Valorisatie van het rode zeewier Gracilaria gracilis door middel van een bioraffinage-aanpak

Summary

Hier beschrijven we verschillende protocollen die gericht zijn op een geïntegreerde valorisatie van Gracilaria gracilis: het oogsten van wilde soorten, in-house groei en extractie van bioactieve ingrediënten. De antioxiderende, antimicrobiële en cytotoxische effecten van de extracten worden geëvalueerd, samen met de voedings- en stabiliteitsbeoordeling van voedsel verrijkt met hele zeewierbiomassa en pigmenten.

Abstract

De belangstelling voor zeewier als overvloedige grondstof om waardevolle en multitarget bioactieve ingrediënten te verkrijgen, groeit voortdurend. In dit werk onderzoeken we het potentieel van Gracilaria gracilis, een eetbaar rood zeewier dat wereldwijd wordt gekweekt vanwege zijn commerciële belang als bron van agar en andere ingrediënten voor cosmetische, farmacologische, voedsel- en diervoedertoepassingen.

De groeiomstandigheden van G. gracilis werden geoptimaliseerd door vegetatieve vermeerdering en sporulatie, terwijl de fysisch-chemische omstandigheden werden gemanipuleerd om een grote biomassavoorraad te verkrijgen. Groene extractiemethoden met ethanol en water werden uitgevoerd over de zeewierbiomassa. Het bioactieve potentieel van extracten werd beoordeeld door middel van een reeks in vitro testen met betrekking tot hun cytotoxiciteit, antioxiderende en antimicrobiële eigenschappen. Bovendien werd gedroogde zeewierbiomassa verwerkt in pastaformuleringen om de voedingswaarde van voedsel te verhogen. Pigmenten geëxtraheerd uit G. gracilis zijn ook in yoghurt verwerkt als een natuurlijke kleurstof en hun stabiliteit werd geëvalueerd. Beide producten werden onderworpen aan de beoordeling van een semi-getraind sensorisch panel met als doel de beste uiteindelijke formulering te bereiken voordat ze op de markt komen.

De resultaten ondersteunen de veelzijdigheid van G. gracilis , of het nu wordt toegepast als een hele biomassa, extracten en/of pigmenten. Door verschillende geoptimaliseerde protocollen te implementeren, maakt dit werk de ontwikkeling mogelijk van producten met het potentieel om de voedsel-, cosmetica- en aquacultuurmarkten te laten profiteren, ecologische duurzaamheid en een blauwe circulaire economie te bevorderen.

Bovendien, en in overeenstemming met een bioraffinagebenadering, zal de resterende biomassa van zeewier worden gebruikt als biostimulant voor plantengroei of worden omgezet in koolstofmaterialen voor gebruik in waterzuivering van de interne aquacultuursystemen van MARE-Polytechnic van Leiria, Portugal.

Introduction

Zeewier kan worden beschouwd als een interessante natuurlijke grondstof die kan worden gebruikt door de farmaceutische, voedings-, diervoeder- en milieusector. Ze biosynthetiseren een arsenaal aan moleculen, waarvan er vele niet worden aangetroffen in terrestrische organismen, met relevante biologische eigenschappen ^1,2. Er moeten echter voor zeewier geoptimaliseerde teeltprotocollen worden geïmplementeerd om een grote biomassavoorraad te garanderen.

Bij de teeltmethoden moet altijd rekening worden gehouden met de aard van de zeewierthalli en de algehele morfologie. Gracilaria gracilis is een klonaal taxon, wat betekent dat het aanhechtingsorgaan meerdere vegetatieve assen produceert. Voortplanting door fragmentatie (vegetatieve voortplanting) wordt dus bereikt, aangezien elk van deze assen volledig in staat is om een onafhankelijk leven aan te nemen van het hoofdthallus³. Klonale taxa kunnen met succes worden geïntegreerd met eenvoudige en snelle kweekmethoden in één stap, aangezien grote hoeveelheden biomassa worden verkregen door het thallus te splitsen in kleine fragmenten die snel regenereren en uitgroeien tot nieuwe, genetisch identieke individuen. Zowel haplontische als diplontische thalli kunnen in dit proces worden gebruikt. Hoewel het geslacht een complexe haplo-diplontische isomorfe trifasische levenscyclus vertoont, is sporulatie zelden nodig, behalve wanneer genetische vernieuwing van de bestanden nodig is om verbeterde gewassen te verkrijgen. In dit geval geven zowel tetrasporen (haplontische sporen gevormd door meiose) als carpospores (diplontische sporen gevormd door mitose) aanleiding tot macroscopische thalli die vervolgens kunnen worden gekweekt en vermeerderd door vegetatieve voortplanting⁴. Groeicycli worden bepaald door omgevingsomstandigheden en de fysiologische toestand van de individuen, naast andere biologische factoren zoals het ontstaan van epifyten en de hechting van andere organismen. Daarom is het optimaliseren van de groeiomstandigheden cruciaal om een hoge productiviteit te garanderen en biomassa van goede kwaliteit te produceren⁵.

De extractie van bioactieve stoffen uit zeewier, waaronder G. gracilis, kan op verschillende manieren worden bereikt ^6,7. De keuze van de extractiemethode hangt af van de specifieke verbindingen die van belang zijn, de beoogde toepassing en de kenmerken van het zeewier. In deze studie hebben we ons gericht op oplosmiddelextractie, waarbij groene oplosmiddelen, zoals water of ethanol, worden gebruikt om bioactieve stoffen op te lossen en te extraheren uit de zeewierbiomassa. De extractie kan op een veelzijdige en effectieve manier worden uitgevoerd door middel van maceratie en kan worden gebruikt voor een breed scala aan verbindingen. Het is een eenvoudige en veelgebruikte methode waarbij biomassa gedurende een langere periode in een oplosmiddel wordt geweekt, meestal bij kamertemperatuur of licht verhoogde temperaturen. Het oplosmiddel wordt geroerd om het extractieproces te verbeteren. Na de gewenste extractietijd wordt het oplosmiddel door filtratie of centrifugatie gescheiden van het vaste materiaal.

Water is een veelgebruikt oplosmiddel in voedingstoepassingen vanwege de veiligheid, beschikbaarheid en compatibiliteit met een breed scala aan voedingsproducten. Waterextractie is geschikt voor polaire verbindingen zoals polysachariden, peptiden en bepaalde fenolen. Het is echter mogelijk dat het niet-polaire verbindingen niet effectief extraheert. Ethanol is ook een veelgebruikt oplosmiddel in voedingstoepassingen en kan effectief zijn voor het extraheren van een verscheidenheid aan bioactieve moleculen, waaronder fenolische verbindingen, flavonoïden en bepaalde pigmenten. Ethanol wordt algemeen erkend als veilig voor gebruik in voedsel en kan gemakkelijk worden verdampt, waarbij de geëxtraheerde verbindingen achterblijven. Het is vermeldenswaard dat bij de keuze van de winningsmethode rekening moet worden gehouden met factoren als efficiëntie, selectiviteit, kosteneffectiviteit en milieu-impact. De optimalisatie van extractieparameters, zoals oplosmiddelconcentratie, extractietijd, temperatuur en druk, is cruciaal voor het bereiken van optimale opbrengsten van bioactieve stoffen uit G. gracilis of andere zeewieren.

Zeewieren blijken antimicrobiële activiteit te vertonen tegen een breed scala aan micro-organismen, waaronder bacteriën, schimmels^{en virussen.} Deze activiteit wordt toegeschreven aan bioactieve componenten, waaronder fenolen, polysachariden, peptiden en vetzuren. Verschillende studies hebben hun werkzaamheid aangetoond tegen ziekteverwekkers zoals onder^andere Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. en Pseudomonas aeruginosa. De antimicrobiële activiteit van zeewier wordt toegeschreven aan de aanwezigheid van bioactieve stoffen die kunnen interfereren met microbiële celwanden, membranen, enzymen en signaalroutes¹⁰. Deze verbindingen kunnen de microbiële groei verstoren, de vorming van biofilms remmen en immuunresponsen moduleren.

Rode zeewieren, ook wel rhodofyten genoemd, zijn een groep algen die antimicrobiële activiteit kunnen vertonen tegen een verscheidenheid aan micro-organismen. Binnen deze groep bevat G. gracilis verschillende bioactieve stoffen die kunnen bijdragen aan de gerapporteerde antimicrobiële activiteit. Hoewel de specifieke moleculen kunnen variëren, zijn de gemeenschappelijke klassen die zijn gerapporteerd in G. gracilis en mogelijk antimicrobiële eigenschappen bezitten, polysachariden, fenolen, terpenoïden en pigmenten11. Het is echter belangrijk op te merken dat de aanwezigheid en hoeveelheden van deze componenten kunnen variëren, afhankelijk van factoren zoals de locatie van zeewierverzameling, seizoensgebondenheid, fysiologische toestand van de thalli en omgevingsomstandigheden. Daarom kunnen de specifieke klasse en concentratie van antimicrobiële verbindingen in G. gracilis dienovereenkomstig variëren.

G. gracilis blijkt ook antioxiderende eigenschappen te hebben, die verschillende fenolische verbindingen bevatten, waarvan is aangetoond dat ze vrije radicalen opruimen en oxidatieve stress verminderen¹².Antioxidanten helpen cellen te beschermen tegen schade veroorzaakt door reactieve zuurstofsoorten en hebben potentiële gezondheidsvoordelen. De antioxiderende capaciteit kan direct worden geëvalueerd door middel van verschillende methoden, waaronder de 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) vrije radicalenvanger en, indirect, door de kwantificering van het totale polyfenolgehalte (TPC)¹³.

Hoewel van een ingrediënt wordt gemeld dat het een prominente bioactiviteit heeft, is de cytotoxiciteitsbeoordeling ervan onmisbaar bij het beoordelen van natuurlijke en synthetische stoffen die in contact komen met levende cellen of weefsels. Er zijn verschillende methoden om cytotoxiciteit te meten, elk met voordelen en beperkingen. Over het algemeen bieden ze een scala aan opties om de schadelijke effecten van veel stoffen op cellen te evalueren en tegelijkertijd de mechanismen van celbeschadiging en -dood te onderzoeken¹⁴.

In dit werk gebruiken we de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT)-test, een colorimetrische methode geïntroduceerd door Mosmann (1983)¹⁵. Deze methode meet de reductie van tetrazoliumzouten tot een paars formazanproduct door metabolisch actieve cellen. Hoe hoger de hoeveelheid formazankristallen, hoe hoger het aantal levensvatbare cellen, waardoor een indirecte maat voor cytotoxiciteit wordt geboden¹⁴. Aangezien in dit werk G. gracilis water- en ethanolextracten bedoeld zijn om te worden opgenomen in dermocosmetische formuleringen, wordt de in vitro cytotoxiciteitsevaluatie uitgevoerd in een keratinocyt (HaCaT) cellijn.

Wat de voedseltoepassing betreft, bevatten zeewieren over het algemeen weinig calorieën en zijn ze qua voedingswaarde rijk aan voedingsvezels, essentiële elementen en aminozuren, polysachariden, meervoudig onverzadigde vetzuren, polyfenolen en vitamines ^2,16. G. gracilis is geen uitzondering, met een interessante voedingswaarde. Freitas et al. (2021)⁴ ontdekten dat gekweekte G. gracilis hogere niveaus van eiwitten en vitamine C had en het niveau van totale lipiden handhaafde in vergelijking met wild zeewier. Dit kan een economisch en ecologisch voordeel opleveren, aangezien de productie uit voedingsoogpunt de voorkeur verdient boven de exploitatie van wilde hulpbronnen. Bovendien maken consumenten zich steeds meer zorgen over het soort voedsel dat ze eten, dus het is belangrijk om nieuwe ingrediënten voor voedselverrijking te introduceren en nieuwe middelen te gebruiken om extracten te verkrijgen die waarde kunnen toevoegen aan een product en een "clean label" kunnen claimen. Bovendien is de huidige markt zeer concurrerend, waardoor de ontwikkeling van nieuwe producten en innovatieve strategieën nodig zijn om fabrikanten van hun concurrenten te onderscheiden¹⁷.

De verrijking van producten met een slechte voedingswaarde, zoals pasta, met mariene hulpbronnen, waaronder zeewier, is een strategie om deze hulpbron als een nieuw voedingsmiddel te introduceren en een strategie voor marktdifferentiatie door middel van een product met een duidelijke voedingswaarde. Aan de andere kant is G. gracilis een bron van natuurlijke rode pigmenten zoals phycobiliproteïnen¹⁸, met een groot potentieel voor toepassingen in de voedingsindustrie. Dit zeewier heeft op verschillende gebieden grote belangstelling getoond en kan worden toegepast met behulp van het hele zeewier, extracten en/of de resterende biomassa. In dit werk demonstreren we enkele voorbeelden van dergelijke toepassingen.

Protocol

1. Oogsten en voorbereiden van biomassa

1. Oogst de exemplaren van G. gracilis tijdens eb en vervoer ze snel naar het laboratorium in donkere, gekoelde dozen om uitdroging, licht en blootstelling aan de lucht te voorkomen.
2. Was in het laboratorium elk thallus met stromend zeewater en reinig grondig om puin, necrotische delen, epifyten en andere organismen van het oppervlak te verwijderen.
3. Bewaar de wilde biomassa in constant belucht zeewater (31-35 psu) in een klimaatruimte (20 ± 1 °C) met een lage instraling van daglicht, koelwitte en fluorescentielampen en een fotoperiode van 16:08 (licht: donker) gedurende 7 dagen. Geef gedurende deze periode geen voedingsmedia toe; Hierdoor kan het zeewier zich langzaam aanpassen aan de nieuwe omstandigheden binnenshuis.

2. Voorraadbeheer

1. Snijd na de acclimatisatieperiode gezonde uiteinden van zeewierthalli met een steriel mes. Volgens Redmond et al. (2014)¹⁹ en onder steriele omstandigheden, sleept u elke tip door een agargel die eerder is bereid in petrischalen (1,0% bacteriologische agar, in een verhouding van 1:1 gedestilleerd water/zeewater) om eventuele resterende verontreinigingen te verwijderen. Voer de agar-sleep drie keer uit voor elke tip en sleep de tip altijd door ongebruikte delen van de agar-gel.
2. Glaswerk met zuur wassen in een zoutzuuroplossing (HCl, 15%) en grondig afspoelen met gedestilleerd water. Steriliseer alle gereedschappen, glaswerk, agar, zeewater en gedestilleerd water dat bij het reinigingsproces wordt gebruikt met een autoclaaf (121 °C, 15 min).
   LET OP: Zie het veiligheidsinformatieblad van HCl dat door de leverancier is geleverd.
3. Tips groeien in gesteriliseerd zeewater bij 35 psu, aangevuld met Von Stosch Enriched solution (VSE) gemodificeerd voor rode zeewieren, volgens Redmond et al. (2014)¹⁹. Voeg germaniumdioxide (GeO₂) toe aan het medium (1 ml/l) om de groei van epifytische diatomeeën te voorkomen.
   LET OP: Zie het veiligheidsinformatieblad van GeO₂ dat door de leverancier is geleverd.
   OPMERKING: Tips die pigmentverlies vertonen, zoals waargenomen door gedeeltelijke of volledige verkleuring, staan onder stress of zijn al dood en moeten worden weggegooid.

3. Teelt en opschaling

1. Verdeel na de acclimatisatieperiode willekeurig ongeveer 8-10 gezonde tips in kolven met platte bodem van 250 ml in een klimaatkamer van 20 ± 1 °C met het witte koele licht van 20 ± 0,5 μmol fotonen ^{m-2 s-1} (1500 lux), een fotoperiode ingesteld op 16 uur: 8 uur (licht: donker) en steriel zeewater verrijkt met ^{VSE-kweekmedia} die elke week wordt vernieuwd.
2. Voer wekelijkse gewichtsmetingen uit en vermijd overmatige belasting van de thalli²⁰. Verwijder hiervoor voorzichtig de uiteinden van het kweekmedium, spoel voorzichtig af en weeg de milligrammen op een laboratoriumweegschaal.
   OPMERKING: Deze procedure kan worden uitgevoerd samen met de wekelijkse vernieuwing van de kweekmedia.
3. Thalli kan in deze kolven groeien tot een dichtheid van 2 g/l. Voer nu een opschaling van de ontvanger uit (250 ml, 1 L en 5 L). Breng de teelt over naar open witte buitenbakken van 50 L en groter wanneer het volume 5 L bereikt.
4. Bereken de relatieve groeisnelheid (RGR) volgens Patarra et al. (2017)²¹ :
   RGR (% fw/dag) = ([Ln (fw) - Ln (iw)]/t) x 100
   waarbij IW en FW respectievelijk het begin- en het uiteindelijke verse gewicht zijn, uitgedrukt in grammen, en t de tijd in dagen.
   OPMERKING: Bij deze laboratoriumopstelling bereikt RGR waarden tot 21% per dag. Het oogsten van biomassa kan op elk moment worden uitgevoerd. Biomassa moet snel worden verwerkt om afbraak te voorkomen door drogen in de oven, vriesdrogen of gewoon ingevroren (-20 °C), afhankelijk van het beoogde gebruik. De gedroogde biomassa kan ook bij kamertemperatuur (RT) worden bewaard of ingevroren worden opgeslagen.

4. Extractie procedure

OPMERKING: Om de in vitro cytotoxiciteit, antioxiderende en antimicrobiële eigenschappen van G. gracils-extracten te beoordelen, houdt de bereiding ervan rekening met twee verschillende parameters: de extractietemperatuur en het type oplosmiddel.

1. Om de extracties uit te voeren, droogt u de G. gracilis biomassa in de oven en maalt u de biomassa (bijv. in een huishoudelijke koffiemolen) totdat het poeder door een zeef van 200 μm gaat.
2. Weeg de gedroogde biomassa (10 g) af en los deze op in 100 ml oplosmiddel (absolute ethanol of steriel water).
3. Roer in een tegen licht beschermd vat gedurende 30 minuten.
4. Voer sequentiële ethanol > water en water> ethanolextracties uit bij RT, 40 °C en 70 °C.
5. Voer voor elke temperatuur de extracties met ethanol en water twee keer afzonderlijk uit.
6. Scheid de vloeibare extracten van de resterende biomassa door filtratie door filtreerpapier (Whatman No.1), gevolgd door centrifugeren bij 8000 x g gedurende 10 minuten bij RT.
7. Hergebruik de resterende algenbiomassa voor verdere extractie met het andere oplosmiddel. Als een monster eerst met ethanol is geëxtraheerd, extraheer het dan met water en vice versa.
8. Vriesdroog de waterige extracten en damp de ethanolextracten in een roterende verdamper bij 40 °C.
9. Bewaar de gedroogde extracten bij 4 °C.
10. Los de extracten op in een concentratie van 50 mg/ml (antimicrobiële testen) of 10 mg/ml (antioxidanttesten). Los de waterige extracten op in steriel water en de ethanolextracten in absolute ethanol.

5. Antimicrobiële activiteit

OPMERKING: De ethanolische en waterige extracten moeten afzonderlijk worden getest op Bacillus subtilis subsp . spizizenii (DSM 347), Escherichia coli (DSM 5922) en Listonella anguillarum (DSM 21597). Antimicrobiële tests moeten worden uitgevoerd volgens de aanbevelingen van het National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2012)²². Alle culturen zijn afkomstig uit de Duitse collectie van micro-organismen en celculturen (DSMZ). L. anguillarum werd gekweekt op tryptische sojabouillon (TSB) of tryptische soja-agar (TSA) aangevuld met 1% natriumchloride (NaCl). De overige twee stammen werden gekweekt op LB-medium (VWR Chemicals). De culturen Bacillus subtilis subsp . spizizenii (DSM 347) en Listonella anguillarum (DSM 21597) werden geïncubeerd bij 30 °C, terwijl Escherichia coli (DSM 5922) werd geïncubeerd bij 37 °C, volgens de instructies van de leverancier. De bouillon-microverdunningsmethode kan worden gebruikt voor de bepaling van antimicrobiële activiteit in vloeibare media, en dit moet op microschaal worden uitgevoerd, zodat het antimicrobiële potentieel snel en efficiënt kan worden bepaald. Deze goedkope methode maakt het mogelijk om in slechts 24 uur resultaten te verkrijgen, waardoor het geschikt is om in een vroeg stadium de beste extractieomstandigheden te bepalen die het mogelijk maken om voor een bepaalde microbiële stam resultaten te verkrijgen op het gebied van groeiremmende werking. De methodologie vereist echter het gebruik van steriele microtiterplaten met een deksel dat specifiek is voor microbiële groei, evenals de beschikbaarheid van een microplaatlezer voor de golflengte van 600 nm.

1. Voer de microverdunningstests van de bouillon uit met behulp van onbehandelde microtiterplaten met 96 putjes en een ronde bodem met 170 μl Muller-Hinton-bouillon (MHB), geïnoculeerd met 10 μl gestandaardiseerd inoculum (bij 0,5 McFarland-standaard) en 20 μl van elk extract (50 mg/ml).
2. Incubeer de platen gedurende 24 uur bij de optimale temperatuur voor elke stam.
3. Detecteer de antimicrobiële activiteit door de vermindering van de zichtbare troebelheid, gemeten door de optische dichtheid (OD ₆₀₀) te registreren in een microplaatspectrofotometer, na 0 uur en 24 uur.
4. Druk de resultaten uit als een percentage van remming:
   
   waarbij Abs. ext het verschil is in de gemeten extinctie, tussen 0 uur en 24 uur, in de putjes die een bacteriestam bevatten die groeit in aanwezigheid van het extract, en Abs verwijst naar dezelfde maat in putjes die de bacteriestam en het oplosmiddel bevatten.
5. Neem bij deze methode controlereacties op, met putjes die alleen kweekmedium bevatten dat de negatieve controle zal zijn, maar ook putjes met medium dat is geïnoculeerd met de standaardstam toegevoegd aan oplosmiddel (ethanol of water) en medium met de bacteriestam en het positieve controle-antibioticum (chlooramfenicol).

6. Antioxiderende werking en kwantificering van de totale hoeveelheid polyfenolen

1. Totaal polyfenolgehalte
   OPMERKING: Het totale polyfenolgehalte (TPC) wordt uitgevoerd volgens de Folin-Ciocalteu-methode²³ en aangepast aan microschaal.
   1. Voeg aan elk putje van een microtiterplaat met 96 putjes, beschermd tegen licht, 158 μL ultrapuur water, 2 μL van het monster en 10 μL Folin-Ciocalteu-reagens toe.
      LET OP: Zie het veiligheidsinformatieblad van het Folin-Ciocalteu-reagens dat door de leverancier is geleverd.
   2. Voeg na 2 minuten 30 μL Na₂CO₃ (20%) toe.
   3. Meet de monsters na incubatie in het donker bij RT gedurende 1 uur spectrofotometrisch bij 755 nm.
   4. Gebruik galluszuur (waarmee de kalibratiecurve kan worden uitgezet) of ultrapuur water (2 μL) als controles.
   5. Druk de resultaten uit als galluszuurequivalenten (mg GAE/g-extract).
2. 2,2 difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radicale wegvangende activiteit
   OPMERKING: De antioxiderende werking van de extracten wordt geëvalueerd zoals beschreven door Duan et al. (2006)²⁴, aangepast aan microschaal
   1. Plaats in een microtiterplaat met 96 putjes, beschermd tegen licht, 2 μl van elk monster (met een concentratie van 10 mg/ml) en 198 μl DPPH opgelost in absolute ethanol (0,1 mM).
      LET OP: Zie het veiligheidsinformatieblad van DPPH dat door de leverancier is geleverd.
   2. Voer de reactie 30 minuten uit op RT in het donker. Meet de extinctie bij 517 nm in een microplaatspectrofotometer.
   3. Voer een controlereactie uit met 2 μl absolute ethanol/gedestilleerd water en 198 μl DPPH-oplossing. Voer een blancometing uit met 2 μl extract en 198 μl absolute ethanol.
   4. Druk de resultaten uit als het percentage DPPH-remming met behulp van de volgende vergelijking:
      
      waarbij As de extinctie van het algenextract is, Ab de extinctie van de blanco monsters en Ac de extinctie van de controle.

7. Evaluatie van cytotoxiciteit in epidermale cellen

OPMERKING: Het in vitro cytotoxische effect van de waterige en ethanolextracten van G. gracilis wordt geëvalueerd in menselijke keratinocyten (HaCaT-cellen - 300493) door middel van de MTT-colorimetrische test zoals eerder beschreven²⁵. Cellen werden overgenomen van Cell Lines Services, Duitsland (CLS) en de methode werd uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en CLS-instructies.
LET OP: Zie het veiligheidsinformatieblad van MTT dat door de leverancier is geleverd)

1. Onderhoud van celkweek
   1. Kweek HaCaT-cellen in Dulbecco's Modified Eagle's high glucose medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% antibioticum/antimycotische oplossing (amfotericine B, 0,25 mM; penicilline, 60 mM; streptomycine, 100 mM).
   2. Gebruik trypsine-EDTA om de cellen te dissociëren.
      OPMERKING: De subcultuur van HaCaT-cellen wordt bereikt nadat de cellen totale samenvloeiing hebben bereikt.
   3. Kweek de cellen in een kamer bij 37 °C met 5% CO₂ en 95% luchtvochtigheid.
   4. Subcultuur van de cellen volgens de instructies van de biobank wanneer culturen 80%-85% samenvloeiing bereiken.
2. Evaluatie van cytotoxiciteit
   1. Na het zaaien van cellen in platen met 96 putjes en een nacht incubatie, behandelt u HaCaT-cellen (4 x 10⁴ cellen/putje) met de gedroogde extracten die eerder zijn opgelost in DMSO (100 mg/ml). Voeg vervolgens 2 μL van de extractoplossing toe aan 198 μL medium en incubeer de platen gedurende 24 uur.
   2. Verwijder het kweekmedium en voeg 100 μL MTT (0,5 mg/ml) toe aan de cellen. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten in het donker onder de hierboven genoemde normale kweekomstandigheden.
   3. Verwijder de MTT-oplossing en los de intracellulaire formazankristallen op met 100 μL DMSO.
   4. Meet de extinctie bij 570 nm met behulp van een microplaatlezer. Druk de resultaten uit als een percentage van de onbehandelde controlecellen.

8. Voedselinnovatie

1. Nieuw voedingsproduct: Pasta met zeewier
   1. Selectie van ingrediënten en pastaformulering
      LET OP: De selectie van de ingrediënten is gemaakt in samenwerking met een pastabedrijf. Bij de keuze van de belangrijkste ingrediënten (beschreven in punt 8.2) is rekening gehouden met hun gemakkelijke toegankelijkheid en compatibiliteit met de bestaande productielijnen, waarbij gebruik wordt gemaakt van mariene hulpbronnen om pasta met toegevoegde voedingswaarde te verkrijgen.
      1. Ontwerp na de keuze van de ingrediënten de formulering volgens de beoogde voedingswaarde (bron van vezels, vitamines en minerale elementen, laag verzadigd vet) door de theoretische chemische samenstelling van de formuleringen te analyseren met behulp van een spreadsheet.
      2. Wanneer aan de theoretische vereisten is voldaan, gaat u verder met de productie op laboratoriumschaal zoals beschreven in stap 8.1.2.
      3. Voer een sensorische test uit met een semi-getraind panel (>10 proevers) om de noodzaak van herformulering of de acceptatie van de formulering voor de volgende stappen te valideren.
         OPMERKING: Het panel was eerder getraind voor het proeven van pasta en evalueerde hedonisch de gepresenteerde formuleringen met betrekking tot kenmerken zoals smaak, smaak, geur, textuur en uiterlijk.
   2. Productie van pasta
      NOTITIE: Maak Chifferi-pastamonsters met behulp van een pasta-extruder.
      1. Meng in de apparatuur eerder gedefinieerde porties rijstmeel, G. gracilis en Chlorella vulgaris en voeg ongeveer 30% water toe aan het mengsel.
      2. Om droge pasta te verkrijgen, droogt u Chifferi bij 68 °C gedurende 42 minuten, gevolgd door 5 uur en 30 minuten bij 76 °C, waarbij een industrieel proces wordt gesimuleerd.
      3. Verpak en vacumeer ten slotte de monsters en bewaar ze op een donkere plaats bij RT tot verdere analyse.
   3. Nutritionele analyse
      OPMERKING: Gebruik voor de analyses van het voedingsprofiel gedroogde en gemacereerde monsters in drievoud.
      1. Ruw eiwitgehalte: Voer een totale eiwitbepaling uit volgens de Kjeldahl-methode , aangepast aan Duarte et al. (2022)²⁶, volgens de stappen 8.1.3.2-8.1.3.6.
      2. Weeg 1,0 g monster (of gedestilleerd water voor de blanco test) nauwkeurig af en meng met twee Kjeldahl-tabletten en 25 ml H₂SO₄ in de digestiebuisjes.
         LET OP: Zie het veiligheidsinformatieblad van H₂SO₄ dat door de leverancier is geleverd.
      3. Voer de vergisting van de monsters uit in een Kjeldahl-vergister bij 220 °C gedurende 30 min, gevolgd door 90 min bij 400 °C.
      4. Voeg na afkoeling tot RT 80 ml gedestilleerd water toe en destilleer de gevormde ammoniak tot 30 ml van een 4% H 3 BO_3-oplossingdie broomcresolgroen en methylrood bevat. Deze stap vindt plaats onder alkalische omstandigheden (destillatie met 40% NaOH met behulp van een Kjeldahl-distilleerder.
         LET OP: Zie het veiligheidsinformatieblad van de H 3 BO_3-oplossingmet broomcresolgroen, methylrood en 40% NaOH die door de leverancier wordt geleverd.
      5. Titreer de gedistilleerde monsters met HCl 0,1 M totdat een kleurverandering naar grijsroze wordt waargenomen.
      6. Bereken het gehalte aan ruw eiwit, weergegeven door het stikstofgehalte van het monster, en druk dit uit in g per 100 g met behulp van de volgende vergelijking:
         
         waarbij V_s overeenkomt met het HCl-volume (ml) dat wordt gebruikt bij de titratie van het monster; V_b komt overeen met het volume dat in de blanco wordt gebruikt; N komt overeen met HCl-normaliteit; w komt overeen met het gewicht van het monster (g).
      7. Totaal vetgehalte: Bepaal het totale vetgehalte met behulp van de Folch-methode, overgenomen van Folch et al. (1957)²⁷, volgens de stappen 8.1.3.8-8.1.3.14.
      8. Bereid het Folch-reagens voor door_{CHCl 3} en MeOH te mengen in een verhouding van 2:1 (v:v).
         LET OP: Zie het veiligheidsinformatieblad van het Folch-reagens dat door de leverancier is geleverd.
      9. Voeg aan reageerbuisjes met 1 g aliquots monsters 5 ml Folch-reagens en 0,8 ml gedestilleerd water toe. Meng in een draaikolk gedurende 1 min.
      10. Voeg vervolgens nog eens 5 ml Folch-reagens toe en homogeniseer gedurende 5 minuten. Voeg 1,2 ml 0,8% NaCl-oplossing toe en homogeniseer gedurende 2 minuten_.
      11. Centrifugeer de monsters op 7000 x g gedurende 10 minuten. Filtreer de organische fase (onderste fase) door hydrofiel katoen en watervrij natriumsulfaat in een glazen kolf met ronde bodem.
      12. Om monsterverlies te voorkomen, herhaalt u de stappen van toevoeging van 5 ml_{CHCl 3}, homogenisatie, centrifugatie en filtratie onder dezelfde omstandigheden.
      13. Verwijder het organische oplosmiddel uit de opgevangen organische fasen door middel van verdamping onder lage druk en laat het 4 uur in de oven op 105 °C staan. Koel de monsters af in een exsiccator
      14. Bereken het vetgehalte, uitgedrukt in g per 100 g, met behulp van de volgende vergelijking:
          
          waarbij W₁ het lege gewicht van de glazen kolf met ronde bodem is; W₂ is het aanvankelijke gewicht van het monster; W₃ is de glazen kolf met ronde bodem en het monstergewicht.
      15. Gehalte aan ruwe celstof: Bepaal het gehalte aan ruwe celstof met behulp van een methode die is aangepast aan ISO 6865 (2000)²⁸, volgens de stappen 8.1.3.16-8.1.3.22.
      16. Weeg 1 g van het monster (W0) af in een glazen kroes met filterbodem (referentie P2) en plaats het in de vezelanalysator.
      17. De eerste stap is zure hydrolyse: voeg 150 ml 1,25% H 2 SO₄, voorverwarmd, en₂ml antischuimmiddel (n-octanol) toe aan de kolom van elke kroes; Verwarm tot het kookt en bewaar 30 min.
      18. Na verwijdering van dit oplosmiddel, driemaal wassen met gedeïoniseerd water om door te gaan naar de basishydrolyse. Voeg 150 ml 1,25% NaOH, voorverwarmd, en 5 ml antischuimmiddel toe aan de vloeistofvrije kolom en voer dezelfde verhittingsprocedure uit als voor de zure hydrolyse.
      19. Maak tot slot een drievoudige wasbeurt met 150 ml aceton voor de koude extractie.
      20. Haal na dit proces de kroezen voorzichtig uit het systeem en plaats ze gedurende 1 uur in een oven op 150 °C. Noteer het eindgewicht (W1).
      21. Plaats de kroezen gedurende 3 uur in een moffeloven bij 500 °C en noteer vervolgens het eindgewicht (W2).
      22. Bereken het gehalte aan ruwe celstof en druk de resultaten uit in percentages met behulp van de volgende vergelijking:
          %Ruwe celstof = 100 x (W1-W2)/W0
      23. Vetzuurprofiel (FA): Bepaal het vetzuurprofiel volgens Fernández et al.(2015)29, volgens de stappen 8.1.3.24-8.1.3.29.
          OPMERKING: De methylesters van vetzuren (FAME's) worden verkregen door directe zuurgekatalyseerde transmethylering van de gemalen gevriesdroogde monsters. Alle analyses worden in drievoud uitgevoerd.
      24. Voeg 2 ml van een 2% (v/v) H 2 SO_4-oplossing in methanol toe aan een monster van 50 mg en giet het mengsel gedurende₂uur onder voortdurend roeren bij 80 °C.
          LET OP: Zie het veiligheidsinformatieblad van methanol dat door de leverancier wordt geleverd.
      25. Voeg na afkoeling tot RT 1 ml ultrapuur water en 2 ml n-heptaan toe aan elk monster, draai het mengsel gedurende 1 minuut en centrifugeer het gedurende 5 minuten.
          LET OP: Zie het veiligheidsinformatieblad van n-heptaan dat door de leverancier is geleverd.
      26. Herstel de bovenste n-heptaanfase (organisch) die de FAME's bevat en breng deze over naar gaschromatografie (GC)-flacons.
      27. Analyseer in een gaschromatograaf die is uitgerust met een TR-FAME capillaire kolom (60 m × 0,25 mm ID, 0,25 μm filmdikte), een autosampler en een vlamionisatiedetector (FID).
      28. Stel de injector (splitless-modus) in op 250 °C en de detector op 280 °C. Stel de begintemperatuur van de kolom in op 75 °C en houd deze 1 minuut vast. Verhoog vervolgens met 5 °C/min tot 170 °C en houd 10 minuten vast. Verhoog vervolgens met 5 °C/min tot 190 °C en houd nog eens 10 minuten aan. Verhoog ten slotte met 2 °C/min tot 240 °C en houd 10 minuten vast. Gebruik helium als draaggas met een debiet van 1,5 ml/min. Toevoer van lucht en waterstof met debieten van respectievelijk 350 en 35 ml/min.
      29. Bepaal het FA-profiel door de resulterende retentietijden te vergelijken met een standaard en de resultaten uit te drukken als een percentage van het totale vet.
      30. Profiel van minerale elementen: Bepaal de minerale elementen (Ca, P, Mg, Na, K, Fe, Cu, Mn, Zn) geanalyseerd door ICP-OES, volgens de methode aangepast van Pinto et al. (2022)³⁰, volgens de stappen 8.1.3.31-8.1.3.34.
      31. Weeg ongeveer 0,4 g van elk droog monster nauwkeurig af en voeg 7,5 ml HNO₃ en 2,5 ml HCl toe.
          LET OP: Zie het veiligheidsinformatieblad van HNO₃ en HCl dat door de leverancier is geleverd.
      32. De vergisting verloopt in twee fasen: Verhoog de temperatuur van RT tot 90 °C in 30 minuten (en houd nog eens 30 minuten aan bij deze temperatuur), gevolgd door 60 minuten bij 105 °C.
      33. Koel de monsteroplossingen, verdun ze tot 25 ml en filter ze en bewaar ze in geëtiketteerde buisjes. Voer bij elke vertering hetzelfde proces uit met een referentiemateriaal en een blanco. Verkrijg de concentratie van de verschillende elementen door ICP-OES.
      34. Druk de resultaten uit in mg per 100 g fw.
      35. Koolhydraatgehalte: Bereken het koolhydraatgehalte volgens de stappen 8.1.3.36-8.1.3.37.
      36. Bereken het beschikbare koolhydraatgehalte (exclusief vezels) door het verschil van de eerder bepaalde factoren per 100 g, met behulp van de volgende vergelijking, volgens de Voedsel- en Landbouworganisatie (FAO; 2003)³¹
          
      37. Druk de resultaten uit in g per 100 g.
      38. Vocht- en asgehalte: Maak een schatting van het vocht- en asgehalte volgens de stappen 8.1.3.39-8.1.3.45.
      39. Incubeer porseleinen kroezen gedurende 3 uur bij 105 °C, koel ze af in een exsiccator en weeg ze.
      40. Weeg 10 g van het monster af in de kroes en plaats het gedurende 3 uur in een droogoven bij 105 °C totdat de waarden van de opeenvolgende wegingen niet meer dan 10 mg verschillen.
      41. Bereken het vochtgehalte, uitgedrukt in g per 100 g fw, met behulp van de volgende vergelijking:
          
          waarbij W₁ het gewicht van de lege kroes is, W₂ het gewicht van de kroes met het verse monster en W₃ het gewicht van de kroes met het gedroogde monster.
      42. Plaats de kroezen met de gedroogde monsters na de bepaling van het vochtgehalte gedurende 4 uur in een verbrandingsoven bij 525 °C.
      43. Herhaal deze procedure totdat de opeenvolgende wegingen niet meer dan 1 mg verschillen.
      44. Koel de monsters af tot RT in een exsiccator en weeg ze vervolgens.
      45. Bereken het asgehalte, uitgedrukt in g per 100 g fw, met behulp van de volgende vergelijking:
          
          waarbij W₁ het gewicht van de lege kroes is, W₂ het gewicht van de kroes met vers monster, W₃ het gewicht van de kroes met gewicht.
      46. Energetische waarde: Bereken de energetische waarde volgens de stappen 8.1.3.47-8.1.3.48.
      47. Bereken de energetische waarde van de monsters volgens de EU-verordening:De verstrekking van voedselinformatie aan consumenten (Verordening (EU) nr. 1169/2011)³², met behulp van de vergelijkingen:
          Energie (kcal/ 100 g) = 4 x (g eiwitten) + 4 x (g koolhydraten) + 9 x (g vet) + 2 x (g vezels)
          Energie (kJ/ 100 g) = 17 x (g eiwitten) + 17 x (g koolhydraten) + 37 x (g vet) + 8 x (g vezels)
      48. Druk de resultaten uit in kilocalorieën per 100 g en kilojoule per 100 g.
   4. Acceptatie door de consument
      1. Evalueer de acceptatie door de consument met behulp van pastamonsters die gedurende 8 minuten in gedestilleerd water zijn gekookt.
      2. Voer een consumentenacceptatietest uit: Evalueer het uiterlijk, de kleur, de textuur, de geur, de zeesmaak, de algehele smaak, de algehele evaluatie en de aankoopintentie van de monsters.
         OPMERKING: De consumentenacceptatietest is gebaseerd op hedonische tests die het uiterlijk, de kleur, de textuur, de geur, de zeesmaak, de algehele smaak, de algehele evaluatie en de aankoopintentie evalueren op een schaal van 1-9, waarbij 1 een slechte evaluatie is en 9 een zeer goede evaluatie.
      3. Voer sensorische tests uit in individuele sensorcabines in een sensorisch analyselaboratorium (met temperatuur- en lichtregeling). Zorg voor bestek, servetten en glazen bekers met mineraalwater om het gehemelte tussen de monsters door schoon te maken.
         OPMERKING: Proevers zijn tussen de 16 en 64 jaar oud en hebben alle achtergronden (n > 80).
2. Yoghurt
   1. Pigment extractie
      OPMERKING: Voer de pigmentextractie uit volgens de methodologie beschreven in Pereira et al. (2020)¹⁸.
      1. Bereid het extractieoplosmiddel voor, natriumfosfaatbuffer op 0,1 M, met natriumfosfaat dibasisch (0,03 M) en natriumfosfaat monobasisch (0,07 M). Stel de pH in op pH 6,8 met behulp van NaOH of HCl.
      2. Weeg 1 g G. gracilis af en voeg 50 ml natriumfosfaatbuffer (pH 6,8) toe. Homogeniseer gedurende 10 minuten, gevolgd door 10 minuten maceratie met vijzel en stamper.
      3. Breng de oplossing over in een buis en centrifugeer gedurende 20 minuten bij 12,298 x g (4 °C).
      4. Pool het supernatans en voeg langzaam 65% ammoniumsulfaat toe. Wanneer al het ammoniumsulfaat is opgelost, bedek de oplossing met een aluminiumplaat en laat u deze een nacht neerslaan bij 4 °C.
         LET OP: Zie het door de leverancier geleverde veiligheidsinformatieblad van ammoniumsulfaat.
      5. Centrifugeer het neerslag gedurende 20 minuten bij 12,298 x g (4 °C). Win de pellet terug en los op in gedestilleerd water (ongeveer 5 ml).
      6. Dialyse van het extract met behulp van een slangmembraan (14 kDa) tegen water gedurende 24 uur, gevolgd door vriesdrogen. Bewaar het gevriesdroogde extract beschermd tegen licht bij 4 °C tot gebruik.
   2. Yoghurt bereiding
      1. Bereid natuurlijke yoghurt door 1 L gepasteuriseerde melk, 120 g natuurlijke yoghurt, 20 g suiker en 50 g melkpoeder in een thermomixer te mengen gedurende 5 min, 50 °C, snelheid 3.
      2. Plaats het mengsel gedurende 12 uur in de thermomixerpot in een incubator bij 37 °C.
      3. Voeg het extract toe door het in yoghurt te mengen in een concentratie van 0,21%. Bewaar de monsters tot de analyse in afzonderlijke glazen kolven bij 4 °C.
      4. Bewaar afzonderlijke porties yoghurt zonder pigment (controle) bij 4 °C tot analyse.
   3. Kleur stabiliteit
      OPMERKING: Evalueer de stabiliteit van het pigment in de yoghurt door middel van kleuranalyse gedurende 12 dagen. Voer een kleuranalyse uit met behulp van een reflectiecolorimeter, met behulp van een standaardwaarnemer van 2 graden en een D65-lichtbron. De resultaten worden gepresenteerd als CIELab-coördinaten met L (lichtheid, zwart - wit, 0 - 100), a* (groen - rood, -60 - 60) en b* (blauw - geel, -60 - 60) parameters. Parameter a* heeft positieve waarden voor roodachtige kleuren en negatieve waarden voor groenachtige kleuren. Parameter b* neemt positieve waarden voor gelige kleuren en negatieve waarden voor blauwachtige kleuren. L* is de parameter van helderheid, de eigenschap volgens welke elke kleur kan worden beschouwd als gelijkwaardig aan een lid van de grijstinten tussen zwart en wit³³.
      1. Kalibreer de colorimeter met behulp van een witte keramische plaat (L* 88.5, a* 0.32, b* 0.33) die door de fabrikant is geleverd.
      2. Vul een cel met ongeveer 28 g van het monster (of controlemiddel) en analyseer de kleur met behulp van software voor kleurgegevensanalyse.
         OPMERKING: De software die werd gebruikt voor de analyse van kleurgegevens was de SpectraMagic NX.
      3. Voer 5 keer metingen uit in monster-/controledrievouden.
   4. Sensorische analyse
      OPMERKING: Voer sensorische evaluatie uit van yoghurt met pigmentopname met behulp van een driehoekstest (ISO 4120, 2004)³⁴ en een hedonistische evaluatie van kleur, smaak en algehele waardering.
      1. Geef de panelleden voor de driehoekstest drie monsters (één monster yoghurt met pigment en twee controlemonsters, of twee monsters yoghurt met pigment en één controlegroep) en vraag hen om een ander monster te kiezen op basis van het aroma, de textuur en de smaak. Verstrek monsters in vergelijkbare volumes die zijn geïdentificeerd met willekeurige 3-cijferige codes.
      2. Voor de hedonische evaluatie van de yoghurt met pigment, geef je de panelleden een monster van yoghurt met pigment en vraag je hen om de kleur, smaak en algehele waardering te evalueren met behulp van een 9-punts hedonische schaal (van extreem afkeer tot extreem leuk).

Representative Results

Antimicrobiële activiteit

Bij de interpretatie van de verkregen resultaten moet er rekening mee worden gehouden dat hoe hoger het remmingspercentage, hoe groter de werkzaamheid van het extract bij het remmen van de groei van die specifieke stam en dus hoe interessanter het extract is als antimicrobieel middel. Door deze methodologie kunnen we snel identificeren welke extracten een grotere activiteit hebben op bepaalde bacteriestammen, en ook de meest interessante identificeren in termen van toekomstig gebruik. We kunnen dus een startpunt hebben voor verdere studies over datzelfde extract.

Figuur 1 toont de resultaten die zijn verkregen met waterige extracten, zowel in de eerste als in de tweede extractie, onmiddellijk na het drogen van de biomassa (figuur 1A) en in de derde en vierde extractie (figuur 1B), verkregen na de ethanolextracties, waarbij de biomassa integraal wordt gebruikt. We kunnen zien dat de meest interessante resultaten, die overeenkomen met de derde en vierde waterige extracties, hogere antimicrobiële activiteiten aan het licht brengen, met name in extracten verkregen bij 70 °C. De concentratie van het extract in de putjes is 5 mg/ml.

Figuur 1: Groeiremming van bacteriesoorten in aanwezigheid van waterige extracten van G. gracilis. Groeiremming van 3 bacteriesoorten (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Listonella anguillarum) na 24 uur groei in een vloeibaar medium, in aanwezigheid van waterige extracten (Aq) van G. gracilis verkregen bij verschillende temperaturen, kamertemperatuur (RT), 40 °C (40) en 70 °C (70). De positieve controle werd uitgevoerd met chlooramfenicol (CHL) en de resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde waarden (n = 8). De gegevens hebben betrekking op de 4 opeenvolgende extractiestappen (1^st, 2^nd, 3^rd, 4^th). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De ethanolextracten lijken bijzonder effectief te zijn in het remmen van de groei van L. anguillarum, zoals weergegeven in figuur 2. Hierin worden de resultaten weergegeven die zijn verkregen met de ethanolextracten, ook in de eerste en tweede extractie (figuur 2A) en de derde en vierde extractie (figuur 2B), verkregen na de eerste extractie in water.

Figuur 2: Groeiremming van bacteriesoorten in aanwezigheid van ethanolische extracten van G. gracilis. Groeiremming van 3 bacteriesoorten (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Listonella anguillarum) na 24 uur groei, in een vloeibaar medium, in aanwezigheid van ethanolextracten (Et) van G. gracilis, verkregen bij verschillende temperaturen, kamertemperatuur (RT), 40 °C (40) en 70 °C (70). Positieve controle werd uitgevoerd met chlooramfenicol (CHL) en de resultaten werden uitgedrukt als gemiddelde waarden (n = 8). De gegevens hebben betrekking op de 4 opeenvolgende extractiestappen (1^st, 2^nd, 3^rd, 4^th). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Antioxiderende werking

Wat betreft de resultaten die het antioxiderende potentieel van de verschillende extracten benadrukken, met name in de DPPH-test, geven de resultaten in figuur 3 aan dat de temperatuur van 40 °C het meest effectief was, wat resulteerde in hogere remmingswaarden van de oxidantactiviteit dan die welke werden waargenomen in extracten verkregen bij RT of 70 °C. Dit geldt voor de G. gracilis monsters, en er kunnen grote variaties zijn, afhankelijk van de gebruikte monsters en de algengroeiomstandigheden. Daarom wordt aanbevolen tests uit te voeren om de beste omstandigheden voor elk specifiek type monster aan te geven.

Figuur 3: Remming van het DPPH-radicaal (%) in aanwezigheid van extracten verkregen bij verschillende temperaturen. Extracten werden verkregen door ethanolische (Et) of waterige (Aq) extractie. De 1e^en 2e^extracties werden achtereenvolgens gemaakt van droge biomassa. De overige (3e^en 4e^{) werden} gemaakt met biomassa die eerder was geëxtraheerd met het alternatieve oplosmiddel. RT betekent kamertemperatuur; 40, extract verkregen bij 40 °C; en 70, extract verkregen bij 70 °C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Vergelijkbare resultaten werden verkregen wat betreft de kwantificering van de totale polyfenolen (figuur 4), waarbij de temperatuur van 40 °C als de beste werd beschouwd wat betreft de extractie van antioxidanten. Dit toont aan dat de antioxiderende werking gecorreleerd lijkt te zijn met de fenolische componenten die in de extracten aanwezig zijn.

Figuur 4: Kwantificering van het totale gehalte aan polyfenolen (TPC) in extracten verkregen bij verschillende temperaturen. De^{extracten werden} verkregen door ethanolische (Et) of waterige (Aq) extractie, waarbij 1e en 2e^extractie achtereenvolgens werden gemaakt uit droge algen en de resterende (3e^en 4e⁾ werden gemaakt met biomassa die eerder was geëxtraheerd met een ander oplosmiddel. RT betekent kamertemperatuur; 40, extract verkregen bij 40 °C; en 70, extract verkregen bij 70 °C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Cytotoxiciteit in HaCat-cellen

De eerste stap om de veiligheid van cosmetische ingrediënten te beoordelen, is de studie van hun in vitro cytotoxiciteit in epidermale en dermale cellijnen. Zoals te zien is in figuur 5, werden er geen cytotoxische effecten waargenomen op keratinocyten (HaCaT-cellen), wat suggereert dat bij de maximale geteste concentratie (1 mg/ml) zowel waterige als ethanolextracten veilig zijn voor gebruik op de huid.

Figuur 5: Cytotoxisch effect van Gracilaria gracilis extracten (1 mg/ml) op HaCaT-cellen na 24 uur behandeling. De waarden in elke kolom worden uitgedrukt als het gemiddelde ± de standaardfout van het gemiddelde (SEM) van drie onafhankelijke experimenten in drievoud. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Innovatie op het gebied van voeding

De uiteindelijke pastaformuleringen werden verkregen na talrijke proeven tussen theoretische formulering en sensorische tests door een semi-getraind panel. Na deze stap werd toegang verkregen tot de chemische karakterisering, inclusief voedingsevaluatie, vetzuren en profielen van minerale elementen. Het was mogelijk om een voedingskarakterisering op te stellen (tabel 1 en tabel 2) en om het bestaan van verwachte voedingsclaims te verifiëren op basis van de Europese wetgeving (REG (EU) nr. 1169/2011)³².

Voedingswaarde		met 100 g Pasta	% ADH
Energie		1478.90 kJ (348.74 kcal)	17
Lipiden		1.06 ± 0.10 g	2
Waarvan:
	Verzadigde vetzuren	0,38 ± 0,01 g	2
	Koolhydraten	72.59± 0.21 g	28
	Vezel	3.84 ± 0.20 g
	Eiwit	10.29 ± 0.20 g	21
	Zout	0,22 ± 0,02 g	9

Tabel 1: Voedingswaarde. Voedingsfeiten van ontwikkelde pasta op basis van chemische analyses (n=3) van energie en koolhydraten verkregen door berekening en het respectieve percentage van de aanbevolen dosisinname (n = 3).

Deze pastaformuleringen zijn ontworpen om een doelgroep aan te spreken die een gezonder dieet in gedachten heeft, dus de hoeveelheid vet per 100 g van een product moet zo klein mogelijk zijn. Gedetailleerde analyse van het vetzuurprofiel toont een waarde van 0,38 g verzadigde vetzuren/100 g, wat ruim onder de limiet ligt voor producten met een laag verzadigd vetgehalte, waarmee het oorspronkelijke doel bij de productie van deze pasta wordt bereikt. Wat het vezelgehalte betreft, was het ook mogelijk om, in overeenstemming met de Europese regelgeving, deze pastaformulering als bron van vezels te claimen.

In de karakterisering van minerale elementen, bepaald door ICP-OES en weergegeven in tabel 2, wordt de waarde van ongeveer 219 mg/100 g Na in 100 g van dit product vermeld, zodat niet kan worden geverifieerd dat het een product is met een laag natriumgehalte (<0,12 g/100 g). Vanwege het verhoogde natriumgehalte dat van nature in de ingrediënten aanwezig is, is het mogelijk dat dit product geen zout in de confectie hoeft te worden toegevoegd.

Tabel 2: Profiel van de minerale elementen van de pasta. Blauw - hoog gehalte aan element; Rood - bron van een bepaald element (n = 3). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Volgens de genoemde verordening van de Europese Unie en de ADH% voor elk element, is te zien dat dit product een hoog gehalte aan K, P, Fe heeft en ook een bron van Zn is. Het heeft Se, Mg en Ca in kleinere hoeveelheden.

Voor de pasta-acceptatietests werden 86 testers gebruikt, waarvan 63 vrouwen en 23 mannen, ouder dan 18 jaar. De acceptatietesten waren gebaseerd op hedonistische schalen van 9 punten, zoals vastgelegd in de normen. Het gezonde deeg scoorde 5 en 6 op een hedonistische schaal van 1 tot 9 voor respectievelijk de parameters "Zeesmaak" en "Visueel uiterlijk" (Figuur 6).

Figuur 6: Resultaten van sensorische consumentenacceptatietests . (A) De hedonistische keuze voor uiterlijk, kleur, textuur, geur, zeesmaak en algehele smaak. (B) De hedonistische keuze voor algehele waardering en aankoopintentie. Schaal 1-9, waarbij 1 een slechte evaluatie is en 9 een zeer goede evaluatie (n = 86). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De pasta scoorde 5 en 6 op een hedonistische schaal van 1 tot 9 voor respectievelijk de parameters "Zeesmaak" en "Visuele verschijning" (Figuur 6A). Deze pasta kreeg een lage waarde op deze schaal met betrekking tot de textuurparameter (rekening houdend met andere reeds bestudeerde formuleringen), waarschijnlijk omdat het basisingrediënt rijstmeel is; Desondanks behaalde het waarden op een schaal van 1 tot 9, variërend van 4 tot 7, wat een goede acceptatie door de gemiddelde consument weerspiegelt. Op een hedonistische schaal van 1 tot 9 had de pasta als meest voorkomende antwoorden de waarde van 5 voor aankoopintentie en de waarde van 6 voor algemene waardering, zoals weergegeven in figuur 6B. Het bleek dat ongeveer 65% van de proevers een antwoord koos dat gelijk was aan of hoger was dan de score van 6 voor de algehele beoordeling van deze pasta. De kleurstabiliteit van de yoghurts met pigment werd gedurende 12 dagen bij -4 °C geëvalueerd en de resultaten zijn weergegeven in figuur 7.

Figuur 7: Kleurstabiliteit van de yoghurt. (links) Controleer yoghurt en (rechts) yoghurt met Gracilaria gracilis pigment gedurende 12 dagen opslag. De parameters a*, b* en L* zijn dimensieloos. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De resultaten geven aan dat de a*- en b*-parameters in de loop van de tijd stabiel waren, terwijl de L*-waarden een hogere variantie vertoonden. De lichtheid vertoonde hogere waarden na 8 dagen opslag. Hoewel er enkele verschillen werden gevonden in de lichtheidsparameters, wat aangeeft dat de monsters in de loop van de tijd lichter waren, vertoonden de parameters roodheid (a*) en blauw (b*) een goede stabiliteit. De opname van de extracten in yoghurt vertoonde een goed kleurbehoud, met een ΔE van 7,01 ± 2,36 na 12 dagen opslag. Wat betreft de sensorische evaluatie van de yoghurt, identificeerden 9 op de 13 panelleden correct het juiste monster in de driehoekstest, wat suggereert dat er verschillen waren tussen de yoghurts die dit onderscheid mogelijk maakten. De hedonistische tests die bij het semi-getrainde panel werden uitgevoerd, toonden een goede acceptatie van het product, wat tot uiting kwam in scores boven de 7 (Figuur 8). De modus van de score voor elk van de drie geteste attributen was 9, wat leidde tot scoregemiddelden boven de 8. De beste beoordeling werd gemaakt op kleur, wat een uitstekende acceptatie door het panel weerspiegelt, een onthullend resultaat.

Figuur 8: Resultaten van de hedonistische sensorische evaluatie van de yoghurt met Gracilaria gracilis pigment. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De antimicrobiële activiteitstests in een vloeibaar medium worden gebruikt om de effectiviteit van antimicrobiële stoffen tegen micro-organismen gesuspendeerd in een vloeibaar medium te evalueren en worden meestal uitgevoerd om het vermogen van een stof te bepalen om de groei te remmen of micro-organismen te doden^35,36,37,38. Ze worden gebruikt om de gevoeligheid van micro-organismen voor antimicrobiële middelen te evalueren en worden uitgevoerd in reageerbuizen of microtitratieplaten, waar verschillende concentraties van de antimicrobiële stof worden getest tegen een gestandaardiseerde suspensie van het doelmicro-organisme²². Antimicrobiële activiteit wordt beoordeeld door microbiële groei of de aan- of afwezigheid van troebelheid in het kweekmedium te meten na een goede incubatietijd.

Er zijn verschillende technieken en methoden om deze tests uit te voeren, zoals de bouillonverdunningsmethode, de agardiffusiemethode (zoals de schijfdiffusietest) en de bouillonmicroverdunningsmethode, een van de meest gebruikte³⁸. Enkele van de meest kritische punten bij deze methoden zijn de juiste bereiding van het inoculum, de keuze van het kweekmedium, de kwaliteit van de gebruikte antimicrobiële stoffen, de standaardisatie van de techniek en effectieve contaminatiecontrole. Het inoculum, een gestandaardiseerde suspensie van micro-organismen, moet correct worden bereid om de nauwkeurigheid van de resultaten te garanderen. Dit omvat een geschikte selectie van microbiële cultuur, een juiste kweek van zuivere stammen, aanpassing van de celconcentratie en standaardisatie van de suspensie om een geschikte optische dichtheid of celconcentratie te verkrijgen.

Het gebruikte kweekmedium moet zorgvuldig worden gekozen om ervoor te zorgen dat het de ideale groeiomstandigheden biedt voor het te testen micro-organisme. Chemische samenstelling, pH en andere factoren kunnen de testresultaten beïnvloeden. Het is belangrijk om de aanbevelingen van de fabrikant voor de bereiding van het kweekmedium op te volgen. De kwaliteit van de antimicrobiële middelen die als controle worden gebruikt, is van fundamenteel belang en het is belangrijk ervoor te zorgen dat deze zuiver zijn, binnen de houdbaarheidstermijn vallen en op de juiste manier worden bewaard. Etikettering en houdbaarheidsdata moeten altijd worden geraadpleegd, volgens de instructies van de fabrikant. De standaardisatie van de techniek is ook cruciaal om de nauwkeurigheid van de resultaten te garanderen. Dit omvat de toevoeging van de geteste concentraties aan het kweekmedium, evenals het handhaven van aseptische omstandigheden gedurende de hele procedure. Bovendien kan kruisbesmetting van micro-organismen tijdens het testen leiden tot valse of onbetrouwbare resultaten. Het is essentieel om gedurende de hele procedure strikte aseptische praktijken te volgen, van de manipulatie van het inoculum tot de incubatie van de buizen of platen. Het gebruik van schone werkbladen, de juiste pipetteertechnieken en de juiste verwijdering van materialen zijn belangrijke maatregelen om besmetting te voorkomen.

Aandacht voor detail en strikte naleving van vastgestelde protocollen en richtlijnen zijn cruciaal om fouten tot een minimum te beperken en de betrouwbaarheid van de resultaten van antimicrobiële activiteitstests in een vloeibaar medium te garanderen. Ook hebben de antimicrobiële activiteitstests enkele beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden³⁷.

Factoren zoals pH, temperatuur, aanwezigheid van bloedbestanddelen en interacties met het immuunsysteem worden niet in aanmerking genomen in deze tests, wat het vermogen om de effectiviteit van een antimicrobieel middel in een levend organisme te voorspellen kan beperken. Tests meten ook het vermogen van een antimicrobiële stof om microbiële groei te remmen of micro-organismen te doden en geven geen gedetailleerde informatie over het werkingsmechanisme van het antimicrobiële middel of de selectiviteit ervan tegen specifieke micro-organismen. Er zijn beperkingen bij het detecteren van resistentie, aangezien de gebruikte methoden het mogelijk maken om de ontwikkeling van resistentie in de loop van de tijd te detecteren of te voorspellen. Sommige micro-organismen kunnen resistentiemechanismen ontwikkelen als reactie op langdurige blootstelling aan een antimicrobieel middel, en deze veranderingen kunnen mogelijk niet gemakkelijk worden gedetecteerd door middel van deze tests. Tests van antimicrobiële activiteit in een vloeibaar medium houden over het algemeen geen rekening met andere gastheerfactoren die de effectiviteit van een antimicrobieel middel kunnen beïnvloeden, zoals de aanwezigheid van biofilms of de immuunrespons van de gastheer.

Het is belangrijk om rekening te houden met deze beperkingen en om het testen op antimicrobiële activiteit in vloeibare media aan te vullen met andere methoden en benaderingen, zoals in vivo studies, biofilmmodellen en andere³⁹. Op het gebied van bioprospectie voor bioactieve macroalgenverbindingen kunnen antimicrobiële activiteitstests worden gebruikt om het antimicrobiële potentieel van algenextracten of geïsoleerde verbindingen te evalueren, waarbij stoffen met antimicrobiële activiteit worden geïdentificeerd tegen specifieke microbiële pathogenen, die toepassingen kunnen hebben op gebieden zoals de productie van geneesmiddelen, cosmetica, levensmiddelen of landbouwproducten⁴⁰.

Antioxiderende activiteitstests zijn methoden die worden gebruikt om het vermogen van een verbinding of extract om vrije radicalen te neutraliseren of oxidatieve stress te verminderen, te evalueren. Deze testen worden veel gebruikt in antioxidantenonderzoek, zowel in voedingsmiddelen als in natuurlijke producten zoals bijvoorbeeld algen. Er zijn verschillende methoden om de antioxiderende werking te evalueren, en een van de meest gebruikte is het absorptievermogen van vrije radicalen. In deze test wordt een stabiele vrije radicaal, de 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), gebruikt om het vermogen van een verbinding om een elektron te doneren en de vrije radicaal te neutraliseren te evalueren. De antioxiderende activiteit wordt gemeten door de paarse kleur van DPPH te verminderen, die optreedt wanneer de antioxidantverbinding een elektron aan de vrije radicaal doneert. Andere methoden zijn de absorptiecapaciteit voor zuurstofradicalen (ORAC), de ijzerreductiecapaciteit (FRAP) of de vrije radicalenreductiecapaciteit (ABTS)⁴¹.

Kwantificering van totale polyfenolen (QTP) daarentegen is geen directe methode om de antioxiderende werking te bepalen, maar geeft een maat voor de totale concentratie polyfenolen in een monster, hoewel verschillende storende stoffen de resultaten kunnen beïnvloeden. Hoewel van veel polyfenolen bekend is dat ze antioxiderende eigenschappen hebben, is de antioxiderende activiteit van een verbinding gerelateerd aan verschillende factoren, zoals de chemische structuur, concentratie, het vermogen om vrije radicalen te doneren of op te vangen, en interacties met andere cellulaire componenten^. De eenvoudige kwantificering van het totale aantal polyfenolen kan geen evaluatie opleveren van de antioxiderende werking van het monster. Het is echter belangrijk op te merken dat de aanwezigheid van polyfenolen in een monster in verband kan worden gebracht met een grotere kans op antioxiderende activiteit, aangezien veel polyfenolen antioxiderende eigenschappen bezitten. QTP kan dus dienen als een voorlopige indicator van de aanwezigheid van polyfenolen in het monster, maar bevestiging van de antioxiderende activiteit vereist antioxiderende activiteitstests. Polyfenolen zijn een klasse van chemische verbindingen die wijd verspreid zijn in de natuur en worden aangetroffen in voedsel, planten, fruit, groenten en algen. Er zijn verschillende methoden voor de kwantificering van totale polyfenolen, en de Folin-Ciocalteu-methode is een van de meest gebruikte. QTP geeft een algemene maat voor de concentratie van polyfenolen, maar specificeert niet de afzonderlijke polyfenolische verbindingen die in het monster aanwezig zijn. Daarom is het een kwantitatieve maar geen kwalitatieve methode. Bovendien is het belangrijk om te bedenken dat verschillende polyfenolen verschillende antioxiderende capaciteiten en biologische activiteiten hebben, dus QTP geeft geen gedetailleerde informatie over de specifieke functionele eigenschappen van de aanwezige polyfenolen.

Elke methode heeft zijn voordelen en beperkingen, en de keuze voor een bepaalde test hangt af van de kenmerken van de te bestuderen verbinding en het doel van de analyse. Het is belangrijk om de specifieke instructies van elke methode te volgen om betrouwbare en vergelijkbare resultaten te garanderen. Bij het bepalen van de antioxidantcapaciteit zijn enkele van de meest voorkomende kritische stappen in de eerste plaats de monstervoorbereiding. Het is belangrijk om de monsters correct voor te bereiden, ervoor te zorgen dat voldoende concentraties worden verkregen en besmetting te voorkomen. Dit omvat het nauwkeurig wegen van de verbindingen of extracten en het oplossen ervan in geschikte oplosmiddelen. Het is ook belangrijk om rekening te houden met de stabiliteit van de verbindingen en extracten tijdens het proces van voorbereiding, opslag en hantering. Alle reagentia die bij de antioxiderende activiteitstests worden gebruikt, moeten goed worden voorbereid en gestandaardiseerd om de reproduceerbaarheid van de resultaten te garanderen. Dit omvat de juiste voorbereiding van de galluszuurstandaard en de nauwkeurigheid van de volumes. Reactietijd is een cruciaal aspect van het verkrijgen van nauwkeurige resultaten in antioxidanttests. Het is noodzakelijk om de incubatietijd te optimaliseren om een volledige reactie tussen de antioxidant en de vrije radicalen te garanderen. Onvoldoende tijd kan leiden tot onderschatting van de antioxiderende activiteit, terwijl overmatige tijd kan leiden tot afbraak van de verbindingen of interferentie door secundaire reacties. Ook moet de temperatuur tijdens tests nauwkeurig en consistent worden gecontroleerd. Temperatuur beïnvloedt de snelheid van chemische reacties en kan de resultaten beïnvloeden. Het is belangrijk om de temperatuuromstandigheden te volgen die worden aanbevolen door de specifieke methoden en om gedurende de hele procedure temperatuurstabiliteit te garanderen. Het opnemen van passende controles is essentieel om de resultaten van antioxidanttests te valideren. Dit kunnen positieve controles zijn (verbindingen waarvan bekend is dat ze antioxiderende werking hebben) en negatieve controles (monsters zonder antioxiderende activiteit). Controles bieden een vergelijkingsbasis voor de interpretatie van de resultaten en helpen de nauwkeurigheid van de verkregen gegevens te waarborgen. Om betrouwbare resultaten te verkrijgen, wordt aanbevolen om tests van antioxiderende activiteit op replicaten uit te voeren en het experiment meerdere keren te herhalen om de significantie van de gegevens te vergroten en om betrouwbaardere en robuustere resultaten te verkrijgen.

Testmethoden voor antioxiderende activiteit hebben enkele beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden bij het interpreteren van de resultaten, namelijk het feit dat ze in vloeibare media mogelijk niet volledig de complexiteit van biologische systemen en interacties tussen verschillende verbindingen weergeven, het brede scala aan antioxidantreacties die kunnen optreden, cellulair metabolisme en omgevingsfactoren die de antioxiderende activiteit kunnen beïnvloeden. Er moeten dus verschillende tests worden gebruikt. Men moet zich ook bewust zijn van het gebrek aan directe correlatie met gezondheidsvoordelen; Hoewel antioxiderende werking vaak wordt geassocieerd met gezondheidsvoordelen, vertaalt dit zich niet altijd direct in gezondheidsvoordelen in levende organismen vanwege vele andere factoren, zoals biologische beschikbaarheid, metabolisme en interacties met andere biologische systemen.

Het is belangrijk om in gedachten te houden dat antioxiderende activiteitstests nuttige hulpmiddelen zijn voor de eerste evaluatie van het antioxidantpotentieel van verbindingen en extracten, maar niet mogen worden beschouwd als een definitieve indicator van biologische effecten of gezondheidsvoordelen. Aanvullende studies zijn nodig om de impact van antioxidanten op het lichaam volledig te begrijpen.

Hoewel de methoden voor het testen van de antioxiderende activiteit in vloeibaar medium veel worden gebruikt in onderzoek en hun voordelen en beperkingen hebben, kunnen deze methoden in vergelijking met de alternatieven als goed worden beschouwd in termen van bruikbaarheid, snelheid, kosten en implementatiegemak. Een van de belangrijkste voordelen is de eenvoud en snelheid van de procedures en hun geschiktheid voor initieel onderzoek, screening van verbindingen en grootschalige studies. Deze methoden zijn relatief snel uit te voeren en kunnen in korte tijd resultaten opleveren, op een meer betaalbare manier, en vereisen minder gespecialiseerde apparatuur in vergelijking met andere methoden.

Algen staan bekend om hun vermogen om bioactieve stoffen te produceren, waaronder antioxidanten, die gunstige gezondheidseigenschappen kunnen hebben⁴³. Algenextracten kunnen worden bereid uit verschillende delen van de algen en kunnen worden verkregen met behulp van verschillende oplosmiddelen, zoals onder andere water, ethanol, methanol of aceton. Het is belangrijk om te onthouden dat de antioxiderende werking van algenextracten kan variëren afhankelijk van verschillende factoren, zoals de algensoort, de extractiemethode en de concentratie van de aanwezige bioactieve stoffen. Daarom wordt aanbevolen om antioxiderende activiteitstests uit te voeren op replicaten en vergelijkingen uit te voeren met geschikte controles om betrouwbaardere resultaten te verkrijgen. Deze methoden kunnen worden gebruikt als een eerste hulpmiddel bij het screenen en selecteren van algenextracten met antioxiderende potentie voor verder onderzoek.

De MTT-test is een veelgebruikte techniek voor een voorlopige evaluatie van in vitro cytotoxische effecten van stoffen voor menselijk en dierlijk gebruik. Ondanks dat het de meest gebruikte methode is om cytotoxiciteit te testen, wordt de omzetting van MTT in formazankristallen beïnvloed door tal van factoren, zoals de stofwisseling en het aantal mitochondriën, en is het alleen van toepassing op aanhangende celdoelen¹⁴. De belangrijkste kritieke stappen van het hier beschreven protocol hebben betrekking op het uiteindelijke optreden van celkweekcontaminaties, ongewenste groei van HaCaT-cellen en een laag percentage celconfluentie. Er zijn andere methoden, zoals lactaatdehydrogenase (LDH), adenosinetrifosfaat (ATP) en kolonievormingstests voor het meten van cytotoxiciteit. Ze hebben echter allemaal voordelen en beperkingen. Ghasemi et al. (2021)⁴⁴ evalueerden het effect van verschillende variabelen op de MTT-assaymetingen op een prostaatkankercellijn (PC-3). Factoren zoals de dichtheid van het zaaien van cellen, de concentratie van MTT, de incubatietijd na toevoeging van MTT, serumuithongering, de samenstelling van celkweekmedia, vrijgekomen intracellulaire inhoud en extrusie van formazan naar de extracellulaire ruimte werden geanalyseerd. Uit deze studie werden door deze auteurs nuttige aanbevelingen gedaan over hoe de test moet worden toegepast en een perspectief op waar het nut van de test een krachtig hulpmiddel is, maar ook waar het beperkingen heeft. Desalniettemin is de MTT-test een snelle, zeer gevoelige en eenvoudige methodologie die kan worden toegepast als een voorlopige cytotoxiciteitsbeoordeling van veel stoffen met mogelijke toepassing op therapeutisch, voedsel-, diervoeder-, landbouw- en milieugebied. In het bijzonder bleek uit de hier uitgevoerde MTT-test dat de ethanol en waterige extracten van G. gracilis , in de geteste concentraties, geen invloed hadden op de levensvatbaarheid van keratinocyten en kunnen worden gebruikt voor in-vivotests om ervoor te zorgen dat ze volledig veilig zijn voor gebruik via de huid bij de mens.

Het gebruik van mariene hulpbronnen in voedingsmiddelen heeft eens te meer aangetoond dat het niet alleen potentieel heeft om producten met toegevoegde voedingswaarde te verkrijgen, maar ook om producten met een schoner label te vinden. De toevoeging van hele G. gracilis (pasta) of extract (als kleurstof voor levensmiddelen) toont marktpotentieel, en de toepassing ervan zou een van de strategieën kunnen zijn voor bedrijven om zich op te vallen in de markt, te voldoen aan de voedingsbehoeften van de consument en hun markttrends te volgen.

Toen zeewier aan de pastaformuleringen werd toegevoegd, bleek aanvankelijk dat de structuur was veranderd en dat het niet mogelijk was om de gewenste deegvormen te verkrijgen. We stonden voor de uitdaging om de hoeveelheden aan te passen en andere ingrediënten toe te voegen die niet eerder waren voorzien, met als doel de textuur van de pasta te behouden. Naast de juiste hoeveelheid van elk ingrediënt, werd de extrusiemethode aangepast tijdens de ontwikkeling van de pasta. Afgezien van deze moeilijkheid is de ontwikkeling van nieuwe producten gebaseerd op drie fundamentele principes: het product moet zintuiglijk aantrekkelijk zijn (textuur, smaak, geur); het product moet een toegevoegde voedingswaarde hebben; En het moet maximaal gebruik maken van duurzame ingrediënten en methodologieën. In die zin is een andere grote uitdaging het gebruik van het sensorische paneel om de meest aantrekkelijke formulering te bereiken. De meeste fysisch-chemische analyses die op pasta werden uitgevoerd, waren al geoptimaliseerd voor voedselmatrices; Bij dit werk werd de monstervoorbereiding echter geoptimaliseerd, zodat deze efficiënt kon worden toegepast op alle analysemethoden.

Wat het gebruik van G. gracilis pigment als kleurstof betreft, werd gekozen voor een gekoeld product vanwege de thermische gevoeligheid van dit type molecuul⁴⁵. Omdat yoghurtbereiding thermische verwerking omvat, werd het pigment aan het eindproduct toegevoegd. Het mengen van het pigment in de yoghurt resulteerde in een product dat iets vloeibaarder was dan de controle zonder pigment. Aan het einde van de driehoekstest merkten sommige panelleden zelfs op dat het enige verschil tussen de monsters de textuur was. Dit is een goed resultaat, aangezien het belangrijkste doel van de driehoekstest was om na te gaan of er merkbare verschillen waren tussen yoghurt met en zonder pigment, met name verschillen in smaak en geur, aangezien zeewierextracten een onaangename smaak/geur kunnen geven aan voedingsproducten. Dit was een voorstudie met een klein semi-getraind panel. In verdere studies moet een groter aantal proevers in aanmerking worden genomen om betrouwbaardere marktresultaten te bereiken. Wat betreft de evaluatie van de pigmentstabiliteit in yoghurt, zouden verdere studies de evaluatie van andere fysisch-chemische eigenschappen van de yoghurt met pigment in de loop van de tijd kunnen omvatten, zoals pH, wateractiviteit (aw) en textuur. Sensorische evaluatie in de loop van de tijd zou ook wenselijk zijn.

Concluderend benadrukken de hier beschreven protocollen het potentieel van het rode zeewier G. gracilis als bron van ingrediënten om nieuwe producten te ontwikkelen met potentiële toepassingen in de farmaceutische, dermocosmetische en voedingsindustrie. Bovendien blijft de nageëxtraheerde restbiomassa een waardevol materiaal dat kan worden toegepast als biostimulant voor plantengroei, bodemverrijking, visvoer of grondstof om biochar en/of gefunctionaliseerde koolwaterstoffen voor waterzuiveringsdoeleinden te verkrijgen. De hier beschreven bioraffinagebenadering kan worden toegepast op andere zeewiersoorten, waardoor een blauwe circulaire economie en ecologische duurzaamheid worden bevorderd.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute Ethanol	Aga, Portugal	64-17-5
Ammonium Chloride	PanReac	12125-02-9
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	1397-89-3
Analytical scale balance	Sartorius, TE124S	22105307
Bacillus subtilis subsp. spizizenii	German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)	DSM 347
Biotin	Panreac AppliChem	58-85-5
Centrifuge	Eppendorf, 5810R	5811JH490481
Chloramphenicol	PanReac	56-75-7
CO2 Chamber	Memmert	N/A
Cool White Fluorescent Lamps	OSRAM Lumilux Skywhite	N/A
Densitometer McFarland	Grant Instruments	N/A
DMEM medium	Sigma-Aldrich	D5796
DMSO	Sigma-Aldrich	67-68-5
DPPH	Sigma, Steinheim, Germany	1898-66-4
Escherichia coli (DSM 5922)	German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)	DSM5922
Ethanol 96%	AGA-Portugal	64-17-5
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA)	J.T.Baker	6381-92-6
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524
Filter Paper (Whatman No.1)	Whatman	WHA1001320
Flasks	VWR International, Alcabideche, Portugal	N/A
Folin-Ciocalteu	VWR Chemicals	31360.264
Gallic Acid	Merck	149-91-7
Germanium (IV) Oxide, 99.999%	AlfaAesar	1310-53-8
HaCaT cells – 300493	CLS-Cell Lines Services, Germany	300493
Hot Plate Magnetic Stirrer	IKA, C-MAG HS7	06.090564
Iron Sulfate	VWR Chemicals	10124-49-9
Laminar flow hood	TelStar, Portugal	526013
LB Medium	VWR Chemicals	J106
Listonella anguillarum	German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)	DSM 21597
Manganese Chloride	VWR Chemicals	7773.01.5
Micropipettes	Eppendorf, Portugal	N/A
Microplates	VWR International, Alcabideche, Portugal	10861-666
Microplates	Greiner	738-0168
Microplates (sterile)	Fisher Scientific	10022403
Microplate reader	Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA	1611151E
MTT	Sigma-Aldrich	289-93-1
Muller-Hinton Broth (MHB)	VWR Chemicals	90004-658
Oven	Binder, FD115	12-04490
Oven	Binder, BD115	04-62615
Penicillin	Sigma-Aldrich	1406-05-9
pH meter Inolab	VWR International, Alcabideche, Portugal	15212099
Pippete tips	Eppendorf, Portugal	5412307
Pyrex Bottles Media Storage	VWR International, Alcabideche, Portugal	16157-169
Rotary Evaporator	Heidolph, Laborota 4000	80409287
Rotavapor	IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal	07.524254
Sodium Carbonate (Na2CO3)	Chem-Lab	497-19-8
Sodium Chloride (NaCl)	Normax Chem	7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic	Riedel-de Haën	7558-79-4
SpectraMagic NX	Konica Minolta, Japan		color data analysis software
Spectrophotometer	Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA	5A4T092004
Streptomycin	Sigma-Aldrich	57-92-1
Thiamine	Panreac AppliChem	59-43-8
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049
Tryptic Soy Agar (TSA)	VWR Chemicals	ICNA091010617
Tryptic Soy Broth (TSB)	VWR Chemicals	22091
Ultrapure water	Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany	F5HA17360B
Vacuum pump	Buchi, Switzerland	FIS05-402-103
Vitamin B12	Merck	68-19-9