol > vann og vann > etanolekstraksjoner ved RT, 40 °C og 70 °C.
  5. For hver temperatur, utfør ekstraksjonene med etanol og vann separat to ganger.
  6. Separer de flytende ekstraktene fra den gjenværende biomassen ved filtrering gjennom filterpapir (Whatman No.1), etterfulgt av sentrifugering ved 8000 x g i 10 minutter ved RT.
  7. Gjenbruk den gjenværende algebiomassen for videre ekstraksjon med det andre løsningsmidlet. Hvis en prøve først ble ekstrahert med etanol, trekk den ut med vann neste, og omvendt.
  8. Frysetørke de vandige ekstraktene og fordamp etanolekstraktene i en roterende fordamper ved 40 °C.
  9. Oppbevar de tørkede ekstraktene ved 4 °C.
  10. Oppløs ekstraktene i en konsentrasjon på 50 mg / ml (antimikrobielle analyser) eller 10 mg / ml (antioksidantanalyser). Løs opp de vandige ekstraktene i sterilt vann og de etanoliske ekstraktene i absolutt etanol.

5. Antimikrobiell aktivitet

MERK: De etanoliske og vandige ekstraktene bør testes individuelt mot Bacillus subtilis subsp . spizizenii (DSM 347), Escherichia coli (DSM 5922) og Listonella anguillarum (DSM 21597). Antimikrobiell testing må utføres i henhold til anbefalingene fra National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2012) 22. Alle kulturer ble hentet fra den tyske samlingen av mikroorganismer og cellekulturer (DSMZ). L. anguillarum ble dyrket på tryptisk soyabuljong (TSB) eller tryptisk soyaagar (TSA) tilsatt 1% natriumklorid (NaCl). De resterende to stammene ble dyrket på LB-medium (VWR Chemicals). Dyrkningene Bacillus subtilis subsp . spizizenii (DSM 347) og Listonella anguillarum (DSM 21597) ble inkubert ved 30 °C, mens Escherichia coli (DSM 5922) ble inkubert ved 37 °C, i henhold til leverandørens instruksjoner. Buljongmikrofortynningsmetoden kan brukes til bestemmelse av antimikrobiell aktivitet i flytende medier, og dette bør utføres i mikroskala, slik at det antimikrobielle potensialet kan bestemmes raskt og effektivt. Denne rimelige metoden gjør det mulig å oppnå resultater på bare 24 timer, og er derfor egnet til å bestemme på et tidlig stadium de beste ekstraksjonsforholdene som gjør det mulig for en gitt mikrobiell stamme å oppnå resultater når det gjelder veksthemmende virkning. Metodikken krever imidlertid bruk av sterile mikroplater med et lokk spesifikt for mikrobiell vekst, samt tilgjengeligheten av en mikroplateleser for 600 nm bølgelengde.

  1. Utfør buljongmikrofortynningstestene ved bruk av ubehandlede og rundbunns 96-brønns mikroplater med 170 μL Muller-Hinton-buljong (MHB), inokulert med 10 μL standardisert inokulum (ved 0,5 McFarland standard) og 20 μL av hvert ekstrakt (50 mg / ml).
  2. Inkuber platene i 24 timer ved optimal temperatur for hver stamme.
  3. Oppdag den antimikrobielle aktiviteten ved å redusere den synlige turbiditeten målt ved å registrere den optiske tettheten (OD 600) i et mikroplatespektrofotometer ved 0 timer og 24 timer.
  4. Uttrykk resultatene som en prosentandel av hemming:
    Equation 1
    hvor Abs. ext er forskjellen i absorbansen målt, mellom 0 timer og 24 timer, i brønnene som inneholder bakteriestamme som vokser i nærvær av ekstraktet, og Abs refererer til det samme målet i brønner som inneholder bakteriestammen og løsningsmidlet.
  5. I denne metoden, inkluderer kontrollreaksjoner, med brønner som bare inneholder dyrkningsmedium som vil være den negative kontrollen, men også brønner med medium inokulert med standardstammen tilsatt løsningsmiddel (etanol eller vann) og medium med bakteriestammen og det positive kontrollantibiotikumet (kloramfenikol).

6. Antioxidantaktivitet og kvantifisering av totale polyfenoler

  1. Totalt polyfenolisk innhold
    MERK: Totalt polyfenolisk innhold (TPC) utføres ved hjelp av Folin-Ciocalteu-metoden23 og tilpasses mikroskala.
    1. Legg til hver brønn i en 96-brønns mikroplate, beskyttet mot lys, 158 μL ultrarent vann, 2 μL av prøven og 10 μL Folin-Ciocalteu-reagens.
      FORSIKTIG: Se sikkerhetsdatabladet til Folin-Ciocalteu-reagenset levert av leverandøren.
    2. Etter 2 minutter, tilsett 30 μL Na2CO3 (20%).
    3. Etter inkubasjon i mørket ved RT i 1 time, måles prøvene spektrofotometrisk ved 755 nm.
    4. Bruk gallinsyre (som gjør at kalibreringskurven kan plottes) eller ultrarent vann (2 μL) som kontroller.
    5. Uttrykk resultatene som gallinsyreekvivalenter (mg GAE/g ekstrakt).
  2. 2,2 difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radikal rensingsaktivitet
    MERK: Antioksidantaktiviteten til ekstraktene evalueres som beskrevet av Duan et al. (2006) 24, tilpasset mikroskala
    1. I en 96-brønns mikroplate beskyttet mot lys, plasser 2 μL av hver prøve (i en konsentrasjon på 10 mg / ml) og 198 μL DPPH oppløst i absolutt etanol (0,1 mM).
      FORSIKTIG: Se sikkerhetsdatabladet til DPPH levert av leverandøren.
    2. Kjør reaksjonen i 30 min ved RT i mørket. Mål absorbansen ved 517 nm i et mikroplate-spektrofotometer.
    3. Utfør en kontrollreaksjon med 2 μL absolutt etanol / destillert vann og 198 mikrol DPPH-oppløsning. Utfør en blank måling med 2 μL ekstrakt og 198 μL absolutt etanol.
    4. Uttrykk resultatene som prosentandelen av DPPH-hemming ved hjelp av følgende ligning:
      Equation 2
      hvor As er absorbansen av algeekstraktet, Ab er absorbansen av de tomme prøvene og Ac er absorbansen av kontrollen.

7. Cytotoksisitetsevaluering i epidermale celler

MERK: Den in vitro cytotoksiske effekten av vandige og etanolekstrakter av G. gracilis evalueres i humane keratinocytter (HaCaT-celler - 300493) gjennom MTT-kolorimetrisk analyse som tidligere beskrevet25. Cellene ble anskaffet fra Cell Lines Services, Tyskland (CLS) og metoden ble utført i henhold til institusjonelle retningslinjer og CLS-instrukser.
FORSIKTIG: Se sikkerhetsdatabladet til MTT levert av leverandøren)

  1. Vedlikehold av cellekultur
    1. Dyrkning av HaCaT-celler i Dulbeccos modifiserte ørns høye glukosemedium (DMEM) supplert med 10 % føtalt bovint serum (FBS) og 1 % antibiotika/antimykotisk løsning (amfotericin B, 0,25 mM; penicillin, 60 mM; streptomycin, 100 mM).
    2. Bruk trypsin-EDTA til å dissosiere cellene.
      MERK: Subkulturen av HaCaT-celler oppnås etter at cellene når total konfluens.
    3. Dyrk cellene i et kammer ved 37 °C med 5% CO2 og 95% fuktighet.
    4. Subkultur cellene i henhold til biobankens instruksjoner når kulturer når 80% -85% samløp.
  2. Evaluering av cytotoksisitet
    1. Etter såing av celler i 96-brønnsplater og inkubering over natten, behandle HaCaT-celler (4 x 104 celler/brønn) med tørkede ekstrakter som tidligere er oppløst i DMSO (100 mg/ml). Deretter tilsettes 2 μL av ekstraktoppløsningen til 198 μL medium og inkuberer platene i 24 timer.
    2. Fjern kulturmediet og tilsett 100 μL MTT (0,5 mg / ml) til cellene. Inkuber cellene i 30 minutter i mørket ved vanlige kulturforhold nevnt ovenfor.
    3. Fjern MTT-løsningen og oppløselig de intracellulære formazankrystallene med 100 μL DMSO.
    4. Mål absorbansen ved 570 nm ved hjelp av en mikroplateleser. Uttrykk resultatene som en prosentandel av kontroll ubehandlede celler.

8. Mat innovasjon

  1. Nytt matprodukt: Pasta med tang og tare
    1. Utvalg av ingredienser og pastaformulering
      MERK: Ingrediensutvalget ble gjort i samarbeid med et pastafirma. Valget av nøkkelingredienser (beskrevet i pkt. 8.2) ble gjort på grunn av deres enkle tilgjengelighet og kompatibilitet med eksisterende produksjonslinjer, ved hjelp av marine ressurser for å skaffe pasta med ekstra næringsverdi.
      1. Etter ingrediensenes valg, design formuleringen etter den tiltenkte næringsverdien (kilde til fiber, vitaminer og mineralelementer, lite mettet fett) ved å analysere formuleringenes teoretiske kjemiske sammensetning ved hjelp av et regneark.
      2. Når de teoretiske kravene er oppfylt, fortsett med laboratorieskalaproduksjonen som beskrevet i trinn 8.1.2.
      3. Utfør en sensorisk test med et halvtrent panel (>10 smakere) for å validere behovet for reformulering eller aksept av formuleringen for følgende trinn.
        MERK: Panelet ble tidligere trent for smaksprøver av pasta og evaluerte hedonisk formuleringene som ble presentert angående attributter som smak, smak, lukt, tekstur og utseende.
    2. Pastaproduksjon
      MERK: Produser Chifferi pastaprøver ved hjelp av en pastaekstruder.
      1. I utstyret, bland tidligere definerte deler av rismel, G. gracilis , og Chlorella vulgaris, og tilsett ca 30% vann til blandingen.
      2. For å oppnå tørr pasta, tørk Chifferi ved 68 ° C i 42 minutter, etterfulgt av 5 t, 30 min ved 76 ° C, simulerer en industriell prosess.
      3. Til slutt, pakk og vakuumforsegle prøvene og lagre dem på et mørkt sted på RT til videre analyse.
    3. Ernæringsmessig analyse
      MERK: For ernæringsprofilanalysene, bruk tørkede og masererte prøver i tre eksemplarer.
      1. Råproteininnhold: Utføre total proteinanalyse gjennom Kjeldahl-metoden , tilpasset fra Duarte et al. (2022)26, etter trinn 8.1.3.2-8.1.3.6.
      2. Vei nøyaktig 1,0 g prøve (eller destillert vann for den tomme analysen) og bland med to Kjeldahl tabletter og 25 ml H2SO4 i fordøyelsesrør.
        FORSIKTIG: Se sikkerhetsdatabladet til H2SO4 levert av leverandøren.
      3. Utfør fordøyelsen av prøver i en Kjeldahl-fordøyer ved 220 °C i 30 minutter, etterfulgt av 90 minutter ved 400 °C.
      4. Etter avkjøling til RT, tilsett 80 ml destillert vann og destiller ammoniakken dannet i 30 ml av en 4% H3BO3-oppløsning inneholdende bromokresolgrønn og metylrød. Dette trinnet foregår under alkaliske forhold (destillasjon med 40% NaOH ved hjelp av en Kjeldahl-destillatør.
        FORSIKTIG: Se sikkerhetsdatabladet til H 3 BO3oppløsningen som inneholder bromokresolgrønn, metylrød og 40% NaOH levert av leverandøren.
      5. Titrer de destillerte prøvene med HCl 0,1 M til en endring i farge til en gråaktig rosa er observert.
      6. Beregn råproteininnholdet, representert ved prøvens nitrogeninnhold, og uttrykk det som g per 100 g ved hjelp av følgende ligning:
        Equation 3
        der Vs tilsvarer HCl-volumet (ml) som brukes i prøvetitrering; Vb tilsvarer volumet som brukes i blankt; N tilsvarer HCl-normalitet; w tilsvarer prøvevekt (g).
      7. Totalt fettinnhold: Bestem det totale fettinnholdet ved hjelp av Folch-metoden, tilpasset fra Folch et al. (1957) 27, etter trinn 8.1.3.8-8.1.3.14.
      8. Tilbered Folch-reagens ved å blande CHCl3 og MeOH i en andel på 2:1 (v:v).
        FORSIKTIG: Se sikkerhetsdatabladet til Folch-reagenset levert av leverandøren.
      9. For å reagere rør som inneholder 1 g alikoter av prøver, tilsett 5 ml Folch-reagens og 0,8 ml destillert vann. Bland i en virvel i 1 min.
      10. Deretter tilsettes ytterligere 5 ml Folch-reagens og homogeniseres i 5 minutter. Tilsett 1,2 ml 0,8% NaCl-oppløsning og homogeniser i 2 minutter.
      11. Sentrifuger prøvene ved 7000 x g i 10 minutter. Filtrer den organiske fasen (nedre fase) gjennom hydrofil bomull og vannfritt natriumsulfat i en rundbunnet glasskolbe.
      12. For å unngå tap av prøve, gjenta trinnene for tilsetning av 5 ml CHCl3, homogenisering, sentrifugering og filtrering under de samme forholdene.
      13. Fjern det organiske løsningsmidlet fra de oppsamlede organiske fasene ved lavtrykksfordampning og la det stå i ovnen ved 105 °C i 4 timer. Kjøl ned prøvene i en tørketromme.
      14. Beregn fettinnholdet, uttrykt som g per 100 g, ved hjelp av følgende ligning:
        Equation 4
        hvor W1 er den tomme rundbunnede glasskolbevekten; W2 er prøvens opprinnelige vekt; W3 er den rundbunnede glasskolben med prøvevekten.
      15. Råfiberinnhold: Bestem råfiberinnholdet ved hjelp av en metodikk tilpasset ISO 6865 (2000) 28, etter trinn 8.1.3.16-8.1.3.22.
      16. Vei 1 g av prøven (W0) inn i en glassdigel med filterbunn (referanse P2) og plasser den i fiberanalysatoren.
      17. Det første trinnet er syrehydrolyse: Tilsett 150 ml 1,25%H2SO4, forvarmet og 2 ml antiskummende middel (n-oktanol) til kolonnen i hver smeltedigel; Varm til koking og hold i 30 min.
      18. Etter fjerning av dette løsningsmidlet, vask tre ganger med avionisert vann for å fortsette til basisk hydrolyse. Tilsett 150 ml 1,25% NaOH, forvarmet og 5 ml antiskummiddel til den væskefrie kolonnen, og utfør samme oppvarmingsprosedyre som for syrehydrolysen.
      19. Til slutt, gjør en trippel vask med 150 ml aceton for kald ekstraksjon.
      20. Etter denne prosessen, fjern forsiktig diglene fra systemet og sett dem i en ovn ved 150 °C i 1 time. Registrer den endelige vekten (W1).
      21. Legg diglene i en muffelovn ved 500 °C i 3 timer og registrer deretter den endelige vekten (W2).
      22. Beregn råfiberinnholdet og uttrykk resultatene i prosent ved hjelp av følgende ligning:
        %Råfiber = 100 x (W1-W2)/W0
      23. Fettsyreprofil (FA): Bestem fettsyreprofilen i henhold til Fernández et al. (2015) 29, ved å følge trinn 8.1.3.24-8.1.3.29.
        MERK: Fettsyrene metylestere (FAMEs) oppnås ved direkte syrekatalysert transmetylering av de malte frysetørkede prøvene. Alle analyser gjøres i tre eksemplarer.
      24. Tilsett 2 ml av en 2 % (v/v) H2SO4-oppløsning i metanol til en 50 mg prøve og hell blandingen ved 80 °C i 2 timer under kontinuerlig omrøring.
        FORSIKTIG: Se sikkerhetsdatabladet for metanol levert av leverandøren.
      25. Etter avkjøling til RT, tilsett 1 ml ultrarent vann og 2 ml n-heptan til hver prøve, virvle blandingen i 1 min og sentrifuger den i 5 minutter.
        FORSIKTIG: Se sikkerhetsdatabladet til n-heptan levert av leverandøren.
      26. Gjenopprett den øvre n-heptanfasen (organisk) som inneholder FAME og overfør den til hetteglass med gasskromatografi (GC).
      27. Analyser i en gasskromatograf utstyrt med en TR-FAME kapillærkolonne (60 m × 0,25 mm ID, 0,25 μm filmtykkelse), en automatisk prøvetaker og en flammeioniseringsdetektor (FID).
      28. Sett injektoren (splittfri modus) på 250 °C og detektoren på 280 °C. Sett kolonnens innledende temperatur på 75 °C og hold den i 1 min. Hev deretter ved 5 °C/min til 170 °C og hold i 10 min. Løft deretter ved 5 °C/min til 190 °C og hold ytterligere 10 min. Til slutt, løft ved 2 °C/min til 240 °C og hold i 10 min. Bruk helium som bærergass ved en strømningshastighet på 1,5 ml/min. Tilluft og hydrogen ved strømningshastigheter på henholdsvis 350 og 35 ml/min.
      29. Bestem FA-profilen ved å sammenligne de resulterende retensjonstidene med en standard og uttrykke resultatene som en prosentandel av totalt fett.
      30. Mineralelementprofil: Bestem mineralelementene (Ca, P, Mg, Na, K, Fe, Cu, Mn, Zn) analysert av ICP-OES, etter metoden tilpasset fra Pinto et al. (2022) 30, etter trinn 8.1.3.31-8.1.3.34.
      31. Vei nøyaktig ca. 0,4 g av hver tørrprøve og tilsett 7,5 ml HNO3 og 2,5 ml HCl.
        FORSIKTIG: Se sikkerhetsdatabladet til HNO3 og HCl levert av leverandøren.
      32. Fordøyelsen følger en to-trinns prosess: Øk temperaturen fra RT til 90 °C på 30 minutter (og oppretthold ytterligere 30 minutter ved denne temperaturen) etterfulgt av 60 min ved 105 °C.
      33. Avkjøl prøveløsningene, fortynn dem til 25 ml, og filtrer og oppbevar dem i merkede rør. I hver fordøyelse, utfør den samme prosessen med et referansemateriale og et tomt. Oppnå konsentrasjonen av de forskjellige elementene ved ICP-OES.
      34. Express resultatene i mg per 100 g fw.
      35. Karbohydratinnhold: Beregn karbohydratinnholdet etter trinn 8.1.3.36-8.1.3.37.
      36. Beregn innholdet av tilgjengelige karbohydrater (ekskludert fiber) ved forskjellen mellom de tidligere bestemte faktorene per 100 g, ved å bruke følgende ligning, ifølge Food and Agriculture Organization (FAO; 2003) 31
        Equation 5
      37. Express resultatene i g per 100 g.
      38. Fuktighet og askeinnhold: Beregn fuktighet og askeinnhold ved å følge trinn 8.1.3.39-8.1.3.45.
      39. Inkuber porselensdiglene i 3 timer ved 105 °C, avkjøl dem i en tørketrommel og vei dem.
      40. Vei 10 g av prøven inn i digelen og sett den i en tørkeovn ved 105 °C i 3 timers sykluser til verdiene fra suksessive vektinger ikke avviker med mer enn 10 mg.
      41. Beregn fuktighetsinnhold, uttrykt som g per 100 g fw, ved hjelp av følgende ligning:
        Equation 6
        hvor W1 er vekten av den tomme digelen, W2 er vekten av smeltedigelen med den ferske prøven, og W3 er vekten av digelen med den tørkede prøven.
      42. Etter fuktinnholdsanalysen, plasser diglene med de tørkede prøvene i en forbrenningsovn ved 525 °Ci 4 timer.
      43. Gjenta denne prosedyren til påfølgende vekting ikke avviker med mer enn 1 mg.
      44. Avkjøl prøvene til RT i en tørketrommel og vei dem deretter.
      45. Beregn askeinnholdet, uttrykt som g per 100 g fw, ved hjelp av følgende ligning:
        Equation 7
        hvor W1 er vekten av den tomme digelen, W2 er vekten av smeltedigelen med fersk prøve, W3 er vekten av smeltedigelen med vekt.
      46. Energiværdi: Beregn energiværdien ved å følge trinn 8.1.3.47-8.1.3.48.
      47. Beregn den energiske verdien av prøvene i henhold til EU-forskriften: Levering av matinformasjon til forbrukerne (forordning 1169/2011) 32, ved hjelp av ligningene:
        Energi (kcal / 100 g) = 4 x (g proteiner) + 4 x (g karbohydrater) + 9 x (g fett) + 2 x (g fiber)
        Energi (kJ/ 100 g) = 17 x (g proteiner) + 17 x (g karbohydrater) + 37 x (g fett) + 8 x (g fiber)
      48. Express resultatene i kilokalorier per 100 g og kilojoule per 100 g.
    4. Forbrukernes aksept
      1. Evaluer forbrukeraksept ved hjelp av pastaprøver kokt i destillert vann i 8 minutter.
      2. Utfør forbrukergodkjenningstest: Evaluer visuelt utseende, farge, tekstur, lukt, sjøsmak, generell smak, generell evaluering og kjøpsintensjon for prøvene.
        MERK: Forbrukerens akseptansetest er basert på hedoniske tester som evaluerer visuelt utseende, farge, tekstur, lukt, sjøsmak, generell smak, generell evaluering og kjøpsintensjon på en skala fra 1-9, hvor 1 er en dårlig evaluering, og 9 er en veldig god evaluering.
      3. Utføre sensoriske tester i individuelle sensoriske båser i et sensorisk analyselaboratorium (med temperatur- og lysstyring). Gi bestikk, servietter og glasskopper mineralvann for å rense ganen mellom prøvene.
        MERK: Smakere er i alderen 16-64 fra alle bakgrunner (n > 80).
  2. Yoghurt
    1. Pigment ekstraksjon
      MERK: Utfør pigmentekstraksjonen gjennom metodikken beskrevet i Pereira et al. (2020) 18.
      1. Forbered ekstraksjonsløsningsmidlet, natriumfosfatbuffer ved 0,1 M, med natriumfosfatdibasisk (0,03 M) og natriumfosfat monobasisk (0,07 M). Sett pH på pH 6,8 ved hjelp av NaOH eller HCl.
      2. Vei 1 g G. gracilis og tilsett 50 ml natriumfosfatbuffer (pH 6,8). Homogeniser i 10 minutter, etterfulgt av 10 min maserasjon med mørtel og pistill.
      3. Overfør oppløsningen til et rør og sentrifuge i 20 minutter ved 12 298 x g (4 °C).
      4. Pool supernatanten og tilsett sakte 65% ammoniumsulfat. Når alt ammoniumsulfatet er oppløst, dekk oppløsningen med en aluminiumplate og la den felles ut ved 4 °C over natten.
        FORSIKTIG: Se sikkerhetsdatabladet for ammoniumsulfat levert av leverandøren.
      5. Sentrifuger bunnfallet i 20 minutter ved 12 298 x g (4 °C). Gjenvinn pelleten og oppløs i destillert vann (ca. 5 ml).
      6. Utfør dialyse av ekstraktet ved hjelp av en slangemembran (14 kDa) mot vann i 24 timer, etterfulgt av frysetørking. Oppbevar frysetørket ekstrakt beskyttet mot lys ved 4 °C inntil bruk.
    2. Yoghurt forberedelse
      1. Forbered naturlig yoghurt ved å blande 1 liter pasteurisert melk, 120 g naturlig yoghurt, 20 g sukker og 50 g melkepulver i en termomixer i 5 minutter, 50 ° C, hastighet 3.
      2. Sett blandingen i termomixerkannen i en inkubator ved 37 °C i 12 timer.
      3. Inkluder ekstraktet ved å blande det i yoghurt i en konsentrasjon på 0,21%. Oppbevar prøvene i individuelle glassflasker ved 4 °C frem til analyse.
      4. Oppbevar individuelle porsjoner yoghurt uten pigment (kontroll) ved 4 °C inntil analyse.
    3. Fargestabilitet
      MERK: Vurder pigmentets stabilitet i yoghurtene gjennom fargeanalyse i 12 dager. Utfør fargeanalyse ved hjelp av et refleksjonskolorimeter ved hjelp av en 2-graders standardobservatør og et D65-belysningsmiddel. Resultatene presenteres som CIELab-koordinater med parameterne L (lyshet, svart-hvitt, 0 – 100), a* (grønt – rødt, -60 – 60) og b* (blått – gult, -60 – 60). Parameter a* har positive verdier for rødlige farger og negative verdier for grønne farger. Parameter b* tar positive verdier for gulaktige farger og negative verdier for blåaktige farger. L* er parameteren for lysstyrke, som er egenskapen som hver farge kan betraktes som ekvivalent med et medlem av gråtonene mellom svart og hvitt33.
      1. Kalibrer kolorimeteret med en hvit keramisk plate (L * 88.5, a * 0.32, b * 0.33) levert av produsenten.
      2. Fyll en celle med omtrent 28 g av prøven (eller kontrollen) og analyser fargen ved hjelp av fargedataanalyseprogramvare.
        MERK: Programvaren som ble brukt til fargedataanalyse var SpectraMagic NX.
      3. Utfør avlesninger 5 ganger i prøve-/kontrolltriplikater.
    4. Sensorisk analyse
      MERK: Utfør sensorisk evaluering av yoghurt med pigmentinkorporering ved hjelp av en trekanttest (ISO 4120, 2004) 34 og en hedonisk evaluering av farge, smak og generell takknemlighet.
      1. For trekanttesten, gi paneldeltakerne tre prøver (en prøve yoghurt med pigment og to prøver av kontroll, eller to prøver av yoghurt med pigment og en kontroll) og be dem velge en annen prøve basert på aroma, tekstur og smak. Gi prøver i lignende volumer identifisert med tilfeldige 3-tallskoder.
      2. For den hedoniske evalueringen av yoghurt med pigment, gi paneldeltakerne en prøve av yoghurt med pigment og be dem om å evaluere farge, smak og generell takknemlighet ved hjelp av en 9-punkts hedonisk skala (fra ekstremt misliker til ekstremt lik).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Antimikrobiell aktivitet

Ved tolkning av de oppnådde resultatene bør man huske på at jo høyere prosentandel av inhibering, desto større er effekten av ekstraktet ved å hemme veksten av den spesifikke stammen, og følgelig jo mer interessant ekstraktet er som et antimikrobielt middel. Gjennom denne metodikken kan vi raskt identifisere hvilke ekstrakter som har større aktivitet på visse bakteriestammer, og også identifisere det mest interessante når det gjelder fremtidig bruk. Vi kan dermed ha et utgangspunkt for videre studier på det samme ekstraktet.

Figur 1 viser resultatene oppnådd med vandige ekstrakter, både i første og andre ekstraksjoner, umiddelbart etter biomassetørking (figur 1A) og i tredje og fjerde ekstraksjoner (figur 1B), oppnådd etter etanolekstraksjonene, og dermed bruker biomassen integrert. Vi kan se at de mest interessante resultatene, tilsvarende tredje og fjerde vandige ekstraksjon, avslører høyere antimikrobielle aktiviteter, spesielt i ekstrakter oppnådd ved 70 °C. Konsentrasjonen av ekstrakt i brønnene er 5 mg/ml.

Figure 1
Figur 1: Veksthemming av bakteriearter i nærvær av vandige ekstrakter av G. gracilis. Veksthemming av 3 bakteriearter (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Listonella anguillarum) etter 24 timers vekst i et flytende medium, i nærvær av vandige ekstrakter (Aq) av G. gracilis oppnådd ved forskjellige temperaturer, romtemperatur (RT), 40 °C (40) og 70 °C (70). Den positive kontrollen ble gjort med kloramfenikol (CHL), og resultatene uttrykkes som gjennomsnittsverdier (n = 8). Data refererer til de 4 sekvensielle ekstraksjonstrinnene (1st, 2nd, 3rd, 4th). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

De etanoliske ekstraktene ser ut til å være spesielt effektive for å hemme veksten av L. anguillarum, som vist i figur 2. Dette viser resultatene oppnådd med etanolekstraktene, også i første og andre ekstraksjoner (figur 2A) og tredje og fjerde ekstraksjon (figur 2B), oppnådd etter den første vandige ekstraksjonen.

Figure 2
Figur 2: Veksthemming av bakteriearter i nærvær av etanoliske ekstrakter av G. gracilis. Veksthemming av 3 bakteriearter (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Listonella anguillarum) etter 24 timers vekst, i et flytende medium, i nærvær av etanoliske ekstrakter (Et) av G. gracilis, oppnådd ved forskjellige temperaturer, romtemperatur (RT), 40 °C (40) og 70 °C (70). Positiv kontroll ble gjort med kloramfenikol (CHL), og resultatene ble uttrykt som gjennomsnittsverdier (n = 8). Data refererer til de 4 sekvensielle ekstraksjonstrinnene (1st, 2nd, 3rd, 4th). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Antioksidant aktivitet

Når det gjelder resultatene som fremhever antioksidantpotensialet til de forskjellige ekstraktene, nemlig i DPPH-testen, indikerer resultatene uttrykt i figur 3 at temperaturen på 40 ° C var den mest effektive, noe som resulterte i høyere inhiberingsverdier av oksidasjonsaktiviteten enn de som ble observert i ekstrakter oppnådd ved RT eller 70 ° C. Dette gjelder for G. gracilis-prøvene , og det kan være store variasjoner avhengig av prøvene som brukes og algevekstbetingelsene. Det anbefales derfor at tester utføres for å indikere de beste forholdene for hver bestemt type prøve.

Figure 3
Figur 3: Inhibering av DPPH-radikalet (%) i nærvær av ekstrakter oppnådd ved forskjellige temperaturer. Ekstrakter ble oppnådd gjennom etanolisk (Et) eller vandig (Aq) ekstraksjon. 1. og 2. ekstraksjoner ble gjort fra tørr biomasse sekvensielt. De resterende (3. og 4.plass) ble laget med biomasse som tidligere ble ekstrahert med det alternative løsningsmidlet. RT betyr romtemperatur; 40, ekstrakt oppnådd ved 40 °C; og 70, ekstrakt oppnådd ved 70 °C. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Lignende resultater ble oppnådd når det gjelder total polyfenolkvantifisering (figur 4), med temperaturen på 40 ° C ansett som den beste når det gjelder ekstraksjon av antioksidantforbindelser. Dette viser at antioksidantaktiviteten ser ut til å være korrelert med fenolkomponentene som er tilstede i ekstraktene.

Figure 4
Figur 4: Kvantifisering av totalt polyfenolinnhold (TPC) i ekstrakter oppnådd ved forskjellige temperaturer. Ekstraktene ble oppnådd ved etanolisk (Et) eller vandig (Aq) ekstraksjon, hvor 1st og 2nd ekstraksjon ble gjort sekvensielt fra tørre alger og de resterende (3rd og 4th) ble laget med biomasse tidligere ekstrahert med et annet løsningsmiddel. RT betyr romtemperatur; 40, ekstrakt oppnådd ved 40 °C; og 70, ekstrakt oppnådd ved 70 °C. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Cytotoksisitet i HaCat-celler

Det første trinnet for å vurdere kosmetiske ingrediensers sikkerhet er studiet av deres in vitro cytotoksisitet i epidermale og dermale cellelinjer. Som det fremgår av figur 5, ble det ikke observert cytotoksiske effekter på keratinocytter (HaCaT-celler), noe som tyder på at både vandige ekstrakter og etanolekstrakter er trygge for kutan bruk ved maksimal analysekonsentrasjon (1 mg/ml).

Figure 5
Figur 5: Cytotoksisk effekt av ekstrakter av Gracilaria gracilis (1 mg/ml) på HaCaT-celler etter 24 timers behandling. Verdiene i hver kolonne uttrykkes som gjennomsnittet ± standardfeilen for gjennomsnittet (SEM) av tre uavhengige eksperimenter i tre eksemplarer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Innovasjon innen mat

De endelige pastaformuleringene ble oppnådd etter mange forsøk mellom teoretisk formulering og sensorisk testing av et halvtrent panel. Etter dette trinnet ble den kjemiske karakteriseringen tilgjengelig, inkludert ernæringsmessig evaluering, fettsyrer og mineralelementprofiler. Det var mulig å lage en ernæringskarakterisering (tabell 1 og tabell 2) og verifisere eksistensen av forventede ernæringspåstander basert på europeisk lovgivning (REG (EU) nr. 1169/2011)32.

Ernæring Fakta med 100 g pasta % RDI
Energi 1478,90 kJ (348,74 kcal) 17
Lipider 1,06 ± 0,10 g 2
Fra hva:
Mettede fettsyrer 0,38 ± 0,01 g 2
Karbohydrater 72,59± 0,21 g 28
Fiber 3,84 ± 0,20 g
Protein 10,29 ± 0,20 g 21
Salt 0,22 ± 0,02 g 9

Tabell 1: Fakta om ernæring. Næringsfakta om utviklet pasta basert på kjemiske analyser (n = 3) av energi og karbohydrater oppnådd ved beregning og respektive prosentandel av anbefalt doseinntak (n = 3).

Disse pastaformuleringene er designet for å appellere til en målforbruker som har et sunnere kosthold i tankene, så mengden fett per 100 g av et produkt må være så liten som mulig. Detaljert analyse av fettsyreprofilen viser en verdi på 0,38 g mettede fettsyrer/100 g, som er godt under grensen for produkter med lavt mettet fett, og oppfyller det opprinnelige målet for produksjonen av denne pastaen. Når det gjelder fiberinnholdet, var det også mulig, i samsvar med europeiske forskrifter, å hevde denne pastaformuleringen som en kilde til fiber.

I mineralelementkarakteriseringen, bestemt av ICP-OES og presentert i tabell 2, er det rapportert verdien av ca. 219 mg / 100 g Na tilstede i 100 g av dette produktet, så det kan ikke verifiseres at det er et produkt med lavt natriuminnhold (<0,12 g / 100 g). På grunn av det forhøyede natriuminnholdet som er naturlig tilstede i ingrediensene, kan dette produktet ikke kreve tilsetning av salt i konfekt.

Table 2

Tabell 2: Pastamineralelementprofil. Blå - høyt innhold av elementet; Rød kilde til et bestemt element (n = 3). Klikk her for å laste ned denne tabellen.

I henhold til den refererte EU-forskriften og RDI% for hvert element, kan det sees at dette produktet har et høyt innhold av K, P, Fe, og er også en kilde til Zn. Den har Se, Mg og Ca til stede i mindre mengder.

For pasta-aksepttestene ble det brukt 86 testere, hvorav 63 var kvinner og 23 menn, i alderen over 18 år. Godkjennelsestestene var basert på hedoniske skalaer på 9 poeng, som fastsatt i standardene. Den sunne deigen scoret 5 og 6 på en hedonisk skala fra 1 til 9 for henholdsvis parametrene "Sea smak" og "Visuelt utseende" (figur 6).

Figure 6

Figur 6: Resultater fra sensoriske forbrukeraksepttester . (A) Det hedoniske valget for visuelt utseende, farge, tekstur, lukt, sjøsmak og generell smak. (B) Det hedoniske valget for generell takknemlighet og kjøpsintensjon. Skala 1-9, der 1 er en dårlig evaluering, og 9 er en svært god evaluering (n = 86). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Pastaen scoret 5 og 6 på en hedonisk skala fra 1 til 9 for henholdsvis parametrene "Sea smak" og "Visuelt utseende" (figur 6A). Denne pastaen oppnådde en lav verdi på denne skalaen angående teksturparameteren (vurderer andre formuleringer som allerede er studert), sannsynligvis fordi basisbestanddelen er rismel; Til tross for dette oppnådde den verdier på en skala fra 1 til 9, fra 4 til 7, noe som gjenspeiler en god aksept av den gjennomsnittlige forbrukeren. På en hedonisk skala fra 1 til 9 hadde pastaen som hyppigst respons verdien av 5 for kjøpsintensjon og verdien av 6 for total verdsettelse, som vist i figur 6B. Det ble funnet at omtrent 65% av smakerne valgte et svar lik eller høyere enn poengsummen på 6 for den samlede vurderingen av denne pastaen. Fargestabiliteten til yoghurtene med pigment ble evaluert i 12 dager ved -4 °C, og resultatene er presentert i figur 7.

Figure 7
Figur 7: Yoghurtens fargestabilitet. (Venstre) Kontroller yoghurt og (høyre) yoghurt med Gracilaria gracilis pigment under 12 dagers lagring. Parametrene a*, b* og L* er dimensjonsløse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Resultatene indikerer at a*- og b*-parametrene var stabile over tid, mens L*-verdiene viste høyere varians. Lysheten viste høyere verdier etter 8 dagers lagring. Mens noen forskjeller ble funnet i lyshetsparametrene, noe som indikerer at prøvene var lettere over tid, viste parametrene rødhet (a *) og blå (b *) god stabilitet. Inkorporeringen av ekstraktene i yoghurt viste god fargebevaring, med en ΔE på 7,01 ± 2,36 etter 12 dagers lagring. Når det gjelder sensorisk evaluering av yoghurt, identifiserte 9 av 13 paneldeltakere riktig prøve i trekanttesten, noe som tyder på at det var forskjeller mellom yoghurtene som tillot dette skillet. De hedoniske testene som ble gjort til det halvtrente panelet viste en god aksept av produktet, reflektert i score over 7 (figur 8). Poengsummen for noen av de tre attributtene som ble testet, var 9, noe som førte til poenggjennomsnitt over 8. Den beste evalueringen ble gjort til farge, noe som gjenspeiler en utmerket aksept av panelet, et avslørende resultat.

Figure 8
Figur 8: Resultater av den hedoniske sensoriske evalueringen av yoghurt med Gracilaria gracilis-pigment. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De antimikrobielle aktivitetstestene i et flytende medium brukes til å evaluere effektiviteten av antimikrobielle stoffer mot mikroorganismer suspendert i et flytende medium og utføres vanligvis for å bestemme et stoffs evne til å hemme vekst eller drepe mikroorganismer35,36,37,38. De brukes til å evaluere mikroorganismers følsomhet overfor antimikrobielle midler og utføres i reagensrør eller mikrotitreringsplater, hvor forskjellige konsentrasjoner av det antimikrobielle stoffet testes mot en standardisert suspensjon av målmikroorganismen22. Antimikrobiell aktivitet vurderes ved å måle mikrobiell vekst eller tilstedeværelse/fravær av turbiditet i kulturmediet etter en riktig inkubasjonsperiode.

Det finnes flere teknikker og metoder for å utføre disse testene, for eksempel buljongfortynningsmetoden, agardiffusjonsmetoden (for eksempel skivediffusjonstesten) og buljongmikrodilusjonsmetoden, som er en av de mest brukte38. Noen av de mest kritiske punktene i disse metodene inkluderer riktig forberedelse av inokulumet, valg av kulturmedium, kvaliteten på de antimikrobielle stoffene som brukes, standardisering av teknikken og effektiv forurensningskontroll. Inokulumet, som er en standardisert suspensjon av mikroorganismer, må fremstilles riktig for å sikre nøyaktigheten av resultatene. Dette innebærer et passende utvalg av mikrobiell kultur, en riktig kultur av rene stammer, justering av cellekonsentrasjon og standardisering av suspensjonen for å oppnå en passende optisk tetthet eller cellekonsentrasjon.

Dyrkningsmediet som brukes, bør velges nøye for å sikre at det gir de ideelle vekstforholdene for mikroorganismen som testes. Kjemisk sammensetning, pH og andre faktorer kan påvirke testresultatene. Det er viktig å følge produsentens anbefalinger for utarbeidelse av kulturmediet. Kvaliteten på de antimikrobielle midlene som brukes som kontroll er grunnleggende, og det er viktig å sikre at disse er rene, innenfor holdbarheten og lagret riktig. Merking og utløpsdatoer bør alltid konsulteres, i henhold til produsentens instruksjoner. Standardiseringen av teknikken er også avgjørende for å sikre nøyaktigheten av resultatene. Dette inkluderer tilsetning av de testede konsentrasjonene til kulturmediet, samt vedlikehold av aseptiske forhold gjennom hele prosedyren. I tillegg kan krysskontaminering av mikroorganismer under testing føre til falske eller upålitelige resultater. Det er viktig å følge strenge aseptiske rutiner gjennom hele prosedyren, fra manipulering av inokulum til inkubasjon av rørene eller platene. Bruk av rene benkeplater, riktig pipetteringsteknikk og riktig avhending av materialer er viktige tiltak for å unngå forurensning.

Oppmerksomhet på detaljer og streng overholdelse av etablerte protokoller og retningslinjer er avgjørende for å minimere feil og sikre påliteligheten av resultatene i antimikrobielle aktivitetstester i et flytende medium. De antimikrobielle aktivitetstestene har også noen begrensninger som bør vurderes37.

Faktorer som pH, temperatur, tilstedeværelse av blodkomponenter og interaksjoner med immunsystemet vurderes ikke i disse testene, noe som kan begrense evnen til å forutsi effektiviteten av et antimikrobielt middel i en levende organisme. Tester måler også evnen til et antimikrobielt stoff til å hemme mikrobiell vekst eller drepe mikroorganismer og gir ikke detaljert informasjon om virkningsmekanismen til det antimikrobielle eller dets selektivitet mot spesifikke mikroorganismer. Det er begrensninger i å oppdage motstand, da metodene som brukes, kanskje ikke tillater deteksjon eller prediksjon av utviklingen av resistens over tid. Noen mikroorganismer kan utvikle resistensmekanismer som respons på langvarig eksponering for et antimikrobielt middel, og disse endringene kan ikke lett oppdages gjennom disse testene. Tester av antimikrobiell aktivitet i et flytende medium tar generelt ikke hensyn til andre vertsfaktorer som kan påvirke effektiviteten av et antimikrobielt middel, for eksempel tilstedeværelsen av biofilmer eller vertens immunrespons.

Det er viktig å vurdere disse begrensningene og å komplementere testing for antimikrobiell aktivitet i flytende medier med andre metoder og tilnærminger, for eksempel in vivo-studier , biofilmmodeller og andre39. Når det gjelder bioprospektering av bioaktive makroalgeforbindelser, kan antimikrobielle aktivitetstester brukes til å evaluere det antimikrobielle potensialet til algeekstrakter eller isolerte forbindelser, identifisere stoffer med antimikrobiell aktivitet mot spesifikke mikrobielle patogener, som kan ha anvendelser på områder som produksjon av medisiner, kosmetikk, mat eller landbruksprodukter40.

Antioxidantaktivitetstester er metoder som brukes til å evaluere evnen til en forbindelse eller ekstrakt for å nøytralisere frie radikaler eller redusere oksidativt stress. Disse testene er mye brukt i antioksidantforskning, både i matvarer og i naturlige produkter som alger, for eksempel. Det finnes flere metoder for å evaluere antioksidantaktiviteten, og en av de mest brukte er absorpsjonskapasiteten for frie radikaler. I denne testen brukes et stabilt fritt radikal, 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), til å evaluere evnen til en forbindelse til å donere et elektron og nøytralisere det frie radikalet. Antioxidantaktivitet måles ved å redusere den lilla fargen på DPPH, som oppstår når antioksidantforbindelsen donerer et elektron til det frie radikalet. Andre metoder inkluderer oksygenradikalabsorpsjonskapasiteten (ORAC), jernreduksjonskapasiteten (FRAP) eller reduksjonskapasiteten for frie radikaler (ABTS)41.

Kvantifisering av totale polyfenoler (QTP) er derimot ikke en direkte metode for å bestemme antioksidantaktiviteten, men gir et mål på den totale konsentrasjonen av polyfenoler i en prøve, selv om flere forstyrrende stoffer kan påvirke resultatene. Selv om mange polyfenoler er kjent for å ha antioksidantegenskaper, er antioksidantaktiviteten til en forbindelse relatert til flere faktorer, for eksempel dens kjemiske struktur, konsentrasjon, evne til å donere eller fange frie radikaler og interaksjoner med andre cellulære komponenter42. Den enkle kvantifiseringen av totale polyfenoler kan ikke gi en evaluering av antioksidantaktiviteten til prøven. Det er imidlertid viktig å merke seg at tilstedeværelsen av polyfenoler i en prøve kan være forbundet med en høyere sannsynlighet for antioksidantaktivitet siden mange polyfenoler har antioksidantegenskaper. Dermed kan QTP tjene som en foreløpig indikator på tilstedeværelsen av polyfenoler i prøven, men bekreftelse av antioksidantaktivitet krever antioksidantaktivitetsanalyser. Polyfenoler er en klasse av kjemiske forbindelser utbredt i naturen, finnes i mat, planter, frukt, grønnsaker og alger. Det finnes forskjellige metoder for kvantifisering av totale polyfenoler, og Folin-Ciocalteu-metoden er en av de mest brukte. QTP gir et generelt mål på konsentrasjonen av polyfenoler, men spesifiserer ikke de enkelte polyfenoliske forbindelsene som er tilstede i prøven. Derfor er det en kvantitativ, men ikke en kvalitativ metode. Videre er det viktig å vurdere at forskjellige polyfenoler har forskjellig antioksidantkapasitet og biologiske aktiviteter, slik at QTP ikke gir detaljert informasjon om de spesifikke funksjonelle egenskapene til polyfenolene som er tilstede.

Hver metode har sine fordeler og begrensninger, og valget av en gitt test avhenger av egenskapene til forbindelsen som studeres og formålet med analysen. Det er viktig å følge de spesifikke instruksjonene for hver metode for å sikre pålitelige og sammenlignbare resultater. Når du bestemmer antioksidantkapasiteten, inkluderer noen av de vanlige kritiske trinnene for det første prøvepreparatet. Det er viktig å forberede prøvene riktig, sikre at tilstrekkelige konsentrasjoner oppnås og unngå forurensning. Dette innebærer nøyaktig veiing av forbindelsene eller ekstraktene og oppløsning av dem i passende løsningsmidler. Det er også viktig å vurdere stabiliteten av forbindelsene og ekstraktene under prosessen med fremstilling, lagring og håndtering. Alle reagensene som brukes i antioksidantaktivitetstestene må være riktig forberedt og standardisert for å sikre reproduserbarhet av resultatene. Dette innebærer riktig fremstilling av gallinsyrestandarden og nøyaktigheten av volumene. Reaksjonstid er et kritisk aspekt for å få nøyaktige resultater i antioksidanttester. Det er nødvendig å optimalisere inkubasjonstiden for å sikre en fullstendig reaksjon mellom antioksidantforbindelsen og det frie radikalet. Utilstrekkelig tid kan føre til underestimering av antioksidantaktivitet, mens overdreven tid kan føre til nedbrytning av forbindelsene eller interferens fra sekundære reaksjoner. Temperaturen under testene må også kontrolleres nøyaktig og konsekvent. Temperatur påvirker hastigheten på kjemiske reaksjoner og kan påvirke resultatene. Det er viktig å følge temperaturforholdene som anbefales av de spesifikke metodene og sikre temperaturstabilitet gjennom hele prosedyren. Inkludering av passende kontroller er avgjørende for å validere resultatene av antioksidanttester. Dette kan inkludere positive kontroller (forbindelser kjent for å ha antioksidantaktivitet) og negative kontroller (prøver uten antioksidantaktivitet). Kontroller gir et sammenligningsgrunnlag for tolkning av resultater og bidrar til å sikre nøyaktigheten av dataene som innhentes. For å oppnå pålitelige resultater anbefales det å utføre tester av antioksidantaktivitet på replikater og gjenta forsøket flere ganger for å øke betydningen av dataene og for å oppnå mer pålitelige og robuste resultater.

Testmetoder for antioksidantaktivitet har noen begrensninger som bør vurderes når resultatene tolkes, nemlig det faktum at de i flytende medier kanskje ikke fullt ut fanger kompleksiteten til biologiske systemer og interaksjoner mellom forskjellige forbindelser, det brede spekteret av antioksidantreaksjoner som kan oppstå, cellulær metabolisme og miljøfaktorer som kan påvirke antioksidantaktiviteten. Så, forskjellige tester bør brukes. Man må også være klar over mangelen på direkte sammenheng med helsegevinster; Selv om antioksidantaktivitet ofte er forbundet med helsemessige fordeler, oversetter dette ikke alltid direkte til helsemessige fordeler i levende organismer på grunn av mange andre faktorer, som biotilgjengelighet, metabolisme og interaksjoner med andre biologiske systemer.

Det er viktig å huske på at antioksidantaktivitetstester er nyttige verktøy for den første evalueringen av antioksidantpotensialet til forbindelser og ekstrakter, men bør ikke betraktes som en definitiv indikator på biologiske effekter eller helsemessige fordeler. Ytterligere studier er nødvendig for å forstå virkningen av antioksidanter på kroppen fullt ut.

Selv om metodene for å teste antioksidantaktiviteten i flytende medium er mye brukt i forskning og har sine fordeler og begrensninger, sammenlignet med alternativene, kan disse metodene betraktes som gode når det gjelder praktisk, hastighet, kostnad og enkel implementering. En av hovedfordelene er enkelheten og hastigheten på prosedyrene og deres egnethet for innledende forskning, sammensatt screening og store studier. Disse metodene er relativt raske å utføre og kan gi resultater på kort tid, på en rimeligere måte, og krever mindre spesialisert utstyr sammenlignet med andre metoder.

Alger er kjent for sin evne til å produsere bioaktive forbindelser, inkludert antioksidanter, som kan ha gunstige helseegenskaper43. Algerekstrakter kan fremstilles fra forskjellige deler av alger og kan oppnås ved hjelp av forskjellige løsningsmidler, for eksempel vann, etanol, metanol eller aceton, blant andre. Det er viktig å huske at antioksidantaktiviteten til algerekstrakter kan variere avhengig av flere faktorer, for eksempel alger, ekstraksjonsmetodikk og konsentrasjonen av de bioaktive forbindelsene som er tilstede. Derfor anbefales det å utføre antioksidantaktivitetstester på replikater og å utføre sammenligninger med passende kontroller for å oppnå mer pålitelige resultater. Disse metodene kan brukes som et første verktøy i screening og utvelgelse av algeekstrakter med antioksidantpotensial for videre studier.

MTT-analysen er en mye brukt teknikk for en foreløpig evaluering av in vitro cytotoksiske effekter av stoffer til bruk hos mennesker og dyr. Til tross for at det er den mest brukte metoden for testing av cytotoksisitet, påvirkes omdannelsen av MTT til formazankrystaller av mange faktorer som metabolsk hastighet og antall mitokondrier, og det gjelder bare for adherente cellemål14. De viktigste kritiske trinnene i protokollen beskrevet her er relatert til den endelige forekomsten av cellekulturforurensninger, uønsket HaCaT-cellevekst og en lav prosentandel av cellekonfluens. Det finnes andre metoder, for eksempel laktatdehydrogenase (LDH), adenosintrifosfat (ATP) og kolonidannelsesanalyser for måling av cytotoksisitet. Men alle har fordeler og begrensninger. Ghasemi et al. (2021)44 evaluerte effekten av flere variabler på MTT-analysemålingene på en prostatakreftcellelinje (PC-3). Faktorer som cellesåtetthet, konsentrasjonen av MTT, inkubasjonstid etter MTT-tillegg, serumsult, sammensetningen av cellekulturmedier, frigjort intracellulært innhold og ekstrudering av formazan til det ekstracellulære rommet ble analysert. Fra denne studien ble nyttige anbefalinger om hvordan man bruker analysen og et perspektiv på hvor analysens nytte er et kraftig verktøy, men på samme måte hvor det har begrensninger, skissert av disse forfatterne. Likevel er MTT-analysen en rask, svært sensitiv og enkel metodikk som kan brukes som en foreløpig cytotoksisitetsvurdering av mange stoffer med potensiell anvendelse innen terapeutisk, mat, fôr, landbruk og miljø. Spesielt viste MTT-analysen her utført at etanol og vandige ekstrakter fra G. gracilis , i de analyserte konsentrasjonene, ikke påvirket keratinocyttens levedyktighet og kan fortsette in vivo-analyser for å sikre at de er helt trygge for menneskelig kutan bruk.

Bruken av marine ressurser i matprodukter har nok en gang vist sitt potensial ikke bare for å få tak i produkter med økt næringsverdi, men også for å finne renere merkede produkter. Tilsetningen av hele G. gracilis (pasta) eller ekstrakt (som matfargestoffer) viser markedspotensial, og anvendelsen kan være en av strategiene for selskaper å skille seg ut i markedet, tilfredsstille forbrukernes ernæringsmessige behov og følge deres markedstrender.

Når tang ble lagt til pastaformuleringene, ble det først funnet at strukturen ble endret og at det ikke var mulig å oppnå de ønskede deigformene. Vi hadde utfordringen med å justere mengder og legge til andre ingredienser som ikke tidligere var forutsett, med sikte på å opprettholde pastaens tekstur. I tillegg til riktig mengde av hver ingrediens, ble ekstruderingsmetoden tilpasset gjennom hele utviklingen av pastaen. Bortsett fra denne vanskeligheten er utviklingen av nye produkter basert på tre grunnleggende prinsipper: produktet må være sensorisk tiltalende (tekstur, smak, lukt); produktet må ha tilsatt næringsverdi; Og det må gjøre maksimal bruk av bærekraftige ingredienser og metoder. I denne forstand er en annen stor utfordring bruken av sensorisk panel for å oppnå den mest tiltalende formuleringen. De fleste av de fysisk-kjemiske analysene som ble utført på pasta var allerede optimalisert for matmatriser; I dette arbeidet ble imidlertid prøveprepareringen optimalisert slik at den effektivt kunne brukes på alle analysemetodene.

Når det gjelder bruken av G. gracilis-pigmentet som fargestoff, ble et kjøleprodukt valgt på grunn av den termiske følsomheten til denne typen molekyl45. Siden yoghurtpreparat innebærer termisk behandling, ble pigmentet tilsatt til sluttproduktet. Blanding av pigmentet i yoghurt resulterte i et produkt litt mer flytende enn kontrollen uten pigment. Faktisk, på slutten av trekanttesten, kommenterte noen paneldeltakere at den eneste forskjellen mellom prøvene var teksturen. Dette er et godt resultat siden hovedformålet med trekanttesten var å verifisere om det var merkbare forskjeller mellom yoghurt med og uten pigment, spesielt forskjeller i smak og lukt, da tangekstrakter kan gi ubehagelig smak / lukt til matvarer. Dette var en forstudie som involverte et lite halvtrent panel. I videre studier bør et større antall smakere vurderes for å oppnå mer pålitelige markedsresultater. Når det gjelder evaluering av pigmentstabilitet i yoghurt, kan videre studier omfatte evaluering av andre fysisk-kjemiske egenskaper av yoghurt med pigment over tid, for eksempel pH, vannaktivitet (aw) og tekstur. Sensorisk evaluering over tid vil også være ønskelig.

Avslutningsvis fremhever protokollene beskrevet her potensialet til den røde tangen G. gracilis som en kilde til ingredienser for å utvikle nye produkter med potensielle anvendelser i farmasøytisk, dermokosmetisk og næringsmiddelindustrien. Videre forblir den etterekstraherte restbiomassen et verdifullt materiale som skal brukes som plantevekstbiostimulant, jordberikelse, fiskefôring eller råstoff for å oppnå biokull og / eller funksjonaliserte karboner for vannrensingsformål. Bioraffineritilnærmingen beskrevet her kan brukes på andre tangarter, fremme en blå sirkulær økonomi og miljømessig bærekraft.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av den portugisiske stiftelsen for vitenskap og teknologi (FCT) gjennom de strategiske prosjektene gitt til MARE-Marine and Environmental Sciences Centre (UIDP/04292/2020 og UIDB/04292/2020), og Associate Laboratory ARNET (LA/P/0069/2020). FCT finansierte også de individuelle doktorgradsstipendene til Marta V. Freitas (UI/BD/150957/2021) og Tatiana Pereira (2021. 07791. BD). Dette arbeidet ble også støttet økonomisk av prosjektet HP4A - HEALTHY PASTA FOR ALL (co-promotion nr. 039952), delfinansiert av ERDF - European Regional Development Fund, under Portugal 2020-programmet, gjennom COMPETE 2020 - Competitiveness and Internationalisation Operational Programme.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute Ethanol Aga, Portugal 64-17-5
Ammonium Chloride PanReac 12125-02-9
Amphotericin B Sigma-Aldrich 1397-89-3
Analytical scale balance Sartorius, TE124S 22105307
Bacillus subtilis subsp. spizizenii German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) DSM 347
Biotin Panreac AppliChem 58-85-5
Centrifuge Eppendorf, 5810R 5811JH490481
Chloramphenicol PanReac 56-75-7
CO2 Chamber Memmert N/A
Cool White Fluorescent Lamps OSRAM Lumilux Skywhite N/A
Densitometer McFarland Grant Instruments N/A
DMEM medium Sigma-Aldrich D5796
DMSO Sigma-Aldrich 67-68-5
DPPH Sigma, Steinheim, Germany 1898-66-4
Escherichia coli (DSM 5922) German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) DSM5922
Ethanol 96% AGA-Portugal 64-17-5
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA) J.T.Baker 6381-92-6
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Filter Paper (Whatman No.1) Whatman WHA1001320
Flasks VWR International, Alcabideche, Portugal  N/A
Folin-Ciocalteu VWR Chemicals 31360.264
Gallic Acid  Merck 149-91-7
Germanium (IV) Oxide, 99.999% AlfaAesar 1310-53-8
HaCaT cells – 300493 CLS-Cell Lines Services, Germany  300493
Hot Plate Magnetic Stirrer IKA, C-MAG HS7 06.090564
Iron Sulfate VWR Chemicals 10124-49-9
Laminar flow hood TelStar, Portugal 526013
LB Medium  VWR Chemicals J106
Listonella anguillarum German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)  DSM 21597
Manganese Chloride VWR Chemicals 7773.01.5
Micropipettes  Eppendorf, Portugal N/A
Microplates VWR International, Alcabideche, Portugal  10861-666
Microplates Greiner 738-0168
Microplates (sterile) Fisher Scientific 10022403
Microplate reader  Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA 1611151E
MTT Sigma-Aldrich 289-93-1
Muller-Hinton Broth (MHB) VWR Chemicals 90004-658
Oven Binder, FD115 12-04490
Oven Binder, BD115 04-62615
Penicillin Sigma-Aldrich 1406-05-9
pH meter Inolab  VWR International, Alcabideche, Portugal  15212099
Pippete tips Eppendorf, Portugal 5412307
Pyrex Bottles Media Storage  VWR International, Alcabideche, Portugal  16157-169
Rotary Evaporator Heidolph, Laborota 4000 80409287
Rotavapor IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal 07.524254
Sodium Carbonate (Na2CO3) Chem-Lab 497-19-8
Sodium Chloride (NaCl)  Normax Chem 7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic Riedel-de Haën 7558-79-4
SpectraMagic NX Konica Minolta, Japan color data analysis software
Spectrophotometer Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA 5A4T092004
Streptomycin Sigma-Aldrich 57-92-1
Thiamine Panreac AppliChem 59-43-8
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4049
Tryptic Soy Agar (TSA) VWR Chemicals ICNA091010617
Tryptic Soy Broth (TSB)  VWR Chemicals 22091
Ultrapure water  Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany F5HA17360B
Vacuum pump Buchi, Switzerland FIS05-402-103
Vitamin B12 Merck 68-19-9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Charoensiddhi, S., Abraham, R. E., Su, P., Zhang, W. Seaweed and seaweed-derived metabolites as prebiotics. Advances in Food and Nutrition Research. 91, 97-156 (2020).
  2. Roohinejad, S., Koubaa, M., Barba, F. J., Saljoughian, S., Amid, M., Greiner, R. Application of seaweeds to develop new food products with enhanced shelf-life, quality, and health-related beneficial properties. Food Research International. 99, 1066-1083 (2017).
  3. Hurd, C. L., Harrison, P. J., Bischof, K., Lobban, C. S. Seaweed Ecology and Physiology. (second). , Cambridge University Press, UK. (2014).
  4. Freitas, M. V., Mouga, T., Correia, A. P., Afonso, C., Baptista, T. New insights on the sporulation, germination, and nutritional profile of Gracilaria gracilis (Rhodophyta) grown under controlled conditions. Journal of Marine Science and Engineering. 9 (6), 562 (2021).
  5. Friedlander, M. Advances in cultivation of Gelidiales. Journal of Applied Phycology. 20 (5), 451-456 (2008).
  6. Matos, G. S., Pereira, S. G., Genisheva, Z. A., Gomes, A. M., Teixeira, J. A., Rocha, C. M. R. Advances in extraction methods to recover added-value compounds from seaweeds: Sustainability and functionality. Foods. 10, 516 (2021).
  7. Ummat, V., Sivagnanam, S. P., Rajauria, G., O'Donnell, C., Tiwari, B. K. Advances in pre-treatment techniques and green extraction technologies for bioactives from seaweeds. Trends in Food Science & Technology. 110, 90-106 (2021).
  8. Pérez, M. J., Falqué, E., Domínguez, H. Seaweed Antimicrobials, Present Status and Future Perspectives. Handbook of Algal Technologies andPhytochemicals:Volume I Food, Health and Nutraceutical Applications. Ravishankar, G., Ambati, R. R. , 1st ed, CRC Press, Boca Raton, Florida. (2019).
  9. Cavallo, R. A., Acquaviva, M. I., Stabili, L., Cecere, E., Petrocelli, A., Narracci, M. Antibacterial activity of marine macroalgae against fish pathogenic Vibrio species. Central European Journal of Biology. 8, 646-653 (2013).
  10. Shannon, E., Abu-Ghannam, N. Antibacterial derivatives of marine algae: An overview of pharmacological mechanisms and applications. Marine Drugs. 14 (4), 81 (2016).
  11. Capillo, G., et al. New insights into the culture method and antibacterial potential of Gracilaria gracilis. Marine Drugs. 16 (12), 492 (2018).
  12. Francavilla, M., Franchi, M., Monteleone, M., Caroppo, C. The red seaweed Gracilaria gracilis as a multi products source. Marine Drugs. 11 (10), 3754-3776 (2013).
  13. Sánchez-Ayora, H., Pérez-Jiménez, J. Antioxidant Capacity of Seaweeds: In Vitro and In Vivo Assessment. Marine Phenolic Compounds. Pérez-Correa, J. R., Mateos, R., Domínguez, R. , Elsevier. 299-341 (2023).
  14. Anil, S., Sweety, V. K., Vikas, B., Betsy-Joseph, B. Cytotoxicity and Cell Viability Assessment of Biomaterials. Cytotoxicity. , Intechopen. 111822 (2023).
  15. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  16. Roleda, M. Y., et al. Variations in polyphenol and heavy metal contents of wild-harvested and cultivated seaweed bulk biomass: Health risk assessment and implication for food applications. Food Control. 95, 121-134 (2019).
  17. Souza, K. D., et al. Gastronomy and the development of new food products: Technological prospection. International Journal of Gastronomy and Food Science. 33, 100769 (2023).
  18. Pereira, T., et al. Optimization of phycobiliprotein pigments extraction from red algae Gracilaria gracilis for substitution of synthetic food colorants. Food Chemistry. 321, 126688 (2020).
  19. Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. New England Seaweed Culture Handbook-Nursery Systems. Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. , Connecticut Sea Grant, University of Connecticut. (2014).
  20. Yong, Y. S., Yong, W. T. L., Anton, A. Analysis of formulae for determination of seaweed growth rate. Journal of Applied Phycology. 25 (6), 1831-1834 (2013).
  21. Patarra, R. F., Carreiro, A. S., Lloveras, A. A., Abreu, M. H., Buschmann, A. H., Neto, A. I. Effects of light, temperature and stocking density on Halopteris scoparia growth. Journal of Applied Phycology. 29 (1), 405-411 (2017).
  22. NCCLS, National Committee for Clinical Laboratory Standards, Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests: Approved Standard. 32, 11th ed, Wayne, PA, USA. M02-M11 (2012).
  23. Singleton, V. L., Rossi, J. A. J. Colorimetry to total phenolics with phosphomolybdic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
  24. Duan, X. J., Zhang, W. W., Li, X. M., Wang, B. G. Evaluation of antioxidant property of extract and fractions obtained from a red alga, Polysiphonia urceolata. Food Chemistry. 95 (1), 37-43 (2006).
  25. Freitas, R., et al. Highlighting the biological potential of the brown seaweed Fucus spiralis for skin applications. Antioxidants. 9 (7), 611 (2020).
  26. Duarte, A., et al. Seasonal study of the nutritional composition of unexploited and low commercial value fish species from the Portuguese coast. Food Science and Nutrition. 10 (10), 3368-3379 (2020).
  27. Folch, J., Lees, M., Stanley, G. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  28. ISO 6865. Animal feeding stuffs - Determination of crude fibre content - Method with intermediate filtration. Bureau of Indian Standards (BIS). , (2000).
  29. Fernández, A., Grienke, U., Soler-Vila, A., Guihéneuf, F., Stengel, D. B., Tasdemir, D. Seasonal and geographical variations in the biochemical composition of the blue mussel (Mytilus edulis L.) from Ireland. Food Chemistry. 177, 43-52 (2015).
  30. Pinto, F., et al. Annual variations in the mineral element content of five fish species from the Portuguese coast. Food Research International. 158, 111482 (2022).
  31. FAO. Food energy - methods of analysis and conversion factors. , FAO Food and Nutrition Paper 77 at https://www.fao.org/fileadmin/templates/food_composition/documents/book_abstracts/Food_energy.pdf (2003).
  32. Regulation (EU) Nr. 1169/2011 of the European Parliament and of the Council of 25 -10-2011. 25, https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/?uri=CELEX%3A32011R1169 (2011).
  33. Pathare, P. B., Opara, U. L., Al-Said, F. A. J. Colour measurement and analysis in fresh and processed foods: A review. Food and Bioprocess Technology. 6 (1), 36-60 (2013).
  34. ISO 4120. Sensory analysis - Methodology - Triangle test. International Standard. , https://www.iso.org/standard/33495.html (2004).
  35. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: A review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  36. Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
  37. Gajic, I., et al. Antimicrobial susceptibility testing: A comprehensive review of currently used methods. Antibiotics. 11 (4), 427 (2022).
  38. Gonzalez-Pastor, R., et al. Current landscape of methods to evaluate antimicrobial activity of natural extracts. Molecules. 28 (3), 1068 (2023).
  39. Li, J., et al. Antimicrobial activity and resistance: Influencing factors. Frontiers in Pharmacology. 13 (8), 364 (2017).
  40. Silva, A., et al. Macroalgae as a source of valuable antimicrobial compounds: Extraction and applications. Antibiotics. 9 (10), 642 (2020).
  41. Munteanu, I. G., Apetrei, C. Analytical methods used in determining antioxidant activity: A review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3380 (2021).
  42. Ma, S., et al. Comparison of common analytical methods for the quantification of total polyphenols and flavanols in fruit juices and ciders. Journal of Food Science. 84 (8), 2147-2158 (2019).
  43. Tziveleka, L. A., Tammam, M. A., Tzakou, O., Roussis, V., Ioannou, E. Metabolites with antioxidant activity from marine macroalgae. Antioxidants. 10 (9), 1431 (2021).
  44. Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
  45. Pereira, T., Barroso, S., Mendes, S., Gil, M. M. Stability, kinetics, and application study of phycobiliprotein pigments extracted from red algae Gracilaria gracilis. Journal of Food Science. 85 (10), 3400-3405 (2020).

Tags

Biologi utgave 201
Valorisering av Red Seaweed <em>Gracilaria gracilis</em> gjennom en bioraffineri tilnærming
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martins, A., Pinto, F. R., Barroso,… More

Martins, A., Pinto, F. R., Barroso, S., Pereira, T., Mouga, T., Afonso, C., Freitas, M. V., Pinteus, S., Pedrosa, R., Gil, M. M. Valorization of the Red Seaweed Gracilaria gracilis Through a Biorefinery Approach. J. Vis. Exp. (201), e65923, doi:10.3791/65923 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter