Summary
Настоящий протокол обеспечивает пошаговую процедуру быстрой и одновременной оптической очистки, многократного мечения и объемной 3D-реконструкции десятков посмертных срезов мозга человека путем комбинирования (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-тиодиэтанол [TDE]) короткого метода трансформации тканей с визуализацией флуоресцентной микроскопии со световым листом в стандартном протоколе с высокой пропускной способностью.
Abstract
Несмотря на многочисленные методы очистки, появившиеся в последнее десятилетие, обработка посмертного человеческого мозга остается сложной задачей из-за его размеров и сложности, которые делают визуализацию с микрометровым разрешением особенно сложной. В данной работе представлен протокол реконструкции объемных участков головного мозга человека путем одновременной обработки десятков срезов протоколом тканевой трансформации SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]), который позволяет очищать, маркировать и последовательно визуализировать образцы с помощью световой флуоресцентной микроскопии (LSFM). SHORT обеспечивает быстрое очищение тканей и однородное множественное мечение толстых срезов несколькими нейрональными маркерами, что позволяет идентифицировать различные субпопуляции нейронов как в белом, так и в сером веществе. После очистки срезы визуализируются с помощью LSFM с микрометровым разрешением и по нескольким каналам одновременно для быстрой 3D-реконструкции. Комбинируя SHORT с LSFM-анализом в рамках протокола с высокой пропускной способностью, можно получить 3D-реконструкцию цитоархитектуры больших объемных областей с высоким разрешением за короткое время, что позволяет получить всестороннюю структурную характеристику мозга человека.
Introduction
Анализ 3D-молекулярной организации и цитоархитектоники больших объемов человеческого мозга требует оптической прозрачности образцов, достигаемой с помощью протоколов с длительным временем обработки. Методы оптической очистки были разработаны для минимизации гетерогенности показателя преломления (RI) в тканях, тем самым уменьшая рассеяние света и увеличивая глубину проникновения света для визуализации с высоким разрешением 1,2,3,4,5. Современные достижения в области методов очистки и мечения глубоких тканей позволяют проводить объемную визуализацию неповрежденных органов и эмбрионов грызунов с использованием передовых методов микроскопии 6,7,8,9,10,11,12.
Тем не менее, объемная 3D-реконструкция больших участков посмертного человеческого мозга по-прежнему представляет собой сложную задачу по сравнению с модельными организмами. Сложный биологический состав и различные условия посмертной фиксации и хранения могут поставить под угрозу эффективность очистки тканей, глубину проникновения антител и распознавание эпитопов 13,14,15,16,17,18,19. Кроме того, механическое сечение тканей и последующая очистка и маркировка каждого среза по-прежнему требуется для достижения эффективной очистки и равномерного мечения больших областей человеческого мозга, что приводит к длительному времени обработки и необходимости сложного специального оборудования по сравнению с модельными организмами 15,20,21,22.
Методика тканевой трансформации SWITCH - H2O2 - антигена Retrieval -TDE (SHORT) была разработана специально для анализа больших объемов головного мозга человека18,23. Этот метод использует сохранение структуры тканей по протоколу SWITCH11 и высокие концентрации перекиси водорода для уменьшения автофлуоресценции тканей в сочетании с восстановлением эпитопов. SHORT позволяет равномерно окрашивать срезы головного мозга человека маркерами для различных подтипов нейронов, глиальных клеток, сосудов и миелинизированных волокон18,24. Его результаты совместимы с анализом белков как низкой, так и высокой плотности. Полученные высокие уровни прозрачности и равномерная маркировка позволяют проводить объемную реконструкцию толстых срезов с помощью флуоресцентной микроскопии, в частности, для быстрого получения светового листа могут быть использованы приборы 18,24,25,26,27.
В данной работе мы описываем, как техника тканевой трансформации SHORT может быть использована для одновременной очистки и многораундового мечения десятков фиксированных формалином участков человеческого мозга. Четыре различных флуоресцентных маркера могут использоваться вместе, что приводит к идентификации различных клеточных субпопуляций. После очистки можно выполнить объемную визуализацию высокого разрешения с помощью флуоресцентной микроскопии. Здесь мы использовали изготовленную на заказ инвертированную LSFM 18,24,25,26,27, которая обеспечивает быстрое оптическое секционирование образца и быстрый параллельный захват нескольких каналов. С помощью этого протокола с высокой пропускной способностью можно получить всестороннюю клеточную и структурную характеристику с субклеточным разрешением больших областей человеческого мозга, как это уже было продемонстрировано при картировании всей области Брока23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Образцы тканей человека, зафиксированные формалином, были предоставлены отделением невропатологии Службы аутопсии Массачусетской больницы общего профиля (MGH) (Бостон, США). Письменное согласие было получено от здоровых участников перед смертью в соответствии с одобренными IRB протоколами сбора тканей от Комитета по биобезопасности Партнеров (PIBC, протокол 2003P001937). Разрешительные документы хранятся в Службе аутопсии MGH в Бостоне, штат Массачусетс, США, и предоставляются по запросу.
1. Заделка агарозы и резка образца
- Приготовьте 4%-ный раствор агарозы в 1x фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7,4) в стакане и заложите внутрь тканевый блок. Подождите, пока он не нагреется до комнатной температуры (RT), а затем храните при температуре 4 °C в течение 24 часов.
- Для получения высокоточных срезов приклейте образец к диску образца вибратома и заполните лоток холодным 1x PBS (pH 7,4). Отрегулируйте параметры вибратомы, такие как частота, амплитуда и скорость, в соответствии с типом ткани, которую нужно разрезать (используемые значения: частота = 5 (50 Гц); амплитуда = 0,4; скорость = 3 (0,15 мм/с).
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от объема образца следует использовать разные вибратомы. Для образцов с максимальным объемом 70 x 40 x 15 мм можно использовать вибратом (например, Leica VT1000 S); для больших образцов можно использовать компрессионный аппарат (например, VF-900-0Z Microtome18) или изготовленный по индивидуальному заказу аппарат21. Здесь мы представляем ломтики, нарезанные толщиной 400 мкм или 500 мкм. - После нарезки поместите все ломтики в консервирующий раствор, состоящий из 1x PBS (pH 7,4) с 0,01% w/v азида натрия (NaN3), и храните при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед заделкой подождите, пока раствор агарозы не нагреется до 37 °C. Более высокая температура может повредить образец. Рекомендуется не оставлять образцы в PFA более чем на 48 ч, так как длительная фиксация может помешать процедуре мечения, повреждая антигены и увеличивая аутофлуоресценцию тканей. Для длительного хранения тканей человека используется ПБС с NaN3 для предотвращения микробного загрязнения. Из-за токсичности NaN3 приготовьте консервирующий раствор под химическим колпаком.
2. Фиксация тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворы, используемые в следующем протоколе, готовятся в больших объемах, достаточных для обработки всех срезов одного и того же тканевого блока и минимизации технической вариативности и сокращения времени на отдельные этапы.
- Приготовьте раствор для отключения с 50% v/v 1x PBS pH 3, 25% v/v 0,1 M соляной кислоты (HCl), 25% v/v 0,1 M гидрофталата калия (KHP) и свежего 4% v/v глутарового альдегида. Поместите все образцы в чашки с завинчивающимися крышками (70 x 23 мм) и инкубируйте их в растворе Switch-off при легком встряхивании при 4 °C в течение 1 суток, защищая их от света алюминиевой фольгой.
- Приготовьте раствор для включения с 1x PBS (pH 7,4) и свежим 1% v/v глутаровым альдегидом. Поместите все образцы в новую посуду и инкубируйте их с раствором Switch-on при легком встряхивании при 4 °C в течение 1 суток, защищая их от света алюминиевой фольгой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за высокой токсичности и светочувствительности глутарового альдегида растворы для выключения и включения всегда должны быть приготовлены свежими и храниться под химическим колпаком на льду. Всегда наполняйте посуду 20 мл каждого раствора и закрывайте ее парапленкой.
3. Деактивация и очистка
ПРИМЕЧАНИЕ: Реакционноспособный глутаровый альдегид в образцах должен быть инактивирован инкубацией с инактивационным раствором, состоящим из 1x PBS pH 7,4, 4% w/v ацетамида, 4% w/v глицина, pH 9,0. Раствор можно хранить при температуре 4 °C до 3 месяцев. Для удаления липидов и придания ткани прозрачности используем очищающий раствор, состоящий из 200 мМ додецилсульфата натрия (SDS), 20 мМ сульфита натрия (Na2SO3) и 20 мМ борной кислоты (H3BO3), рН 9,0. Раствор должен храниться в RT, так как SDS выпадает в осадок при 4 °C. Все последующие действия будут выполняться в пробирках, наполненных раствором.
- Переместите образцы из посуды в пробирки и промойте в течение 3 x 2 ч с 1x PBS pH 7,4 при RT при легком встряхивании.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этапе 3.1 необходимо работать под химическим колпаком из-за токсичности глутарового альдегида. Ацетамид, SDS и борная кислота также являются токсичными реагентами, и с ними необходимо обращаться под химическим колпаком. Всегда наполняйте пробирку 50 мл каждого раствора. - Инкубируют образцы в инактивационном растворе при 37 °C на водяной бане в течение ночи (но/к).
- Стирайте в течение 3 x 2 ч в 1x PBS pH 7,4 при RT при легком встряхивании.
- Образцы выдерживают в очищающем растворе при температуре 55 °С на водяной бане в течение 3-7 дней. Меняйте раствор каждые 2 дня (табл. 1).
4. Иммуномаркировка
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед этапом маркировки необходимо удалить остаточный SDS, уменьшить автофлуоресценцию и демаскировать эпитопы с помощью раствора для извлечения антигена, состоящего из 10 мМ основания Tris, 1 мМ ЭДТА и 0,05% v/v Tween 20, pH 9. рН раствора 9 оптимизирован для эффективного процесса извлечения; Трис-основание действует как буферный агент для поддержания стабильной рН-среды; ЭДТА, которая является хелатирующим агентом, повышает доступность антигена. Неионогенный моющий крем Tween 20 способствует улучшению проницаемости тканей. Этот раствор можно хранить при температуре 4 °C. Важно отметить, что перекись водорода в сочетании со стадией извлечения антигена оказывает синергетический эффект в снижении аутофлюоресцентного сигнала, разрушая и/или модифицируя эндогенные флуорофоры, ответственные за неспецифический фоновый сигнал (например, липофусцин).
- Приготовьте 1x PBS с 0,1% v/v Triton X-100 (PBST), предварительно прогрейте его до 37 °C и промойте образцы 3 x 3 ч в течение дня при легком встряхивании при 37 °C в инкубаторе. Оставьте последнюю стирку о/н.
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните исходный раствор PBST при температуре 4 °C. Очень важно удалить SDS из ткани, так как при низких температурах он может образовывать нерастворимые осадки, которые могут помешать последующим процессам поглощения. - На следующий день добавьте 10 мл 30% v/v перекиси водорода (H2O2) к каждому образцу и оставьте его при легком встряхивании при RT на 45 мин.
- Стирайте 3 x 10 мин с 1x PBS (pH 7,4) с легким встряхиванием при RT.
- Раствор для извлечения антигена разогреть до 95 °C на водяной бане; Переложите образцы в нагретый раствор и оставьте их при температуре 95 °C на 10 мин.
- Дайте образцам остыть до температуры RT в течение 40 минут при легком встряхивании.
- Промывайте 3 x 5 минут деионизированной водой при легком встряхивании.
- Уравновешивают образцы в ПБС при 4 °C в течение 15 мин.
- Приготовьте свежий раствор антител на основе PBST с 0,01% массы NaN3 (см. ПРИМЕЧАНИЕ для шага 1.3) и добавьте первичные антитела. Инкубируют образцы с раствором в чашках с завинчивающимися крышками при 37 °С в течение n суток (1-7) в инкубаторе при осторожном встряхивании и защите от света (табл. 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации зависит от размера и толщины (Таблица 1 и Таблица 2). - Через n дней образцы перемещают в пробирки и промывают 3 х 2 ч предварительно подогретым ПБСТ при 37 °С с легким встряхиванием в инкубаторе.
- Добавляют вторичные антитела в ПБСТ с 0,01% мас./оNaN3 и инкубируют образцы в новых чашках с завинчивающимися крышками при 37 °С в течение n дней (1-6) в инкубаторе с легким встряхиванием и в защищенном от света месте (табл. 1 и табл. 2).
- Через n дней переложить образцы в пробирки и промыть 3 х 3 ч в течение суток предварительно подогретым ПБСТ при 37 °С в инкубаторе с щадящим встряхиванием. Оставьте последнюю стирку о/н.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку Triton X-100 и Tween 20 вязкие, медленно пипетку, чтобы наконечник заполнился. Всегда наполняйте пробирку 50 мл каждого раствора. Используйте 10 мл растворов антител для каждого образца и закройте чашку парапленкой, чтобы предотвратить испарение раствора. Поскольку растворы антител содержат NaN3, их можно хранить при температуре 4 °C и повторно использовать для маркировки новых образцов в течение 2 недель.
5. Согласование показателя преломления
ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения высокого уровня прозрачности необходимо гомогенизировать показатель преломления тканей. Здесь мы используем 2,2'-тиодиэтанол (TDE), разбавленный в 1x PBS. Решения TDE должны храниться в RT.
- Переложите образцы в новую посуду, добавьте 30% v/v TDE и оставьте на 4 ч при легком встряхивании при RT.
- Удалите 30%-ный раствор v/v TDE, добавьте 68% v/v TDE к образцам и оставьте их при легком встряхивании при RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку TDE вязкий, медленно продавайте пипетку, чтобы наконечник заполнился. Вдыхание паров или тумана TDE может вызвать раздражение дыхательной системы. Поэтому желательно работать в хорошо проветриваемом помещении или использовать вытяжные шкафы, чтобы свести к минимуму воздействие. Растворы TDE должны храниться в RT. Используйте 10 мл растворов TDE для каждого образца.
6. Монтаж образца
ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения монтажа образца и получения изображений LSFM мы используем изготовленный по индивидуальному заказу герметичный держатель образца (называемый «сэндвич»), который состоит из трех частей: предметного стекла микроскопа, спейсера и покровного стекла.
- Наденьте стальную прокладку (56 x 56 x 0,5мм3) на предметное стекло микроскопа (60 x 60 x 1мм3) и положите образец на предметное стекло для микроскопии.
- Аккуратно положите кварцевый покровный листок (60 х 60 х 0,5мм3), скрепите все вместе и приготовьте двухкомпонентный силиконовый клей в пропорции 1:1. Используйте кварцевое покрывало, чтобы соответствовать показателю преломления и уменьшить оптическую аберрацию в процессе съемки.
- С помощью шприца объемом 1 мл заполните пространство между прокладкой и покровным стеклом двухкомпонентным силиконовым клеем и дайте высохнуть в течение 10 минут.
- Снимите зажимы и с помощью маленькой иглы медленно заполните весь сэндвич 68% v/v TDE.
- Сделайте свежий клей и запечатайте бутерброд.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если TDE случайно достигнет прокладки на шаге 6.1, клей не затвердеет. Убедитесь, что на шаге 6.2 не образуются пузырьки воздуха.
7. Зачистка
ПРИМЕЧАНИЕ: Структурная сохранность и улучшенная доступность эпитопов SHORT позволяют многократно маркировать срезы путем удаления антител и повторного окрашивания образцов другими маркерами.
- Откройте бутерброд лезвием, положите образцы в новую посуду с завинчивающимися крышками, наполненную 30% v/v TDE, и оставьте их на 3 часа.
- Переложите образцы в пробирки, промойте в течение 3 x 2 ч в 1x PBS (pH 7,4) при RT с легким встряхиванием и оставьте последнюю промывку o/n.
- Поместите образцы в очищающий раствор на водяную баню при температуре 80 °C на 4 ч.
- Стирать в течение 3 x 2 ч в 1x PBST (pH 7,4) при 37 °C при легком встряхивании и оставить последнюю стирку o/n. Теперь образец готов к повторной маркировке, начиная с шага 4.8.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда наполняйте пробирку 50 мл каждого раствора. Используйте 10 мл раствора TDE для каждого образца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол, описанный здесь, позволяет одновременно обрабатывать несколько срезов толщиной от 100 мкм до 500 мкм с помощью метода SHORT. Такой подход значительно сокращает общее время обработки всей процедуры. В данной работе мы даем исчерпывающее описание всего конвейера (рис. 1) для одновременной обработки нескольких посмертных толстых срезов человеческого мозга и демонстрируем протокол сразу на 24 срезах (рис. 2А). Продолжительность очистки и совместного мечения колеблется от 11 до 30 дней с учетом размера и толщины образцов (табл. 1), исключая визуализацию и постграфическую обработку. После расщепления и сопоставления показателя преломления в TDE достигается оптимальная и однородная прозрачность всех срезов ткани как в сером, так и в белом веществе (рис. 2B).
Получение изображения может быть выполнено с помощью различных современных флуоресцентных микроскопов, включая конфокальнуюмикроскопию 25 и двухфотонную микроскопию14. Здесь мы использовали изготовленную на заказ инвертированную LSFM18,23, оснащенную четырьмя лазерными линиями возбуждения: 405 нм, 488 нм, 561 нм и 638 нм, способную приобретать четыре различные биологические особенности, меченные флуорофор-конъюгированными антителами. На рисунке 3A показаны репрезентативные изображения среза толщиной 400 мкм из области болезни Брока человека, помеченного пан-нейрональным маркером NeuN, соматостатином (SST) и кальретинином (CR), которые маркируют две различные субпопуляции интернейронов и ядерный маркер DAPI (рис. 3A, B). В плите толщиной 400 мкм мы наблюдали, что глобальная флуоресценция вдоль Z не ограничивается поверхностью, а практически равномерна по всей глубине ткани, хотя интенсивность сигнала немного снижается в середине (рис. 3В).
Для достижения более полной клеточной характеристики тканей головного мозга человека можно выполнить многоэтапное мечение одних и тех же образцов путем удаления антител и повторной маркировки образца, как показано в оригинальной статье SHORT. На рисунке 4 (адаптированном из Pesce et al.18) демонстрируется потенциальное применение семи различных антител на срезе ткани толщиной 500 мкм, обработанном с помощью SHORT, в трех последовательных циклах иммуноокрашивания. Используемые антитела включают NeuN, SST, CR, Парвальбумин (PV) и вазоактивный кишечный пептид (VIP) в качестве ингибирующих нейрональных маркеров, глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) для глиальных клеток и виментин (VIM) для сосудистой сети (Таблица 2). Результаты демонстрируют замечательную способность SHORT сохранять информацию о тканях во время различных процедур зачистки, эффективно снижать сигналы автофлуоресценции и достигать эффективной очистки образцов.
Рисунок 1: Временная шкала SHORT. Схема, представляющая шаги, необходимые для обработки образцов по протоколу SHORT. На каждом этапе десятки пластин тканей человеческого мозга обрабатываются вместе. После встраивания в агарозу и нарезки образцы помещают в растворы Switch-on и Switch-off на 1 сутки каждый; Этапы инактивации выполняются в течение ночи, в то время как делипидация путем инкубации в клиринговом растворе занимает 3-7 дней. После этого образцы инкубируют с первичными и вторичными растворами антител в течение максимум 7 и 6 дней соответственно. После согласования показателя преломления образцы устанавливаются в держатель образца (сэндвич) для визуализации и хранения LSFM. В любой момент после сэндвич-сборки образцы могут быть зачищены и перемаркированы для обнаружения различных маркеров. Сокращения: TDE = 2,2'-тиодиэтанол; SHORT = SWITCH - H2O2 - Антиген Retrieval -TDE; o/n = овернайт; RI = показатель преломления; LSFM = световая флуоресцентная микроскопия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Срезы человеческого мозга из блока области Брока, обработанные одновременно. (A) Двадцать четыре последовательных среза из области Брока размером 4 x 4 x 0,04 см3 в PBS перед обработкой методом SHORT. (Б) Те же образцы, что и в А , показанные после обработки SHORT. Масштабная линейка = 1 см. Сокращения: TDE = 2,2'-тиодиэтанол; SHORT = SWITCH - H2O2 - Антиген Retrieval -TDE; PBS = фосфатно-солевой буфер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Репрезентативные LSFM-изображения осветленного среза, помеченного четырьмя различными маркерами. (A) Проекционные изображения максимальной интенсивности (разрешение 3,3 x 3,3 x 3,3мкм3), показывающие мезоскопическую реконструкцию обработанного SHORT среза области Брока, помеченного для NeuN, соматостатина, кальретинина и ядерного маркера DAPI. Справа показано объединенное изображение (NeuN-SST-CR-DAPI). Масштабная линейка = 0,5 см. (B) Увеличенная вставка объединенного изображения в A. Масштабная линейка = 100 мкм. (C) Высокое разрешение (0,55 x 0,55 x 3,3 мкм) yz изображений из (B). Масштабная линейка = 100 мкм. Сокращения: TDE = 2,2'-тиодиэтанол; SHORT = SWITCH - H2O2 - Антиген Retrieval -TDE; LSFM = световая флуоресцентная микроскопия; NeuN = нейрональный ядерный антиген; ТСТ = соматостатин; CR = кальретинин; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные LSFM-изображения многораундового окрашивания в КОРОТКО обработанных срезах. (A) Изображения среза головного мозга человека, прошедшего предварительную очистку (в PBS) и после многораундового мечения с сопоставлением показателя преломления (68% TDE). Масштабная линейка = 1 см. (B) Слияние различных каналов, полученных в течение трех последовательных многораундовых циклов. На изображении показано как белое, так и серое вещество, помеченное вазоактивным кишечным пептидом, соматостатином, парвальбумином, кальретинином, нейрональным ядерным антигеном, глиальным фибриллярным кислым белком и виментином. Одноканальные изображения с высоким разрешением (0,55 x 0,55 x 3,3 мкм) показаны справа и под изображением. Масштабная линейка = 100 мкм для всех изображений, кроме GFAP (масштабная линейка 10 = мкм). (C) Проекционные изображения максимальной интенсивности среза толщиной 500 мкм, показывающие сигнал от семи различных антител, используемых в трех последовательных раундах иммуноокрашивания. Раунд 1: PV-SST-VIP; раунд 2: CR-SST-NeuN; Раунд 3: VIM-SST-GFAP. Масштабная линейка = 1 мм. Эта цифра была изменена из Pesce et al.18. Сокращения: TDE = 2,2'-тиодиэтанол; SHORT = SWITCH - H2O2 - Антиген Retrieval -TDE; LSFM = световая флуоресцентная микроскопия; NeuN = нейрональный ядерный антиген; ТСТ = соматостатин; CR = кальретинин; ПВ = парвальбумин; GFAP = глиальный фибриллярный кислый белок; VIM = виментин; VIP = вазоактивный кишечный пептид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Репрезентативная временная длина SHORT для образцов с различной площадью и толщиной. Образцы с разной площадью и толщиной требуют переменного времени инкубации в растворах для очистки и антител, что приводит к различному времени для всего трубопровода SHORT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 2: Антитела, совместимые с SHORT. В таблице перечислены все антитела, которые были протестированы по протоколу SHORT и показали специфическое окрашивание в образцах человеческого мозга толщиной 400-500 мкм. Столбец P/M обозначает поликлональные и моноклональные антитела. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Визуализация с высоким разрешением и 3D-реконструкция больших областей человеческого мозга требуют механического среза тканей с последующим оптическим очищением и иммунометированием отдельных срезов. Протокол, представленный здесь, описывает, как метод трансформации тканей SHORT может быть использован для быстрой и одновременной обработки нескольких толстых срезов человеческого мозга для 3D-реконструкции мозга с субклеточным разрешением с помощью LSFM.
В отличие от других подходов, при использовании метода SHORT этапы очистки и множественной маркировки не требуют сложного специализированного оборудования. Большая часть образцов может быть обработана полностью, что сокращает время обработки больших блоков тканей человеческого мозга и сводит к минимуму техническую вариативность.
Процедуры обесцвечивания и демаскировки эпитопов имеют решающее значение при работе со старыми, фиксированными формалином тканями человека. Растворы для извлечения перекиси водорода и щелочных антигенов также можно использовать в сочетании с другими методами очистки, такими как iDISCO 6,28, CLARITY, SWITCH и SHIELD24.
Для обеспечения сохранности эпитопной информации и достижения равномерной очистки как серого, так и белого вещества необходимо трансформировать образец в гибрид геля и ткани, устойчивый к теплу и химическим реагентам. Глутаровый альдегид был выбран из-за его превосходной способности к сшиванию и способности проникать в тканевую пластину при низком pH (pH = 3). Концентрация глутарового альдегида является критическим фактором, определяющим прочность и чистоту ткани. Более высокая концентрация приводит к лучшему сохранению структуры ткани, но также увеличивает время, необходимое для очищения. Этот выбор позволяет достичь желаемых результатов с точки зрения сохранения эпитопов и однородной очистки. В случае отключающего раствора (шаг протокола 2.1) концентрация глутарового альдегида была тщательно подобрана и оптимизирована для достижения баланса между эффективным сшиванием и быстрым очищением18,25. SHORT специально разработан для работы с фиксированными формалином срезами человеческого мозга из области Брока, гиппокампа и коры головного мозга 18,23,25. Однако при работе с другими биологическими моделями или другими участками мозга могут потребоваться некоторые модификации из-за вариаций состава серого и белого вещества.
Одной из важнейших задач этого протокола также является оптимизация инкубационного времени в растворах для очистки (шаг протокола 3.4) и растворов антител (шаги протокола 4.8 и 4.10), в основном связанная с размером образца и биологическим составом ткани. Мы подсчитали, что 500 мкм представляют собой предел толщины ткани для достижения оптимальной прозрачности как в белом, так и в сером веществе и равномерного мечения по всей глубине ткани для окрашивания нескольких антител (табл. 2). Подробное описание этих процессов можно найти в Pesce et al.18 и Scardigli et al.24. Разные области мозга могут иметь разный состав липидов и белков, а в старом мозге вырабатывается высокое содержание пигментов липофусцинового типа и нейромеланина, которые производят сильный сигнал автофлуоресценции и изменяют диффузию зонда по всей ткани. Например, ломтик толщиной 400 мкм и 16см2 из области болезни Брока требует 7-дневной обработки очищающим раствором для достижения высокого уровня делипидации. Для обеспечения равномерного окрашивания по всей глубине ткани требуется инкубация с первичными и вторичными растворами антител в течение 7 и 6 дней соответственно (рис. 3). Поэтому перед применением описанного здесь протокола с высокой пропускной способностью требуется тонкая оптимизация этапов очистки и маркировки.
SHORT позволяет хранить образцы в специально изготовленном держателе для изображений, так как было доказано, что флуоресцентный сигнал сохраняется не менее одного года. Таким образом, исследователи могут заранее подготовить все бутерброды и сохранить их для этапа визуализации, который может быть выполнен впоследствии. Примечательно, что предметное стекло микроскопа, прокладка и покровное стекло, используемые для приготовления бутербродов, могут быть настроены в соответствии с размером образца.
Образцы, обработанные по протоколу SHORT, описанному здесь, были проанализированы с помощью специально изготовленного инвертированного LSFM18,23. Эта установка состоит из двух манипуляторов, оснащенных 12-кратными объективами, изготовленными по индивидуальному заказу, с воротником для коррекции показателя преломления (RI). Каждый объектив действует как осветительный и детектирующий рычаг одновременно, позволяя одновременно захватывать два канала с объемной скоростью 0,16см3/ч. Поскольку держатель образца может вмещать два бутерброда одновременно, мы можем последовательно визуализировать четыре канала в двух срезах за 10 часов. Из-за умеренной токсичности паров TDE для дыхательной системы, чтобы избежать сферической аберрации, держатель образца заполняют 91% v/v раствором глицерина/воды, который соответствует RI (1,46) как кварцевого покровного стекла, так и раствора TDE. Раствор глицерина и воды 91% v/v необходимо менять каждые 3 дня, чтобы избежать загрязнения пылью. Таким образом, наша LSFM позволяет быстро получать образцы с низким фотообесцвечиванием с изотропным разрешением 3,6 мкм после постобработки 18,23,29. Большой объем полученных данных был обработан с помощью определенного конвейера для повторной нарезки и сшивания стеков изображений с помощью программного обеспечения собственной разработки ZetaStitcher (https://github.com/lens-biophotonics/ZetaStitcher)23,29.
Несмотря на то, что мы использовали SHORT в сочетании с флуоресцентной микроскопией со световым листом, для сбора данных могут использоваться различные виды методов флуоресцентной визуализации в зависимости от доступности лаборатории и конкретных областей применения. Например, конфокальная микроскопия25 или двухфотонная микроскопия14 могут быть использованы для анализа очищенных образцов. Этот тип анализа рекомендуется для образцов с относительно небольшими объемами, поскольку они являются системами, основанными на сканировании, и время сбора данных для больших участков тканей очень велико30. Благодаря более быстрому получению изображений и разделению латерального и осевого разрешения, светолистовая флуоресцентная микроскопия является предпочтительным методом для визуализации больших объемов очищенных образцов 3,4,18,31,32,33.
Таким образом, мы описали быстрый протокол с высокой пропускной способностью для одновременной очистки, гомогенной совместной маркировки и объемной 3D-реконструкции десятков посмертных срезов человеческого мозга. Комбинируя SHORT с LSFM-визуализацией и вычислительным анализом, можно получить трехмерные данные для комплексной клеточной переписи и протеомного анализа человеческого мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Брюса Фишля (Bruce Fischl), Массачусетская больница общего профиля, Центр биомедицинской визуализации им. А.А. Мартиноса, отделение радиологии, за предоставление образцов человеческого мозга, проанализированных в этом исследовании. Этот проект получил финансирование от Рамочной программы исследований и инноваций Европейского Союза «Горизонт 2020» в рамках грантового соглашения No 654148 (Laserlab-Europe), от Рамочной программы Европейского Союза по исследованиям и инновациям «Горизонт 2020» в рамках Специального грантового соглашения No 785907 (Проект «Мозг человека» SGA2) и No 945539 (Проект «Мозг человека» SGA3), от Центра корпорации больниц общего профиля Национальных институтов здравоохранения под номером U01 MH117023, и от Министерства образования Италии в рамках Итальянского узла Euro-Bioimaging (исследовательская инфраструктура ESFRI). Наконец, это исследование было проведено при участии «Fondazione CR Firenze». Содержание этой работы является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2'-thiodiethanol | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
| Acetamide >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| Agarose High EEO | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
| Boric Acid | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
| Coverslips | LaserOptex | / | customized |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| Glutaraldehyde | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
| Glycine | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
| Hydrogen Peroxide 30% | Merck Life Science S.R.L. | ||
| Incubator ISS-4075 | Lab companion | / | |
| Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) | / | / | custom-made |
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| Microscope slides | Laborchimica | / | customized |
| Phospate buffer saline tablet | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | out of production |
| Potassium Hydrogen Phtalate | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| Sodium Azide | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
| Sodium Sulfite | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
| Spacers | Microlaser srl | customized | |
| Sputum Containers (dishes with screw lids) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| Tris Base | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
| Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
| Tubes | Sarstedt | 62 547254 | |
| Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| Water bath | Memmert | WNB 7-45 | |
| Antibodies and Dyes | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-NeuN Antibody | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | Dilution used, 1:100 |
| Anti-Parvalbumin antibody (PV) | Abcam | ab32895 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM) | Abcam | ab8069 | Dilution used, 1:200 |
| Calretinin Polyclonal antibody | ProteinTech | 12278_1_AP | Dilution used, 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | Dilution used, 1:100 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed | Abcam | ab175475 | Dilution used, 1:200 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | Dilution used, 1:200 |
| Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody | Abcam | ab194324 | Dilution used, 1:200 |
| Somatostatin Antibody YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | Dilution used, 1:200 |
| Vasoactive intestinal peptide (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | Dilution used, 1:200 |
References
- Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251 (2019).
- Richardson, D. S., et al.
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nature Protocols. 16 (6), 2732-2748 (2021).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 713-741 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6 (1), 18631 (2016).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Lee, H., Park, J. -H., Seo, I., Park, S. -H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14 (1), 48 (2014).
- Murray, E., et al. Simple, Scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Costantini, I., et al. Large-scale, cell-resolution volumetric mapping allows layer-specific investigation of human brain cytoarchitecture. Biomedical Optics Express. 12 (6), 3684 (2021).
- Lai, H. M., et al. Next generation histology methods for three-dimensional imaging of fresh and archival human brain tissues. Nature Communications. 9 (1), 1066 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812.e19 (2020).
- Costantini, I., et al. Autofluorescence enhancement for label-free imaging of myelinated fibers in mammalian brains. Scientific Reports. 11 (1), 8038 (2021).
- Pesce, L., et al. 3D molecular phenotyping of cleared human brain tissues with light-sheet fluorescence microscopy. Communications Biology. 5 (1), 447 (2022).
- Schueth, A., et al. Efficient 3D light-sheet imaging of very large-scale optically cleared human brain and prostate tissue samples. Communications Biology. 6 (1), 170 (2023).
- Morawski, M., et al. Developing 3D microscopy with CLARITY on human brain tissue: Towards a tool for informing and validating MRI-based histology. NeuroImage. 182, 417-428 (2018).
- Park, J., et al. Integrated platform for multi-scale molecular imaging and phenotyping of the human brain. bioRxiv. , (2022).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Costantini, I., et al. A cellular resolution atlas of Broca's area. Science Advances. (9), eadg3844 (2023).
- Scardigli, M., et al. Comparison of different tissue clearing methods for three-dimensional reconstruction of human brain cellular anatomy using advanced imaging techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 752234 (2021).
- Pesce, L., et al. Exploring the human cerebral cortex using confocal microscopy. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 168, 3-9 (2022).
- Keller, P. J., Dodt, H. -U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173.e12 (2017).
- Sorelli, M., et al. Fiber enhancement and 3D orientation analysis in label-free two-photon fluorescence microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 4160 (2023).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369 (2021).
- Costantini, I., et al. Editorial: The human brain multiscale imaging challenge. Frontiers in Neuroanatomy. (16), 1060405 (2022).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5 (1), 9808 (2015).
