Summary
Das vorliegende Protokoll bietet ein Schritt-für-Schritt-Verfahren für die schnelle und gleichzeitige optische Reinigung, die Multi-Round-Markierung und die volumetrische 3D-Rekonstruktion von Dutzenden von postmortalen menschlichen Hirnschnitten durch die Kombination der (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT-Gewebetransformationstechnik mit Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebung in einem routinemäßigen Hochdurchsatzprotokoll.
Abstract
Trotz der zahlreichen Clearing-Techniken, die im letzten Jahrzehnt entstanden sind, bleibt die Verarbeitung postmortaler menschlicher Gehirne aufgrund ihrer Dimensionen und Komplexität, die die Bildgebung mit Mikrometerauflösung besonders schwierig machen, eine herausfordernde Aufgabe. In dieser Arbeit wird ein Protokoll vorgestellt, um die Rekonstruktion volumetrischer Abschnitte des menschlichen Gehirns durchzuführen, indem gleichzeitig Dutzende von Schnitten mit dem SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen R etrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) Gewebetransformationsprotokoll verarbeitet werden, das die Klärung, Markierung und sequenzielle Bildgebungder Proben mit Lichtblattfluoreszenzmikroskopie (LSFM) ermöglicht. SHORT ermöglicht eine schnelle Gewebereinigung und homogene Mehrfachmarkierung dicker Schichten mit mehreren neuronalen Markern und ermöglicht so die Identifizierung verschiedener neuronaler Subpopulationen sowohl in der weißen als auch in der grauen Substanz. Nach der Säuberung werden die Schichten über LSFM mit Mikrometerauflösung und in mehreren Kanälen gleichzeitig für eine schnelle 3D-Rekonstruktion abgebildet. Durch die Kombination von SHORT mit LSFM-Analyse innerhalb eines routinemäßigen Hochdurchsatzprotokolls ist es möglich, die 3D-Zytoarchitektur-Rekonstruktion großer volumetrischer Areale mit hoher Auflösung in kurzer Zeit zu erhalten und so eine umfassende strukturelle Charakterisierung des menschlichen Gehirns zu ermöglichen.
Introduction
Die Analyse der molekularen 3D-Organisation und Zytoarchitektur großer Volumina des menschlichen Gehirns erfordert eine optische Transparenz der Proben, die durch Protokolle mit langer Verarbeitungszeit erreicht wird. Optische Clearing-Techniken wurden entwickelt, um die Heterogenität des Brechungsindex (RI) innerhalb des Gewebes zu minimieren, wodurch die Lichtstreuung reduziert und die Lichteindringtiefe für hochauflösende Bildgebung erhöhtwird 1,2,3,4,5. Derzeitige Fortschritte bei der Klärung und der Markierung von tiefem Gewebe ermöglichen die volumetrische Bildgebung intakter Nagetierorgane und -embryonen unter Nutzung modernster Mikroskopietechniken 6,7,8,9,10,11,12.
Die volumetrische 3D-Rekonstruktion großer Bereiche des postmortalen menschlichen Gehirns stellt im Vergleich zu Modellorganismen jedoch noch eine herausfordernde Aufgabe dar. Die komplexe biologische Zusammensetzung und die variablen postmortalen Fixierungs- und Lagerbedingungen können die Effizienz der Gewebereinigung, die Eindringtiefe der Antikörper und die Epitoperkennung beeinträchtigen 13,14,15,16,17,18,19. Darüber hinaus ist immer noch ein mechanischer Gewebeschnitt und die anschließende Klärung und Markierung jeder einzelnen Scheibe erforderlich, um eine effiziente Klärung und gleichmäßige Markierung großer menschlicher Gehirnareale zu erreichen, was im Vergleich zu Modellorganismen zu langen Bearbeitungszeiten und dem Bedarf an ausgeklügelten kundenspezifischen Geräten führt 15,20,21,22.
Die S WITCH - H2O2 - Antigen Retrieval -TDE (SHORT) Gewebetransformationstechnik wurde speziell für die Analyse großer Volumina des menschlichen Gehirns entwickelt18,23. Diese Methode nutzt die Gewebestrukturkonservierung des SWITCH-Protokolls11 und hohe Konzentrationen von Peroxidwasserstoff, um die Autofluoreszenz des Gewebes in Kombination mit der Epitopwiederherstellung zu verringern. SHORT ermöglicht eine gleichmäßige Färbung menschlicher Hirnschnitte mit Markern für verschiedene neuronale Subtypen, Gliazellen, Gefäße und myelinisierte Fasern18,24. Die Ergebnisse sind mit der Analyse von Proteinen mit niedriger und hoher Dichte kompatibel. Die daraus resultierende hohe Transparenz und gleichmäßige Markierung ermöglichen die volumetrische Rekonstruktion dicker Schichten mit Fluoreszenzmikroskopie, insbesondere für die schnelle Erfassung können Lichtblattapparaturen verwendet werden 18,24,25,26,27.
In dieser Arbeit beschreiben wir, wie die SHORT-Gewebetransformationstechnik für die gleichzeitige Klärung und mehrstufige Markierung von Dutzenden von formalinfixierten menschlichen Hirnschnitten verwendet werden kann. Vier verschiedene fluoreszierende Marker können zusammen verwendet werden, was zur Identifizierung verschiedener zellulärer Subpopulationen führt. Nach der Klärung kann eine hochauflösende volumetrische Bildgebung mit Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden. Hier haben wir ein speziell angefertigtes invertiertes LSFM 18,24,25,26,27 verwendet, das ein schnelles optisches Schneiden der Probe und eine schnelle parallele Erfassung mehrerer Kanäle ermöglicht. Mit diesem routinemäßigen Hochdurchsatzprotokoll ist es möglich, eine umfassende zelluläre und strukturelle Charakterisierung mit einer subzellulären Auflösung großer Bereiche des menschlichen Gehirns zu erhalten, wie bereits in der Kartierung eines gesamten Broca-Arealsgezeigt wurde 23.
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Protocol
Formalinfixierte menschliche Gewebeproben wurden von der Abteilung für Neuropathologie des Autopsiedienstes des Massachusetts General Hospital (MGH) (Boston, USA) zur Verfügung gestellt. Die schriftliche Zustimmung der gesunden Teilnehmer wurde vor dem Tod gemäß den vom IRB genehmigten Gewebeentnahmeprotokollen des Partners Institutional Biosafety Committee (PIBC, Protokoll 2003P001937) eingeholt. Die Genehmigungsdokumente werden bei den MGH Autopsy Services in Boston, MA, USA, aufbewahrt und sind auf Anfrage erhältlich.
1. Agarose-Einbettung und Probenschneiden
- Bereiten Sie eine 4%ige w/v-Agaroselösung in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) in einem Becherglas vor und betten Sie den Gewebeblock darin ein. Warten Sie, bis es Raumtemperatur (RT) erreicht hat, und lagern Sie es dann 24 Stunden lang bei 4 °C.
- Um hochpräzise Schnitte zu erhalten, kleben Sie die Probe auf die Probenscheibe des Vibratoms und füllen Sie die Schale mit kaltem 1x PBS (pH 7,4). Passen Sie die Vibratomparameter wie Frequenz, Amplitude und Geschwindigkeit entsprechend der Art des zu schneidenden Gewebes an (verwendete Werte: Frequenz = 5 (50 Hz); Amplitude = 0,4; Geschwindigkeit = 3 (0,15 mm/s).
HINWEIS: Je nach Probenvolumen sollten unterschiedliche Vibratome verwendet werden. Für Proben mit einem maximalen Volumen von 70 x 40 x 15 mm kann ein Vibratom (z.B. Leica VT1000 S) verwendet werden; Für größere Proben ist es möglich, ein Kompresstom (z. B. VF-900-0Z-Mikrotom18) oder eine speziell angefertigte Vorrichtung21 zu verwenden. Hier präsentieren wir Scheiben, die entweder mit einer Dicke von 400 μm oder 500 μm geschnitten wurden. - Nach dem Schneiden alle Scheiben in eine Konservierungslösung aus 1x PBS (pH 7,4) mit 0,01 Gew.-% Natriumazid (NaN3) geben und bei 4 °C lagern.
HINWEIS: Warten Sie vor dem Einbetten, bis die Agaroselösung 37 °C erreicht hat. Eine höhere Temperatur kann die Probe beschädigen. Es wird empfohlen, die Proben nicht länger als 48 Stunden in PFA zu belassen, da eine längere Fixierung das Markierungsverfahren beeinträchtigen kann, indem sie Antigene schädigt und die Autofluoreszenz des Gewebes erhöht. Für die Langzeitlagerung von menschlichem Gewebe wird PBS mit NaN3 verwendet, um eine mikrobielle Kontamination zu verhindern. Aufgrund der Toxizität von NaN3 ist die Konservierungslösung unter einer chemischen Haube herzustellen.
2. Fixierung des Gewebes
HINWEIS: Alle im folgenden Protokoll verwendeten Lösungen werden in großen Mengen hergestellt, die ausreichen, um alle Schichten desselben Gewebeblocks zu verarbeiten und die technische Variabilität zu minimieren und die Zeit für einzelne Schritte zu verkürzen.
- Bereiten Sie die Abschaltlösung mit 50 % v/v 1x PBS pH 3, 25 % v/v 0,1 M Salzsäure (HCl), 25 % v/v 0,1 M Kaliumhydrogenphthalat (KHP) und frischem 4 % v/v Glutaraldehyd vor. Geben Sie alle Proben in Schalen mit Schraubdeckel (70 x 23 mm) und inkubieren Sie sie mit der Switch-off-Lösung mit leichtem Schütteln bei 4 °C für 1 Tag, wobei Sie sie mit Aluminiumfolie vor Licht schützen.
- Bereiten Sie die Einschaltlösung mit 1x PBS (pH 7,4) und frischem 1% v/v Glutaraldehyd zu. Geben Sie alle Proben in neue Schalen und inkubieren Sie sie mit der Switch-on-Lösung mit leichtem Schütteln bei 4 °C für 1 Tag, wobei Sie sie mit Aluminiumfolie vor Licht schützen.
HINWEIS: Aufgrund der hohen Toxizität und Lichtempfindlichkeit von Glutaraldehyd müssen sowohl Abschalt- als auch Einschaltlösungen immer frisch zubereitet und unter der chemischen Haube auf Eis aufbewahrt werden. Füllen Sie die Schale immer mit 20 ml jeder Lösung und verschließen Sie sie mit Parafilm.
3. Inaktivierung und Clearing
HINWEIS: Reaktives Glutaraldehyd in den Proben muss durch Inkubation mit einer Inaktivierungslösung inaktiviert werden, die aus 1x PBS pH 7,4, 4 % w/v Acetamid, 4 % w/v Glycin, pH 9,0 besteht. Die Lösung kann bei 4 °C bis zu 3 Monate gelagert werden. Um Lipide zu entfernen und das Gewebe transparent zu machen, verwenden wir die Clearing-Lösung, bestehend aus 200 mM Natriumdodecylsulfat (SDS), 20 mM Natriumsulfit (Na2SO3) und 20 mM Borsäure (H3BO3), pH 9,0. Die Lösung muss bei RT gelagert werden, da SDS bei 4 °C ausfällt. Alle folgenden Schritte werden in Röhrchen durchgeführt, die mit der Lösung gefüllt sind.
- Die Proben aus dem Geschirr in die Röhrchen geben und 3 x 2 h mit 1x PBS pH 7,4 bei RT in leichtem Schütteln waschen.
HINWEIS: Für Schritt 3.1 ist es notwendig, aufgrund der Glutaraldehyd-Toxizität unter der chemischen Haube zu arbeiten. Paracetamid, SDS und Borsäure sind ebenfalls toxische Reagenzien und müssen unter einer chemischen Haube gehandhabt werden. Füllen Sie das Röhrchen immer mit 50 ml jeder Lösung. - Die Proben werden in einer Inaktivierungslösung bei 37 °C in einem Wasserbad über Nacht (o/n) inkubiert.
- 3 x 2 h in 1x PBS pH 7,4 bei RT unter leichtem Schütteln waschen.
- Die Proben werden in einer Reinigungslösung bei 55 °C im Wasserbad für 3-7 Tage inkubiert. Wechseln Sie die Lösung alle 2 Tage (Tabelle 1).
4. Immunmarkierung
HINWEIS: Vor dem Markierungsschritt ist es notwendig, das restliche Sicherheitsdatenblatt zu entfernen, die Autofluoreszenz zu reduzieren und die Epitope mit einer Antigen-Rückgewinnungslösung zu demaskieren, die aus 10 mM Trisbase, 1 mM EDTA und 0,05 % v/v Tween 20, pH 9 besteht. Der pH-Wert der Lösung von 9 ist für einen effizienten Rückgewinnungsprozess optimiert. Trisbase wirkt als Puffermittel, um eine stabile pH-Umgebung aufrechtzuerhalten; EDTA, ein Chelatbildner, verbessert die Zugänglichkeit des Antigens. Das nichtionische Waschmittel Tween 20 trägt dazu bei, die Durchlässigkeit des Gewebes zu verbessern. Diese Lösung kann bei 4 °C gelagert werden. Es ist wichtig zu beachten, dass Wasserstoffperoxid in Kombination mit dem Antigen-Retrieval-Schritt einen synergistischen Effekt bei der Reduzierung des Autofluoreszenzsignals hat, indem die endogenen Fluorophore, die für das unspezifische Hintergrundsignal verantwortlich sind (wie Lipofuscin), abgebaut und/oder modifiziert werden.
- 1x PBS mit 0,1% v/v Triton X-100 (PBST) vorbereiten, auf 37 °C vorwärmen und die Proben 3 x 3 h tagsüber bei leichtem Schütteln bei 37 °C im Inkubator waschen. Lassen Sie die letzte Wäsche o/n.
HINWEIS: Lagern Sie die PBST-Stammlösung bei 4 °C. Es ist von entscheidender Bedeutung, SDS aus dem Gewebe zu entfernen, da es bei niedrigen Temperaturen unlösliche Ausscheidungen bilden kann, die nachfolgende Aufnahmeprozesse beeinträchtigen können. - Am nächsten Tag werden 10 ml 30 % v/v Wasserstoffperoxid (H2O2) zu jeder Probe gegeben und 45 Minuten lang bei RT leicht geschüttelt.
- 3 x 10 min mit 1x PBS (pH 7,4) unter leichtem Schütteln bei RT waschen.
- Die Antigen-Rückgewinnungslösung wird auf 95 °C im Wasserbad vorgewärmt; Die Proben werden in die erhitzte Lösung überführt und 10 min bei 95 °C belassen.
- Lassen Sie die Proben 40 Minuten lang unter leichtem Schütteln auf RT abkühlen.
- 3 x 5 min mit deionisiertem Wasser unter leichtem Schütteln waschen.
- Die Proben werden in PBS bei 4 °C für 15 min ausgeglichen.
- Frische Antikörperlösung aus PBST mit 0,01 Gew.-%NaN3 herstellen (siehe HINWEIS zu Schritt 1.3) und Primärantikörper hinzufügen. Die Proben werden mit der Lösung in Schalen mit Schraubdeckel bei 37 °C für n Tage (1-7) in einem Inkubator mit leichtem Schütteln und Lichtschutz inkubiert (Tabelle 2).
HINWEIS: Die Inkubationszeit ist größen- und dickenabhängig (Tabelle 1 und Tabelle 2). - Nach n Tagen werden die Proben in Röhrchen umgefüllt und 3 x 2 h mit vorgewärmtem PBST bei 37 °C unter leichtem Schütteln im Inkubator gewaschen.
- Sekundärantikörper in PBST mit 0,01 Gew.-%NaN3 zugeben und die Proben in neuen Schalen mit Schraubdeckel bei 37 °C für n Tage (1-6) in einem Inkubator mit leichtem Schütteln und lichtgeschützt inkubieren (Tabelle 1 und Tabelle 2).
- Nach n Tagen werden die Proben in Röhrchen umgefüllt und tagsüber 3 x 3 h mit vorgewärmtem PBST bei 37 °C in einem schonenden Schüttelinkubator gewaschen. Lassen Sie die letzte Wäsche o/n.
HINWEIS: Da Triton X-100 und Tween 20 viskos sind, pipettieren Sie langsam, damit sich die Spitze füllen kann. Füllen Sie das Röhrchen immer mit 50 ml jeder Lösung. Verwenden Sie 10 ml Antikörperlösungen für jede Probe und versiegeln Sie die Schale mit Parafilm, um eine Verdunstung der Lösung zu verhindern. Da die Antikörperlösungen NaN3 enthalten, können sie bei 4 °C gelagert und innerhalb von 2 Wochen zur Markierung neuer Proben wiederverwendet werden.
5. Anpassung des Brechungsindex
HINWEIS: Um ein hohes Maß an Transparenz zu erreichen, ist es notwendig, den Brechungsindex des Gewebes zu homogenisieren. Hier verwenden wir 2,2'-Thiodiethanol (TDE) verdünnt in 1x PBS. TDE-Lösungen müssen bei RT gelagert werden.
- Übertragen Sie die Proben in neue Schalen, fügen Sie 30 % v/v TDE hinzu und lassen Sie sie 4 h lang bei leichtem Schütteln bei RT stehen.
- Entfernen Sie die 30%ige v/v-TDE-Lösung, geben Sie 68 %ige v/v-TDE-Werte zu den Proben und lassen Sie sie bei RT leicht schütteln.
HINWEIS: Da TDE viskos ist, pipettieren Sie langsam, damit sich die Spitze füllen kann. Das Einatmen von TDE-Dampf oder -Nebel kann die Atemwege reizen. Daher ist es ratsam, in einem gut belüfteten Bereich zu arbeiten oder Abzüge zu verwenden, um die Exposition zu minimieren. TDE-Lösungen müssen bei RT gelagert werden. Verwenden Sie 10 ml TDE-Lösungen für jede Probe.
6. Probenmontage
HINWEIS: Um die Probenmontage und die LSFM-Bildaufnahme zu erleichtern, verwenden wir einen speziell angefertigten, versiegelten Probenhalter (als "Sandwich" bezeichnet), der aus drei Teilen besteht: einem Objektträger, einem Abstandshalter und einem Deckglas.
- Legen Sie den Stahlabstandshalter (56 x 56 x 0,5 mm3) über den Objektträger (60 x 60 x 1 mm3) und legen Sie die Probe auf den Objektträger.
- Legen Sie das Quarzdeckglas (60 x 60 x 0,5 mm3) vorsichtig auf, klippen Sie alles zusammen und bereiten Sie einen Zweikomponenten-Silikonkleber im Verhältnis 1:1 vor. Verwenden Sie ein Quarzdeckglas, um den Brechungsindex anzupassen und die optische Aberration während des Aufnahmeprozesses zu reduzieren.
- Füllen Sie mit einer 1-ml-Spritze den Raum zwischen dem Abstandshalter und dem Deckglas mit einem Zweikomponenten-Silikonkleber und lassen Sie ihn 10 Minuten trocknen.
- Entferne die Clips und fülle mit einer kleinen Nadel langsam das gesamte Sandwich mit 68% v/v TDE.
- Stellen Sie frischen Kleber her und verschließen Sie das Sandwich.
HINWEIS: Wenn das TDE in Schritt 6.1 versehentlich den Abstandshalter erreicht, härtet der Kleber nicht aus. Stellen Sie sicher, dass sich in Schritt 6.2 keine Luftblasen bilden.
7. Abisolieren
HINWEIS: Die strukturelle Konservierung und die verbesserte Zugänglichkeit des Epitops von SHORT ermöglichen die Markierung von Schichten in mehreren Runden durch Entfernen der Antikörper und erneutes Färben der Proben mit anderen Markern.
- Öffnen Sie das Sandwich mit einer Klinge, legen Sie die Proben in neue Schalen mit Schraubdeckeln, die mit 30 % v/v TDE gefüllt sind, und lassen Sie sie 3 Stunden lang stehen.
- Die Proben werden in Röhrchen umgefüllt, 3 x 2 h in 1x PBS (pH 7,4) bei RT mit leichtem Schütteln gewaschen und die letzte Wäsche o/n gelassen.
- Die Proben werden in einer Reinigungslösung in einem Wasserbad bei 80 °C für 4 h gegeben.
- 3 x 2 h in 1x PBST (pH 7,4) bei 37 °C unter leichtem Schütteln waschen und die letzte Wäsche o/n stehen lassen. Jetzt kann die Probe ab Schritt 4.8 erneut beschriftet werden.
HINWEIS: Füllen Sie das Röhrchen immer mit 50 ml jeder Lösung. Verwenden Sie 10 ml TDE-Lösung für jede Probe.
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Representative Results
Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Behandlung mehrerer Schichten mit einer Dicke von 100 μm bis 500 μm mit der SHORT-Methode. Dieser Ansatz reduziert die Gesamtbearbeitungszeit für das gesamte Verfahren erheblich. In dieser Arbeit bieten wir eine umfassende Beschreibung der gesamten Pipeline (Abbildung 1) für die gleichzeitige Verarbeitung mehrerer postmortaler Dickschnitte des menschlichen Gehirns und demonstrieren das Protokoll an 24 Schichten gleichzeitig (Abbildung 2A). Die Dauer für das Clearing und Co-Labeling liegt zwischen 11 und 30 Tagen, wenn man die Größe und Dicke der Proben berücksichtigt (Tabelle 1), ohne Bildgebung und Postimaging-Verarbeitung. Nach Delipidierung und Brechungsindexanpassung bei TDE wird eine optimale und homogene Transparenz aller Gewebeschnitte sowohl in der grauen als auch in der weißen Substanz erreicht (Abbildung 2B).
Die Bildaufnahme kann mit verschiedenen fortschrittlichen Fluoreszenzmikroskopen durchgeführt werden, einschließlich konfokaler25- und Zwei-Photonen-Mikroskopie14. Hier haben wir einen speziell angefertigten invertierten LSFM 18,23 verwendet, der mit vier Anregungslaserlinien ausgestattet ist: 405 nm, 488 nm, 561 nm und 638 nm, die in der Lage sind, vier verschiedene biologische Merkmale zu erfassen, die mit Fluorophor-konjugierten Antikörpern markiert sind. Abbildung 3A zeigt repräsentative Bilder einer 400 μm dicken Scheibe aus einem menschlichen Broca-Areal, das für NeuN, einen panneuronalen Marker, Somatostatin (SST) und Calretinin (CR) markiert ist, die zwei verschiedene Subpopulationen von Interneuronen und den nukleären Marker DAPI markieren (Abbildung 3A,B). In der 400 μm dicken Platte konnten wir beobachten, dass die globale Fluoreszenz entlang von Z nicht auf die Oberfläche beschränkt ist, sondern über die gesamte Gewebetiefe nahezu gleichmäßig ist, obwohl die Signalintensität in der Mitte leicht abnimmt (Abbildung 3C).
Um eine umfassendere zelluläre Charakterisierung von menschlichem Hirngewebe zu erreichen, ist es möglich, die gleichen Proben in mehreren Runden zu markieren, indem die Antikörper abgestreift und die Probe neu markiert werden, wie in der SHORT-Originalarbeit gezeigt. Abbildung 4 (adaptiert von Pesce et al.18) zeigt die potenzielle Anwendung von sieben verschiedenen Antikörpern auf einen 500 μm dicken Gewebeschnitt, der mit SHORT in drei aufeinanderfolgenden Immunfärberunden verarbeitet wurde. Zu den verwendeten Antikörpern gehören NeuN, SST, CR, Parvalbumin (PV) und vasoaktives intestinales Peptid (VIP) als inhibitorische neuronale Marker, saures Gliafibrillenprotein (GFAP) für Gliazellen und Vimentin (VIM) für das Gefäßsystem (Tabelle 2). Die Ergebnisse zeigen die bemerkenswerte Fähigkeit von SHORT, Gewebeinformationen während verschiedener Stripping-Verfahren zu erhalten, Autofluoreszenzsignale effektiv zu reduzieren und eine effiziente Probenreinigung zu erreichen.
Abbildung 1: Zeitleiste von SHORT. Schema, das die Schritte darstellt, die erforderlich sind, um die Proben mit dem SHORT-Protokoll zu verarbeiten. In jedem Schritt werden Dutzende von menschlichen Hirngewebeplatten zusammen verarbeitet. Nach dem Einbetten in Agarose und dem Schneiden werden die Proben für jeweils 1 Tag in Einschalt- und Ausschaltlösungen gelegt; Die Inaktivierungsschritte werden über Nacht durchgeführt, während die Delipidierung durch Inkubation in Reinigungslösung 3-7 Tage dauert. Danach werden die Proben für maximal 7 bzw. 6 Tage mit primären und sekundären Antikörperlösungen inkubiert. Nach der Brechungsindexanpassung werden die Proben in den Probenhalter (Sandwich) für die LSFM-Bildgebung und -Lagerung montiert. Nach der Sandwichmontage können die Proben jederzeit abgezogen und neu etikettiert werden, um verschiedene Marker zu erkennen. Abkürzungen: TDE = 2,2'-Thiodiethanol; SHORT = SHEXE - H2O2 - Antigen Retrieval -TDE; o/n = über Nacht; RI = Brechungsindex; LSFM = Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Menschliche Gehirnschnitte aus dem Block eines Broca-Bereichs, die gleichzeitig verarbeitet werden. (A) Vierundzwanzig aufeinanderfolgende Scheiben aus dem Broca-Bereich von 4 x 4 x 0,04 cm3 in PBS vor der Verarbeitung mit der SHORT-Methode. (B) Die gleichen Proben in A, die nach der SHORT-Verarbeitung gezeigt wurden. Maßstabsleiste = 1 cm. Abkürzungen: TDE = 2,2'-Thiodiethanol; SHORT = SHEXE - H2O2 - Antigen Retrieval -TDE; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Repräsentative LSFM-Bilder einer geklärten Schicht, die mit vier verschiedenen Markern beschriftet ist. (A) Projektionsbilder mit maximaler Intensität (Auflösung von 3,3 x 3,3 x 3,3 μm3), die eine mesoskopische Rekonstruktion einer SHORT-prozessierten Scheibe des Broca-Areals zeigen, die für NeuN, Somatostatin, Calretinin und den Kernmarker DAPI markiert ist. Rechts ist das zusammengefügte Bild (NeuN-SST-CR-DAPI) dargestellt. Maßstabsleiste = 0,5 cm. (B) Vergrößerte Einfügung des zusammengeführten Bildes in A. Maßstabsleiste = 100 μm. (C) Hochauflösende (0,55 x 0,55 x 3,3 μm) yz-Bilder von (B). Maßstabsbalken = 100 μm. Abkürzungen: TDE = 2,2'-Thiodiethanol; SHORT = SHEXE - H2O2 - Antigen Retrieval -TDE; LSFM = Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie; NeuN = Neuronales Kernantigen; SST = Somatostatin; CR = Calretinin; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative LSFM-Bilder der Multi-Round-Färbung in SHORT-prozessierten Schichten. (A) Bilder eines menschlichen Gehirnschnitts vor dem Clearing (in PBS) und nach der Multi-Round-Markierung mit Brechungsindexanpassung (68% TDE). Maßstabsleiste = 1 cm. (B) Zusammenführung der verschiedenen Kanäle, die in drei aufeinanderfolgenden Mehrfachrunden aufgenommen wurden. Das Bild zeigt sowohl die weiße als auch die graue Substanz, die mit vasoaktivem intestinalem Peptid, Somatostatin, Parvalbumin, Calretinin, neuronalem Kernantigen, saurem Gliafibrillenprotein und Vimentin markiert ist. Hochauflösend (Auflösung von 0,55 x 0,55 x 3,3 μm), Einkanalbilder werden rechts und unterhalb des Bildes angezeigt. Maßstabsleiste = 100 μm für alle Bilder, außer GFAP (Maßstabsleiste 10 = μm). (C) Projektionsbilder mit maximaler Intensität von 500 μm dicken Schichten, die das Signal von sieben verschiedenen Antikörpern zeigen, die in drei aufeinanderfolgenden Runden der Immunfärbung verwendet wurden. Runde 1: PV-SST-VIP; Runde 2: CR-SST-NeuN; Runde 3: VIM-SST-GFAP. Maßstabsleiste = 1 mm. Diese Abbildung wurde von Pesce et al.18 modifiziert. Abkürzungen: TDE = 2,2'-Thiodiethanol; SHORT = SHEXE - H2O2 - Antigen Retrieval -TDE; LSFM = Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie; NeuN = Neuronales Kernantigen; SST = Somatostatin; CR = Calretinin; PV = Parvalbumin; GFAP = saures Gliafibrillenprotein; VIM = Vimentin; VIP = vasoaktives intestinales Peptid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Tabelle 1: Repräsentative Zeitdauer von SHORT für Proben mit einer Reihe von Bereichen und Dicken. Proben mit unterschiedlichen Flächen und Dicken erfordern eine variable Inkubationszeit in Clearing- und Antikörperlösungen, was zu unterschiedlichen Zeitlängen für die gesamte SHORT-Pipeline führt. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Antikörper, die mit SHORT kompatibel sind. Die Tabelle listet alle Antikörper auf, die mit dem SHORT-Protokoll getestet wurden und eine spezifische Färbung in 400-500 μm dicken menschlichen Gehirnproben zeigten. Die P/M-Säule bezeichnet polyklonale und monoklonale Antikörper. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Hochauflösende Bildgebung und 3D-Rekonstruktion großer menschlicher Hirnareale erfordern mechanische Gewebeschnitte, gefolgt von optischer Klärung und Immunmarkierung einzelner Schichten. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt, wie die SHORT-Gewebetransformationsmethode für die schnelle und gleichzeitige Verarbeitung mehrerer menschlicher Hirndickschnitte für die 3D-Hirnrekonstruktion mit subzellulärer Auflösung mit LSFM verwendet werden kann.
Im Gegensatz zu anderen Ansätzen sind bei der SHORT-Methode für die Clearing- und Multi-Labeling-Schritte keine ausgeklügelten kundenspezifischen Geräte erforderlich. Ein Großteil der Proben kann insgesamt verarbeitet werden, wodurch die Bearbeitungszeit großer menschlicher Hirngewebeblöcke verkürzt und die technische Variabilität minimiert wird.
Entfärbungs- und Epitop-Entlarvungsbehandlungen sind bei der Arbeit mit gealtertem, formalinfixiertem menschlichem Gewebe von entscheidender Bedeutung. Das Wasserstoffperoxid und die alkalischen Antigen-Rückgewinnungslösungen können auch in Kombination mit anderen Reinigungsmethoden wie iDISCO 6,28, CLARITY, SWITCH und SHIELD24 verwendet werden.
Um die Erhaltung der epitopalen Informationen zu gewährleisten und eine gleichmäßige Reinigung sowohl der grauen als auch der weißen Substanz zu erreichen, ist es notwendig, die Probe in einen Gel/Gewebe-Hybrid umzuwandeln, der gegen Hitze und chemische Reagenzien resistent ist. Glutaraldehyd wurde aufgrund seiner hervorragenden Vernetzungsfähigkeit und seiner Fähigkeit, bei niedrigem pH-Wert (pH = 3) in die Gewebeplatte einzudringen, ausgewählt. Die Konzentration von Glutaraldehyd ist ein entscheidender Faktor bei der Bestimmung der Festigkeit und Klarheit des Gewebes. Eine höhere Konzentration führt zu einem besseren Erhalt der Gewebestruktur, erhöht aber auch die benötigte Zeit für die Reinigung. Diese Wahl ermöglicht die gewünschten Ergebnisse in Bezug auf die Epitopkonservierung und die homogene Klärung. Im Falle der Abschaltlösung (Protokollschritt 2.1) wurde die Konzentration von Glutaraldehyd sorgfältig ausgewählt und optimiert, um ein Gleichgewicht zwischen effektiver Vernetzung und schneller Klärung herzustellen18,25. SHORT ist speziell auf die Arbeit mit formalinfixierten menschlichen Gehirnschnitten aus dem Broca-Areal, dem Hippocampus und dem kortikalen Kortex zugeschnitten 18,23,25. Bei der Arbeit mit anderen biologischen Modellen oder verschiedenen Hirnregionen können jedoch aufgrund von Variationen in der Zusammensetzung der grauen und weißen Substanz einige Modifikationen erforderlich sein.
Eine wichtige Aufgabe dieses Protokolls ist auch die Optimierung der Inkubationszeit in Clearing- (Protokollschritt 3.4) und Antikörperlösungen (Protokollschritte 4.8 und 4.10), hauptsächlich bezogen auf die Probengröße und die biologische Zusammensetzung des Gewebes. Wir schätzten, dass 500 μm die Gewebedickengrenze darstellen, um eine optimale Transparenz sowohl in der weißen als auch in der grauen Substanz und eine gleichmäßige Markierung über die gesamte Gewebetiefe für die Färbung verschiedener Antikörper zu erreichen (Tabelle 2). Eine detaillierte Beschreibung dieser Prozesse findet sich in Pesce et al.18 und Scardigli et al.24. Verschiedene Gehirnbereiche können eine unterschiedliche Zusammensetzung an Lipiden und Proteinen haben, und gealterte Gehirne entwickeln einen hohen Gehalt an Lipofuscin-artigen Pigmenten und Neuromelanin, die ein starkes Autofluoreszenzsignal erzeugen und die Sondendiffusion im gesamten Gewebe verändern. Ein Beispiel: Eine 400 μm dicke Scheibe von 16cm2 aus dem menschlichen Broca-Areal benötigt 7 Tage Behandlung mit der Clearing-Lösung, um ein hohes Maß an Delipidierung zu erreichen. Um eine gleichmäßige Färbung über die gesamte Gewebetiefe zu gewährleisten, ist eine Inkubation mit primären und sekundären Antikörperlösungen für 7 bzw. 6 Tage erforderlich (Abbildung 3). Vor der Anwendung des hier beschriebenen Hochdurchsatzprotokolls ist daher eine Feinoptimierung der Clearing- und Labeling-Schritte erforderlich.
SHORT ermöglicht die Aufbewahrung von Proben in der speziell angefertigten Bildgebungshalterung, da nachgewiesen wurde, dass das Fluoreszenzsignal mindestens ein Jahr lang erhalten bleibt. So können die Forscher alle Sandwiches im Voraus zubereiten und für den anschließenden Bildgebungsschritt aufbewahren. Insbesondere der Objektträger, der Abstandshalter und das Deckglas, das zur Zubereitung der Sandwiches verwendet wird, können je nach Größe der Probe angepasst werden.
Die Proben, die mit dem hier beschriebenen SHORT-Protokoll verarbeitet wurden, wurden mit einem speziell angefertigten invertierten LSFM18,23 analysiert. Dieser Aufbau besteht aus zwei Armen, die mit 12x maßgeschneiderten Objektiven mit einem Brechungsindex-Korrekturring (RI) ausgestattet sind. Jedes Objektiv fungiert gleichzeitig als Beleuchtungs- und Detektionsarm, was die gleichzeitige Erfassung von zwei Kanälen mit einer Volumengeschwindigkeit von 0,16 cm3/h ermöglicht. Da der Probenhalter zwei Sandwiches gleichzeitig aufnehmen kann, sind wir in der Lage, vier Kanäle in zwei Scheiben in 10 h nacheinander abzubilden. Wegen der milden Toxizität von TDE-Dampf für die Atemwege wird der Probenhalter zur Vermeidung einer sphärischen Aberration mit einer 91%igen Glycerin/Wasser-Lösung gefüllt, die dem RI (1,46) sowohl des Quarzdeckglases als auch der TDE-Lösung entspricht. Die 91%ige V/V-Glycerin/Wasser-Lösung muss alle 3 Tage gewechselt werden, um eine Staubkontamination zu vermeiden. Daher ermöglicht unser LSFM die schnelle Aufnahme von Proben mit geringer Photobleichung bei einer isotropen Auflösung von 3,6 μm nach der Nachbearbeitung 18,23,29. Die große Menge an produzierten Daten wurde mit einer definierten Pipeline zum Re-Slicing und Stitching der Bildstapel mit einer selbst entwickelten Software, ZetaStitcher (https://github.com/lens-biophotonics/ZetaStitcher)23,29, verarbeitet.
Obwohl wir SHORT in Kombination mit der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie verwendet haben, können je nach Verfügbarkeit des Labors und den spezifischen Anwendungen verschiedene Arten von Fluoreszenz-Bildgebungstechniken für die Erfassung eingesetzt werden. Zum Beispiel kann die konfokale Mikroskopie25 oder die Zwei-Photonen-Mikroskopie14 verwendet werden, um geräumte Proben zu analysieren. Diese Art der Analyse wird für Proben mit relativ kleinen Volumina empfohlen, da es sich um scanbasierte Systeme handelt und die Aufnahmezeit für große Gewebebereiche sehr lang ist30. Durch die schnellere Bildgebung und die Entkopplung der lateralen und axialen Auflösung ist die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie die bevorzugte Methode zur Abbildung großer Mengen geklärter Proben 3,4,18,31,32,33.
Zusammenfassend beschrieben wir ein schnelles Hochdurchsatzprotokoll für das gleichzeitige Clearing, die homogene Co-Markierung und die volumetrische 3D-Rekonstruktion von Dutzenden von postmortalen menschlichen Hirnschnitten. Durch die Kombination von SHORT mit LSFM-Bildgebung und computergestützter Analyse ist es möglich, dreidimensionale Daten für eine umfassende Zellzählung und proteomische Analyse des menschlichen Gehirns zu erhalten.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass die Forschung in Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.
Acknowledgments
Wir danken Bruce Fischl, Massachusetts General Hospital, A.A. Martinos Center for Biomedical Imaging, Department of Radioology, für die Bereitstellung der in dieser Studie analysierten menschlichen Gehirnproben. Dieses Projekt wurde gefördert durch das Forschungs- und Innovationsrahmenprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 654148 (Laserlab-Europe), aus dem Horizon 2020-Rahmenprogramm der Europäischen Union für Forschung und Innovation im Rahmen der spezifischen Finanzhilfevereinbarungen Nr. 785907 (Human Brain Project SGA2) und Nr. 945539 (Human Brain Project SGA3), vom General Hospital Corporation Center der National Institutes of Health unter der Fördernummer U01 MH117023, und vom italienischen Bildungsministerium im Rahmen des italienischen Euro-Bioimaging Italian Node (ESFRI-Forschungsinfrastruktur). Schließlich wurde diese Forschung mit Unterstützung der "Fondazione CR Firenze" durchgeführt. Der Inhalt dieser Arbeit liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2'-thiodiethanol | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
| Acetamide >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| Agarose High EEO | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
| Boric Acid | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
| Coverslips | LaserOptex | / | customized |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| Glutaraldehyde | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
| Glycine | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
| Hydrogen Peroxide 30% | Merck Life Science S.R.L. | ||
| Incubator ISS-4075 | Lab companion | / | |
| Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) | / | / | custom-made |
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| Microscope slides | Laborchimica | / | customized |
| Phospate buffer saline tablet | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | out of production |
| Potassium Hydrogen Phtalate | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| Sodium Azide | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
| Sodium Sulfite | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
| Spacers | Microlaser srl | customized | |
| Sputum Containers (dishes with screw lids) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| Tris Base | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
| Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
| Tubes | Sarstedt | 62 547254 | |
| Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| Water bath | Memmert | WNB 7-45 | |
| Antibodies and Dyes | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-NeuN Antibody | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | Dilution used, 1:100 |
| Anti-Parvalbumin antibody (PV) | Abcam | ab32895 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM) | Abcam | ab8069 | Dilution used, 1:200 |
| Calretinin Polyclonal antibody | ProteinTech | 12278_1_AP | Dilution used, 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | Dilution used, 1:100 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed | Abcam | ab175475 | Dilution used, 1:200 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | Dilution used, 1:200 |
| Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody | Abcam | ab194324 | Dilution used, 1:200 |
| Somatostatin Antibody YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | Dilution used, 1:200 |
| Vasoactive intestinal peptide (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | Dilution used, 1:200 |
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