Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Valorisering af den røde tang Gracilaria gracilis gennem en bioraffinaderitilgang

Published: November 21, 2023 doi: 10.3791/65923
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1, 1, 1
1MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, ESTM, Polytechnic University of Leiria, 2MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, Department of Life Sciences, University of Coimbra

Summary

Her beskriver vi flere protokoller, der sigter mod en integreret valorisering af Gracilaria gracilis: høst af vilde arter, intern vækst og udvinding af bioaktive ingredienser. Ekstrakternes antioxidante, antimikrobielle og cytotoksiske virkninger evalueres sammen med ernærings- og stabilitetsvurderingen af fødevarer beriget med hele tangbiomasse og pigmenter.

Abstract

Interessen for tang som et rigeligt råmateriale til at opnå værdifulde og multitarget bioaktive ingredienser vokser konstant. I dette arbejde undersøger vi potentialet i Gracilaria gracilis, en spiselig rød tang, der dyrkes over hele verden for sin kommercielle interesse som kilde til agar og andre ingredienser til kosmetiske, farmakologiske, fødevare- og foderapplikationer.

G. gracilis vækstbetingelser blev optimeret gennem vegetativ formering og sporulation, mens de fysisk-kemiske forhold blev manipuleret for at opnå en stor biomassebestand. Grønne ekstraktionsmetoder med ethanol og vand blev udført over tangbiomassen. Det bioaktive potentiale af ekstrakter blev vurderet gennem et sæt in vitro assays vedrørende deres cytotoksicitet, antioxidant og antimikrobielle egenskaber. Derudover blev tørret tangbiomasse inkorporeret i pastaformuleringer for at øge fødevarens næringsværdi. Pigmenter ekstraheret fra G. gracilis er også blevet indarbejdet i yoghurt som et naturligt farvestof, og deres stabilitet blev evalueret. Begge produkter blev påskønnet af et semi-trænet sensorisk panel, der sigter mod at opnå den bedste endelige formulering, før de når markedet.

Resultaterne understøtter alsidigheden af G. gracilis , uanset om det anvendes som en hel biomasse, ekstrakter og / eller pigmenter. Ved at implementere flere optimerede protokoller muliggør dette arbejde udvikling af produkter med potentiale til at gavne fødevare-, kosmetik- og akvakulturmarkederne, fremme miljømæssig bæredygtighed og en blå cirkulær økonomi.

Desuden og i overensstemmelse med en bioraffinaderitilgang vil den resterende tangbiomasse blive anvendt som biostimulans til plantevækst eller omdannet til kulstofmaterialer, der skal bruges til vandrensning af de interne akvakultursystemer i MARE-Polytechnic i Leiria, Portugal.

Introduction

Tang kan betragtes som et interessant naturligt råmateriale, der kan profiteres af medicinal-, fødevare-, foder- og miljøsektorerne. De biosyntetiserer en række molekyler, hvoraf mange ikke findes i landorganismer, med relevante biologiske egenskaber 1,2. Der skal dog implementeres tangoptimerede dyrkningsprotokoller for at sikre et stort biomasselager.

Dyrkningsmetoder skal altid tage hensyn til tangthalliens art og den overordnede morfologi. Gracilaria gracilis er et klonalt taxon, hvilket betyder, at fastgørelsesorganet producerer flere vegetative akser. Formering ved fragmentering (vegetativ reproduktion) opnås således, da hver af disse akser fuldt ud er i stand til at vedtage et uafhængigt liv fra hovedthallusen3. Klontaxa kan med succes integreres med enkle og hurtige et-trins dyrkningsmetoder, da store mængder biomasse opnås ved at opdele thallusen i små fragmenter, der hurtigt regenererer og vokser til nye, genetisk identiske individer. Både haplontisk og diplontisk thalli kan anvendes i denne proces. Selvom slægten udviser en kompleks haplo-diplontisk isomorf triphasisk livscyklus, er sporulation sjældent nødvendig, undtagen når genetisk fornyelse af bestandene er nødvendig for at opnå forbedrede afgrøder. I dette tilfælde giver både tetrasporer (haplontiske sporer dannet af meiose) og carposporer (diplontiske sporer dannet af mitose) anledning til makroskopiske thalli, som derefter kan dyrkes og formeres ved vegetativ reproduktion4. Vækstcyklusser dikteres af miljøforhold og individernes fysiologiske tilstand, blandt andre biologiske faktorer såsom fremkomsten af epifytter og vedhæftningen af andre organismer. Derfor er optimering af vækstbetingelser afgørende for at sikre høj produktivitet og producere biomasse af god kvalitet5.

Ekstraktion af bioaktive forbindelser fra tang, herunder G. gracilis, kan opnås ved forskellige metoder 6,7. Valget af ekstraktionsmetode afhænger af de specifikke forbindelser af interesse, målanvendelsen og tangens egenskaber. I denne undersøgelse fokuserede vi på opløsningsmiddelekstraktion, som involverer brug af grønne opløsningsmidler, såsom vand eller ethanol, til at opløse og ekstrahere bioaktive forbindelser fra tangbiomassen. Ekstraktionen kan udføres gennem maceration på en alsidig og effektiv måde og kan bruges til en lang række forbindelser. Det er en enkel og udbredt metode, der involverer iblødsætning af biomasse i et opløsningsmiddel i en længere periode, typisk ved stuetemperatur eller let forhøjede temperaturer. Opløsningsmidlet omrøres for at forbedre ekstraktionsprocessen. Efter den ønskede ekstraktionstid adskilles opløsningsmidlet fra det faste materiale ved filtrering eller centrifugering.

Vand er et almindeligt anvendt opløsningsmiddel i fødevareapplikationer på grund af dets sikkerhed, tilgængelighed og kompatibilitet med en lang række fødevarer. Vandekstraktion er velegnet til polære forbindelser såsom polysaccharider, peptider og visse phenoler. Det kan dog ikke effektivt ekstrahere ikke-polære forbindelser. Ethanol er også et meget anvendt opløsningsmiddel i fødevareapplikationer og kan være effektivt til ekstraktion af en række bioaktive molekyler, herunder phenolforbindelser, flavonoider og visse pigmenter. Ethanol er generelt anerkendt som sikkert til brug i fødevarer og kan let fordampes og efterlade de ekstraherede forbindelser. Det er værd at bemærke, at valget af ekstraktionsmetode bør overveje faktorer som effektivitet, selektivitet, omkostningseffektivitet og miljøpåvirkning. Optimering af ekstraktionsparametre, såsom opløsningsmiddelkoncentration, ekstraktionstid, temperatur og tryk, er afgørende for at opnå optimale udbytter af bioaktive forbindelser fra G. gracilis eller andre tangplanter.

Tang har vist sig at udvise antimikrobiel aktivitet mod en lang række mikroorganismer, herunder bakterier, svampe og vira8. Denne aktivitet tilskrives bioaktive komponenter, herunder phenoler, polysaccharider, peptider og fedtsyrer. Flere undersøgelser har vist deres effektivitet mod patogener som Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. og Pseudomonas aeruginosa, blandt andre9. Den antimikrobielle aktivitet af tang tilskrives tilstedeværelsen af bioaktive forbindelser, der kan forstyrre mikrobielle cellevægge, membraner, enzymer og signalveje10. Disse forbindelser kan forstyrre mikrobiel vækst, hæmme biofilmdannelse og modulere immunresponser.

Rød tang, også kendt som rhodophytes, er en gruppe alger, der kan udvise antimikrobiel aktivitet mod en række mikroorganismer. Inden for denne gruppe indeholder G. gracilis forskellige bioaktive forbindelser, der kan bidrage til dets rapporterede antimikrobielle aktivitet. Mens de specifikke molekyler kan variere, er de almindelige klasser, der er blevet rapporteret i G. gracilis og kan have antimikrobielle egenskaber, polysaccharider, phenoler, terpenoider og pigmenter11. Det er dog vigtigt at bemærke, at tilstedeværelsen og mængderne af disse komponenter kan variere afhængigt af faktorer som placeringen af tangopsamling, sæsonbestemthed, tallis fysiologiske tilstand og miljøforhold. Derfor kan den specifikke klasse og koncentration af antimikrobielle forbindelser i G. gracilis variere i overensstemmelse hermed.

G. gracilis har også vist sig at holde antioxidant egenskaber, der indeholder forskellige phenolforbindelser, som har vist sig at skylle frie radikaler og reducere oxidativt stress12.Antioxidanter hjælper med at beskytte celler mod skader forårsaget af reaktive iltarter og har potentielle sundhedsmæssige fordele. Antioxidantkapaciteten kan evalueres direkte ved hjælp af forskellige metoder, herunder 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) frie radikaler og indirekte gennem kvantificering af det samlede polyfenolindhold (TPC)13.

Selv om en ingrediens rapporteres at have en fremtrædende bioaktivitet, er dens cytotoksicitetsvurdering uundværlig ved vurderingen af naturlige og syntetiske stoffer, der skal anvendes i kontakt med levende celler eller væv. Der er flere metoder til måling af cytotoksicitet, hver med fordele og begrænsninger. Samlet set tilbyder de en række muligheder for at evaluere de skadelige virkninger af mange stoffer på celler og samtidig undersøge mekanismerne bag celleskader og død14.

I dette arbejde bruger vi 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay, en kolorimetrisk metode introduceret af Mosmann (1983)15. Denne metode måler reduktionen af tetrazoliumsalte til et lilla formazanprodukt af metabolisk aktive celler. Jo højere mængden af formazankrystaller er, desto højere er antallet af levedygtige celler, hvilket giver et indirekte mål for cytotoksicitet14. Da G. gracilis vand og ethanolekstrakter i dette arbejde er beregnet til at blive inkorporeret i dermokosmetiske formuleringer, udføres in vitro cytotoksicitetsevalueringen i en keratinocyt (HaCaT) cellelinje.

Med hensyn til fødevareanvendelsen er tang generelt lav i kalorier og ernæringsmæssigt rig på kostfibre, essentielle elementer og aminosyrer, polysaccharider, flerumættede fedtsyrer, polyphenoler og vitaminer 2,16. G. gracilis er ingen undtagelse, der har en interessant næringsværdi. Freitas et al. (2021)4 fandt ud af, at dyrket G. gracilis havde højere niveauer af protein og C-vitamin og opretholdt niveauet af samlede lipider sammenlignet med vild tang. Dette kan udgøre en økonomisk og miljømæssig fordel, da produktion ernæringsmæssigt set er at foretrække frem for udnyttelse af vilde ressourcer. Derudover er forbrugerne i stigende grad bekymrede over den type mad, de spiser, så det er vigtigt at introducere nye ingredienser til fødevareberigelse og bruge nye ressourcer til at opnå ekstrakter, der kan tilføre værdi til et produkt og kræve en "ren etiket". Desuden er det nuværende marked meget konkurrencepræget og kræver udvikling af nye produkter og innovative strategier for at differentiere producenterne fra deres konkurrenter17.

Berigelse af produkter med ringe næringsværdi, såsom pasta, med marine ressourcer, herunder tang, er en strategi for at introducere denne ressource som en ny fødevare og en markedsdifferentieringsstrategi gennem et produkt med tydelig næringsværdi. På den anden side er G. gracilis en kilde til naturlige røde pigmenter såsom phycobiliproteiner18, der har et stort potentiale for anvendelser i fødevareindustrien. Denne tang har vist stor interesse i flere områder, og dens anvendelse kan ske ved hjælp af hele tang, ekstrakter og/eller den resterende biomasse. I dette arbejde demonstrerer vi nogle eksempler på sådanne applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Høst og forberedelse af biomasse

  1. Høst prøverne af G. gracilis under lavvande og transporter dem hurtigt til laboratoriet i mørke, afkølede kasser for at undgå tørring, lys og lufteksponering.
  2. I laboratoriet vaskes hver thallus med rindende havvand og rengøres grundigt for at fjerne snavs, nekrotiske dele, epifytter og andre organismer fra overfladen.
  3. Opbevar den vilde biomasse i konstant luftet havvand (31-35 psu) i et klimarum (20 ± 1 °C) med lav bestråling fra dagslys, kølige, hvide og lysstofrør og fotoperiode indstillet til 16:08 (lys: mørk) i 7 dage. I denne periode må du ikke levere næringsmedier; Dette gør det muligt for tangen langsomt at tilpasse sig de nye indendørs forhold.

2. Vedligeholdelse af lagre

  1. Efter akklimatiseringsperioden skæres sunde spidser af tang thalli med et sterilt blad. Efter Redmond et al. (2014) 19 og under sterile forhold trækkes hver spids gennem en agargel, der tidligere er tilberedt i petriskåle (1,0% bakteriologisk agar, i forholdet mellem destilleret vand og havvand) for at fjerne eventuelle resterende forurenende stoffer. Udfør agartrækket tre gange for hver spids, og træk altid spidsen gennem ubrugte dele af agargelen.
  2. Syrevask glasvarer i en saltsyreopløsning (HCI, 15%) og skyl grundigt med destilleret vand. Steriliser alt værktøj, glasvarer, agar, havvand og destilleret vand, der anvendes i rengøringsprocessen med autoklave (121 °C, 15 min).
    FORSIGTIG: Se sikkerhedsdatabladet for HCl leveret af leverandøren.
  3. Tips vokser i steriliseret havvand ved 35 psu, suppleret med Von Stosch beriget opløsning (VSE) modificeret til røde tang, ifølge Redmond et al. (2014) 19. Tilsæt germaniumdioxid (GeO2) til mediet (1 ml / L) for at forhindre vækst af epifytiske kiselalger.
    FORSIGTIG: Se sikkerhedsdatabladet for GeO2 leveret af leverandøren.
    BEMÆRK: Tips, der viser tab af pigmentering, som observeret ved delvis eller total misfarvning, er under stress eller er allerede døde og bør kasseres.

3. Dyrkning og opskalering

  1. Efter akklimatiseringsperioden fordeles tilfældigt ca. 8-10 sunde spidser i 250 ml fladbundede kolber i et klimarum indstillet til 20 ± 1 °C med det hvide kølige lys på 20 ± 0,5 μmol fotoner m-2 s-1 (1500 lux), en fotoperiode indstillet til 16 timer: 8 timer (lys: mørk) og sterilt havvand beriget med VSE-kulturmedier, der fornyes hver uge.
  2. Udfør ugentlige vægtmålinger, undgå at belaste thalli formeget 20. Til dette skal du forsigtigt fjerne spidserne fra kulturmediet, skyl forsigtigt og vej milligram på en laboratorieskala.
    BEMÆRK: Denne procedure kan udføres sammen med kulturmediets ugentlige fornyelse.
  3. Thalli kan vokse i disse kolber op til en massefylde på 2 g/l. På dette tidspunkt skal du udføre en modtageropskalering (250 ml, 1 L og 5 L). Overfør dyrkningen til udendørs åbne hvide beholdere på 50 L og større, når volumenet når 5 L.
  4. Beregn relativ væksthastighed (RGR) i henhold til Patarra et al. (2017)21 :
    RGR (% fw/dag) = ([Ln (fw) - Ln (iw)]/t) x 100
    hvor IW og FW er henholdsvis den indledende og endelige friske vægt udtrykt i gram, og t er tiden i dage.
    BEMÆRK: Under denne laboratorieopsætning når RGR værdier op til 21% pr. Dag. Biomassehøst kan udføres til enhver tid. Biomasse skal forarbejdes hurtigt for at forhindre nedbrydning ved enten ovntørring, frysetørring eller simpelthen opbevares frosset (-20 °C), afhængigt af den tilsigtede anvendelse. Den tørrede biomasse kan opbevares ved stuetemperatur (RT) eller opbevares frossen.

4. Ekstraktionsprocedure

BEMÆRK: For at vurdere in vitro cytotoksicitet, antioxidant og antimikrobielle egenskaber af G. gracils ekstrakter , dets fremstilling overvejer to forskellige parametre: ekstraktionstemperaturen og typen af opløsningsmiddel.

  1. For at udføre ekstraktionerne ovntørres G. gracilis-biomassen og biomassen males (f.eks. i en husholdningskaffekværn), indtil pulveret passerer gennem en 200 μm sigte.
  2. Den tørrede biomasse (10 g) vejes og opløses i 100 ml opløsningsmiddel (absolut ethanol eller sterilt vand).
  3. Rør en beholder, der er beskyttet mod lys, i 30 min.
  4. Udfør sekventiel ethanol > vand og vand > ethanolekstraktioner ved RT, 40 °C og 70 °C.
  5. For hver temperatur udføres ekstraktionerne med ethanol og vand separat to gange.
  6. De flydende ekstrakter adskilles fra den resterende biomasse ved filtrering gennem filterpapir (Whatman No.1) efterfulgt af centrifugering ved 8000 x g i 10 minutter ved RT.
  7. Genbrug den resterende algebiomasse til yderligere ekstraktion med det andet opløsningsmiddel. Hvis en prøve først blev ekstraheret med ethanol, ekstraheres den derefter med vand og omvendt.
  8. De vandige ekstrakter frysetørres, og ethanolekstrakterne inddampes i en rotationsfordamper ved 40 °C.
  9. De tørrede ekstrakter opbevares ved 4 °C.
  10. Ekstrakterne opløses i en koncentration på 50 mg/ml (antimikrobielle assays) eller 10 mg/ml (antioxidantassays). De vandige ekstrakter opløses i sterilt vand og ethanolekstrakterne i absolut ethanol.

5. Antimikrobiel aktivitet

BEMÆRK: De ethanoliske og vandige ekstrakter skal testes individuelt mod Bacillus subtilis subsp . spizizenii (DSM 347), Escherichia coli (DSM 5922) og Listonella anguillarum (DSM 21597). Antimikrobiel testning skal udføres i overensstemmelse med anbefalingerne fra National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2012)22. Alle kulturer blev opnået fra den tyske samling af mikroorganismer og cellekulturer (DSMZ). L. anguillarum blev dyrket på tryptisk sojabuljong (TSB) eller tryptisk sojaagar (TSA) suppleret med 1% natriumchlorid (NaCl). De resterende to stammer blev dyrket på LB-medium (VWR Chemicals). Bacillus subtilis subsp . spizizenii (DSM 347) og Listonella anguillarum (DSM 21597) kulturer blev inkuberet ved 30 °C, mens Escherichia coli (DSM 5922) blev inkuberet ved 37 °C i henhold til leverandørens anvisninger. Bouillonmikrofortyndingsmetoden kan anvendes til bestemmelse af antimikrobiel aktivitet i et flydende medie, og dette bør udføres i mikroskala, hvilket gør det muligt at bestemme det antimikrobielle potentiale hurtigt og effektivt. Denne billige metode gør det muligt at opnå resultater på kun 24 timer, og er derfor egnet til på et tidligt tidspunkt at bestemme de bedste ekstraktionsbetingelser, der tillader for en given mikrobiel stamme at opnå resultater med hensyn til væksthæmmende virkning. Metoden kræver imidlertid anvendelse af sterile mikroplader med et låg, der er specifikt for mikrobiel vækst, samt tilgængeligheden af en mikropladelæser til 600 nm bølgelængden.

  1. Udfør bouillonmikrofortyndingstestene ved hjælp af ikke-behandlede og rundbundede mikroplader med 96 brønde med 170 μL Muller-Hinton Broth (MHB), podet med 10 μL standardiseret inokulum (ved 0,5 McFarland-standard) og 20 μL af hvert ekstrakt (50 mg / ml).
  2. Inkuber pladerne i 24 timer ved den optimale temperatur for hver stamme.
  3. Den antimikrobielle aktivitet detekteres ved reduktion af den synlige turbiditet målt ved registrering af den optiske densitet (OD 600) i et mikropladespektrofotometer ved 0 timer og 24 timer.
  4. Udtryk resultaterne som en procentdel af hæmning:
    Equation 1
    hvor Abs. ext er forskellen i absorbansen målt mellem 0 timer og 24 timer i hullerne, der indeholder bakteriestamme, der vokser i nærvær af ekstraktet, og Abs henviser til det samme mål i huller, der indeholder bakteriestammen og opløsningsmidlet.
  5. I denne metode indbefatter kontrolreaktioner med brønde, der kun indeholder dyrkningsmedium, der vil være den negative kontrol, men også brønde med medium podet med standardstammen tilsat opløsningsmiddel (ethanol eller vand) og medium med bakteriestammen og det positive kontrolantibiotikum (chloramphenicol).

6. Antioxidantaktivitet og kvantificering af samlede polyfenoler

  1. Polyfenolindhold i alt
    BEMÆRK: Det samlede polyfenolindhold (TPC) udføres ved hjælp af Folin-Ciocalteu-metoden23 og tilpasses mikroskala.
    1. Til hver brønd tilsættes en 96-brønds mikroplade, beskyttet mod lys, 158 μL ultrarent vand, 2 μL af prøven og 10 μL Folin-Ciocalteu-reagens.
      FORSIGTIG: Se sikkerhedsdatabladet for Folin-Ciocalteu-reagenset leveret af leverandøren.
    2. Efter 2 minutter tilsættes 30 μLNa2CO3 (20 %).
    3. Efter inkubation i mørke ved RT i 1 time måles prøverne spectrophotometrisk ved 755 nm.
    4. Brug gallinsyre (som gør det muligt at plotte kalibreringskurven) eller ultrarent vand (2 μL) som kontroller.
    5. Resultaterne udtrykkes som gallinsyreækvivalenter (mg GAE/g ekstrakt).
  2. 2,2 diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radikal skylleaktivitet
    BEMÆRK: Ekstrakternes antioxidantaktivitet evalueres som beskrevet af Duan et al. (2006) 24, tilpasset mikroskala
    1. I en mikroplade med 96 huller, der er beskyttet mod lys, anbringes 2 μL af hver prøve (i en koncentration på 10 mg/ml) og 198 μL DPPH opløst i absolut ethanol (0,1 mM).
      FORSIGTIG: Se DPPH's sikkerhedsdatablad leveret af leverandøren.
    2. Kør reaktionen i 30 minutter ved RT i mørke. Absorbansen måles ved 517 nm i et mikropladespektrofotometer.
    3. Der udføres en kontrolreaktion med 2 μL absolut ethanol/destilleret vand og 198 μL DPPH-opløsning. Der foretages en blindprøvemåling med 2 μL ekstrakt og 198 μL absolut ethanol.
    4. Udtryk resultaterne som procentdelen af DPPH-hæmning ved hjælp af følgende ligning:
      Equation 2
      hvor Som er algeekstraktets absorbans, Ab er blindprøvernes absorbans og Ac er kontrollens absorbans.

7. Cytotoksicitetsevaluering i epidermale celler

BEMÆRK: Den in vitro cytotoksiske virkning af de vandige ekstrakter og ethanolekstrakter af G. gracilis evalueres i humane keratinocytter (HaCaT-celler - 300493) gennem MTT-kolorimetrien assay som tidligere beskrevet25. Celler blev erhvervet fra Cell Lines Services, Tyskland (CLS), og metoden blev udført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer og CLS-instruktioner.
FORSIGTIG: Se sikkerhedsdatabladet for MTT leveret af leverandøren)

  1. Vedligeholdelse af cellekultur
    1. Dyrkning af HaCaT-celler i Dulbeccos modificerede ørns høje glukosemedium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% antibiotikum/antimykotisk opløsning (amphotericin B, 0,25 mM; penicillin, 60 mM; streptomycin, 100 mM).
    2. Brug trypsin-EDTA til at dissociere cellerne.
      BEMÆRK: Underkulturen af HaCaT-celler opnås, når cellerne når total sammenløb.
    3. Dyrk cellerne i et kammer ved 37 °C med 5% CO2 og 95 % fugtighed.
    4. Subkultur cellerne i henhold til biobankens instruktioner, når kulturer når 80% -85% sammenløb.
  2. Vurdering af cytotoksicitet
    1. Efter såning af celler i plader med 96 brønde og inkubation natten over behandles HaCaT-celler (4 x 104 celler / brønd) med de tørrede ekstrakter, der tidligere er opløst i DMSO (100 mg / ml). Derefter tilsættes 2 μL af ekstraktopløsningen til 198 μL medium og inkuberes pladerne i 24 timer.
    2. Fjern dyrkningsmediet og tilsæt 100 μL MTT (0,5 mg / ml) til cellerne. Inkuber cellerne i 30 minutter i mørke ved regelmæssige dyrkningsforhold nævnt ovenfor.
    3. MTT-opløsningen fjernes, og de intracellulære formazankrystaller opløses med 100 μL DMSO.
    4. Absorbansen måles ved 570 nm ved hjælp af en mikropladelæser. Resultaterne udtrykkes som en procentdel af ubehandlede kontrolceller.

8. Fødevareinnovation

  1. Nyt fødevareprodukt: Pasta med tang
    1. Valg af ingredienser og pastaformulering
      BEMÆRK: Ingrediensudvælgelsen er foretaget i samarbejde med et pastafirma. Valget af nøgleingredienser (beskrevet i pkt. 8.2) blev foretaget under hensyntagen til deres lette tilgængelighed og kompatibilitet med de eksisterende produktionslinjer ved hjælp af marine ressourcer til at opnå pasta med ekstra næringsværdi.
      1. Efter ingrediensernes valg skal du designe formuleringen efter den tilsigtede næringsværdi (kilde til fiber, vitaminer og mineralske elementer, lavt mættet fedt) ved at analysere formuleringernes teoretiske kemiske sammensætning ved hjælp af et regneark.
      2. Når de teoretiske krav er opfyldt, fortsættes produktionen i laboratorieskala som beskrevet i trin 8.1.2.
      3. Udfør en sensorisk test med et semi-trænet panel (>10 smagsdommere) for at validere behovet for omformulering eller accept af formuleringen i følgende trin.
        BEMÆRK: Panelet var tidligere uddannet til smagning af pasta og evaluerede hedonisk de præsenterede formuleringer med hensyn til egenskaber som smag, smag, lugt, tekstur og udseende.
    2. Pasta produktion
      BEMÆRK: Fremstil Chifferi pastaprøver ved hjælp af en pastaekstruder.
      1. I udstyret blandes tidligere definerede portioner rismel, G. gracilis og Chlorella vulgaris, og tilsæt ca. 30% vand til blandingen.
      2. For at opnå tør pasta tørres Chifferi ved 68 °C i 42 minutter efterfulgt af 5 timer og 30 minutter ved 76 °C, der simulerer en industriel proces.
      3. Til sidst pakkes og vakuumforsegles prøverne og opbevares på et mørkt sted ved RT indtil yderligere analyse.
    3. Ernæringsmæssig analyse
      BEMÆRK: Til ernæringsprofilanalyserne anvendes tørrede og macererede prøver i tre eksemplarer.
      1. Råproteinindhold: Udfør total proteinanalyse gennem Kjeldahl-metoden , tilpasset fra Duarte et al. (2022)26, efter trin 8.1.3.2-8.1.3.6.
      2. 1,0 g prøve (eller destilleret vand til blindprøven) vejes nøjagtigt og blandes med to Kjeldahl-tabletter og 25 mlH2SO4 i fordøjelsesrørene.
        FORSIGTIG: Se sikkerhedsdatabladet for H2SO4 leveret af leverandøren.
      3. Fordøjelsen af prøver udføres i en Kjeldahl-reaktor ved 220 °C i 30 minutter efterfulgt af 90 minutter ved 400 °C.
      4. Efter afkøling til RT tilsættes 80 ml destilleret vand og destilleres ammoniakken dannet til 30 ml af en 4%H3BO3-opløsning indeholdendebromocresolgrøn og methylrød. Dette trin foregår under alkaliske forhold (destillation med 40% NaOH ved hjælp af et Kjeldahl-destilleri.
        FORSIGTIG: Se sikkerhedsdatabladet for H 3 BO3-opløsningen, der indeholder bromocresolgrøn, methylrød og 40 % NaOH leveret af leverandøren.
      5. De destillerede prøver titreres med HCl 0,1 M, indtil der observeres en farveændring til grålig rosa.
      6. Råproteinindholdet, repræsenteret ved prøvens nitrogenindhold, beregnes, og det udtrykkes som g pr. 100 g ved hjælp af følgende ligning:
        Equation 3
        hvor Vs svarer til det HCl-volumen (ml), der er anvendt ved prøvetitrering Vb svarer til det volumen, der anvendes i emnet; N svarer til HCI-normalitet; w svarer til prøvens vægt (g).
      7. Samlet fedtindhold: Det samlede fedtindhold bestemmes ved hjælp af Folch-metoden, tilpasset fra Folch et al. (1957)27, efter trin 8.1.3.8-8.1.3.14.
      8. Der fremstilles folchloreagens ved at blandeCHCl3 og MeOH i forholdet 2:1 (v:v).
        FORSIGTIG: Se sikkerhedsdatabladet for det Folch-reagens, der leveres af leverandøren.
      9. Til reagensglas indeholdende 1 g delprøver tilsættes 5 ml folkereagens og 0,8 ml destilleret vand. Bland i en hvirvel i 1 min.
      10. Derefter tilsættes yderligere 5 ml Folch-reagens og homogeniseres i 5 min. Tilsæt 1,2 ml 0,8% NaCl-opløsning og homogeniser i 2 min.
      11. Prøverne centrifugeres ved 7000 x g i 10 minutter. Den organiske fase (nedre fase) filtreres gennem hydrofil bomuld og vandfrit natriumsulfat i en rundbundet glaskolbe.
      12. For at undgå tab af prøver gentages trinnene for tilsætning af 5 mlCHCl3, homogenisering, centrifugering og filtrering under de samme betingelser.
      13. Det organiske opløsningsmiddel fjernes fra de opsamlede organiske faser ved lavtryksfordampning og henstår i ovnen ved 105 °C i 4 timer. Prøverne afkøles i en ekssikkator.
      14. Fedtindholdet udtrykt i g pr. 100 g beregnes ved hjælp af følgende ligning:
        Equation 4
        hvor W1 er den tomme rundbundede glaskolbevægt W2 er prøvens startvægt W3 er den rundbundede glaskolbe med prøvevægten.
      15. Råfiberindhold: Råfiberindholdet bestemmes ved hjælp af en metode, der er tilpasset ISO 6865 (2000)28, efter trin 8.1.3.16-8.1.3.22.
      16. 1 g af prøven (W0) afvejes i en glasdigel med filterbund (reference P2), og den anbringes i fiberanalysatoren.
      17. Det første trin er syrehydrolyse: Tilsæt 150 ml 1,25%H2SO4,forvarmet, og 2 ml skumdæmpningsmiddel (n-octanol) til søjlen i hver digel; Varm indtil kogning og hold i 30 min.
      18. Efter fjernelse af dette opløsningsmiddel vaskes tre gange med deioniseret vand for at fortsætte til basisk hydrolyse. Tilsæt 150 ml 1,25% NaOH, forvarmet, og 5 ml skumdæmpningsmiddel til den væskefrie søjle, og udfør den samme opvarmningsprocedure som ved syrehydrolyse.
      19. Lav til sidst en tredobbelt vask med 150 ml acetone til den kolde ekstraktion.
      20. Efter denne proces fjernes diglerne forsigtigt fra systemet og anbringes i en ovn ved 150 °C i 1 time. Den endelige vægt (W1) registreres.
      21. Diglerne anbringes i en muffelovn ved 500 °C i 3 timer, hvorefter den endelige vægt (W2) registreres.
      22. Beregn råfiberindholdet og udtryk resultaterne i procent ved hjælp af følgende ligning:
        %Råfiber = 100 x (W1-W2)/W0
      23. Fedtsyreprofil (FA): Bestem fedtsyreprofilen i henhold til Fernández et al.(2015)29, følg trin 8.1.3.24-8.1.3.29.
        BEMÆRK: Fedtsyrerne methylestere (FAME'er) opnås ved direkte syrekatalyseret transmethylering af de formalede frysetørrede prøver. Alle analyser udføres i tre eksemplarer.
      24. Der tilsættes 2 ml af en 2% (v/v)H2SO4-opløsning i methanol til en 50 mg prøve, og blandingen hældes ved 80 °C i 2 timer under kontinuerlig omrøring.
        FORSIGTIG: Se sikkerhedsdatabladet for methanol leveret af leverandøren.
      25. Efter afkøling til RT tilsættes 1 ml ultrarent vand og 2 ml n-heptan til hver prøve, hvirvel blandingen i 1 min og centrifugeres i 5 min.
        FORSIGTIG: Se sikkerhedsdatabladet for n-heptan leveret af leverandøren.
      26. Genvind den øvre n-heptanfase (organisk), der indeholder FAME'erne, og overfør den til gaskromatografi (GC) hætteglas.
      27. Analyse i en gaskromatograf udstyret med en TR-FAME kapillærsøjle (60 m × 0,25 mm ID, 0,25 μm filmtykkelse), en autosampler og en flammeioniseringsdetektor (FID).
      28. Indstil injektoren (splitless mode) til 250 °C og detektoren til 280 °C. Indstil søjlens starttemperatur til 75 °C og hold den i 1 min. Derefter hæves ved 5 °C/min til 170 °C og holdes i 10 minutter. Derefter hæves ved 5 °C/min til 190 °C og holdes yderligere 10 min. Til sidst hæves ved 2 °C/min til 240 °C og holdes i 10 min. Brug helium som bæregas ved en strømningshastighed på 1,5 ml / min. Indblæsningsluft og brint ved strømningshastigheder på henholdsvis 350 og 35 ml/min.
      29. Bestem FA-profilen ved at sammenligne de resulterende retentionstider med en standard og udtryk resultaterne som en procentdel af det samlede fedt.
      30. Mineralgrundstofprofil: Bestem mineralelementerne (Ca, P, Mg, Na, K, Fe, Cu, Mn, Zn) analyseret af ICP-OES efter metoden tilpasset fra Pinto et al. (2022)30 ved at følge trin 8.1.3.31-8.1.3.34.
      31. Ca. 0,4 g af hver tør prøve vejes nøjagtigt, og der tilsættes 7,5 ml HNO3 og 2,5 ml HCI.
        FORSIGTIG: Se sikkerhedsdatabladet for HNO3 og HCl leveret af leverandøren.
      32. Fordøjelsen følger en to-trins proces: Forøg temperaturen fra RT til 90 °C på 30 minutter (og hold yderligere 30 minutter ved denne temperatur) efterfulgt af 60 minutter ved 105 °C.
      33. Afkøl prøveopløsningerne, fortynd dem til 25 ml og filtrer og opbevar dem i mærkede rør. I hver fordøjelse udføres den samme proces med et referencemateriale og et emne. ICP-OES opnår koncentrationen af de forskellige grundstoffer.
      34. Resultaterne udtrykkes i mg pr. 100 g fw.
      35. Kulhydratindhold: Kulhydratindholdet beregnes ved at følge trin 8.1.3.36-8.1.3.37.
      36. Beregn indholdet af tilgængelige kulhydrater (ekskl. Fiber) med forskellen mellem de tidligere bestemte faktorer pr. 100 g ved hjælp af følgende ligning ifølge Fødevare- og Landbrugsorganisationen (FAO; 2003)31
        Equation 5
      37. Udtryk resultaterne i g pr. 100 g.
      38. Vand- og askeindhold: Anslå vand- og askeindholdet ved at følge trin 8.1.3.39-8.1.3.45.
      39. Digler af porcelæn inkuberes i 3 timer ved 105 °C, afkøles i en ekssikkator og vejes.
      40. 10 g af prøven afvejes i digelen og anbringes i tørreovn ved 105 °C i cyklusser i 3 timer, indtil værdierne fra successiv vægtning ikke afviger med mere end 10 mg.
      41. Vandindholdet udtrykt i g pr. 100 g fw beregnes ved hjælp af følgende ligning:
        Equation 6
        hvor W1 er vægten af den tomme digel, W2 er vægten af digelen med den friske prøve, og W3 er vægten af digelen med den tørrede prøve.
      42. Efter vandindholdsanalysen anbringes diglerne med de tørrede prøver i et forbrændingsanlæg ved 525 °Ci 4 timer.
      43. Denne fremgangsmåde gentages, indtil de på hinanden følgende vægtninger ikke afviger med mere end 1 mg.
      44. Prøverne afkøles til RT i en ekssikkator, og de vejes derefter.
      45. Askeindholdet udtrykt i g pr. 100 g fw beregnes ved hjælp af følgende ligning:
        Equation 7
        hvor W1 er vægten af den tomme digel, W2 er digelens vægt med frisk prøve, W3 er digelens vægt med vægt.
      46. Energiværdi: Energiværdien beregnes ved at følge trin 8.1.3.47-8.1.3.48.
      47. Beregn prøvernes energiværdi i henhold til EU-forordningen:Fødevareinformation til forbrugerne (forordning (EU) nr. 1169/2011)32 ved hjælp af ligningerne:
        Energi (kcal/ 100 g) = 4 x (g proteiner) + 4 x (g kulhydrater) + 9 x (g fedt) + 2 x (g fiber)
        Energi (kJ/ 100 g) = 17 x (g proteiner) + 17 x (g kulhydrater) + 37 x (g fedt) + 8 x (g fiber)
      48. Udtryk resultaterne i kilokalorier pr. 100 g og kilojoule pr. 100 g.
    4. Forbrugernes accept
      1. Evaluer forbrugernes accept ved hjælp af pastaprøver kogt i destilleret vand i 8 min.
      2. Udfør forbrugeraccepttest: Evaluer visuelt udseende, farve, tekstur, lugt, havsmag, samlet smag, samlet evaluering og købshensigt for prøverne.
        BEMÆRK: Forbrugeraccepttesten er baseret på hedoniske tests, der evaluerer visuelt udseende, farve, tekstur, lugt, havsmag, samlet smag, samlet evaluering og købshensigt på en skala fra 1-9, hvor 1 er en dårlig evaluering, og 9 er en meget god evaluering.
      3. Udfør sensoriske tests i individuelle sensoriske kabiner i et sensorisk analyselaboratorium (med temperatur- og lysstyring). Giv bestik, servietter og glaskopper mineralvand til at rense ganen mellem prøverne.
        BEMÆRK: Smagere er i alderen 16-64 år fra alle baggrunde (n > 80).
  2. Yoghurt
    1. Pigment ekstraktion
      BEMÆRK: Udfør pigmentekstraktionen gennem metoden beskrevet i Pereira et al. (2020)18.
      1. Ekstraktionsopløsningsmidlet natriumphosphatbuffer fremstilles ved 0,1 M med natriumphosphatdibasisk (0,03 M) og natriumphosphatmonobasisk (0,07 M). Indstil pH til pH 6,8 ved hjælp af NaOH eller HCI.
      2. Der afvejes 1 g G. gracilis og tilsættes 50 ml natriumphosphatbuffer (pH 6,8). Homogeniser i 10 min, efterfulgt af 10 minutters maceration med mørtel og støder.
      3. Opløsningen overføres til et glas og centrifugeres i 20 minutter ved 12.298 x g (4 °C).
      4. Pool, supernatanten og tilsæt langsomt 65% ammoniumsulfat. Når alt ammoniumsulfat er opløst, dækkes opløsningen med en aluminiumsplade og lades udfælde ved 4 °C natten over.
        FORSIGTIG: Se sikkerhedsdatabladet for ammoniumsulfat leveret af leverandøren.
      5. Bundfaldet centrifugeres i 20 minutter ved 12.298 x g (4 °C). Pelleten genvindes og opløses i destilleret vand (ca. 5 ml).
      6. Dialyse af ekstraktet udføres ved hjælp af en slangemembran (14 kDa) mod vand i 24 timer efterfulgt af frysetørring. Det frysetørrede ekstrakt er beskyttet mod lys ved 4 °C indtil brug.
    2. Tilberedning af yoghurt
      1. Tilbered naturlig yoghurt ved at blande 1 liter pasteuriseret mælk, 120 g naturlig yoghurt, 20 g sukker og 50 g mælkepulver i en termomixer i 5 min, 50 ° C, hastighed 3.
      2. Blandingen anbringes i termomixerglasset i en inkubator ved 37 °C i 12 timer.
      3. Inkorporer ekstraktet ved at blande det i yoghurt i en koncentration på 0,21%. Prøverne opbevares i individuelle glaskolber ved 4 °C indtil analysen.
      4. Opbevar individuelle portioner yoghurt uden pigment (kontrol) ved 4 °C indtil analyse.
    3. Farve stabilitet
      BEMÆRK: Evaluer pigmentets stabilitet i yoghurt gennem farveanalyse i 12 dage. Udfør farveanalyse ved hjælp af et reflektanskolorimeter ved hjælp af en 2-graders standardobservatør og et D65-belysningsmiddel. Resultaterne præsenteres som CIELab-koordinater med L (lyshed, sort - hvid, 0 - 100), a * (grøn - rød, -60 - 60) og b * (blå - gul, -60 - 60) parametre. Parameter a* har positive værdier for rødlige farver og negative værdier for grønlige farver. Parameter b* tager positive værdier for gullige farver og negative værdier for blålige farver. L * er parameteren for lysstyrke, som er den egenskab, ifølge hvilken hver farve kan betragtes som svarende til et medlem af gråskalaen mellem sort og hvid33.
      1. Kolibrer kolorimeteret ved hjælp af en hvid keramisk plade (L* 88,5, a* 0,32, b* 0,33) leveret af producenten.
      2. Fyld en celle med ca. 28 g af prøven (eller kontrollen), og analyser farven ved hjælp af farvedataanalysesoftware.
        BEMÆRK: Den software, der blev brugt til farvedataanalyse, var SpectraMagic NX.
      3. Udfør aflæsninger 5 gange i prøve-/kontroltriplikater.
    4. Sensorisk analyse
      BEMÆRK: Udfør sensorisk evaluering af yoghurt med pigmentinkorporering ved hjælp af en trekanttest (ISO 4120, 2004)34 og en hedonisk evaluering af farve, smag og generel påskønnelse.
      1. Til trekanttesten skal du give paneldeltagerne tre prøver (en prøve yoghurt med pigment og to prøver af kontrol eller to prøver af yoghurt med pigment og en kontrol) og bede dem om at vælge en anden prøve baseret på aroma, tekstur og smag. Giv prøver i lignende mængder identificeret med tilfældige 3-talkoder.
      2. Til den hedoniske evaluering af yoghurt med pigment skal du give paneldeltagerne en prøve af yoghurt med pigment og bede dem om at evaluere farven, smagen og den samlede påskønnelse ved hjælp af en 9-punkts hedonisk skala (fra ekstremt modvilje til ekstremt lignende).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Antimikrobiel aktivitet

Ved fortolkning af de opnåede resultater skal man huske på, at jo højere hæmningsprocenten er, desto større er ekstraktets effektivitet til at hæmme væksten af den specifikke stamme, og følgelig jo mere interessant er ekstraktet som et antimikrobielt stof. Gennem denne metode kan vi hurtigt identificere, hvilke ekstrakter der har større aktivitet på visse bakteriestammer, og også identificere de mest interessante med hensyn til fremtidig brug. Vi kan således have et udgangspunkt for yderligere undersøgelser af det samme uddrag.

Figur 1 viser de resultater, der er opnået med vandige ekstrakter, både i den første og anden ekstraktion, umiddelbart efter biomassetørring (figur 1A) og i den tredje og fjerde ekstraktion (figur 1B), opnået efter ethanolekstraktionerne, hvorved biomassen anvendes integreret. Vi kan se, at de mest interessante resultater, svarende til den tredje og fjerde vandige ekstraktion, afslører højere antimikrobielle aktiviteter, især i ekstrakter opnået ved 70 °C. Koncentrationen af ekstrakt i brøndene er 5 mg/ml.

Figure 1
Figur 1: Væksthæmning af bakteriearter i nærvær af vandige ekstrakter af G. gracilis. Væksthæmning af 3 bakteriearter (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Listonella anguillarum) efter 24 timers vækst i et flydende medium under tilstedeværelse af vandige ekstrakter (Aq) af G. gracilis opnået ved forskellige temperaturer, stuetemperatur (RT), 40 °C (40) og 70 °C (70). Den positive kontrol blev udført med chloramphenicol (CHL), og resultaterne udtrykkes som middelværdier (n = 8). Data henviser til de 4 sekventielle ekstraktionstrin (1st, 2nd, 3rd, 4th). Klik her for at se en større version af denne figur.

De ethanoliske ekstrakter synes at være særligt effektive til at hæmme væksten af L. anguillarum, som vist i figur 2. Dette viser de resultater, der er opnået med ethanolekstrakterne, også i den første og anden ekstraktion (figur 2A) og den tredje og fjerde ekstraktion (figur 2B), opnået efter den første vandige ekstraktion.

Figure 2
Figur 2: Væksthæmning af bakteriearter i nærvær af ethanolekstrakter af G. gracilis. Væksthæmning af 3 bakteriearter (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Listonella anguillarum) efter 24 timers vækst i et flydende medium under tilstedeværelse af ethanolekstrakter (Et) af G. gracilis, opnået ved forskellige temperaturer, stuetemperatur (RT), 40 °C (40) og 70 °C (70). Der blev udført positiv kontrol med chloramphenicol (CHL), og resultaterne blev udtrykt som middelværdier (n = 8). Data henviser til de 4 sekventielle ekstraktionstrin (1st, 2nd, 3rd, 4th). Klik her for at se en større version af denne figur.

Antioxidant aktivitet

Med hensyn til de resultater, der fremhæver antioxidantpotentialet i de forskellige ekstrakter, nemlig i DPPH-testen, indikerer resultaterne udtrykt i figur 3 , at temperaturen på 40 °C var den mest effektive, hvilket resulterede i højere hæmningsværdier for oxidantaktiviteten end dem, der blev observeret i ekstrakter opnået ved RT eller 70 °C. Dette gælder for G. gracilis-prøverne , og der kan være store variationer afhængigt af de anvendte prøver og algevækstbetingelserne. Det anbefales derfor, at der udføres test for at angive de bedste betingelser for hver specifik type prøve.

Figure 3
Figur 3: Inhibering af DPPH-radikalet (%) i nærvær af ekstrakter opnået ved forskellige temperaturer. Ekstrakter blev opnået ved ethanol (Et) eller vandig (Aq) ekstraktion. 1. og 2. ekstraktionerne blev fremstillet af tør biomasse sekventielt. De resterende (3. og 4.) blev fremstillet med biomasse, der tidligere var ekstraheret med det alternative opløsningsmiddel. RT betyder stuetemperatur; 40, ekstrakt fremstillet ved 40 °C og 70, ekstrakt fremstillet ved 70 °C. Klik her for at se en større version af dette tal.

Lignende resultater blev opnået med hensyn til total polyphenolkvantificering (figur 4), hvor temperaturen på 40 °C blev betragtet som den bedste med hensyn til ekstraktion af antioxidantforbindelser. Dette viser, at antioxidantaktiviteten synes at være korreleret med de phenoliske komponenter, der er til stede i ekstrakterne.

Figure 4
Figur 4: Kvantificering af det samlede polyphenolindhold (TPC) i ekstrakter opnået ved forskellige temperaturer. Ekstrakterne blev opnået ved ethanol (Et) eller vandig (Aq) ekstraktion, hvor 1. og 2. ekstraktion blev fremstillet sekventielt fra tøralger, og de resterende (3. og 4.) blev fremstillet med biomasse, der tidligere var ekstraheret med et andet opløsningsmiddel. RT betyder stuetemperatur; 40, ekstrakt fremstillet ved 40 °C og 70, ekstrakt fremstillet ved 70 °C. Klik her for at se en større version af dette tal.

Cytotoksicitet i HaCat-celler

Det første skridt til at vurdere kosmetiske ingrediensers sikkerhed er undersøgelsen af deres in vitro cytotoksicitet i epidermale og dermale cellelinjer. Som det kan ses i figur 5, blev der ikke observeret cytotoksiske virkninger på keratinocytter (HaCaT-celler), hvilket tyder på, at både vandige ekstrakter og ethanolekstrakter ved den maksimale analyserede koncentration (1 mg/ml) er sikre til kutan anvendelse.

Figure 5
Figur 5: Cytotoksisk virkning af Gracilaria gracilis ekstrakter (1 mg/ml) på HaCaT-celler efter 24 timers behandling. Værdierne i hver kolonne udtrykkes som gennemsnittet ± standardfejlen af gennemsnittet (SEM) af tre uafhængige eksperimenter i tre eksemplarer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Fødevareinnovation

De endelige pastaformuleringer blev opnået efter adskillige forsøg mellem teoretisk formulering og sensorisk test af et semi-trænet panel. Efter dette trin blev den kemiske karakterisering tilgået, herunder ernæringsmæssig evaluering, fedtsyrer og mineralelementprofiler. Det var muligt at opbygge en ernæringsmæssig karakterisering (tabel 1 og tabel 2) og verificere eksistensen af forventede ernæringsanprisninger baseret på den europæiske lovgivning (REG (EU) nr. 1169/2011)32.

Ernæring Fakta med 100 g pasta % af FUI-investeringer
Energi 1478,90 kJ (348,74 kcal) 17
Lipider 1,06 ± 0,10 g 2
Fra hvad:
Mættede fedtsyrer 0,38 ± 0,01 g 2
Kulhydrater 72,59± 0,21 g 28
Fiber 3,84 ± 0,20 g
Protein 10,29 ± 0,20 g 21
Salt 0,22 ± 0,02 g 9

Tabel 1: Ernæringsmæssige fakta. Ernæringsmæssige fakta om udviklet pasta baseret på kemiske analyser (n = 3) af energi og kulhydrater opnået ved beregning og respektive procentdel af anbefalet dosisindtag (n = 3).

Disse pastaformuleringer er designet til at appellere til en målforbruger, der har en sundere kost i tankerne, så mængden af fedt pr. 100 g af et produkt skal være så lille som muligt. Detaljeret analyse af fedtsyreprofilen viser en værdi på 0,38 g mættede fedtsyrer/100 g, hvilket er langt under grænsen for produkter med lavt indhold af mættet fedtindhold, hvilket opfylder det oprindelige mål i produktionen af denne pasta. Med hensyn til fiberindholdet var det også muligt i overensstemmelse med europæiske regler at hævde denne pastaformulering som en kilde til fiber.

I karakteriseringen af mineralske grundstoffer, bestemt af ICP-OES og præsenteret i tabel 2, angives værdien af ca. 219 mg/100 g Na, der er til stede i 100 g af dette produkt, så det kan ikke verificeres, at det er et produkt med lavt natriumindhold (<0,12 g/100 g). På grund af det forhøjede natriumindhold, der naturligt findes i ingredienserne, kræver dette produkt muligvis ikke tilsætning af salt i konfekture.

Table 2

Tabel 2: Pasta mineralske elementer profil. Blå - højt indhold af element; Rød - kilde til et bestemt element (n = 3). Klik her for at downloade denne tabel.

I henhold til den nævnte EU-forordning og RDI% for hvert element kan det ses, at dette produkt har et højt indhold af K, P, Fe og også er en kilde til Zn. Det har Se, Mg og Ca til stede i mindre mængder.

Til pastaaccepttestene blev der brugt 86 testere, hvoraf 63 var kvinder og 23 mænd i alderen over 18 år. Accepttestene var baseret på hedoniske skalaer på 9 point, som fastsat i standarderne. Den sunde dej scorede 5 og 6 på en hedonisk skala fra 1 til 9 for parametrene "Havsmag" og "Visuelt udseende" (figur 6).

Figure 6

Figur 6: Resultater fra sensoriske forbrugeraccepttest . (A) Det hedoniske valg for visuelt udseende, farve, tekstur, lugt, havsmag og overordnet smag. (B) Det hedoniske valg for samlet vurdering og købshensigt. Skala 1-9, hvor 1 er en dårlig evaluering, og 9 er en meget god evaluering (n = 86). Klik her for at se en større version af denne figur.

Pastaen scorede 5 og 6 på en hedonisk skala fra 1 til 9 for parametrene "Havsmag" og "Visuelt udseende" (figur 6A). Denne pasta opnåede en lav værdi på denne skala med hensyn til teksturparameteren (i betragtning af andre formuleringer, der allerede er undersøgt), sandsynligvis fordi basisingrediensen er rismel; På trods af dette opnåede den værdier på en skala fra 1 til 9, der spænder fra 4 til 7, hvilket afspejler en god accept af gennemsnitsforbrugeren. På en hedonisk skala fra 1 til 9 havde pastaen som hyppigste svar værdien 5 for købshensigt og værdien af 6 for samlet påskønnelse, som vist i figur 6B. Det blev konstateret, at ca. 65% af smagerne valgte et svar, der var lig med eller højere end scoren på 6 til den samlede vurdering af denne pasta. Farvestabiliteten af yoghurt med pigment blev evalueret i 12 dage ved -4 °C, og resultaterne er vist i figur 7.

Figure 7
Figur 7: Yoghurtens farvestabilitet. (venstre) Kontroller yoghurt og (højre) yoghurt med Gracilaria gracilis pigment i løbet af 12 dages opbevaring. Parametrene a*, b* og L* er dimensionsløse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Resultaterne indikerer, at parametrene a* og b* var stabile over tid, mens L*-værdierne viste højere varians. Letheden viste højere værdier efter 8 dages opbevaring. Mens der blev fundet nogle forskelle i lyshedsparametrene, hvilket indikerer, at prøverne var lettere over tid, viste parametrene rødme (a*) og blå (b*) god stabilitet. Inkorporeringen af ekstrakterne i yoghurt viste god farvebevarelse med en ΔE på 7,01 ± 2,36 efter 12 dages opbevaring. Med hensyn til den sensoriske evaluering af yoghurten identificerede 9 ud af 13 paneldeltagere korrekt den korrekte prøve i trekanttesten, hvilket tyder på, at der var forskelle mellem yoghurterne, der tillod denne sondring. De hedoniske tests foretaget på det semi-trænede panel viste en god accept af produktet, afspejlet i score over 7 (figur 8). Scoren for en af de tre attributter, der blev testet, var 9, hvilket førte til scoregennemsnit over 8. Den bedste evaluering blev foretaget til farve, hvilket afspejler en fremragende accept af panelet, et afslørende resultat.

Figure 8
Figur 8: Resultater af den hedoniske sensoriske evaluering af yoghurt med Gracilaria gracilis pigment. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De antimikrobielle aktivitetstest i et flydende medium bruges til at evaluere effektiviteten af antimikrobielle stoffer mod mikroorganismer suspenderet i et flydende medium og udføres normalt for at bestemme et stofs evne til at hæmme vækst eller dræbe mikroorganismer35,36,37,38. De anvendes til at vurdere mikroorganismers følsomhed over for antimikrobielle stoffer og udføres i reagensglas eller mikrotitreringsplader, hvor forskellige koncentrationer af det antimikrobielle stof testes mod en standardiseret suspension af målmikroorganismen22. Antimikrobiel aktivitet vurderes ved at måle mikrobiel vækst eller tilstedeværelse/fravær af turbiditet i dyrkningsmediet efter en passende inkubationsperiode.

Der er flere teknikker og metoder til at udføre disse tests, såsom bouillonfortyndingsmetoden, agardiffusionsmetoden (såsom diskdiffusionstesten) og bouillonmikrofortyndingsmetoden, som er en af de mest anvendte38. Nogle af de mest kritiske punkter i disse metoder omfatter korrekt forberedelse af podningen, valg af kulturmedium, kvaliteten af de anvendte antimikrobielle stoffer, standardisering af teknikken og effektiv kontamineringskontrol. Inokulumet, som er en standardiseret suspension af mikroorganismer, skal fremstilles korrekt for at sikre nøjagtigheden af resultaterne. Dette indebærer en passende udvælgelse af mikrobiel kultur, en korrekt kultur af rene stammer, justering af cellekoncentration og standardisering af suspensionen for at opnå en passende optisk densitet eller cellekoncentration.

Det anvendte dyrkningsmedium bør vælges omhyggeligt for at sikre, at det giver de ideelle vækstbetingelser for den undersøgte mikroorganisme. Kemisk sammensætning, pH og andre faktorer kan påvirke testresultaterne. Det er vigtigt at følge producentens anbefalinger til fremstilling af kulturmediet. Kvaliteten af de antimikrobielle midler, der anvendes som kontrol, er grundlæggende, og det er vigtigt at sikre, at disse er rene, inden for holdbarhed og opbevares korrekt. Mærkning og udløbsdatoer bør altid konsulteres i overensstemmelse med producentens anvisninger. Standardiseringen af teknikken er også afgørende for at sikre nøjagtigheden af resultaterne. Dette omfatter tilsætning af de testede koncentrationer til dyrkningsmediet samt opretholdelse af aseptiske forhold under hele proceduren. Derudover kan krydskontaminering af mikroorganismer under test føre til falske eller upålidelige resultater. Det er vigtigt at følge streng aseptisk praksis under hele proceduren, fra manipulation af podematerialet til inkubation af rørene eller pladerne. Brug af rene bordplader, korrekte pipetteringsteknikker og korrekt bortskaffelse af materialer er vigtige foranstaltninger for at undgå forurening.

Opmærksomhed på detaljer og streng overholdelse af etablerede protokoller og retningslinjer er afgørende for at minimere fejl og sikre pålideligheden af resultaterne i antimikrobielle aktivitetstest i et flydende medium. Testene for antimikrobiel aktivitet har også nogle begrænsninger, der bør betragtes som37.

Faktorer som pH, temperatur, tilstedeværelse af blodkomponenter og interaktioner med immunsystemet tages ikke i betragtning i disse tests, hvilket kan begrænse evnen til at forudsige effektiviteten af et antimikrobielt middel i en levende organisme. Test måler også et antimikrobielt stofs evne til at hæmme mikrobiel vækst eller dræbe mikroorganismer og giver ikke detaljerede oplysninger om antimikrobiel virkningsmekanisme eller dets selektivitet mod specifikke mikroorganismer. Der er begrænsninger i detektering af resistens, da de anvendte metoder muligvis ikke tillader detektion eller forudsigelse af resistensudviklingen over tid. Nogle mikroorganismer kan udvikle resistensmekanismer som reaktion på langvarig eksponering for et antimikrobielt stof, og disse ændringer kan ikke let påvises gennem disse tests. Test af antimikrobiel aktivitet i et flydende medium tager generelt ikke hensyn til andre værtsfaktorer, der kan påvirke effektiviteten af et antimikrobielt middel, såsom tilstedeværelsen af biofilm eller værtens immunrespons.

Det er vigtigt at overveje disse begrænsninger og supplere testning for antimikrobiel aktivitet i flydende medier med andre metoder og tilgange, såsom in vivo-undersøgelser , biofilmmodeller og andre39. Inden for bioprospektering efter bioaktive makroalgeforbindelser kan test for antimikrobiel aktivitet anvendes til at evaluere algeekstrakters eller isolerede forbindelsers antimikrobielle potentiale og identificere stoffer med antimikrobiel aktivitet mod specifikke mikrobielle patogener, som kan anvendes på områder såsom produktion af lægemidler, kosmetik, fødevarer eller landbrugsprodukter40.

Antioxidantaktivitetstest er metoder, der anvendes til at evaluere en forbindelse eller ekstrakts evne til at neutralisere frie radikaler eller reducere oxidativt stress. Disse tests anvendes i vid udstrækning i antioxidantforskning, både i fødevarer og i naturlige produkter som alger, for eksempel. Der er flere metoder til at evaluere antioxidantaktiviteten, og en af de mest almindeligt anvendte er absorptionskapaciteten for frie radikaler. I denne test anvendes et stabilt frit radikal, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), til at evaluere en forbindelses evne til at donere en elektron og neutralisere det frie radikal. Antioxidantaktivitet måles ved at reducere DPPH's lilla farve, som opstår, når antioxidantforbindelsen donerer en elektron til det frie radikal. Andre metoder omfatter oxygenradikalabsorptionskapaciteten (ORAC), jernreduktionskapaciteten (FRAP) eller reduktionskapaciteten for frie radikaler (ABTS)41.

Kvantificering af samlede polyfenoler (QTP) er derimod ikke en direkte metode til bestemmelse af antioxidantaktiviteten, men giver et mål for den samlede koncentration af polyphenoler i en prøve, selvom flere interfererende stoffer kan påvirke resultaterne. Selvom mange polyfenoler vides at have antioxidantegenskaber, er antioxidantaktiviteten af en forbindelse relateret til flere faktorer, såsom dens kemiske struktur, koncentration, evne til at donere eller fange frie radikaler og interaktioner med andre cellulære komponenter42. Den blotte kvantificering af det samlede polyfenolindhold kan ikke give en vurdering af prøvens antioxidantaktivitet. Det er dog vigtigt at bemærke, at tilstedeværelsen af polyfenoler i en prøve kan være forbundet med en højere sandsynlighed for antioxidantaktivitet, da mange polyfenoler besidder antioxidantegenskaber. QTP kan således tjene som en foreløbig indikator for tilstedeværelsen af polyphenoler i prøven, men bekræftelse af antioxidantaktivitet kræver antioxidantaktivitetsassays. Polyfenoler er en klasse af kemiske forbindelser, der er bredt fordelt i naturen, findes i fødevarer, planter, frugt, grøntsager og alger. Der findes forskellige metoder til kvantificering af totale polyfenoler, og Folin-Ciocalteu-metoden er en af de mest anvendte. QTP giver et generelt mål for koncentrationen af polyphenoler, men specificerer ikke de enkelte polyphenoliske forbindelser, der er til stede i prøven. Derfor er det en kvantitativ, men ikke en kvalitativ metode. Desuden er det vigtigt at overveje, at forskellige polyfenoler har forskellige antioxidantkapaciteter og biologiske aktiviteter, så QTP giver ikke detaljerede oplysninger om de specifikke funktionelle egenskaber ved de tilstedeværende polyfenoler.

Hver metode har sine fordele og begrænsninger, og valget af en given test afhænger af egenskaberne ved den undersøgte forbindelse og formålet med analysen. Det er vigtigt at følge de specifikke instruktioner for hver metode for at sikre pålidelige og sammenlignelige resultater. Ved bestemmelse af antioxidantkapaciteten indbefatter nogle af de almindelige kritiske trin for det første prøvepræparatet. Det er vigtigt at forberede prøverne korrekt, sikre, at der opnås tilstrækkelige koncentrationer, og undgå kontaminering. Dette indebærer en nøjagtig vejning af forbindelserne eller ekstrakterne og opløsning af dem i passende opløsningsmidler. Det er også vigtigt at overveje stabiliteten af forbindelser og ekstrakter under processen med forberedelse, opbevaring og håndtering. Alle de reagenser, der anvendes i antioxidantaktivitetstestene, skal være korrekt forberedt og standardiseret for at sikre resultaternes reproducerbarhed. Dette indebærer korrekt fremstilling af gallinsyrestandarden og nøjagtigheden af mængderne. Reaktionstid er et kritisk aspekt for at få nøjagtige resultater i antioxidanttest. Det er nødvendigt at optimere inkubationstiden for at sikre en fuldstændig reaktion mellem antioxidantforbindelsen og det frie radikal. Utilstrækkelig tid kan føre til undervurdering af antioxidantaktivitet, mens overdreven tid kan resultere i nedbrydning af forbindelserne eller interferens fra sekundære reaktioner. Temperaturen under test skal også styres nøjagtigt og konsekvent. Temperatur påvirker hastigheden af kemiske reaktioner og kan påvirke resultaterne. Det er vigtigt at følge de temperaturforhold, der anbefales af de specifikke metoder, og sikre temperaturstabilitet under hele proceduren. Inkluderingen af passende kontroller er afgørende for at validere resultaterne af antioxidanttest. Dette kan omfatte positive kontroller (forbindelser kendt for at have antioxidantaktivitet) og negative kontroller (prøver uden antioxidantaktivitet). Kontrol giver et sammenligningsgrundlag for fortolkning af resultater og bidrager til at sikre nøjagtigheden af de opnåede data. For at opnå pålidelige resultater anbefales det at udføre test af antioxidantaktivitet på replikater og gentage eksperimentet flere gange for at øge betydningen af dataene og for at opnå mere pålidelige og robuste resultater.

Testmetoder for antioxidantaktivitet har nogle begrænsninger, der bør overvejes, når resultaterne fortolkes, nemlig det faktum, at de i flydende medier muligvis ikke fuldt ud fanger kompleksiteten af biologiske systemer og interaktioner mellem forskellige forbindelser, den brede vifte af antioxidantreaktioner, der kan forekomme, cellulær metabolisme og miljøfaktorer, der kan påvirke antioxidantaktivitet. Så forskellige tests skal bruges. Man skal også være opmærksom på manglen på direkte sammenhæng med sundhedsmæssige fordele; Selvom antioxidantaktivitet ofte er forbundet med sundhedsmæssige fordele, oversætter dette ikke altid direkte til sundhedsmæssige fordele i levende organismer på grund af mange andre faktorer, såsom biotilgængelighed, stofskifte og interaktioner med andre biologiske systemer.

Det er vigtigt at huske på, at antioxidantaktivitetstest er nyttige værktøjer til den indledende evaluering af antioxidantpotentialet af forbindelser og ekstrakter, men bør ikke betragtes som en endelig indikator for biologiske virkninger eller sundhedsmæssige fordele. Yderligere undersøgelser er nødvendige for fuldt ud at forstå virkningen af antioxidanter på kroppen.

Selvom metoderne til test af antioxidantaktiviteten i flydende medium er meget udbredt i forskning og har deres fordele og begrænsninger, sammenlignet med alternativerne, kan disse metoder betragtes som gode med hensyn til praktisk, hastighed, omkostninger og nem implementering. En af de største fordele er procedurernes enkelhed og hastighed og deres egnethed til indledende forskning, sammensat screening og store undersøgelser. Disse metoder er relativt hurtige at udføre og kan give resultater på kort tid på en mere overkommelig måde og kræver mindre specialiseret udstyr sammenlignet med andre metoder.

Alger er kendt for deres evne til at producere bioaktive forbindelser, herunder antioxidanter, som kan have gavnlige sundhedsmæssige egenskaber43. Algeekstrakter kan fremstilles fra forskellige dele af algerne og kan opnås ved anvendelse af forskellige opløsningsmidler, såsom vand, ethanol, methanol eller acetone, blandt andre. Det er vigtigt at huske, at antioxidantaktiviteten af algeekstrakter kan variere afhængigt af flere faktorer, såsom algearten, ekstraktionsmetoden og koncentrationen af de tilstedeværende bioaktive forbindelser. Derfor anbefales det at udføre antioxidantaktivitetstest på replikater og at udføre sammenligninger med passende kontroller for at opnå mere pålidelige resultater. Disse metoder kan bruges som et indledende værktøj i screening og udvælgelse af algeekstrakter med antioxidantpotentiale til videre undersøgelser.

MTT-analysen er en meget anvendt teknik til en foreløbig evaluering af in vitro cytotoksiske virkninger af stoffer til human og animalsk brug. På trods af at det er den mest anvendte metode til test af cytotoksicitet, påvirkes omdannelsen af MTT til formazankrystaller af adskillige faktorer som metabolisk hastighed og antallet af mitokondrier, og det gælder kun for klæbende cellemål14. De vigtigste kritiske trin i protokollen beskrevet her er relateret til den eventuelle forekomst af cellekulturforureninger, uønsket HaCaT-cellers vækst og en lav procentdel af cellesammenløb. Der er andre metoder, såsom lactat dehydrogenase (LDH), adenosintrifosfat (ATP) og kolonidannelsesassays til måling af cytotoksicitet. Men alle har fordele og begrænsninger. Ghasemi et al. (2021)44 evaluerede effekten af flere variabler på MTT-assaymålingerne på en prostatacancercellelinje (PC-3). Faktorer som cellesåningstæthed, koncentrationen af MTT, inkubationstid efter MTT-tilsætning, serumsult, sammensætningen af cellekulturmedier, frigivet intracellulært indhold og ekstrudering af formazan til det ekstracellulære rum blev analyseret. Fra denne undersøgelse blev nyttige anbefalinger om, hvordan man anvender analysen og et perspektiv på, hvor analysens anvendelighed er et kraftfuldt værktøj, men ligeledes hvor det har begrænsninger, skitseret af disse forfattere. Ikke desto mindre er MTT-analysen en hurtig, meget følsom og nem metode, der kan anvendes som en foreløbig cytotoksicitetsvurdering af mange stoffer med potentiel anvendelse på behandlings-, fødevare-, foder-, landbrugs- og miljøområdet. Især viste MTT-analysen her udført, at ethanol og vandige ekstrakter fra G. gracilis i de analyserede koncentrationer ikke påvirkede keratinocytlevedygtigheden og kan fortsætte med in vivo-assays for at sikre, at de er fuldstændig sikre til human kutan anvendelse.

Anvendelsen af havets ressourcer i fødevarer har endnu en gang vist sit potentiale til ikke blot at opnå produkter med øget næringsværdi, men også til at finde produkter med renere mærkning. Tilsætningen af hele G. gracilis (pasta) eller ekstrakt (som madfarve) viser markedspotentiale, og dets anvendelse kan være en af strategierne for virksomheder til at skille sig ud på markedet, tilfredsstille forbrugernes ernæringsmæssige behov og følge deres markedstendenser.

Da tang blev tilsat pastaformuleringerne, viste det sig oprindeligt, at strukturen var ændret, og at det ikke var muligt at opnå de ønskede dejformer. Vi havde udfordringen med at justere mængder og tilføje andre ingredienser, der ikke tidligere var forudset, med det formål at bevare pastaens tekstur. Udover den passende mængde af hver ingrediens blev ekstruderingsmetoden tilpasset gennem hele pastaens udvikling. Bortset fra denne vanskelighed er udviklingen af nye produkter baseret på tre grundlæggende principper: produktet skal være sensorisk tiltalende (tekstur, smag, lugt); produktet skal have en næringsmæssig merværdi Og den skal gøre maksimal brug af bæredygtige ingredienser og metoder. I denne forstand er en anden stor udfordring brugen af sensorpanelet til at opnå den mest tiltalende formulering. De fleste af de fysisk-kemiske analyser, der blev udført på pasta, var allerede optimeret til madmatricer; I dette arbejde blev prøveforberedelsen imidlertid optimeret, så den effektivt kunne anvendes på alle analysemetoderne.

Med hensyn til anvendelsen af G. gracilis pigment som farvestof blev der valgt et kølet produkt på grund af den termiske følsomhed af denne type molekyle45. Da yoghurtfremstilling involverer termisk behandling, blev pigmentet tilsat til slutproduktet. Blanding af pigmentet i yoghurten resulterede i et produkt, der var lidt mere flydende end kontrollen uden pigment. Faktisk kommenterede nogle paneldeltagere i slutningen af trekanttesten, at den eneste forskel mellem prøver var teksturen. Dette er et godt resultat, da hovedformålet med trekanttesten var at kontrollere, om der var mærkbare forskelle mellem yoghurt med og uden pigment, især forskelle i smag og lugt, da tangekstrakter kan give ubehagelig smag/lugt til fødevarer. Dette var en forundersøgelse, der involverede et lille semi-trænet panel. I yderligere undersøgelser bør et større antal smagsdommere overvejes for at opnå mere pålidelige markedsresultater. Hvad angår evalueringen af pigmentstabilitet i yoghurt, kan yderligere undersøgelser omfatte evaluering af andre fysisk-kemiske egenskaber af yoghurt med pigment over tid, såsom pH, vandaktivitet (aw) og tekstur. Sensorisk evaluering over tid ville også være ønskelig.

Afslutningsvis fremhæver protokollerne beskrevet her potentialet i den røde tang G. gracilis som ingredienskilde til at udvikle nye produkter med potentielle anvendelser i medicinal-, dermokosmetik- og fødevareindustrien. Desuden forbliver den postekstraherede restbiomasse et værdifuldt materiale, der skal anvendes som biostimulerende middel til plantevækst, jordberigelse, fiskefodring eller råmateriale til opnåelse af biokul og / eller funktionaliserede carbonatomer til vandrensningsformål. Den bioraffineringstilgang, der er beskrevet her, kan anvendes på andre tangarter og fremme en blå cirkulær økonomi og miljømæssig bæredygtighed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af den portugisiske fond for videnskab og teknologi (FCT) gennem de strategiske projekter, der blev tildelt MARE-Marine and Environmental Sciences Centre (UIDP/04292/2020 og UIDB/04292/2020) og Associate Laboratory ARNET (LA/P/0069/2020). FCT finansierede også de individuelle ph.d.-stipendier, der blev tildelt Marta V. Freitas (UI / BD / 150957/2021) og Tatiana Pereira (2021. 07791. BD). Dette arbejde blev også støttet økonomisk af projektet HP4A - SUND PASTA TIL ALLE (medfremme nr. 039952), medfinansieret af EFRU - Den Europæiske Fond for Regionaludvikling under Portugal 2020-programmet gennem det operationelle program COMPETE 2020 - konkurrenceevne og internationalisering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute Ethanol Aga, Portugal 64-17-5
Ammonium Chloride PanReac 12125-02-9
Amphotericin B Sigma-Aldrich 1397-89-3
Analytical scale balance Sartorius, TE124S 22105307
Bacillus subtilis subsp. spizizenii German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) DSM 347
Biotin Panreac AppliChem 58-85-5
Centrifuge Eppendorf, 5810R 5811JH490481
Chloramphenicol PanReac 56-75-7
CO2 Chamber Memmert N/A
Cool White Fluorescent Lamps OSRAM Lumilux Skywhite N/A
Densitometer McFarland Grant Instruments N/A
DMEM medium Sigma-Aldrich D5796
DMSO Sigma-Aldrich 67-68-5
DPPH Sigma, Steinheim, Germany 1898-66-4
Escherichia coli (DSM 5922) German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) DSM5922
Ethanol 96% AGA-Portugal 64-17-5
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA) J.T.Baker 6381-92-6
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Filter Paper (Whatman No.1) Whatman WHA1001320
Flasks VWR International, Alcabideche, Portugal  N/A
Folin-Ciocalteu VWR Chemicals 31360.264
Gallic Acid  Merck 149-91-7
Germanium (IV) Oxide, 99.999% AlfaAesar 1310-53-8
HaCaT cells – 300493 CLS-Cell Lines Services, Germany  300493
Hot Plate Magnetic Stirrer IKA, C-MAG HS7 06.090564
Iron Sulfate VWR Chemicals 10124-49-9
Laminar flow hood TelStar, Portugal 526013
LB Medium  VWR Chemicals J106
Listonella anguillarum German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)  DSM 21597
Manganese Chloride VWR Chemicals 7773.01.5
Micropipettes  Eppendorf, Portugal N/A
Microplates VWR International, Alcabideche, Portugal  10861-666
Microplates Greiner 738-0168
Microplates (sterile) Fisher Scientific 10022403
Microplate reader  Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA 1611151E
MTT Sigma-Aldrich 289-93-1
Muller-Hinton Broth (MHB) VWR Chemicals 90004-658
Oven Binder, FD115 12-04490
Oven Binder, BD115 04-62615
Penicillin Sigma-Aldrich 1406-05-9
pH meter Inolab  VWR International, Alcabideche, Portugal  15212099
Pippete tips Eppendorf, Portugal 5412307
Pyrex Bottles Media Storage  VWR International, Alcabideche, Portugal  16157-169
Rotary Evaporator Heidolph, Laborota 4000 80409287
Rotavapor IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal 07.524254
Sodium Carbonate (Na2CO3) Chem-Lab 497-19-8
Sodium Chloride (NaCl)  Normax Chem 7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic Riedel-de Haën 7558-79-4
SpectraMagic NX Konica Minolta, Japan color data analysis software
Spectrophotometer Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA 5A4T092004
Streptomycin Sigma-Aldrich 57-92-1
Thiamine Panreac AppliChem 59-43-8
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4049
Tryptic Soy Agar (TSA) VWR Chemicals ICNA091010617
Tryptic Soy Broth (TSB)  VWR Chemicals 22091
Ultrapure water  Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany F5HA17360B
Vacuum pump Buchi, Switzerland FIS05-402-103
Vitamin B12 Merck 68-19-9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Charoensiddhi, S., Abraham, R. E., Su, P., Zhang, W. Seaweed and seaweed-derived metabolites as prebiotics. Advances in Food and Nutrition Research. 91, 97-156 (2020).
  2. Roohinejad, S., Koubaa, M., Barba, F. J., Saljoughian, S., Amid, M., Greiner, R. Application of seaweeds to develop new food products with enhanced shelf-life, quality, and health-related beneficial properties. Food Research International. 99, 1066-1083 (2017).
  3. Hurd, C. L., Harrison, P. J., Bischof, K., Lobban, C. S. Seaweed Ecology and Physiology. (second). , Cambridge University Press, UK. (2014).
  4. Freitas, M. V., Mouga, T., Correia, A. P., Afonso, C., Baptista, T. New insights on the sporulation, germination, and nutritional profile of Gracilaria gracilis (Rhodophyta) grown under controlled conditions. Journal of Marine Science and Engineering. 9 (6), 562 (2021).
  5. Friedlander, M. Advances in cultivation of Gelidiales. Journal of Applied Phycology. 20 (5), 451-456 (2008).
  6. Matos, G. S., Pereira, S. G., Genisheva, Z. A., Gomes, A. M., Teixeira, J. A., Rocha, C. M. R. Advances in extraction methods to recover added-value compounds from seaweeds: Sustainability and functionality. Foods. 10, 516 (2021).
  7. Ummat, V., Sivagnanam, S. P., Rajauria, G., O'Donnell, C., Tiwari, B. K. Advances in pre-treatment techniques and green extraction technologies for bioactives from seaweeds. Trends in Food Science & Technology. 110, 90-106 (2021).
  8. Pérez, M. J., Falqué, E., Domínguez, H. Seaweed Antimicrobials, Present Status and Future Perspectives. Handbook of Algal Technologies andPhytochemicals:Volume I Food, Health and Nutraceutical Applications. Ravishankar, G., Ambati, R. R. , 1st ed, CRC Press, Boca Raton, Florida. (2019).
  9. Cavallo, R. A., Acquaviva, M. I., Stabili, L., Cecere, E., Petrocelli, A., Narracci, M. Antibacterial activity of marine macroalgae against fish pathogenic Vibrio species. Central European Journal of Biology. 8, 646-653 (2013).
  10. Shannon, E., Abu-Ghannam, N. Antibacterial derivatives of marine algae: An overview of pharmacological mechanisms and applications. Marine Drugs. 14 (4), 81 (2016).
  11. Capillo, G., et al. New insights into the culture method and antibacterial potential of Gracilaria gracilis. Marine Drugs. 16 (12), 492 (2018).
  12. Francavilla, M., Franchi, M., Monteleone, M., Caroppo, C. The red seaweed Gracilaria gracilis as a multi products source. Marine Drugs. 11 (10), 3754-3776 (2013).
  13. Sánchez-Ayora, H., Pérez-Jiménez, J. Antioxidant Capacity of Seaweeds: In Vitro and In Vivo Assessment. Marine Phenolic Compounds. Pérez-Correa, J. R., Mateos, R., Domínguez, R. , Elsevier. 299-341 (2023).
  14. Anil, S., Sweety, V. K., Vikas, B., Betsy-Joseph, B. Cytotoxicity and Cell Viability Assessment of Biomaterials. Cytotoxicity. , Intechopen. 111822 (2023).
  15. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  16. Roleda, M. Y., et al. Variations in polyphenol and heavy metal contents of wild-harvested and cultivated seaweed bulk biomass: Health risk assessment and implication for food applications. Food Control. 95, 121-134 (2019).
  17. Souza, K. D., et al. Gastronomy and the development of new food products: Technological prospection. International Journal of Gastronomy and Food Science. 33, 100769 (2023).
  18. Pereira, T., et al. Optimization of phycobiliprotein pigments extraction from red algae Gracilaria gracilis for substitution of synthetic food colorants. Food Chemistry. 321, 126688 (2020).
  19. Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. New England Seaweed Culture Handbook-Nursery Systems. Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. , Connecticut Sea Grant, University of Connecticut. (2014).
  20. Yong, Y. S., Yong, W. T. L., Anton, A. Analysis of formulae for determination of seaweed growth rate. Journal of Applied Phycology. 25 (6), 1831-1834 (2013).
  21. Patarra, R. F., Carreiro, A. S., Lloveras, A. A., Abreu, M. H., Buschmann, A. H., Neto, A. I. Effects of light, temperature and stocking density on Halopteris scoparia growth. Journal of Applied Phycology. 29 (1), 405-411 (2017).
  22. NCCLS, National Committee for Clinical Laboratory Standards, Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests: Approved Standard. 32, 11th ed, Wayne, PA, USA. M02-M11 (2012).
  23. Singleton, V. L., Rossi, J. A. J. Colorimetry to total phenolics with phosphomolybdic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
  24. Duan, X. J., Zhang, W. W., Li, X. M., Wang, B. G. Evaluation of antioxidant property of extract and fractions obtained from a red alga, Polysiphonia urceolata. Food Chemistry. 95 (1), 37-43 (2006).
  25. Freitas, R., et al. Highlighting the biological potential of the brown seaweed Fucus spiralis for skin applications. Antioxidants. 9 (7), 611 (2020).
  26. Duarte, A., et al. Seasonal study of the nutritional composition of unexploited and low commercial value fish species from the Portuguese coast. Food Science and Nutrition. 10 (10), 3368-3379 (2020).
  27. Folch, J., Lees, M., Stanley, G. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  28. ISO 6865. Animal feeding stuffs - Determination of crude fibre content - Method with intermediate filtration. Bureau of Indian Standards (BIS). , (2000).
  29. Fernández, A., Grienke, U., Soler-Vila, A., Guihéneuf, F., Stengel, D. B., Tasdemir, D. Seasonal and geographical variations in the biochemical composition of the blue mussel (Mytilus edulis L.) from Ireland. Food Chemistry. 177, 43-52 (2015).
  30. Pinto, F., et al. Annual variations in the mineral element content of five fish species from the Portuguese coast. Food Research International. 158, 111482 (2022).
  31. FAO. Food energy - methods of analysis and conversion factors. , FAO Food and Nutrition Paper 77 at https://www.fao.org/fileadmin/templates/food_composition/documents/book_abstracts/Food_energy.pdf (2003).
  32. Regulation (EU) Nr. 1169/2011 of the European Parliament and of the Council of 25 -10-2011. 25, https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/?uri=CELEX%3A32011R1169 (2011).
  33. Pathare, P. B., Opara, U. L., Al-Said, F. A. J. Colour measurement and analysis in fresh and processed foods: A review. Food and Bioprocess Technology. 6 (1), 36-60 (2013).
  34. ISO 4120. Sensory analysis - Methodology - Triangle test. International Standard. , https://www.iso.org/standard/33495.html (2004).
  35. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: A review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  36. Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
  37. Gajic, I., et al. Antimicrobial susceptibility testing: A comprehensive review of currently used methods. Antibiotics. 11 (4), 427 (2022).
  38. Gonzalez-Pastor, R., et al. Current landscape of methods to evaluate antimicrobial activity of natural extracts. Molecules. 28 (3), 1068 (2023).
  39. Li, J., et al. Antimicrobial activity and resistance: Influencing factors. Frontiers in Pharmacology. 13 (8), 364 (2017).
  40. Silva, A., et al. Macroalgae as a source of valuable antimicrobial compounds: Extraction and applications. Antibiotics. 9 (10), 642 (2020).
  41. Munteanu, I. G., Apetrei, C. Analytical methods used in determining antioxidant activity: A review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3380 (2021).
  42. Ma, S., et al. Comparison of common analytical methods for the quantification of total polyphenols and flavanols in fruit juices and ciders. Journal of Food Science. 84 (8), 2147-2158 (2019).
  43. Tziveleka, L. A., Tammam, M. A., Tzakou, O., Roussis, V., Ioannou, E. Metabolites with antioxidant activity from marine macroalgae. Antioxidants. 10 (9), 1431 (2021).
  44. Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
  45. Pereira, T., Barroso, S., Mendes, S., Gil, M. M. Stability, kinetics, and application study of phycobiliprotein pigments extracted from red algae Gracilaria gracilis. Journal of Food Science. 85 (10), 3400-3405 (2020).

Tags

Biologi udgave 201
Valorisering af den røde tang <em>Gracilaria gracilis</em> gennem en bioraffinaderitilgang
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martins, A., Pinto, F. R., Barroso,… More

Martins, A., Pinto, F. R., Barroso, S., Pereira, T., Mouga, T., Afonso, C., Freitas, M. V., Pinteus, S., Pedrosa, R., Gil, M. M. Valorization of the Red Seaweed Gracilaria gracilis Through a Biorefinery Approach. J. Vis. Exp. (201), e65923, doi:10.3791/65923 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter