Summary
Denne protokol giver en trinvis procedure til hurtig og samtidig optisk clearing, muti-round mærkning og 3D volumetrisk rekonstruktion af snesevis af postmortem menneskelige hjernesektioner ved at kombinere (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) kort vævstransformationsteknik med lysarkfluorescensmikroskopi billeddannelse i en rutinemæssig high-throughput protokol.
Abstract
På trods af de mange rydningsteknikker, der opstod i det sidste årti, er behandling af menneskelige hjerner efter slagtning fortsat en udfordrende opgave på grund af dens dimensioner og kompleksitet, hvilket gør billeddannelse med mikrometeropløsning særlig vanskelig. Dette papir præsenterer en protokol til at udføre rekonstruktionen af volumetriske dele af den menneskelige hjerne ved samtidig at behandle snesevis af sektioner med vævstransformationsprotokollen SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]), som muliggør clearing, mærkning og sekventiel billeddannelse af prøverne med lysarkfluorescensmikroskopi (LSFM). SHORT giver hurtig vævsrensning og homogen multimærkning af tykke skiver med flere neuronale markører, hvilket muliggør identifikation af forskellige neuronale subpopulationer i både hvid og grå substans. Efter rydning afbildes skiverne via LSFM med mikrometeropløsning og i flere kanaler samtidigt for en hurtig 3D-rekonstruktion. Ved at kombinere SHORT med LSFM-analyse inden for en rutinemæssigt høj gennemstrømningsprotokol er det muligt at opnå 3D-cytoarkitekturrekonstruktion af store volumetriske områder ved høj opløsning på kort tid, hvilket muliggør omfattende strukturel karakterisering af den menneskelige hjerne.
Introduction
Analyse af 3D-molekylær organisation og cytoarkitektur af store mængder af den menneskelige hjerne kræver optisk gennemsigtighed af prøver, opnået gennem protokoller med omfattende behandlingstid. Optiske clearingteknikker blev udviklet for at minimere heterogenitet i brydningsindeks (RI) i vævene og derved reducere lysspredning og øge lysindtrængningsdybden for billeddannelse med høj opløsning 1,2,3,4,5. Nuværende fremskridt inden for rydning og dybvævsmærkningsmetoder muliggør volumetrisk billeddannelse af intakte gnaverorganer og embryoner ved at udnytte banebrydende mikroskopiteknikker 6,7,8,9,10,11,12.
Imidlertid udgør volumetrisk 3D-rekonstruktion af store områder af den menneskelige hjerne efter slagtning stadig en udfordrende opgave sammenlignet med modelorganismer. Den komplekse biologiske sammensætning og de variable postmortemfikserings- og opbevaringsbetingelser kan kompromittere vævsrensningseffektiviteten, antistofpenetrationsdybden og epitopgenkendelsen 13,14,15,16,17,18,19. Desuden kræves mekanisk vævssektionering og efterfølgende rydning og mærkning af hver skive stadig for at opnå en effektiv rydning og ensartet mærkning af store menneskelige hjerneområder, hvilket resulterer i lange behandlingstider og behovet for sofistikeret brugerdefineret udstyr sammenlignet med modelorganismer 15,20,21,22.
SWITCH - H2O2 - antigen Retrieval -TDE (SHORT) vævstransformationsteknik er udviklet specielt til at analysere store mængder af den menneskelige hjerne18,23. Denne metode anvender vævets strukturelle bevarelse af SWITCH-protokollen11 og høje koncentrationer af peroxidhydrogen til at reducere vævets autofluorescens i kombination med epitoprestaurering. SHORT tillader ensartet farvning af menneskelige hjerneskiver med markører for forskellige neuronale undertyper, gliaceller, vaskulatur og myelinerede fibre18,24. Dens resultater er kompatible med analysen af både lav- og højdensitetsproteiner. De resulterende høje gennemsigtighedsniveauer og ensartet mærkning muliggør volumetrisk rekonstruktion af tykke skiver med fluorescensmikroskopi, især til hurtig erhvervelse lysarkapparater kan anvendes 18,24,25,26,27.
I dette arbejde beskriver vi, hvordan SHORT-vævstransformationsteknikken kan bruges til samtidig rydning og multi-round mærkning af snesevis af formalinfikserede menneskelige hjernesektioner. Fire forskellige fluorescerende markører kan bruges sammen, hvilket fører til identifikation af forskellige cellulære underpopulationer. Efter rydning kan volumetrisk billeddannelse med høj opløsning udføres med fluorescensmikroskopi. Her brugte vi en specialfremstillet omvendt LSFM 18,24,25,26,27, som muliggør hurtig optisk sektionering af prøven og hurtig erhvervelse af flere kanaler parallelt. Med denne rutinemæssigt høje gennemstrømningsprotokol er det muligt at opnå en omfattende cellulær og strukturel karakterisering med en subcellulær opløsning af store områder af den menneskelige hjerne, som allerede demonstreret i kortlægningen af et helt Brocas område23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Formalinfikserede humane vævsprøver blev leveret af Institut for Neuropatologi ved Massachusetts General Hospital (MGH) Autopsy Service (Boston, USA). Skriftligt samtykke blev indhentet fra raske deltagere før døden efter IRB-godkendte vævsindsamlingsprotokoller fra Partners Institutional Biosafety Committee (PIBC, protokol 2003P001937). Autorisationsdokumenterne opbevares hos MGH Autopsy Services i Boston, MA, USA, og er tilgængelige efter anmodning.
1. Indlejring af agarose og prøveskæring
- Forbered en 4% w / v agaroseopløsning i 1x fosfatbufret saltvand (PBS, pH 7,4) i et bægerglas og indlejr vævsblokken indeni. Vent, indtil den når stuetemperatur (RT), og opbevar derefter ved 4 °C i 24 timer.
- For at opnå sektioner med høj præcision limes prøven på vibratumets prøveskive og fylder bakken med kold 1x PBS (pH 7,4). Juster vibratomparametrene såsom frekvens, amplitude og hastighed i henhold til den type væv, der skal skæres i skiver (anvendte værdier: frekvens = 5 (50 Hz); amplitude = 0,4; hastighed = 3 (0,15 mm / s).
BEMÆRK: Forskellige vibraatomer skal anvendes afhængigt af prøvevolumenet. Til prøver med et maksimalt volumen på 70 x 40 x 15 mm kan der anvendes et vibratomt (f.eks. Leica VT1000 S). til større prøver er det muligt at anvende et kompresstomt (f.eks. VF-900-0Z Microtome18) eller et specialfremstillet apparat21. Her præsenterer vi skiver skåret med en tykkelse på enten 400 μm eller 500 μm. - Efter skæring anbringes alle skiverne i en konserveringsopløsning bestående af 1x PBS (pH 7,4) med 0,01 % w/v natriumazid (NaN3) og opbevares ved 4 °C.
BEMÆRK: Før indlejring ventes, indtil agaroseopløsningen når 37 °C. En højere temperatur kan beskadige prøven. Det anbefales ikke at efterlade prøverne i PFA i mere end 48 timer, da langvarig fiksering kan forstyrre mærkningsproceduren ved at beskadige antigener og øge vævets autofluorescens. Til langtidsopbevaring af humant væv anvendes PBS medNaN3 til at forhindre mikrobiel kontaminering. På grund af toksiciteten af NaN3 fremstilles konserveringsopløsningen under en kemisk hætte.
2. Vævsfiksering
BEMÆRK: Alle opløsninger, der anvendes i den følgende protokol, fremstilles i store mængder, tilstrækkelige til at behandle alle skiverne i den samme vævsblok og minimere den tekniske variabilitet og reducere tiden for individuelle trin.
- Klargør afbryderopløsningen med 50 % v/v 1x PBS pH 3, 25 % v/v 0,1 M saltsyre (HCI), 25 % v/v 0,1 M kaliumhydrogenphthalat (KHP) og frisk 4 % v/v glutaraldehyd. Alle prøverne anbringes i skåle med skruelåg (70 x 23 mm), og de inkuberes med Switch-off-opløsningen med forsigtig omrystning ved 4 °C i 1 dag, idet de beskyttes mod lys med aluminiumsfolie.
- Tænd/sluk-opløsningen fremstilles med 1x PBS (pH 7,4) og frisk 1 % v/v glutaraldehyd. Alle prøverne anbringes i nye skåle, og de inkuberes med Switch-on-opløsningen under forsigtig omrystning ved 4 °C i 1 dag, idet de beskyttes mod lys med aluminiumsfolie.
BEMÆRK: På grund af glutaraldehyds høje toksicitet og lysfølsomhed skal både Switch-off og Switch-on opløsninger altid tilberedes friske og opbevares under kemikaliehætten på is. Fyld altid fadet med 20 ml af hver opløsning og forsegl det med parafilm.
3. Inaktivering og clearing
BEMÆRK: Reaktivt glutaraldehyd i prøverne skal inaktiveres ved inkubation med en inaktiveringsopløsning bestående af 1x PBS pH 7,4, 4% w/v acetamid, 4% w/v glycin, pH 9,0. Opløsningen kan opbevares ved 4 °C i op til 3 måneder. For at fjerne lipider og gøre vævet gennemsigtigt bruger vi clearingopløsningen bestående af 200 mM natriumdodecylsulfat (SDS), 20 mM natriumsulfit (Na2SO3) og 20 mM borsyre (H3BO3), pH 9,0. Opløsningen skal opbevares ved RT, da SDS udfældes ved 4 °C. Alle følgende trin udføres i rør fyldt med opløsningen.
- Flyt prøverne fra skålene til rørene og vask i 3 x 2 timer med 1x PBS pH 7,4 ved RT under forsigtig omrystning.
BEMÆRK: For trin 3.1 er det nødvendigt at arbejde under den kemiske hætte på grund af glutaraldehydtoksiciteten. Acetamid, SDS og borsyre er også giftige reagenser, og de skal håndteres under en kemisk hætte. Fyld altid røret med 50 ml af hver opløsning. - Prøverne inkuberes i inaktiveringsopløsning ved 37 °C i vandbad natten over (o/n).
- Vask i 3 x 2 timer i 1x PBS pH 7,4 ved RT ved let omrystning.
- Prøverne inkuberes i clearingopløsning ved 55 °C i vandbad i 3-7 dage. Skift opløsningen hver 2. dag (tabel 1).
4. Immunmærkning
BEMÆRK: Før mærkningstrinnet er det nødvendigt at fjerne det resterende SDS, reducere autofluorescensen og afmaskere epitoperne med en antigenhentningsopløsning bestående af 10 mM Tris-base, 1 mM EDTA og 0,05% v / v Tween 20, pH 9. Opløsningens pH-værdi på 9 er optimeret til en effektiv hentningsproces; Tris-base fungerer som et buffermiddel for at opretholde et stabilt pH-miljø; EDTA, som er et chelateringsmiddel, forbedrer antigenets tilgængelighed. Det ikke-ioniske vaskemiddel Tween 20 hjælper med at forbedre vævets permeabilitet. Denne opløsning kan opbevares ved 4 °C. Det er vigtigt at bemærke, at hydrogenperoxid kombineret med antigenhentningstrinnet har en synergistisk virkning ved at reducere autofluorescenssignalet ved at nedbryde og/eller ændre de endogene fluoroforer, der er ansvarlige for ikke-specifikt baggrundssignal (såsom lipofuscin).
- Der fremstilles 1x PBS med 0,1 % v/v Triton X-100 (PBST), forvarmes til 37 °C, og prøverne vaskes 3 x 3 timer i løbet af dagen under forsigtig omrystning ved 37 °C i inkubatoren. Lad den sidste vask stå o/n.
BEMÆRK: Opbevar PBST-stamopløsningen ved 4 °C. Det er afgørende at fjerne SDS fra vævet, da det kan danne uopløselige bundfald ved lave temperaturer, der kan forstyrre efterfølgende erhvervelsesprocesser. - Dagen efter tilsættes 10 ml 30% v/v hydrogenperoxid (H2O2) til hver prøve og omrystes forsigtigt ved RT i 45 minutter.
- Vask 3 x 10 min med 1x PBS (pH 7,4) med let omrystning ved RT.
- Antigenudtagningsopløsningen forvarmes ved 95 °C i et vandbad; Prøverne overføres til den opvarmede opløsning og henstår ved 95 °C i 10 minutter.
- Lad prøverne køle ned til RT i 40 minutter under forsigtig omrystning.
- Vask 3 x 5 min med deioniseret vand i let omrystning.
- Prøverne afbalanceres i PBS ved 4 °C i 15 minutter.
- Forbered frisk antistofopløsning fremstillet af PBST med 0,01% w/vNaN3 (se bemærkningen for trin 1.3) og tilsæt primære antistoffer. Prøverne inkuberes med opløsningen i skåle med skruelåg ved 37 °C i n dage (1-7) i en inkubator med let omrystning og beskyttelse mod lys (tabel 2).
BEMÆRK: Inkubationstiden er størrelses- og tykafhængig (tabel 1 og tabel 2). - Efter n dage flyttes prøverne til reagensglas og vaskes 3 x 2 timer med forvarmet PBST ved 37 °C med let omrystning i inkubatoren.
- Der tilsættes sekundære antistoffer i PBST med 0,01 % w/vNaN3 , og prøverne inkuberes i nye skåle med skruelåg ved 37 °C i n dage (1-6) i en inkubator med let omrystning og beskyttet mod lys (tabel 1 og tabel 2).
- Efter n dage overføres prøverne til reagensglas og vaskes 3 x 3 timer i løbet af dagen med forvarmet PBST ved 37 °C i en blid rysteinkubator. Lad den sidste vask stå o/n.
BEMÆRK: Da Triton X-100 og Tween 20 er tyktflydende, pipetteres langsomt for at lade spidsen fylde. Fyld altid røret med 50 ml af hver opløsning. Brug 10 ml antistofopløsninger til hver prøve og forsegl skålen med parafilm for at forhindre fordampning af opløsningen. Da antistofopløsningerne indeholderNaN3, kan de opbevares ved 4 °C og genbruges til mærkning af nye prøver inden for 2 uger.
5. Matchning af brydningsindeks
BEMÆRK: For at opnå et højt niveau af gennemsigtighed er det nødvendigt at homogenisere vævsbrydningsindekset. Her bruger vi 2,2'-thiodiethanol (TDE) fortyndet i 1x PBS. TDE-løsninger skal opbevares hos RT.
- Overfør prøverne til nye retter, tilsæt 30% v/v TDE, og lad dem stå i 4 timer med forsigtig omrystning ved RT.
- Fjern 30% v/v TDE-opløsningen, tilsæt 68% v/v TDE til prøverne, og lad dem stå med forsigtig omrystning ved RT.
BEMÆRK: Da TDE er tyktflydende, pipetteres langsomt for at lade spidsen fylde. Indånding af TDE-damp eller tåge kan irritere åndedrætssystemet. Derfor anbefales det at arbejde i et godt ventileret område eller bruge stinkhætter for at minimere eksponeringen. TDE-opløsninger skal opbevares på RT. Brug 10 ml TDE-opløsninger til hver prøve.
6. Prøve montering
BEMÆRK: For at lette prøvemontering og LSFM-billedoptagelse bruger vi en specialfremstillet, forseglet prøveholder (kaldet "sandwich"), som består af tre dele: et mikroskopglas, en afstandsstykke og en dæksel.
- Sæt stålafstandsstykket (56 x 56 x 0,5 mm3) over mikroskopobjektglasset (60 x 60 x 1 mm3), og læg prøven på mikroskopiglasset.
- Sæt forsigtigt kvartsdækslet (60 x 60 x 0,5 mm3), klip alt sammen, og forbered en tokomponent siliciumlim i forholdet 1: 1. Brug en kvartsdæksel til at matche brydningsindekset og reducere den optiske aberration under anskaffelsesprocessen.
- Brug en 1 ml sprøjte til at fylde mellemrummet mellem afstandsstykket og dæksedlen med en tokomponent siliciumlim og lad det tørre i 10 minutter.
- Fjern klemmerne og brug en lille nål til langsomt at fylde hele sandwichen med 68% v / v TDE.
- Lav frisk lim og forsegl sandwichen.
BEMÆRK: Hvis TDE ved et uheld når afstandsstykket i trin 6.1, hærder limen ikke. Sørg for, at der ikke dannes luftbobler under trin 6.2.
7. Afstribning
BEMÆRK: Den strukturelle bevarelse og den forbedrede epitoptilgængelighed af SHORT tillader mærkning af skiver i flere runder ved at fjerne antistofferne og farve prøverne med andre markører.
- Åbn sandwichen med et blad, læg prøverne i nye fade med skruelåg fyldt med 30% v / v TDE, og lad dem stå i 3 timer.
- Prøverne overføres til reagensglas, vaskes i 3 x 2 timer i 1x PBS (pH 7,4) ved RT under forsigtig omrystning, og den sidste vask efterlades o/n.
- Prøverne anbringes i rydningsopløsning i vandbad ved 80 °C i 4 timer.
- Der vaskes 3 x 2 timer i 1x PBST (pH 7,4) ved 37 °C under forsigtig omrystning, og den sidste vask efterlades o/n. Nu er prøven klar til at blive mærket igen fra trin 4.8.
BEMÆRK: Fyld altid tuben med 50 ml af hver opløsning. Brug 10 ml TDE-opløsning til hver prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den her beskrevne protokol muliggør samtidig behandling af flere skiver, der spænder i tykkelse fra 100 μm til 500 μm, ved hjælp af SHORT-metoden. Denne tilgang reducerer den samlede behandlingstid for hele proceduren betydeligt. I dette arbejde giver vi en omfattende beskrivelse af hele rørledningen (figur 1) til behandling af flere postmortem menneskelige hjernetykke sektioner samtidigt, og vi demonstrerer protokollen på 24 skiver på én gang (figur 2A). Varigheden af rydning og co-mærkning varierer fra 11 til 30 dage under hensyntagen til prøvernes størrelse og tykkelse (tabel 1), eksklusive billeddannelse og behandling efter billeddannelse. Efter delipidering og brydningsindeksmatchning i TDE opnås optimal og homogen gennemsigtighed af alle vævsskiverne i både grå og hvid substans (figur 2B).
Billedoptagelsen kan udføres med forskellige avancerede fluorescensmikroskoper, herunder konfokal25 og to-fotonmikroskopi14. Her brugte vi en specialfremstillet omvendt LSFM18,23 udstyret med fire excitationslaserlinjer: 405 nm, 488 nm, 561 nm og 638 nm, der er i stand til at erhverve fire forskellige biologiske egenskaber mærket med fluoroforkonjugerede antistoffer. Figur 3A viser repræsentative billeder af en 400 μm tyk skive fra et humant Brocas område, der er co-mærket for NeuN, en pan-neuronal markør, Somatostatin (SST) og Calretinin (CR), som mærker to forskellige underpopulationer af interneuroner og den nukleare markør DAPI (figur 3A, B). I den 400 μm tykke plade observerede vi, at den globale fluorescens langs Z ikke er begrænset til overfladen, men den er næsten ensartet i hele vævsdybden, selvom signalintensiteten falder lidt i midten (figur 3C).
For at opnå en mere omfattende cellulær karakterisering af humant hjernevæv er det muligt at udføre multi-round mærkning af de samme prøver ved at fjerne antistofferne og ommærke prøven som demonstreret i SHORT original papir. Figur 4 (tilpasset fra Pesce et al.18) viser den potentielle anvendelse af syv forskellige antistoffer på en 500 μm tyk vævsskive behandlet med SHORT i tre på hinanden følgende runder af immunfarvning. De anvendte antistoffer omfatter NeuN, SST, CR, Parvalbumin (PV) og vasoaktivt tarmpeptid (VIP) som hæmmende neuronale markører, glialfibrillært surt protein (GFAP) til gliaceller og vimentin (VIM) til vaskulatur (tabel 2). Resultaterne viser SHORTs bemærkelsesværdige evne til at bevare vævsinformation gennem forskellige stripningsprocedurer, effektivt reducere autofluorescenssignaler og opnå effektiv prøveclearing.
Figur 1: Tidslinje for SHORT. Skema, der repræsenterer de trin, der kræves for at behandle prøverne med SHORT-protokollen. I hvert trin behandles snesevis af menneskelige hjernevævsplader sammen. Efter indlejring i agarose og udskæring placeres prøver i tænd- og slukopløsninger i 1 dag hver; Inaktiveringstrinnene udføres natten over, mens delipidering gennem inkubation i clearingopløsning kræver 3-7 dage. Derefter inkuberes prøverne med primære og sekundære antistofopløsninger i henholdsvis maksimalt 7 og 6 dage. Efter brydningsindeksmatchning monteres prøver i prøveholderen (sandwich) til LSFM-billeddannelse og opbevaring. Når som helst efter sandwichsamling kan prøver fjernes og ommærkes til påvisning af forskellige markører. Forkortelser: TDE = 2,2'-thiodiethanol; KORT = SHEKS - H2O2 - Antigen Retrieval -TDE; o/n = natten over; RI = brydningsindeks; LSFM = lysarkfluorescensmikroskopi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Menneskelige hjerneskiver fra et Broca-områdes blok behandles samtidigt. (A) Fireogtyve på hinanden følgende skiver fra Brocas areal på 4 x 4 x 0,04 cm3 i PBS før behandling med SHORT-metoden. (B) De samme prøver i A vist efter SHORT-forarbejdningen. Skalastang = 1 cm. Forkortelser: TDE = 2,2'-thiodiethanol; KORT = SHEKS - H2O2 - Antigen Retrieval -TDE; PBS = fosfatbufret saltvand. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. Repræsentative LSFM-billeder af et klaret udsnit mærket med fire forskellige markører. (A) Projektionsbilleder med maksimal intensitet (opløsning på 3,3 x 3,3 x 3,3 μm3), der viser en mesoskopisk rekonstruktion af en SHORT-behandlet skive af Brocas område mærket for NeuN, Somatostatin, Calretinin og den nukleare markør DAPI. Til højre vises det flettede billede (NeuN-SST-CR-DAPI). Skalabjælke = 0,5 cm. (B) Forstørret indsats af det flettede billede i A. Skalabjælke = 100 μm. (C) Høj opløsning (0,55 x 0,55 x 3,3 μm) yz-billeder fra (B). Skalabjælke = 100 μm. Forkortelser: TDE = 2,2'-thiodiethanol; KORT = SHEKS - H2O2 - Antigen Retrieval -TDE; LSFM = lysarkfluorescensmikroskopi; NeuN = neuronalt nukleært antigen; SST = somatostatin; CR = calretinin; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative LSFM-billeder af farvning med flere runder i SHORT-forarbejdede skiver. (A) Billeder af en human hjerneskive preclearing (i PBS) og efter multi-round mærkning med brydningsindeks matchning (68% TDE). Skalastang = 1 cm. (B) Sammenlægning af de forskellige kanaler, der er erhvervet i løbet af tre på hinanden følgende multirunder. Billedet viser både hvidt og gråt stof mærket med vasoaktivt tarmpeptid, somatostatin, parvalbumin, calretinin, neuronalt kerneantigen, glialfibrillært surt protein og vimentin. Højopløsning (opløsning på 0,55 x 0,55 x 3,3 μm), enkeltkanalbilleder vises til højre og under billedet. Skalabjælke = 100 μm for alle billeder, undtagen GFAP (skalalinje 10 = μm). (C) Projektionsbilleder med maksimal intensitet af en 500 μm tyk skive, der viser signalet fra syv forskellige antistoffer, der anvendes i tre på hinanden følgende runder af immunfarvning. Runde 1: PV-SST-VIP; runde 2: CR-SST-NeuN; Runde 3: VIM-SST-GFAP. Vægtstang = 1 mm. Dette tal blev ændret fra Pesce et al.18. Forkortelser: TDE = 2,2'-thiodiethanol; KORT = SHEKS - H2O2 - Antigen Retrieval -TDE; LSFM = lysarkfluorescensmikroskopi; NeuN = neuronalt nukleært antigen; SST = somatostatin; CR = calretinin; PV = parvalbumin; GFAP = glialfibrillært surt protein; VIM = vimentin; VIP = vasoaktivt tarmpeptid. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Repræsentativ tidslængde for SHORT for prøver med et område og tykkelse. Prøver med forskellige områder og tykkelser kræver en variabel inkubationstid i clearing- og antistofopløsninger, hvilket resulterer i forskellige tidslængder for hele SHORT-rørledningen. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Antistoffer kompatible med SHORT. Tabellen viser alle de antistoffer, der blev testet med SHORT-protokollen og viste specifik farvning i 400-500 μm tykke menneskelige hjerneprøver. P/M-kolonnen angiver polyklonale og monoklonale antistoffer. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Højopløsningsbilleddannelse og 3D-rekonstruktion af store menneskelige hjerneområder kræver mekanisk vævssektionering efterfulgt af optisk clearing og immunmærkning af enkeltskiver. Protokollen, der præsenteres her, beskriver, hvordan SHORT-vævstransformationsmetoden kan bruges til hurtig og samtidig behandling af flere menneskelige hjernetykke sektioner til 3D-hjernerekonstruktion med en subcellulær opløsning med LSFM.
I modsætning til andre tilgange, med SHORT-metoden kræver rydnings- og multimærkningstrinnene ikke sofistikeret tilpasset udstyr. En masse prøver kan behandles helt, hvilket reducerer behandlingstiden for store menneskelige hjernevævsblokke og minimerer den tekniske variabilitet.
Affarvning og epitop-afmaskering er afgørende, når man arbejder med ældede, formalinfikserede humane væv. Hydrogenperoxid- og alkaliske antigenhentningsopløsninger kan også anvendes i kombination med andre clearingmetoder såsom iDISCO 6,28, CLARITY, SWITCH og SHIELD24.
For at sikre bevarelsen af epitopal information og opnå ensartet rydning af både grå og hvidt stof er det nødvendigt at omdanne prøven til en gel / vævshybrid, der er modstandsdygtig over for varme og kemiske reagenser. Glutaraldehyd blev valgt for dets fremragende tværbindingsevne og dets evne til at trænge ind i vævspladen ved lav pH (pH = 3). Koncentrationen af glutaraldehyd er en kritisk faktor til bestemmelse af vævets styrke og klarhed. En højere koncentration fører til bedre bevarelse af vævsstrukturen, men øger også den tid, der kræves til clearing. Dette valg muliggør de ønskede resultater med hensyn til epitopbevarelse og homogen rydning. I tilfælde af afbryderopløsningen (protokoltrin 2.1) er koncentrationen af glutaraldehyd omhyggeligt udvalgt og optimeret til at finde en balance mellem effektiv tværbinding og hurtig rydning18,25. SHORT er specielt skræddersyet til at arbejde med formalinfikserede menneskelige hjerneskiver fra Brocas område, hippocampus og kortikal cortex 18,23,25. Men når man arbejder med andre biologiske modeller eller forskellige hjerneområder, kan nogle ændringer være nødvendige på grund af variationer i sammensætningen af grå og hvidt stof.
En kritisk opgave i denne protokol er også optimering af inkubationstiden ved clearing (protokoltrin 3.4) og antistofopløsninger (protokoltrin 4.8 og 4.10), hovedsageligt relateret til prøvestørrelsen og vævets biologiske sammensætning. Vi anslog, at 500 μm repræsenterer vævstykkelsesgrænsen for at opnå optimal gennemsigtighed i både hvidt og gråt stof og ensartet mærkning i hele vævsdybden for flere antistoffarvninger (tabel 2). En detaljeret beskrivelse af disse processer findes i Pesce et al.18 og Scardigli et al.24. Forskellige hjerneområder kan have en anden sammensætning i lipider og proteiner, og ældre hjerner udvikler et højt indhold af lipofuscin-type pigmenter og neuromelanin, der producerer et stærkt autofluorescenssignal og ændrer sondediffusionen gennem vævet. Som et eksempel har en 400 μm tyk skive på 16 cm2 fra human Brocas område brug for 7 dages behandling med clearingopløsningen for at nå et højt niveau af delipidering. For at sikre ensartet farvning i hele vævsdybden kræver det inkubation med primære og sekundære antistofopløsninger i henholdsvis 7 og 6 dage (figur 3). En finoptimering for rydnings- og mærkningstrinnene er derfor påkrævet før anvendelsen af high-throughput-protokollen, der er beskrevet her.
SHORT gør det muligt at opbevare prøver i den specialfremstillede billedholder, da det er blevet påvist, at lysstofrøret bevares i mindst et år. Forskere kan derfor forberede alle sandwichene på forhånd og gemme dem til billeddannelsestrinnet, der kan gøres efterfølgende. Især mikroskopet, afstandsstykket og dækglasset, der bruges til at forberede sandwichene, kan tilpasses i henhold til prøvens størrelse.
Prøverne behandlet med SHORT-protokollen beskrevet her blev analyseret ved hjælp af en specialfremstillet inverteret LSFM18,23. Denne opsætning består af to arme udstyret med 12x specialfremstillede mål med en korrektionskrave med brydningsindeks (RI). Hvert mål fungerer som en belysnings- og detektionsarm på samme tid, hvilket muliggør samtidig erhvervelse af to kanaler med en volumetrisk hastighed på 0,16 cm3/t. Da prøveholderen kan rumme to sandwich ad gangen, er vi i stand til fortløbende at afbilde fire kanaler i to skiver på 10 timer. På grund af TDE-dampens milde toksicitet for åndedrætssystemet fyldes prøveholderen med 91% v / v glycerol / vandopløsning, der matcher RI (1.46) af både kvartsdækslet og TDE-opløsningen for at undgå sfærisk aberration. 91% v/v glycerol/vand-opløsningen skal udskiftes hver 3. dag for at undgå støvforurening. Derfor muliggør vores LSFM hurtig erhvervelse af prøver med lav fotoblegning ved en isotropisk opløsning på 3,6 μm efter efterbehandling 18,23,29. Den store mængde producerede data blev behandlet ved hjælp af en defineret pipeline til genskæring og syning af billedstablerne ved hjælp af en egenudviklet software, ZetaStitcher (https://github.com/lens-biophotonics/ZetaStitcher)23,29.
Selvom vi brugte SHORT i kombination med lysarkfluorescensmikroskopi, kan forskellige former for fluorescensbilleddannelsesteknikker anvendes til erhvervelsen afhængigt af laboratoriets tilgængelighed og de specifikke applikationer. For eksempel kan konfokalmikroskopi25 eller to-fotonmikroskopi14 bruges til at analysere ryddede prøver. Denne type analyse anbefales til prøver med relativt små mængder, da de er scanningsbaserede systemer, og erhvervelsestiden for store vævsområder er meget lang30. Ved at opnå hurtigere billeddannelse og afkobling af lateral og aksial opløsning er lysarkfluorescensmikroskopi den foretrukne metode til billeddannelse af store mængder rensede prøver 3,4,18,31,32,33.
Sammenfattende beskrev vi en hurtig high-throughput protokol til samtidig clearing, homogen co-mærkning og 3D volumetrisk rekonstruktion af snesevis af postmortem menneskelige hjernesektioner. Ved at kombinere SHORT med LSFM-billeddannelse og beregningsanalyse er det muligt at opnå tredimensionelle data til en omfattende celletælling og proteomisk analyse af den menneskelige hjerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommercielle eller finansielle forbindelser, der kunne fortolkes som en potentiel interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker Bruce Fischl, Massachusetts General Hospital, AA Martinos Center for Biomedical Imaging, Department of Radiology, for at levere de menneskelige hjerneprøver, der analyseres i denne undersøgelse. Dette projekt modtog finansiering fra EU's Horizon 2020 rammeprogram for forskning og innovation under tilskudsaftale nr. 654148 (Laserlab-Europe), fra EU's Horizon 2020-rammeprogram for forskning og innovation under den specifikke tilskudsaftale nr. 785907 (Human Brain Project SGA2) og nr. 945539 (Human Brain Project SGA3) fra General Hospital Corporation Center of the National Institutes of Health under tildelingsnummer U01 MH117023, og fra det italienske undervisningsministerium inden for rammerne af Euro-Bioimaging Italian Node (ESFRI-forskningsinfrastruktur). Endelig blev denne forskning udført med bidrag fra "Fondazione CR Firenze." Indholdet af dette arbejde er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health. Figur 1 blev oprettet med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2'-thiodiethanol | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
| Acetamide >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| Agarose High EEO | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
| Boric Acid | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
| Coverslips | LaserOptex | / | customized |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| Glutaraldehyde | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
| Glycine | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
| Hydrogen Peroxide 30% | Merck Life Science S.R.L. | ||
| Incubator ISS-4075 | Lab companion | / | |
| Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) | / | / | custom-made |
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| Microscope slides | Laborchimica | / | customized |
| Phospate buffer saline tablet | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | out of production |
| Potassium Hydrogen Phtalate | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| Sodium Azide | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
| Sodium Sulfite | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
| Spacers | Microlaser srl | customized | |
| Sputum Containers (dishes with screw lids) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| Tris Base | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
| Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
| Tubes | Sarstedt | 62 547254 | |
| Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| Water bath | Memmert | WNB 7-45 | |
| Antibodies and Dyes | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-NeuN Antibody | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | Dilution used, 1:100 |
| Anti-Parvalbumin antibody (PV) | Abcam | ab32895 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM) | Abcam | ab8069 | Dilution used, 1:200 |
| Calretinin Polyclonal antibody | ProteinTech | 12278_1_AP | Dilution used, 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | Dilution used, 1:100 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed | Abcam | ab175475 | Dilution used, 1:200 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | Dilution used, 1:200 |
| Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody | Abcam | ab194324 | Dilution used, 1:200 |
| Somatostatin Antibody YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | Dilution used, 1:200 |
| Vasoactive intestinal peptide (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | Dilution used, 1:200 |
References
- Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251 (2019).
- Richardson, D. S., et al.
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nature Protocols. 16 (6), 2732-2748 (2021).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 713-741 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6 (1), 18631 (2016).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Lee, H., Park, J. -H., Seo, I., Park, S. -H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14 (1), 48 (2014).
- Murray, E., et al. Simple, Scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Costantini, I., et al. Large-scale, cell-resolution volumetric mapping allows layer-specific investigation of human brain cytoarchitecture. Biomedical Optics Express. 12 (6), 3684 (2021).
- Lai, H. M., et al. Next generation histology methods for three-dimensional imaging of fresh and archival human brain tissues. Nature Communications. 9 (1), 1066 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812.e19 (2020).
- Costantini, I., et al. Autofluorescence enhancement for label-free imaging of myelinated fibers in mammalian brains. Scientific Reports. 11 (1), 8038 (2021).
- Pesce, L., et al. 3D molecular phenotyping of cleared human brain tissues with light-sheet fluorescence microscopy. Communications Biology. 5 (1), 447 (2022).
- Schueth, A., et al. Efficient 3D light-sheet imaging of very large-scale optically cleared human brain and prostate tissue samples. Communications Biology. 6 (1), 170 (2023).
- Morawski, M., et al. Developing 3D microscopy with CLARITY on human brain tissue: Towards a tool for informing and validating MRI-based histology. NeuroImage. 182, 417-428 (2018).
- Park, J., et al. Integrated platform for multi-scale molecular imaging and phenotyping of the human brain. bioRxiv. , (2022).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Costantini, I., et al. A cellular resolution atlas of Broca's area. Science Advances. (9), eadg3844 (2023).
- Scardigli, M., et al. Comparison of different tissue clearing methods for three-dimensional reconstruction of human brain cellular anatomy using advanced imaging techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 752234 (2021).
- Pesce, L., et al. Exploring the human cerebral cortex using confocal microscopy. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 168, 3-9 (2022).
- Keller, P. J., Dodt, H. -U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173.e12 (2017).
- Sorelli, M., et al. Fiber enhancement and 3D orientation analysis in label-free two-photon fluorescence microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 4160 (2023).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369 (2021).
- Costantini, I., et al. Editorial: The human brain multiscale imaging challenge. Frontiers in Neuroanatomy. (16), 1060405 (2022).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5 (1), 9808 (2015).
