Summary
여기에서는 Gracilaria gracilis의 통합 가치 평가를 목표로 하는 몇 가지 프로토콜에 대해 설명합니다: 야생 종 수확, 자체 성장 및 생체 활성 성분 추출. 추출물의 항산화, 항균 및 세포 독성 효과와 함께 전체 해조류 바이오매스 및 색소가 풍부한 식품의 영양 및 안정성 평가가 평가됩니다.
Abstract
가치 있는 다중 표적 생리활성 성분을 얻기 위한 풍부한 공급 원료로서의 해조류에 대한 관심은 지속적으로 증가하고 있습니다. 이 연구에서 우리는 화장품, 약리학, 식품 및 사료 응용 분야를 위한 한천 및 기타 성분의 공급원으로서 상업적 이익을 위해 전 세계적으로 재배되는 식용 붉은 해초인 Gracilaria gracilis의 잠재력을 탐구합니다.
G. gracilis 성장 조건은 식물 번식 및 포자 형성을 통해 최적화되었으며 물리 화학적 조건을 조작하여 대규모 바이오 매스 스톡을 달성했습니다. 에탄올과 물을 사용한 녹색 추출 방법은 해조류 바이오매스에서 수행되었습니다. 추출물의 생체 활성 잠재력은 세포 독성, 항산화 및 항균 특성에 관한 일련의 시험관 내 분석을 통해 평가되었습니다. 또한 말린 해조류 바이오매스를 파스타 제형에 통합하여 식품의 영양가를 높였습니다. G. gracilis 에서 추출한 색소도 천연 착색제로 요구르트에 배합되어 안정성을 평가했습니다. 두 제품 모두 시장에 출시되기 전에 최상의 최종 제형을 달성하는 것을 목표로 하는 반 훈련된 감각 패널의 평가를 받았습니다.
결과는 G. gracilis가 전체 바이오매스, 추출물 및/또는 안료로 적용되는지 여부에 관계없이 G. gracilis 의 다양성을 뒷받침합니다. 몇 가지 최적화된 프로토콜을 구현함으로써 이 작업을 통해 식품, 화장품 및 양식 시장에 수익을 창출할 수 있는 잠재력을 가진 제품을 개발하고 환경 지속 가능성과 청색 순환 경제를 촉진할 수 있습니다.
또한, 바이오리파이너리 접근법에 따라 잔류 해조류 바이오매스는 식물 성장을 위한 생물 자극제로 사용되거나 포르투갈 레이리아의 MARE-Polytechnic 사내 양식 시스템의 수질 정화에 사용되는 탄소 물질로 전환될 것입니다.
Introduction
해조류는 제약, 식품, 사료 및 환경 부문에서 이익을 얻을 수 있는 흥미로운 천연 원료로 간주될 수 있습니다. 그들은 관련 생물학적 특성을 가진 육상 유기체에서 발견되지 않는 분자의 파노라마를 생합성합니다 1,2. 그러나 대규모 바이오매스 재고를 확보하기 위해서는 해조류에 최적화된 재배 프로토콜을 구현해야 합니다.
재배 방법은 항상 해조류 탈리의 특성과 전반적인 형태를 고려해야 합니다. Gracilaria gracilis 는 클론 분류군으로, 부착 기관이 여러 식물 축을 생산한다는 것을 의미합니다. 따라서 단편화(식물 번식)에 의한 번식이 이루어지는데, 이는 이들 축이 각각 주 시상(primary thallus)3으로부터 독립된 생명을 완전히 채택할 수 있기 때문이다. 클론 분류군은 간단하고 빠른 원스텝 재배 방법론과 성공적으로 통합될 수 있는데, 이는 탈루스를 빠르게 재생하고 유전적으로 동일한 새로운 개체로 성장시키는 작은 조각으로 분할하여 많은 양의 바이오매스를 얻을 수 있기 때문입니다. 이 과정에서 haplontic 및 diplontic thalli가 모두 사용될 수 있습니다. 속은 복잡한 haplo-diplontic isomorphic triphasic 수명주기를 나타내지만, 포자 형성은 개선 된 작물을 달성하기 위해 주식의 유전 적 재생이 필요한 경우를 제외하고는 거의 필요하지 않습니다. 이 경우, tetraspores(감수분열에 의해 형성된 haplontic spores)와 carpospores(유사분열에 의해 형성된 diplontic spores)는 모두 식물 번식에 의해 성장하고 번식될 수 있는 거시적 탈리(thalli)를 발생시킨다4. 성장주기는 환경 조건과 개인의 생리적 상태, 착생 식물의 출현 및 다른 유기체의 접착과 같은 다른 생물학적 요인에 의해 결정됩니다. 따라서 재배 조건을 최적화하는 것은 높은 생산성을 보장하고 양질의 바이오매스를 생산하는 데 매우 중요하다5.
G. gracilis를 포함한 해조류로부터 생리활성 화합물의 추출은 다양한 방법을 통해 달성될 수 있다 6,7. 추출 방법의 선택은 특정 관심 화합물, 대상 응용 분야 및 해조류의 특성에 따라 다릅니다. 이 연구에서 우리는 물이나 에탄올과 같은 녹색 용매를 사용하여 해조류 바이오매스에서 생리 활성 화합물을 용해하고 추출하는 용매 추출에 중점을 두었습니다. 추출은 다양하고 효과적인 방법으로 침용을 통해 수행 할 수 있으며 광범위한 화합물에 사용할 수 있습니다. 일반적으로 실온 또는 약간 높은 온도에서 장기간 용매에 바이오매스를 담그는 간단하고 널리 사용되는 방법입니다. 용매는 추출 공정을 향상시키기 위해 교반됩니다. 원하는 추출 시간이 지나면 용매를 여과 또는 원심분리를 통해 고체 물질에서 분리합니다.
물은 안전성, 가용성 및 다양한 식품과의 호환성으로 인해 식품 응용 분야에서 일반적으로 사용되는 용매입니다. 물 추출은 다당류, 펩타이드 및 특정 페놀과 같은 극성 화합물에 적합합니다. 그러나 비극성 화합물을 효과적으로 추출하지 못할 수 있습니다. 에탄올은 또한 식품 응용 분야에서 널리 사용되는 용매이며 페놀 화합물, 플라보노이드 및 특정 안료를 포함한 다양한 생체 활성 분자를 추출하는 데 효과적일 수 있습니다. 에탄올은 일반적으로 식품에 사용하기에 안전한 것으로 알려져 있으며 추출된 화합물을 남기고 쉽게 증발할 수 있습니다. 추출 방법의 선택은 효율성, 선택성, 비용 효율성 및 환경 영향과 같은 요소를 고려해야 한다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 용매 농도, 추출 시간, 온도 및 압력과 같은 추출 파라미터의 최적화는 G. gracilis 또는 기타 해조류에서 생리 활성 화합물의 최적 수율을 달성하는 데 매우 중요합니다.
해조류는 박테리아, 곰팡이 및 바이러스를 포함한 광범위한 미생물에 대해 항균 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다8. 이 활성은 페놀, 다당류, 펩타이드 및 지방산을 포함한 생체 활성 성분에 기인합니다. 여러 연구에서 대장균, 황색포도상구균, 살 모넬라 균, 녹농균과 같은 병원균에 대한 효능이 입증되었습니다9. 해조류의 항균 활성은 미생물 세포벽, 세포막, 효소 및 신호 전달 경로를 방해할 수 있는 생리 활성 화합물의 존재에 기인한다10. 이러한 화합물은 미생물 성장을 방해하고 생물막 형성을 억제하며 면역 반응을 조절할 수 있습니다.
rhodophytes라고도 알려진 붉은 해조류는 다양한 미생물에 대해 항균 활성을 나타낼 수 있는 조류 그룹입니다. 이 그룹 내에서 G. gracilis 는 보고된 항균 활성에 기여할 수 있는 다양한 생체 활성 화합물을 함유하고 있습니다. 특정 분자는 다양할 수 있지만, G. gracilis 에서 보고되고 항균 특성을 가질 수 있는 일반적인 부류는 다당류, 페놀, 테르페노이드 및 색소이다11. 그러나 이러한 성분의 존재와 양은 해조류 채취 위치, 계절성, 탈리의 생리적 상태, 환경 조건과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서, G. gracilis 에서 항균 화합물의 특정 등급 및 농도는 그에 따라 달라질 수 있습니다.
G. gracilis 는 또한 자유 라디칼을 제거하고 산화 스트레스를 감소시키는 것으로 밝혀진 다양한 페놀 화합물을 함유한 항산화 특성을 가지고 있는 것으로 밝혀졌습니다12.항산화제는 활성 산소로 인한 손상으로부터 세포를 보호하는 데 도움이 되며 잠재적인 건강상의 이점이 있습니다. 항산화 능력은 2,2-디페닐-1-피크릴히드라질(DPPH) 활성산소 제거 활성을 포함한 다양한 방법을 통해 직접 평가할 수 있으며, 간접적으로 총 폴리페놀 함량(TPC)의 정량화를 통해 평가할 수 있습니다13.
성분이 두드러진 생체 활성을 가지고 있는 것으로 보고되었지만, 세포 독성 평가는 살아있는 세포 또는 조직과 접촉하는 데 사용되는 천연 및 합성 물질을 평가하는 데 필수적입니다. 세포 독성을 측정하는 방법에는 여러 가지가 있으며, 각 방법에는 장점과 한계가 있습니다. 전반적으로, 그들은 세포에 대한 많은 물질의 유해한 영향을 평가하고 동시에 세포 손상 및 사멸의 메커니즘을 조사하기 위한 다양한 옵션을 제공합니다14.
이 연구에서는 Mosmann(1983)15에 의해 도입된 비색 방법인 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 분석을 사용합니다. 이 방법은 대사 활성 세포에 의한 테트라졸륨 염의 자주색 포르마잔 생성물 환원을 측정합니다. 포르마잔 결정의 양이 많을수록 생존 가능한 세포의 수가 많아 세포 독성의 간접적인 측정을 제공합니다14. 이 연구에서 G. gracilis 물과 에탄올 추출물은 dermo-cosmetic 제형에 통합되도록 의도되었기 때문에 in vitro 세포 독성 평가는 각질 세포(HaCaT) 세포주에서 수행됩니다.
식품 적용과 관련하여 해조류는 일반적으로 칼로리가 낮고 식이 섬유, 필수 요소 및 아미노산, 다당류, 고도 불포화 지방산, 폴리페놀 및 비타민 2,16이 영양적으로 풍부합니다. G. gracilis도 예외는 아니며 흥미로운 영양가를 가지고 있습니다. Freitas et al. (2021)4에 따르면 재배된 G. gracilis는 야생 해조류에 비해 단백질과 비타민 C 수치가 더 높고 총 지질 수준을 유지하는 것으로 나타났습니다. 이것은 영양학적으로 말하자면 야생 자원의 착취보다 생산이 바람직하기 때문에 경제적, 환경적 이점을 나타낼 수 있습니다. 또한 소비자들은 자신이 먹는 식품의 종류에 대해 점점 더 많은 관심을 가지고 있으므로 식품 농축을 위한 새로운 성분을 도입하고 새로운 자원을 사용하여 제품에 가치를 더하고 "클린 라벨"을 주장할 수 있는 추출물을 얻는 것이 중요합니다. 게다가, 현재 시장은 경쟁이 매우 치열하여 제조업체를 경쟁업체와 차별화하기 위해 신제품 개발과 혁신적인 전략이 필요합니다17.
파스타와 같이 영양가가 낮은 제품에 해조류 등 수산자원을 농축하는 것은 영양가가 뚜렷한 제품을 통해 이를 새로운 식품으로 소개하는 전략이자 시장 차별화 전략이다. 한편, G. gracilis 는 phycobiliproteins18과 같은 천연 적색 색소의 공급원으로, 식품 산업에 응용할 수 있는 높은 잠재력을 가지고 있습니다. 이 해조류는 여러 분야에서 높은 관심을 보였으며 전체 해조류, 추출물 및/또는 나머지 바이오매스를 사용하여 적용할 수 있습니다. 이 작업에서는 이러한 응용 프로그램의 몇 가지 예를 보여 줍니다.
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Protocol
1. 바이오매스 수확 및 준비
- 썰물 때 G. gracilis 의 표본을 수확하고 건조, 빛 및 공기 노출을 피하기 위해 어둡고 차가운 상자에 담아 실험실로 신속하게 운반합니다.
- 실험실에서 흐르는 바닷물로 각 thallus를 씻고 철저히 청소하여 표면에서 파편, 괴사 부위, 착생식물 및 기타 유기체를 제거합니다.
- 일광 시원한 백색 및 형광등 및 광주기가 제공하는 낮은 조도, 일광 실내 (31 ± 35 °C)에서 지속적으로 폭기 된 해수 (1-1 psu)에서 야생 바이오 매스를 유지하십시오 (빛 : 어두움) 7 일 동안. 이 기간 동안 영양 배지를 공급하지 마십시오. 이를 통해 해조류는 새로운 실내 조건에 천천히 적응할 수 있습니다.
2. 재고 유지
- 적응 기간이 지나면 멸균 칼날로 해초 탈리의 건강한 끝부분을 자릅니다. Redmond et al. (2014)19 에 따라 멸균 상태에서 페트리 접시(1.0% 세균학적 한천, 증류수/해수 비율 1.0%)에서 미리 준비한 한천 겔을 통해 각 팁을 끌어 남아 있는 오염 물질을 제거합니다. 각 팁에 대해 한천 끌기를 세 번 수행하고 항상 한천 겔의 사용하지 않은 부분을 통해 팁을 끕니다.
- 염산 용액(HCl, 15%)으로 유리 제품을 산성 세척하고 증류수로 철저히 헹굽니다. 세척 공정에 사용되는 모든 도구, 유리 제품, 한천, 해수 및 증류수를 오토클레이브(121°C, 15분)로 멸균합니다.
주의 : 공급업체가 제공한 HCl의 안전 데이터 시트를 참조하십시오. - Redmond et al. (2014)19에 따르면 팁은 35psu의 멸균된 해수에서 자라며 붉은 해조류용으로 수정된 Von Stosch 농축 용액(VSE)으로 보충됩니다. 이산화게르마늄(GeO2)을 배지(1mL/L)에 첨가하여 착생 규조류의 성장을 방지합니다.
주의 : 공급업체에서 제공한 GeO2 의 안전 데이터 시트를 참조하십시오.
알림: 부분 또는 전체 변색으로 관찰되는 색소 침착 손실을 나타내는 팁은 스트레스를 받고 있거나 이미 죽었으므로 폐기해야 합니다.
3. 재배 및 규모 확대
- 순응 기간 후, 20 ± 1 °C로 설정된 기후실에서 20 ± 0.5 μmol 광자 m-2 s-1 (1500 lux)의 백색 시원한 빛, 16 h: 8 h(밝음: 어두움)로 설정된 광주기 및 매주 갱신되는 VSE 배양 배지가 농축된 멸균 해수에서 250mL 평판 바닥 플라스크에 약 8-10개의 건강한 팁을 무작위로 분배합니다.
- 매주 체중 측정을 수행하고 탈리에 과도한 부담을 주지 마십시오20. 이를 위해 배양 배지에서 팁을 조심스럽게 제거하고 부드럽게 헹구고 실험실 저울에서 밀리그램의 무게를 잰다.
참고: 이 절차는 배양 배지 주간 갱신과 함께 수행할 수 있습니다. - 탈리는 이 플라스크에서 최대 2g/L의 밀도까지 자랄 수 있습니다. 이 시점에서 수신자 스케일 업(250mL, 1L 및 5L)을 수행합니다. 부피가 50L에 도달하면 50L 이상의 야외 개방형 흰색 용기로 재배를 옮깁니다.
- Patarra et al. (2017)21 에 따라 상대 성장률(RGR)을 계산합니다.
RGR (% fw/일) = ([Ln (fw) - Ln (iw)]/t) x 100
여기서 IW와 FW는 각각 그램으로 표시되는 초기 및 최종 신선 중량이고 T는 일 단위의 시간입니다.
알림: 이 실험실 설정에서 RGR은 하루에 최대 21%의 값에 도달합니다. 바이오매스 수확은 언제든지 수행할 수 있습니다. 바이오매스는 용도에 따라 오븐 건조, 동결 건조 또는 단순히 냉동(-20°C)하여 분해를 방지하기 위해 신속하게 처리해야 합니다. 건조된 바이오매스는 실온(RT)에서 보존하거나 냉동 보관할 수도 있습니다.
4. 추출 절차
참고: G. gracils 추출물의 시험관 내 세포 독성, 항산화 및 항균 특성을 평가하기 위해 준비는 추출 온도와 용매 유형이라는 두 가지 매개변수를 고려합니다.
- 추출을 수행하려면 G. gracilis 바이오매스를 오븐 건조하고 분말이 200μm 체를 통과할 때까지 바이오매스를 분쇄합니다(예: 가정용 커피 그라인더에서).
- 건조된 바이오매스(10g)의 무게를 측정하고 100mL의 용매(절대 에탄올 또는 멸균수)에 녹입니다.
- 빛으로부터 보호된 용기에서 30분 동안 저어줍니다.
- 실온, 40°C 및 70°C에서 물과 물 > 에탄올 추출을 순차적으로 에탄올 > 수행합니다.
- 각 온도에 대해 에탄올과 물을 별도로 두 번 추출합니다.
- 여과지(Whatman No.1)를 통한 여과에 의해 잔류 바이오매스에서 액체 추출물을 분리한 후 RT에서 10분 동안 8000 x g 에서 원심분리합니다.
- 다른 용매로 추가 추출을 위해 남은 조류 바이오매스를 재사용합니다. 샘플을 먼저 에탄올로 추출한 경우 다음으로 물로 추출하고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
- 수성 추출물을 동결 건조하고 에탄올 추출물을 40°C의 회전 증발기에서 증발시킵니다.
- 건조된 추출물은 4 °C에서 보관합니다.
- 추출물을 50mg/mL(항균 분석) 또는 10mg/mL(항산화 분석)의 농도로 용해시킵니다. 수성 추출물을 멸균수에 녹이고 에탄올 추출물을 절대 에탄올에 녹입니다.
5. 항균 작용
참고: 에탄올 및 수성 추출물은 Bacillus subtilis subsp . spizizenii (DSM 347), 대장균 (DSM 5922) 및 Listonella anguillarum (DSM 21597)에 대해 개별적으로 테스트해야 합니다. 항균 검사는 NCCLS(National Committee for Clinical Laboratory Standards)의 권장 사항에 따라 수행해야 합니다.22. 모든 배양물은 독일 미생물 및 세포 배양 컬렉션(DSMZ)에서 얻었습니다. L. 앵귈라룸 은 1% 염화나트륨(NaCl)이 보충된 트립틱 대두 국물(TSB) 또는 트립틱 대두 한천(TSA)에서 성장했습니다. 나머지 2개의 균주는 LB 배지(VWR Chemicals)에서 성장시켰다. Bacillus subtilis subsp . spizizenii (DSM 347) 및 Listonella anguillarum (DSM 21597) 배양액은 30°C에서 배양한 반면, Escherichia coli (DSM 5922)는 공급업체의 지침에 따라 37°C에서 배양했습니다. 육수 미세희석법은 액체 배지에서 항균 활성을 측정하는 데 사용할 수 있으며, 이는 미시적 규모로 수행되어야 항균 가능성을 빠르고 효율적으로 결정할 수 있습니다. 이 저비용 방법을 사용하면 단 24시간 만에 결과를 얻을 수 있으므로 초기 단계에서 주어진 미생물 균주에 대해 성장 억제 작용 측면에서 결과를 얻을 수 있는 최상의 추출 조건을 결정하는 데 적합합니다. 그러나 이 방법론은 미생물 성장에 특화된 뚜껑이 있는 멸균 마이크로플레이트를 사용해야 할 뿐만 아니라 600nm 파장을 위한 마이크로플레이트 리더를 사용할 수 있어야 합니다.
- 170μL의 Muller-Hinton Broth(MHB)가 포함된 처리되지 않은 둥근 바닥 96웰 마이크로플레이트를 사용하여 10μL의 표준화된 접종물(0.5 McFarland 표준) 및 20μL의 각 추출물(50mg/mL)을 접종하여 육수 미세희석 테스트를 수행합니다.
- 각 균주에 대한 최적의 온도에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다.
- 0시간 및 24시간에 마이크로플레이트 분광 광도계에 광학 밀도(OD 600)를 기록하여 측정한 가시 탁도를 감소시켜 항균 활성을 감지합니다.
- 결과를 억제 백분율로 표현합니다.
여기서 Abs. ext는 추출물의 존재 하에서 성장하는 박테리아 균주를 포함하는 웰에서 0 h와 24 h 사이에서 측정된 흡광도의 차이이며, Abs는 박테리아 균주와 용매를 포함하는 웰에서 동일한 측정값을 나타냅니다. - 이 방법에서는 음성 대조군이 될 배양 배지만 포함하는 웰뿐만 아니라 용매(에탄올 또는 물)에 첨가된 표준 균주를 접종한 배지와 박테리아 균주 및 양성 대조군 항생제(클로람페니콜)가 포함된 배지가 있는 웰을 포함하는 대조 반응을 포함합니다.
6. 총 폴리페놀의 항산화 활성 및 정량화
- 총 폴리페놀 함량
참고: 총 폴리페놀 함량(TPC)은 Folin-Ciocalteu 방법23 을 사용하여 수행되며 마이크로 스케일에 맞게 조정됩니다.- 빛으로부터 보호되는 96웰 마이크로플레이트의 각 웰에 158μL의 초순수, 2μL의 시료 및 10μL의 Folin-Ciocalteu 시약을 추가합니다.
주의: 공급업체가 제공한 Folin-Ciocalteu 시약의 안전 데이터 시트를 참조하십시오. - 2 분 후 30 μL의 Na2CO3 (20 %)를 첨가합니다.
- RT의 어두운 곳에서 1시간 동안 배양한 후 755nm에서 분광광도계로 샘플을 측정합니다.
- 갈산(검량선을 표시할 수 있음) 또는 초순수(2μL)를 대조군으로 사용하십시오.
- 결과를 갈산당량(mg GAE/g 추출물)으로 표현합니다.
- 빛으로부터 보호되는 96웰 마이크로플레이트의 각 웰에 158μL의 초순수, 2μL의 시료 및 10μL의 Folin-Ciocalteu 시약을 추가합니다.
- 2,2 diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거 활성
참고: 추출물의 항산화 활성은 Duan et al. (2006)24에 기술된 바와 같이 평가되며, 마이크로 스케일에 적합합니다- 빛으로부터 보호되는 96웰 마이크로플레이트에 각 샘플 2μL(10mg/mL 농도)와 절대 에탄올(0.1mM)에 용해된 DPPH 198μL를 넣습니다.
주의 : 공급업체가 제공한 DPPH의 안전 데이터 시트를 참조하십시오. - 어둠 속에서 RT에서 30분 동안 반응을 실행합니다. 마이크로플레이트 분광 광도계에서 517nm에서 흡광도를 측정합니다.
- 2μL의 절대 에탄올/증류수와 198μL의 DPPH 용액으로 제어 반응을 수행합니다. 2μL의 추출물과 198μL의 절대 에탄올로 블랭크 측정을 수행합니다.
- 다음 방정식을 사용하여 결과를 DPPH 억제 백분율로 표현합니다.
여기서 조류 추출물의 흡광도는 As이고, Ab는 블랭크 샘플의 흡광도이고 Ac는 대조군의 흡광도입니다.
- 빛으로부터 보호되는 96웰 마이크로플레이트에 각 샘플 2μL(10mg/mL 농도)와 절대 에탄올(0.1mM)에 용해된 DPPH 198μL를 넣습니다.
7. 표피세포의 세포독성 평가
참고: G. gracilis의 수성 및 에탄올 추출물의 시험관 내 세포독성 효과는 앞서 설명한 바와 같이 MTT 비색 분석을 통해 인간 각질형성세포(HaCaT 세포 - 300493)에서 평가됩니다25. 세포는 독일 세포주 서비스(Cell Lines Services, Germany, CLS)로부터 획득하였고, 상기 방법은 기관 가이드라인 및 CLS 지침에 따라 수행하였다.
주의 : 공급업체가 제공한 MTT의 안전 데이터 시트 참조)
- 세포 배양 유지
- 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 항생제/항진균 용액(암포테리신 B, 0.25mM, 페니실린, 60mM, 스트렙토마이신, 100mM)이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle's 고포도당 배지(DMEM)에서 HaCaT 세포를 배양합니다.
- 트립신-EDTA를 사용하여 세포를 해리합니다.
참고: HaCaT 세포의 하위 배양은 세포가 완전히 합류한 후에 이루어집니다. - 37 % CO2 및 5 % 습도의 챔버에서 세포를 배양합니다.
- 배양이 80%-85% 합류도에 도달할 때마다 바이오뱅크 지침에 따라 세포를 하위 배양합니다.
- 세포독성 평가
- 96웰 플레이트에 세포를 파종하고 하룻밤 동안 배양한 후 HaCaT 세포(4 x 104 세포/웰)를 DMSO(100mg/mL)에 미리 용해된 건조된 추출물로 처리합니다. 그런 다음 추출물 용액 2μL를 배지 198μL에 첨가하고 플레이트를 24시간 동안 배양합니다.
- 배양 배지를 제거하고 100μL의 MTT(0.5mg/mL)를 세포에 추가합니다. 위에서 언급한 일반 배양 조건에서 어두운 곳에서 30분 동안 세포를 배양합니다.
- MTT 용액을 제거하고 100μL의 DMSO로 세포 내 포르마잔 결정을 용해시킵니다.
- 마이크로플레이트 리더를 사용하여 570nm에서 흡광도를 측정합니다. 결과를 대조군 미처리 세포의 백분율로 표현합니다.
8. 식품 혁신
- 새로운 식품: 해초 파스타
- 재료 선택과 파스타 배합
참고: 재료 선택은 파스타 회사와 공동으로 이루어졌습니다. 주요 재료(섹션 8.2에 설명됨)의 선택은 쉬운 접근성과 기존 생산 라인과의 호환성을 고려하여 이루어졌으며, 해양 자원을 사용하여 영양가가 추가된 파스타를 얻었습니다.- 성분을 선택한 후 스프레드시트를 사용하여 제형의 이론적 화학 조성을 분석하여 의도한 영양가(섬유질, 비타민, 미네랄 성분의 공급원, 저포화 지방)에 따라 제형을 설계합니다.
- 이론적 요구 사항이 충족되면 8.1.2단계에 설명된 대로 실험실 규모 생산을 진행합니다.
- 반 훈련된 패널(>10명의 시음자)과 함께 관능 테스트를 수행하여 다음 단계에 대한 제형의 재형성 또는 수용 여부를 검증합니다.
참고: 패널은 이전에 파스타 시식을 위해 교육을 받았으며 풍미, 맛, 냄새, 질감 및 모양과 같은 속성과 관련하여 제시된 제형을 쾌락적으로 평가했습니다.
- 파스타 생산
알림: 파스타 압출기를 사용하여 Chifferi 파스타 샘플을 생산합니다.- 장비에서 이전에 정의된 쌀가루, G. gracilis, Chlorella vulgaris를 혼합하고 혼합물에 약 30%의 물을 추가합니다.
- 마른 파스타를 얻으려면 Chifferi 를 68°C에서 42분 동안 건조시킨 다음 76°C에서 5시간 30분 동안 건조하여 산업 공정을 시뮬레이션합니다.
- 마지막으로, 샘플을 포장 및 진공 밀봉하고 추가 분석이 있을 때까지 RT의 어두운 곳에 보관합니다.
- 영양 분석
알림: 영양 프로필 분석을 위해 건조 및 침용된 샘플을 세 번 사용하십시오.- 조단백질 함량: 8.1.3.2-8.1.3.6단계에 따라 Duarte et al. (2022)26에서 채택한 Kjeldahl 방법을 통해 총 단백질 분석을 수행합니다.
- 1.0 g의 샘플(또는 블랭크 분석용 증류수)을 정확하게 칭량하고 분해 튜브에서 Kjeldahl 정제 2개 및 H2SO4 25mL와 혼합합니다.
주의 : 공급업체가 제공한 H2SO4 의 안전 데이터 시트를 참조하십시오. - 220°C의 Kjeldahl 분해기에서 30분 동안 시료를 분해한 후 400°C에서 90분 동안 분해합니다.
- RT로 냉각한 후, 증류수 80mL를 첨가하고 형성된 암모니아를 브로모크레졸 그린 및 메틸 레드를 함유하는 4%H3BO3용액 30mL로 증류한다. 이 단계는 알칼리성 조건에서 이루어집니다(Kjeldahl 증류기를 사용하여 40% NaOH로 증류).
주의: 공급업체가 제공한 브로모크레졸 녹색, 메틸 레드 및 40% NaOH를 함유한 H 3 BO3용액의 안전 데이터 시트를 참조하십시오. - 회색빛이 도는 분홍색으로 변하는 것이 관찰될 때까지 HCl 0.1 M으로 증류된 샘플을 적정합니다.
- 샘플의 질소 함량으로 표시되는 조단백질 함량을 계산하고 다음 방정식을 사용하여 100g당 g로 표현합니다.
여기서VS는 샘플 적정에 사용되는 HCl 부피(mL)에 해당합니다. VB 는 블랭크에 사용된 볼륨에 해당합니다. N은 HCl 정규성에 해당합니다. w는 샘플 중량(g)에 해당합니다. - 총 지방 함량: 8.1.3.8-8.1.3.14단계에 따라 Folch et al. (1957)27에서 채택한 Folch 방법을 사용하여 총 지방 함량을 측정합니다.
- CHCl3 와 MeOH를 2:1(v:v)의 비율로 혼합하여 Folch 시약을 준비합니다.
주의 : 공급 업체가 제공 한 Folch 시약의 안전 데이터 시트를 참조하십시오. - 1g의 시료가 포함된 튜브를 시험하려면 Folch 시약 5mL와 증류수 0.8mL를 추가합니다. 소용돌이에서 1분 동안 섞습니다.
- 그런 다음 Folch 시약 5mL를 더 넣고 5분 동안 균질화합니다. 0.8% NaCl 용액 1.2mL를 추가하고 2분 동안 균질화합니다.
- 샘플을 7000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 친수성 면과 무수 황산나트륨을 통해 유기상(하부상)을 둥근 바닥의 유리 플라스크에 여과합니다.
- 시료 손실을 방지하려면 동일한 조건에서 5mL의 CHCl3 첨가, 균질화, 원심분리 및 여과 단계를 반복합니다.
- 저압 증발에 의해 수집된 유기상에서 유기 용매를 제거하고 105°C의 오븐에 4시간 동안 그대로 둡니다. 식히십시오ampsamp데시케이터에서.
- 다음 방정식을 사용하여 100g당 g로 표현되는 지방 함량을 계산합니다.
여기서 W1 은 빈 둥근 바닥 유리 플라스크 무게입니다. W2 는 샘플의 초기 중량입니다. W3 은 샘플 중량이 있는 둥근 바닥 유리 플라스크입니다. - 조섬유 함량: 8.1.3.16-8.1.3.22단계에 따라 ISO 6865(2000)28에서 채택된 방법론을 사용하여 조섬유 함량을 측정합니다.
- 샘플 1g(W0)을 필터 바닥(참조 P2)이 있는 유리 도가니에 넣고 섬유 분석기에 넣습니다.
- 첫 번째 단계는 산 가수분해입니다: 예열된 1.25%H2SO4150mL 및 소포제(n-옥탄올) 2mL를 각 도가니의 컬럼에 첨가합니다. 끓을 때까지 가열하고 30분 동안 그대로 둡니다.
- 이 용매를 제거한 후 탈이온수로 3회 세척하여 염기성 가수분해를 진행한다. 예열된 1.25% NaOH 150mL와 소포제 5mL를 무액 컬럼에 넣고 산 가수분해와 동일한 가열 절차를 수행합니다.
- 마지막으로 저온 추출을 위해 150mL의 아세톤으로 삼중 세척합니다.
- 이 과정이 끝나면 시스템에서 Crucible을 조심스럽게 제거하고 150°C의 오븐에 1시간 동안 넣습니다. 최종 무게(W1)를 기록합니다.
- 500°C의 머플 퍼니스에 3시간 동안 Crucible을 놓고 최종 중량(W2)을 기록합니다.
- 조섬유 함량을 계산하고 다음 방정식을 사용하여 결과를 백분율로 표현합니다.
%조섬유 = 100 x (W1-W2)/W0 - 지방산(FA) 프로필: Fernández et al.(2015)29-8.1.3.24-8.1.3.29단계에 따라 지방산 프로필을 결정합니다.
참고: 지방산 메틸 에스테르(FAME)는 분쇄된 동결 건조 샘플의 직접 산 촉매 트랜스메틸화에 의해 얻어집니다. 모든 분석은 삼중으로 수행됩니다. - 메탄올에 2 % (v / v) H 2SO4 용액 2mL를 50mg 샘플에 첨가하고 혼합물을 80 °C에서 연속 교반하면서2시간 동안 붓습니다.
주의 : 공급 업체가 제공 한 메탄올의 안전 데이터 시트를 참조하십시오. - RT로 냉각한 후 각 샘플에 초순수 1mL와 n-헵탄 2mL를 넣고 혼합물을 1분 동안 소용돌이치고 5분 동안 원심분리합니다.
주의 : 공급업체가 제공한 n-헵탄의 안전 데이터 시트를 참조하십시오. - FAME이 포함된 상부 n-헵탄상(유기물)을 회수하여 가스 크로마토그래피(GC) 바이알로 옮깁니다.
- TR-FAME 모세관 컬럼(60m × 0.25mm ID, 0.25μm 필름 두께), 자동 시료 주입기 및 화염 이온화 검출기(FID)가 장착된 가스 크로마토그래프에서 분석합니다.
- 인젝터(비분할 모드)를 250°C로, 검출기를 280°C로 설정합니다. 컬럼의 초기 온도를 75°C로 설정하고 1분 동안 유지합니다. 그런 다음 5°C/min에서 170°C로 올리고 10분 동안 유지합니다. 그런 다음 5°C/min에서 190°C로 올리고 10분 더 유지합니다. 마지막으로 2°C/min에서 240°C로 올리고 10분 동안 유지합니다. 1.5mL/분의 유속으로 헬륨을 운반 가스로 사용합니다. 공기와 수소를 각각 350mL/분 및 35mL/분의 유속으로 공급합니다.
- 결과 머무름 시간을 표준물질과 비교하여 FA 프로파일을 결정하고 결과를 총 지방의 백분율로 표현합니다.
- 미네랄 원소 프로파일: 8.1.3.31-8.1.3.34단계에 따라 Pinto et al. (2022)30에서 채택한 방법에 따라 ICP-OES로 분석한 미네랄 원소(Ca, P, Mg, Na, K, Fe, Cu, Mn, Zn)를 결정합니다.
- 각 건조 시료의 약 0.4g을 정확하게 칭량하고 HNO3 7.5mL와 HCl 2.5mL를 추가합니다.
주의 : 공급업체가 제공한 HNO3 및 HCl의 안전 데이터 시트를 참조하십시오. - 분해는 2단계 과정을 따릅니다: 30분 안에 온도를 RT에서 90°C로 높인 다음(이 온도에서 30분 더 유지) 105°C에서 60분 동안 가열합니다.
- 샘플 용액을 식히고 25mL로 희석한 다음 여과하여 라벨이 부착된 튜브에 보관합니다. 각 분해에서 기준 물질과 블랭크를 사용하여 동일한 공정을 수행합니다. ICP-OES로 다양한 원소의 농도를 구합니다.
- 결과를 fw 100g당 mg으로 표현합니다.
- 탄수화물 함량: 8.1.3.36-8.1.3.37단계에 따라 탄수화물 함량을 계산합니다.
- FAO(Food and Agriculture Organization, FAO; 2003)31에 따라 다음 방정식을 사용하여 100g당 이전에 결정된 계수의 차이로 사용 가능한 탄수화물(섬유질 제외) 함량을 계산합니다
- 결과를 100g당 g로 표현합니다.
- 수분 및 회분 함량: 8.1.3.39-8.1.3.45단계에 따라 수분 및 회분 함량을 추정합니다.
- 도자기 도가니를 105°C에서 3시간 동안 배양하고 데시케이터에서 식힌 후 무게를 잰다.
- 샘플의 10g을 계량하여 도가니에 넣고 연속 중량 값이 10mg 이상 차이가 나지 않을 때까지 3시간 주기 동안 105°C의 건조 오븐에 넣습니다.
- 다음 방정식을 사용하여 fw 100g당 g로 표시되는 수분 함량을 계산합니다.
여기서 W1 은 빈 샘플팬의 무게이고, W2 는 신선한 샘플이 있는 샘플팬의 무게이고, W3 은 건조된 샘플이 있는 샘플팬의 무게입니다. - 수분 함량 분석 후 건조된 샘플과 함께 샘플팬을 525°C의 소각로에서 4시간 동안 놓습니다.
- 연속적인 가중치가 1mg 이상 차이가 나지 않을 때까지 이 절차를 반복합니다.
- 샘플을 데시케이터에서 RT로 식힌 다음 무게를 잰다.
- 다음 방정식을 사용하여 fw 100g당 g로 표현되는 회분 함량을 계산합니다.
여기서 W1 은 빈 샘플팬의 무게, W2 는 신선한 샘플이 있는 샘플팬의 무게, W3 은 무게가 포함된 샘플팬의 무게입니다. - 에너지 값: 8.1.3.47-8.1.3.48단계에 따라 에너지 값을 계산합니다.
- EU 규정에 따라 샘플의 에너지 값을 계산합니다.소비자에게 식품 정보 제공(규정 1169/2011)32, 방정식을 사용합니다.
에너지 (kcal / 100g) = 4 x (g 단백질) + 4 x (g 탄수화물) + 9 x (g 지방) + 2 x (g 섬유질)
에너지(kJ/100g) = 17 x (단백질 g) + 17 x (g 탄수화물) + 37 x (g 지방) + 8 x (g 섬유질) - 결과를 100g당 킬로칼로리와 100g당 킬로줄로 표현합니다.
- 소비자 수용
- 증류수에서 8분 동안 조리한 파스타 샘플을 사용하여 소비자 수용도를 평가합니다.
- 소비자 수용 테스트 수행: 샘플의 시각적 외관, 색상, 질감, 냄새, 바다 맛, 전반적인 맛, 전반적인 평가 및 구매 의도를 평가합니다.
참고: 소비자 수용 테스트는 시각적 외관, 색상, 질감, 냄새, 바다 맛, 전반적인 맛, 전반적인 평가 및 구매 의도를 1-9의 척도로 평가하는 쾌락 테스트를 기반으로 하며, 여기서 1은 나쁜 평가, 9는 매우 좋은 평가입니다. - 감각 분석 실험실의 개별 감각 부스에서 감각 테스트를 수행합니다(온도 및 조명 제어 포함). 수저, 냅킨 및 생수가 담긴 유리 컵을 제공하여 샘플 사이의 미각을 청소하십시오.
참고 : 시음자는 모든 배경에서 16-64 세 (n > 80)입니다.
- 재료 선택과 파스타 배합
- 요구르트
- 색소 추출
참고: Pereira et al. (2020)18에 설명된 방법론을 통해 색소 추출을 수행합니다.- 추출 용매인 인산나트륨 완충액을 0.1M에서 인산나트륨 이염기성(0.03M) 및 인산나트륨 일염기(0.07M)로 준비합니다. NaOH 또는 HCl을 사용하여 pH를 pH 6.8로 설정합니다.
- G. gracilis 1g의 무게를 잰 후 인산나트륨 완충액 50mL(pH 6.8)를 추가합니다. 10분 동안 균질화한 다음 모르타르와 유봉으로 10분 동안 침용합니다.
- 용액을 튜브로 옮기고 12,298 x g (4°C)에서 20분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 모으고 65% 황산암모늄을 천천히 추가합니다. 황산 암모늄이 모두 용해되면 용액을 알루미늄 시트로 덮고 밤새 4 °C에서 침전시킵니다.
주의 : 공급업체에서 제공한 황산암모늄의 안전보건자료를 참조하십시오. - 침전물을 12,298 x g (4 °C)에서 20분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 회수하여 증류수(약 5mL)에 녹입니다.
- 튜브막(14kDa)을 사용하여 물에 대해 24시간 동안 추출물을 투석한 후 동결 건조합니다. 동결 건조된 추출물을 사용할 때까지 4°C에서 빛으로부터 보호하여 보관하십시오.
- 요구르트 준비
- 저온살균 우유 1L, 천연 요구르트 120g, 설탕 20g, 분유 50g을 열혼합기에 넣고 50°C, 속도 3에서 5분 동안 천연 요구르트를 준비합니다.
- 혼합물을 37°C의 인큐베이터에 있는 열혼합기 용기에 넣고 12시간 동안 넣습니다.
- 추출물을 0.21% 농도의 요구르트에 혼합하여 혼합합니다. 분석이 완료될 때까지 4°C의 개별 유리 플라스크에 시료를 보관합니다.
- 분석할 때까지 색소 없음(대조군)의 요구르트의 개별 부분을 4°C에서 보관합니다.
- 색상 안정성
참고: 12일 동안 색상 분석을 통해 요구르트의 색소 안정성을 평가합니다. 반사율 색도계, 2도 표준 관찰자 및 D65 광원을 사용하여 색상 분석을 수행합니다. 결과는 L(밝기, 검은색 - 흰색, 0 - 100), a*(녹색 - 빨간색, -60 - 60) 및 b*(파란색 - 노란색, -60 - 60) 매개 변수를 사용하여 CIELab 좌표로 표시됩니다. 파라미터 a*는 붉은색의 경우 양수 값이고 녹색의 경우 음수 값을 갖습니다. 매개 변수 b*는 노란색에 대해 양수 값을 취하고 푸르스름한 색상에 대해 음수 값을 사용합니다. L*은 광도의 매개변수로, 각 색상이 흑백33 사이의 그레이스케일 구성원과 동등한 것으로 간주될 수 있는 속성입니다.- 제조업체에서 제공한 흰색 세라믹 플레이트(L* 88.5, a* 0.32, b* 0.33)를 사용하여 색도계를 보정합니다.
- 약 28g의 샘플(또는 대조군)로 셀을 채우고 색상 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 색상을 분석합니다.
참고: 색상 데이터 분석에 사용된 소프트웨어는 SpectraMagic NX였습니다. - s에서 판독을 5회 수행ample/대조군 삼중.
- 감각 분석
참고: 삼각형 테스트(ISO 4120, 2004)34 와 색상, 맛 및 전반적인 감상에 대한 쾌락적 평가를 사용하여 색소가 포함된 요구르트의 감각 평가를 수행합니다.- 삼각형 테스트의 경우 패널리스트에게 3개의 샘플(색소가 있는 요구르트 샘플 1개와 대조군 샘플 2개 또는 색소가 포함된 요구르트 샘플 2개와 대조군 1개)을 제공하고 향, 질감 및 맛에 따라 다른 샘플을 선택하도록 요청합니다. 임의의 3자리 코드로 식별된 유사한 부피의 샘플을 제공합니다.
- 색소가 함유된 요거트의 쾌락적 평가를 위해 패널리스트에게 색소가 함유된 요구르트 샘플을 제공하고 9점 쾌락 척도(매우 싫어함에서 매우 좋아함까지)를 사용하여 색상, 맛 및 전반적인 감상을 평가하도록 요청합니다.
- 색소 추출
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Representative Results
항균 작용
얻은 결과를 해석 할 때, 억제 비율이 높을수록 특정 균주의 성장을 억제하는 추출물의 효능이 커지고 결과적으로 추출물이 항균제로서 더 흥미로워진다는 점을 명심해야합니다. 이 방법론을 통해 특정 박테리아 균주에서 어떤 추출물이 더 큰 활성을 보이는지 신속하게 식별할 수 있으며, 향후 사용 측면에서 가장 흥미로운 추출물도 식별할 수 있습니다. 따라서 우리는 동일한 추출물에 대한 추가 연구를 위한 출발점을 가질 수 있습니다.
그림 1은 바이오매스 건조 직후(그림 1A)와 에탄올 추출 후 얻은 세 번째 및 네 번째 추출(그림 1B)에서 첫 번째 및 두 번째 추출 모두에서 수성 추출물로 얻은 결과를 보여주며, 따라서 바이오매스를 통합적으로 사용합니다. 세 번째 및 네 번째 수성 추출에 해당하는 가장 흥미로운 결과는 특히 70°C에서 얻은 추출물에서 더 높은 항균 활성을 나타낸다는 것을 알 수 있습니다. 우물의 추출물 농도는 5mg/mL입니다.
그림 1: G. gracilis의 수용성 추출물이 있는 경우 박테리아 종의 성장 억제. 상이한 온도, 실온(RT), 40°C(40) 및 70°C(70)에서 수득된 G. gracilis의 수성 추출물(Aq)의 존재 하에서 액체 배지에서 24시간 동안 성장한 후 3가지 박테리아 종(Bacillus subtilis, Escherichia coli, Listonella anguillarum)의 성장 억제. 양성 대조군은 클로람페니콜(CHL)로 수행하였으며, 결과는 평균값(n=8)으로 표현하였다. 데이터는 4개의 순차적 추출 단계(1차, 2차, 3차, 4차)를 참조합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
에탄올 추출물은 그림 2에서 볼 수 있듯이 L. anguillarum의 성장을 억제하는 데 특히 효과적인 것으로 보입니다. 이것은 첫 번째 수성 추출 후에 얻은 첫 번째 및 두 번째 추출(그림 2A)과 세 번째 및 네 번째 추출(그림 2B)에서도 에탄올 추출물로 얻은 결과를 보여줍니다.
그림 2: G. gracilis의 에탄올 추출물이 있는 경우 박테리아 종의 성장 억제. 3 박테리아 종 (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Listonella anguillarum)의 성장 억제, 액체 배지에서, G. gracilis의 에탄올 추출물 (Et)의 존재 하에서, 다른 온도, 실온 (RT), 40 ° C (40) 및 70 ° C (70). 양성 대조군은 클로람페니콜(CHL)로 수행하였고, 결과는 평균값(n=8)으로 표현하였다. 데이터는 4개의 순차적 추출 단계(1차, 2차, 3차, 4차)를 참조합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
항산화 작용
DPPH 테스트에서 다양한 추출물의 항산화 잠재력을 강조하는 결과와 관련하여 그림 3 에 표현된 결과는 40°C의 온도가 가장 효과적이어서 RT 또는 70°C에서 얻은 추출물에서 관찰된 것보다 산화 활성의 억제 값이 더 높다는 것을 나타냅니다. 이는 G. gracilis 샘플에 유효하며, 사용된 샘플과 조류 성장 조건에 따라 큰 차이가 있을 수 있습니다. 따라서 각 특정 유형의 샘플에 대한 최상의 조건을 나타내기 위해 테스트를 수행하는 것이 좋습니다.
그림 3: 다른 온도에서 얻은 추출물의 존재 하에서 DPPH 라디칼(%)의 억제. 추출물은 에탄올(Et) 또는 수성(Aq) 추출을 통해 수득하였다. 1차 및 2차 추출은 건조 바이오매스로부터 순차적으로 이루어졌다. 나머지 것들 (3차 및 4일)은 이전에 대체 용매로 추출 된 바이오 매스로 만들어졌습니다. RT는 실온을 의미합니다. 40, 40°C에서 수득된 추출물; 및 70, 70°C에서 얻은 추출물. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
총 폴리페놀 정량화 측면에서도 유사한 결과를 얻었으며(그림 4), 40°C의 온도가 항산화 화합물 추출 측면에서 가장 좋은 것으로 간주되었습니다. 이것은 항산화 활성이 추출물에 존재하는 페놀 성분과 상관 관계가 있는 것으로 보인다는 것을 보여줍니다.
그림 4: 다양한 온도에서 얻은 추출물의 총 폴리페놀 함량(TPC) 정량화. 추출물은 에탄올(Et) 또는 수성(Aq) 추출에 의해 수득되었으며, 여기서 1차 및 2차 추출은 건조조류로부터 순차적으로 이루어지고, 나머지(3차 및 4차)는 이전에 다른 용매로 추출한 바이오매스로 제조하였다. RT는 실온을 의미합니다. 40, 40°C에서 수득된 추출물; 및 70, 70°C에서 얻은 추출물. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
HaCat 세포의 세포 독성
화장품 성분의 안전성을 평가하는 첫 번째 단계는 표피 및 진피 세포주에서 체외 세포 독성을 연구하는 것입니다. 그림 5에서 볼 수 있듯이 각질세포(HaCaT 세포)에서는 세포독성 효과가 관찰되지 않았으며, 이는 최대 분석 농도(1mg/mL)에서 수성 추출물과 에탄올 추출물 모두 피부 사용에 안전하다는 것을 시사합니다.
그림 5: Gracilaria gracilis 추출물(1mg/mL)이 처리 24시간 후 HaCaT 세포에 미치는 세포독성 효과. 각 열의 값은 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차(SEM)로 표현됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
식품 혁신
최종 파스타 제형은 이론적 제형과 반 훈련된 패널에 의한 관능 테스트 사이의 수많은 시행 끝에 얻어졌습니다. 이 단계 후, 영양 평가, 지방산 및 미네랄 원소 프로파일을 포함한 화학적 특성 분석에 접근했습니다. 영양학적 특성화(표 1 및 표 2)를 구축하고 유럽 법률(REG(EU) No. 1169/2011)32에 따라 예상되는 영양 강조 표시의 존재를 검증할 수 있었습니다.
| 영양 성분표 | 파스타 100g으로 | % RDI | |
| 에너지 | 1478.90 킬로 (348.74 kcal) | 17 | |
| 지질 | 1.06 ± 0.10 g | 2 | |
| 무엇으로 부터: | |||
| 포화 지방산 | 0.38 ± 0.01 그램 | 2 | |
| 탄수화물 | 72.59± 0.21 지 | 28 | |
| 파이버 | 3.84 ± 0.20 g | ||
| 단백질 | 10.29 ± 0.20 그램 | 21 | |
| 소금 | 0.22 ± 0.02 그램 | 9 | |
표 1: 영양 성분표. 계산으로 얻은 에너지 및 탄수화물의 화학 분석(n=3)과 권장 복용량 섭취량의 각 비율(n=3)을 기반으로 한 개발된 파스타의 영양 정보.
이러한 파스타 제형은 더 건강한 식단을 염두에 두고 있는 대상 소비자에게 어필하도록 설계되었으므로 제품 100g당 지방의 양은 가능한 한 적어야 합니다. 지방산 프로파일을 자세히 분석한 결과 포화 지방산 100g당 0.38g의 값이 나타났으며, 이는 저포화 지방 제품의 한계치보다 훨씬 낮아 이 파스타 생산의 초기 목표를 달성했습니다. 섬유질 함량과 관련하여 유럽 규정에 따라 이 파스타 제형을 섬유질 공급원으로 주장하는 것도 가능했습니다.
ICP-OES에 의해 결정되어 표 2에 제시된 미네랄 원소 특성 분석에서는 본 제품 100g에 존재하는 Na 약 219mg/100g의 값이 보고되어 있으므로 나트륨 함량이 낮은 제품(<0.12g/100g)인지 확인할 수 없습니다. 재료에 자연적으로 존재하는 높은 나트륨 함량으로 인해 이 제품은 과자에 소금을 첨가할 필요가 없을 수 있습니다.
표 2: 파스타 미네랄 성분 프로파일. 파란색 - 원소 함량이 높습니다. 빨간색 - 특정 요소의 소스(n = 3). 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
참조된 유럽 연합 규정 및 각 원소에 대한 RDI%에 따르면 이 제품은 K, P, Fe 함량이 높으며 Zn의 공급원이기도 함을 알 수 있습니다. Se, Mg, Ca가 소량으로 존재합니다.
파스타 수용 테스트에는 86명의 테스터가 사용되었으며, 그 중 63명은 여성, 23명은 18세 이상의 남성이었습니다. 수락 테스트는 표준에 규정된 대로 9점의 쾌락 척도를 기반으로 했습니다. 건강한 반죽은 "바다 맛"과 "시각적 외관"에 대해 각각 1에서 9까지의 쾌락 척도에서 5점과 6점을 받았습니다(그림 6).
그림 6: 관능 소비자 수용 테스트 결과 . (A) 시각적 외관, 색상, 질감, 냄새, 바다 맛 및 전반적인 맛에 대한 쾌락적 선택. (B) 전반적인 감상 및 구매 의도에 대한 쾌락적 선택. 척도 1-9, 여기서 1은 좋지 않은 평가이고 9는 매우 좋은 평가입니다(n = 86). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
파스타는 "바다의 맛"과 "시각적 외관"에 대해 각각 1에서 9까지의 쾌락 척도에서 5점과 6점을 받았습니다(그림 6A). 이 파스타는 질감 매개변수(이미 연구된 다른 제형을 고려)와 관련하여 이 척도에서 낮은 값을 얻었는데, 아마도 기본 성분이 쌀가루이기 때문일 것입니다. 그럼에도 불구하고 1에서 9까지의 척도로 값을 얻었으며 4에서 7까지의 범위는 일반 소비자의 좋은 수용을 반영합니다. 1에서 9까지의 쾌락 척도에서 파스타는 그림 6B와 같이 구매 의도에 대해 5, 전반적인 감상에 대해 6의 값을 가장 많이 응답했습니다. 시식자의 약 65%가 이 파스타에 대한 전반적인 평가에서 6점 이상의 응답을 선택한 것으로 나타났습니다. 안료가 함유된 요구르트의 색상 안정성을 -4°C에서 12일 동안 평가했으며 결과는 그림 7에 나와 있습니다.
그림 7: 요구르트의 색상 안정성. (왼쪽) 12일 동안 보관하는 동안 Gracilaria gracilis 색소가 함유된 요구르트와 (오른쪽) 요구르트를 대조합니다. a*, b* 및 L* 매개변수는 차원이 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
결과는 a* 및 b* 매개변수가 시간이 지남에 따라 안정적인 반면 L* 값은 더 높은 분산을 나타낸다는 것을 나타냅니다. 가벼움은 8일 보관 후 더 높은 값을 보여주었습니다. 가벼움 파라미터에서 약간의 차이가 발견되어 샘플이 시간이 지남에 따라 더 가벼워졌음을 나타내지만 적색도(a*) 및 파란색(b*) 파라미터는 양호한 안정성을 보였습니다. 요구르트에 추출물을 함유한 결과, 12일 보관 후 ΔE가 7.01 ± 2.36으로 우수한 색상 유지력을 보였습니다. 요거트의 관능 평가와 관련하여, 13명의 패널리스트 중 9명이 삼각형 테스트에서 올바른 샘플을 정확하게 식별했으며, 이는 이러한 차이를 허용하는 요구르트 간에 차이가 있음을 시사합니다. 반쯤 훈련된 패널에 대한 쾌락 테스트는 제품에 대한 좋은 수용도를 보여주었으며 이는 7점 이상의 점수에 반영되었습니다(그림 8). 테스트 중인 세 가지 속성 중 하나에 대한 점수 모드는 9였으며 평균 점수가 8 이상이었습니다. 가장 좋은 평가는 색상에 이루어졌으며, 이는 패널의 탁월한 수용을 반영하여 결과를 드러냈습니다.
그림 8: Gracilaria gracilis 색소를 사용한 요구르트의 쾌락적 감각 평가 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
액체 배지에서의 항균 활성 시험은 액체 배지에 현탁된 미생물에 대한 항균 물질의 효과를 평가하는 데 사용되며 일반적으로 성장을 억제하거나 미생물을 죽이는 물질의 능력을 결정하기 위해 수행됩니다35,36,37,38. 이들은 항균제에 대한 미생물의 민감도를 평가하는데 사용되며, 시험관 또는 미세적정판에서 수행되며, 여기서 항균 물질의 상이한 농도가 표적 미생물22의 표준화된 현탁액에 대해 시험된다. 항균 활성은 적절한 배양 기간 후 배양 배지에서 미생물 성장 또는 탁도의 유무를 측정하여 평가됩니다.
이러한 테스트를 수행하는 방법에는 육수 희석법, 한천 확산법(예: 디스크 확산 검사) 및 가장 많이 사용되는 육수 미세희석법과 같은 여러 기술과 방법이 있으며,이는 38. 이러한 방법에서 가장 중요한 사항 중 일부는 접종물의 적절한 준비, 배양 배지의 선택, 사용된 항균제의 품질, 기술의 표준화 및 효과적인 오염 제어를 포함합니다. 미생물의 표준화된 현탁액인 접종물은 결과의 정확성을 보장하기 위해 올바르게 준비되어야 합니다. 여기에는 적절한 미생물 배양 선택, 순수 균주의 적절한 배양, 세포 농도 조정 및 적절한 광학 밀도 또는 세포 농도를 얻기 위한 현탁액의 표준화가 포함됩니다.
사용되는 배양 배지는 테스트 중인 미생물에 이상적인 성장 조건을 제공할 수 있도록 신중하게 선택해야 합니다. 화학 성분, pH 및 기타 요인이 테스트 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 배양 배지 준비에 대한 제조업체의 권장 사항을 따르는 것이 중요합니다. 방제에 사용되는 항균제의 품질은 기본이며, 이러한 항균제가 순수하고 유통 기한 내에 있으며 올바르게 보관되는지 확인하는 것이 중요합니다. 라벨링 및 만료 날짜는 항상 제조업체의 지침에 따라 참조해야 합니다. 기술의 표준화는 결과의 정확성을 보장하는 데에도 중요합니다. 여기에는 배양 배지에 테스트된 농도를 추가하는 것과 절차 전반에 걸쳐 무균 상태를 유지하는 것이 포함됩니다. 또한 테스트 중 미생물의 교차 오염은 잘못된 또는 신뢰할 수 없는 결과를 초래할 수 있습니다. 접종물의 조작에서 튜브 또는 플레이트의 배양에 이르기까지 절차 전반에 걸쳐 엄격한 무균 관행을 따르는 것이 중요합니다. 깨끗한 조리대의 사용, 적절한 피펫팅 기술 및 적절한 재료 폐기는 오염을 방지하기 위한 중요한 조치입니다.
세부 사항에 주의를 기울이고 확립된 프로토콜 및 지침을 엄격하게 준수하는 것은 액체 매체에서 항균 활성 테스트에서 오류를 최소화하고 결과의 신뢰성을 보장하는 데 매우 중요합니다. 또한, 항균 활성 시험에는 고려해야 할 몇 가지 한계가 있다37.
pH, 온도, 혈액 성분의 존재 및 면역 체계와의 상호 작용과 같은 요인은 이러한 테스트에서 고려되지 않으므로 살아있는 유기체에서 항균제의 효과를 예측하는 능력이 제한될 수 있습니다. 또한 검사는 미생물 성장을 억제하거나 미생물을 죽이는 항균 물질의 능력을 측정하고 항균제의 작용 메커니즘 또는 특정 미생물에 대한 선택성에 대한 자세한 정보를 제공하지 않습니다. 저항을 감지하는 데는 한계가 있는데, 사용된 방법은 시간 경과에 따른 저항의 발달을 감지하거나 예측할 수 없기 때문입니다. 일부 미생물은 항균제에 장기간 노출되면 내성 기전을 발달시킬 수 있으며, 이러한 변화는 이러한 검사를 통해 쉽게 검출되지 않을 수 있습니다. 액체 배지에서의 항균 활성의 시험은 일반적으로 생물막의 존재 또는 숙주의 면역 반응과 같은 항균제의 효과에 영향을 미칠 수 있는 다른 숙주 인자를 고려하지 않는다.
이러한 한계를 고려하고 액체 배지에서의 항균 활성에 대한 시험을 생체 내 연구, 생물막 모델 등과 같은 다른 방법 및 접근법으로 보완하는 것이 중요하다39. 생리 활성 거대 조류 화합물에 대한 생물 탐사 분야에서 항균 활성 테스트는 조류 추출물 또는 분리 화합물의 항균 가능성을 평가하는 데 사용할 수 있으며, 의약품, 화장품, 식품 또는 농산물 생산과 같은 분야에서 응용될 수 있는 특정 미생물 병원체에 대한 항균 활성을 가진 물질을 식별할 수 있습니다(40).
항산화 활성 테스트는 화합물 또는 추출물이 활성산소를 중화하거나 산화 스트레스를 줄이는 능력을 평가하는 데 사용되는 방법입니다. 이러한 검사는 식품과 조류와 같은 천연 제품 모두에서 항산화 연구에 널리 사용됩니다. 항산화 활성을 평가하는 방법에는 여러 가지가 있으며 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나는 자유 라디칼 흡수 능력입니다. 이 테스트에서는 안정적인 자유 라디칼인 2,2-디페닐-1-피크릴히드라질(DPPH)을 사용하여 전자를 기증하고 자유 라디칼을 중화하는 화합물의 능력을 평가합니다. 항산화 활성은 항산화 화합물이 자유 라디칼에 전자를 기증할 때 발생하는 DPPH의 보라색을 줄여 측정됩니다. 다른 방법으로는 산소 라디칼 흡수 능력(ORAC), 철 환원 능력(FRAP) 또는 자유 라디칼 환원 능력(ABTS)이 있습니다(41).
반면에 총 폴리페놀(QTP)의 정량화는 항산화 활성을 측정하는 직접적인 방법은 아니지만 여러 간섭 물질이 결과에 영향을 미칠 수 있지만 샘플의 폴리페놀 총 농도를 측정할 수 있습니다. 많은 폴리페놀이 항산화 특성을 갖는 것으로 알려져 있지만, 화합물의 항산화 활성은 화학 구조, 농도, 자유 라디칼을 기증하거나 포획하는 능력, 다른 세포 구성 요소와의 상호 작용과 같은 여러 요인과 관련이 있습니다42. 총 폴리페놀의 단순 정량화는 샘플의 항산화 활성을 평가할 수 없습니다. 그러나 많은 폴리페놀이 항산화 특성을 가지고 있기 때문에 샘플에 폴리페놀의 존재는 항산화 활성의 더 높은 가능성과 관련이 있을 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서 QTP는 시료 내 폴리페놀의 존재에 대한 예비 지표 역할을 할 수 있지만, 항산화 활성을 확인하려면 항산화 활성 분석이 필요합니다. 폴리페놀은 자연에 널리 분포하는 화합물의 일종으로 식품, 식물, 과일, 채소 및 조류에서 발견됩니다. 총 폴리페놀의 정량화에는 여러 가지 방법이 있으며 Folin-Ciocalteu 방법이 가장 많이 사용되는 방법 중 하나입니다. QTP는 폴리페놀의 농도에 대한 일반적인 측정값을 제공하지만 샘플에 존재하는 개별 폴리페놀 화합물을 지정하지는 않습니다. 따라서 정량적 방법이지만 정성적 방법은 아닙니다. 또한 폴리페놀마다 항산화 능력과 생물학적 활성이 다르기 때문에 QTP는 존재하는 폴리페놀의 특정 기능적 특성에 대한 자세한 정보를 제공하지 않는다는 점을 고려하는 것이 중요합니다.
각 방법에는 장점과 한계가 있으며, 주어진 테스트의 선택은 연구 중인 화합물의 특성과 분석 목적에 따라 다릅니다. 신뢰할 수 있고 비교 가능한 결과를 보장하기 위해 각 방법의 특정 지침을 따르는 것이 중요합니다. 항산화 용량을 결정할 때 일반적으로 중요한 단계 중 일부는 먼저 샘플 준비를 포함합니다. 샘플을 올바르게 준비하여 적절한 농도를 얻고 오염을 방지하는 것이 중요합니다. 여기에는 화합물 또는 추출물의 정확한 계량과 적절한 용매에 용해시키는 작업이 포함됩니다. 또한 준비, 보관 및 취급 과정에서 화합물 및 추출물의 안정성을 고려하는 것이 중요합니다. 항산화 활성 테스트에 사용되는 모든 시약은 결과의 재현성을 보장하기 위해 적절하게 준비되고 표준화되어야 합니다. 여기에는 갈산 표준물질의 올바른 준비와 부피의 정확성이 포함됩니다. 반응 시간은 항산화 테스트에서 정확한 결과를 얻는 데 중요한 측면입니다. 항산화 화합물과 자유 라디칼 사이의 완전한 반응을 보장하기 위해 배양 시간을 최적화해야 합니다. 시간이 부족하면 항산화 활성을 과소평가할 수 있으며, 시간이 부족하면 화합물이 분해되거나 2차 반응의 간섭을 받을 수 있습니다. 또한 시험 중 온도는 정확하고 일관되게 제어되어야 합니다. 온도는 화학 반응 속도에 영향을 미치며 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 특정 방법에서 권장하는 온도 조건을 따르고 절차 전반에 걸쳐 온도 안정성을 보장하는 것이 중요합니다. 항산화 테스트 결과를 검증하기 위해서는 적절한 대조군을 포함하는 것이 필수적입니다. 여기에는 양성 대조군(항산화 활성이 있는 것으로 알려진 화합물)과 음성 대조군(항산화 활성이 없는 샘플)이 포함될 수 있습니다. 컨트롤은 결과 해석을 위한 비교의 기초를 제공하고 얻은 데이터의 정확성을 보장하는 데 도움이 됩니다. 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 반복에 대한 항산화 활성 테스트를 수행하고 실험을 여러 번 반복하여 데이터의 유의성을 높이고 보다 신뢰할 수 있고 확실한 결과를 얻는 것이 좋습니다.
항산화 활성 테스트 방법에는 결과를 해석할 때 고려해야 할 몇 가지 제한 사항이 있습니다., 즉, 액체 배지에서, 생물학적 시스템의 복잡성과 다른 화합물 간의 상호 작용, 발생할 수 있는 광범위한 항산화 반응, 세포 대사 및 항산화 활성에 영향을 미칠 수 있는 환경 요인을 완전히 포착하지 못할 수 있다는 사실. 따라서 다른 테스트를 사용해야 합니다. 또한 건강상의 이점과 직접적인 상관 관계가 없다는 것을 알고 있어야 합니다. 항산화 활성은 종종 건강상의 이점과 관련이 있지만 생체 이용률, 신진대사 및 다른 생물학적 시스템과의 상호 작용과 같은 다른 많은 요인으로 인해 항상 살아있는 유기체의 건강상의 이점으로 직접 해석되는 것은 아닙니다.
항산화 활성 테스트는 화합물 및 추출물의 항산화 잠재력에 대한 초기 평가에 유용한 도구이지만 생물학적 효과나 건강상의 이점에 대한 결정적인 지표로 간주되어서는 안 된다는 점을 명심하는 것이 중요합니다. 항산화제가 신체에 미치는 영향을 완전히 이해하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.
액체 배지에서 항산화 활성을 테스트하는 방법은 연구에 널리 사용되며 장단점이 있지만 대안과 비교할 때 이러한 방법은 실용성, 속도, 비용 및 구현 용이성 측면에서 좋은 것으로 간주될 수 있습니다. 주요 장점 중 하나는 절차의 단순성과 속도, 초기 연구, 화합물 스크리닝 및 대규모 연구에 대한 적합성입니다. 이러한 방법은 비교적 빠르게 수행할 수 있고 더 저렴한 방법으로 단기간에 결과를 제공할 수 있으며 다른 방법에 비해 덜 전문화된 장비가 필요합니다.
조류는 항산화제를 포함한 생리 활성 화합물을 생산하는 능력으로 알려져 있으며, 이는 유익한 건강 특성을 가질 수 있다43. 조류 추출물은 조류의 다른 부분으로부터 제조될 수 있으며 물, 에탄올, 메탄올 또는 아세톤과 같은 다른 용매를 사용하여 얻을 수 있습니다. 조류 추출물의 항산화 활성은 조류의 종, 추출 방법 및 존재하는 생리 활성 화합물의 농도와 같은 여러 요인에 따라 달라질 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 반복실험에 대해 항산화 활성 테스트를 수행하고 보다 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해 적절한 대조군과 비교하는 것이 좋습니다. 이러한 방법은 추가 연구를 위해 항산화 잠재력을 가진 조류 추출물의 선별 및 선택에 초기 도구로 사용할 수 있습니다.
MTT 분석은 인간 및 동물용 물질의 시험관 내 세포독성 효과의 예비 평가에 널리 사용되는 기술입니다. 그러나, 세포독성을 시험하는 데 가장 많이 사용되는 방법임에도 불구하고, MTT에서 포르마잔 결정으로의 전환은 대사율 및 미토콘드리아의 수와 같은 수많은 요인에 의해 영향을 받으며, 부착성 세포 표적에만 적용할 수 있다14. 여기에 설명된 프로토콜의 주요 중요 단계는 세포 배양 오염의 최종 발생, 바람직하지 않은 HaCaT 세포의 성장 및 낮은 세포 밀도 비율과 관련이 있습니다. 젖산 탈수소효소(LDH), 아데노신 삼인산(ATP) 및 세포 독성을 측정하기 위한 콜로니 형성 분석과 같은 다른 방법이 있습니다. 그러나 그들 모두는 장점과 제약이 있습니다. Ghasemi et al. (2021)44 는 전립선암 세포주(PC-3)에 대한 MTT 분석 측정에 대한 여러 변수의 효과를 평가했습니다. 세포 파종 밀도, MTT의 농도, MTT 첨가 후 배양 시간, 혈청 결핍, 세포 배양 배지의 조성, 방출된 세포 내 내용물, 세포 외 공간으로의 포르마잔 압출과 같은 요인을 분석했습니다. 이 연구에서 분석을 적용하는 방법에 대한 유용한 권장 사항과 분석의 유용성이 강력한 도구이지만 마찬가지로 한계가 있는 부분에 대한 관점이 이 저자들은 설명했습니다. 그럼에도 불구하고 MTT 분석은 치료, 식품, 사료, 농업 및 환경 분야에서 잠재적으로 적용할 수 있는 많은 물질의 예비 세포 독성 평가로 적용할 수 있는 빠르고 민감하며 쉬운 방법론입니다. 특히, 여기에서 수행된 MTT 분석은 분석된 농도에서 G. gracilis 의 에탄올 및 수성 추출물이 각질세포 생존력에 영향을 미치지 않았으며 인간 피부 사용에 완전히 안전한지 확인하기 위해 생체 내 분석을 진행할 수 있음을 입증했습니다.
식품에 해양 자원을 사용하는 것은 영양가가 추가된 제품을 얻을 수 있을 뿐만 아니라 더 깨끗한 라벨 제품을 찾을 수 있는 잠재력을 다시 한 번 보여주었습니다. 전체 G. gracilis (파스타) 또는 추출물(식용 색소)의 첨가는 시장 잠재력을 보여주며, 그 적용은 기업이 시장에서 두각을 나타내고 소비자의 영양 요구를 충족하며 시장 동향을 따르기 위한 전략 중 하나가 될 수 있습니다.
파스타 제형에 해초를 첨가했을 때, 처음에는 구조가 변경되어 원하는 반죽 모양을 얻을 수 없다는 것이 밝혀졌습니다. 파스타의 질감을 유지하기 위해 수량을 조절하고 이전에 예상하지 못했던 다른 재료를 추가해야 하는 과제가 있었습니다. 각 재료의 적절한 양 외에도 압출 방법은 파스타 개발 전반에 걸쳐 적용되었습니다. 이러한 어려움 외에도 신제품 개발은 세 가지 기본 원칙을 기반으로 합니다: 제품은 감각적으로 매력적이어야 합니다(질감, 맛, 냄새). 제품에 영양가가 추가되어야 합니다. 그리고 지속 가능한 재료와 방법론을 최대한 활용해야 합니다. 이러한 의미에서 또 다른 주요 과제는 가장 매력적인 제형을 얻기 위해 감각 패널을 사용하는 것입니다. 파스타에 대해 수행된 대부분의 물리화학적 분석은 이미 식품 매트릭스에 최적화되어 있었습니다. 그러나 이 작업에서는 모든 분석 방법에 효율적으로 적용할 수 있도록 샘플 준비를 최적화했습니다.
착색제로서 G. gracilis 안료의 사용과 관련하여, 이러한 유형의 분자45의 열 민감성 때문에 냉장 제품이 선택되었다. 요구르트 제조에는 열처리가 필요하기 때문에 안료가 최종 제품에 첨가되었습니다. 요구르트에 색소를 혼합하면 색소가 없는 대조군보다 약간 더 많은 액체가 생성됩니다. 사실, 삼각형 테스트가 끝날 무렵 일부 패널리스트는 샘플 간의 유일한 차이점은 질감이라고 언급했습니다. 삼각형 테스트의 주요 목적은 색소가 있는 요구르트와 없는 요구르트 사이에 눈에 띄는 차이가 있는지, 특히 맛과 냄새의 차이가 있는지 확인하는 것이었기 때문에 해조류 추출물은 식품에 불쾌한 맛/냄새를 부여할 수 있기 때문에 좋은 결과입니다. 이것은 소규모 반 훈련 패널을 포함하는 예비 연구였습니다. 추가 연구에서는 보다 신뢰할 수 있는 시장 결과를 얻기 위해 더 많은 수의 시음자를 고려해야 합니다. 요구르트의 색소 안정성 평가와 관련하여 추가 연구에는 pH, 수분 활성도(aw) 및 질감과 같은 시간 경과에 따른 색소가 포함된 요구르트의 다른 물리화학적 특성 평가가 포함될 수 있습니다. 시간 경과에 따른 감각 평가도 바람직합니다.
결론적으로, 여기에 설명된 프로토콜은 제약, 피부화장품 및 식품 산업에서 잠재적인 응용 분야를 가진 새로운 제품을 개발하기 위한 성분 공급원으로서 붉은 해초 G. gracilis 의 잠재력을 강조합니다. 또한, 추출 후 잔류 바이오매스는 식물 성장 생물 자극제, 토양 농축, 어류 사료 또는 수질 정화 목적으로 바이오 숯 및/또는 기능성 탄소를 얻기 위한 공급 원료로 적용되는 귀중한 물질로 남아 있습니다. 여기에 설명된 바이오리파이너리 접근 방식은 다른 해조류 종에도 적용되어 청색 순환 경제와 환경 지속 가능성을 촉진할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 MARE-해양 및 환경 과학 센터(UIDP/04292/2020 및 UIDB/04292/2020) 및 Associate Laboratory ARNET(LA/P/0069/2020)에 부여된 전략 프로젝트를 통해 포르투갈 과학 기술 재단(FCT)의 지원을 받았습니다. FCT는 또한 Marta V. Freitas(UI/BD/150957/2021)와 Tatiana Pereira(2021. 07791. BD)입니다. 이 작업은 또한 COMPETE 2020 - 경쟁력 및 국제화 운영 프로그램을 통해 포르투갈 2020 프로그램에 따라 ERDF(유럽 지역 개발 기금)가 공동 자금을 지원하는 프로젝트 HP4A - HEALTHY PASTA FOR ALL(공동 프로모션 번호 039952)의 재정적 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute Ethanol | Aga, Portugal | 64-17-5 | |
| Ammonium Chloride | PanReac | 12125-02-9 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| Analytical scale balance | Sartorius, TE124S | 22105307 | |
| Bacillus subtilis subsp. spizizenii | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 347 | |
| Biotin | Panreac AppliChem | 58-85-5 | |
| Centrifuge | Eppendorf, 5810R | 5811JH490481 | |
| Chloramphenicol | PanReac | 56-75-7 | |
| CO2 Chamber | Memmert | N/A | |
| Cool White Fluorescent Lamps | OSRAM Lumilux Skywhite | N/A | |
| Densitometer McFarland | Grant Instruments | N/A | |
| DMEM medium | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | |
| DPPH | Sigma, Steinheim, Germany | 1898-66-4 | |
| Escherichia coli (DSM 5922) | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM5922 | |
| Ethanol 96% | AGA-Portugal | 64-17-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA) | J.T.Baker | 6381-92-6 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Filter Paper (Whatman No.1) | Whatman | WHA1001320 | |
| Flasks | VWR International, Alcabideche, Portugal | N/A | |
| Folin-Ciocalteu | VWR Chemicals | 31360.264 | |
| Gallic Acid | Merck | 149-91-7 | |
| Germanium (IV) Oxide, 99.999% | AlfaAesar | 1310-53-8 | |
| HaCaT cells – 300493 | CLS-Cell Lines Services, Germany | 300493 | |
| Hot Plate Magnetic Stirrer | IKA, C-MAG HS7 | 06.090564 | |
| Iron Sulfate | VWR Chemicals | 10124-49-9 | |
| Laminar flow hood | TelStar, Portugal | 526013 | |
| LB Medium | VWR Chemicals | J106 | |
| Listonella anguillarum | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 21597 | |
| Manganese Chloride | VWR Chemicals | 7773.01.5 | |
| Micropipettes | Eppendorf, Portugal | N/A | |
| Microplates | VWR International, Alcabideche, Portugal | 10861-666 | |
| Microplates | Greiner | 738-0168 | |
| Microplates (sterile) | Fisher Scientific | 10022403 | |
| Microplate reader | Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA | 1611151E | |
| MTT | Sigma-Aldrich | 289-93-1 | |
| Muller-Hinton Broth (MHB) | VWR Chemicals | 90004-658 | |
| Oven | Binder, FD115 | 12-04490 | |
| Oven | Binder, BD115 | 04-62615 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1406-05-9 | |
| pH meter Inolab | VWR International, Alcabideche, Portugal | 15212099 | |
| Pippete tips | Eppendorf, Portugal | 5412307 | |
| Pyrex Bottles Media Storage | VWR International, Alcabideche, Portugal | 16157-169 | |
| Rotary Evaporator | Heidolph, Laborota 4000 | 80409287 | |
| Rotavapor | IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal | 07.524254 | |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Chem-Lab | 497-19-8 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Normax Chem | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Riedel-de Haën | 7558-79-4 | |
| SpectraMagic NX | Konica Minolta, Japan | color data analysis software | |
| Spectrophotometer | Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA | 5A4T092004 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | 57-92-1 | |
| Thiamine | Panreac AppliChem | 59-43-8 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tryptic Soy Agar (TSA) | VWR Chemicals | ICNA091010617 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | VWR Chemicals | 22091 | |
| Ultrapure water | Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany | F5HA17360B | |
| Vacuum pump | Buchi, Switzerland | FIS05-402-103 | |
| Vitamin B12 | Merck | 68-19-9 |
References
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