Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

ऑप्टिकल समाशोधन और बड़े पैमाने पर मानव मस्तिष्क इमेजिंग में प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए लेबलिंग

Published: January 26, 2024 doi: 10.3791/65960
Automatic Translation
*1, *1, *1,2, 1, 1,3, 1, 1,4,5, 1,4,6, 1,4,5
1European Laboratory for Non-linear Spectroscopy (LENS), University of Florence, 2Division of Physiology, Department of Experimental and Clinical Medicine, University of Florence, 3Department of Physics, University of Pisa, 4National Research Council - National Institute of Optics (CNR-INO), 5Department of Physics and Astronomy, University of Florence, 6Department of Biology, University of Florence
* These authors contributed equally

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल तेजी से और एक साथ ऑप्टिकल समाशोधन, म्यूटी-राउंड लेबलिंग, और पोस्टमॉर्टम मानव मस्तिष्क वर्गों के दसियों के 3 डी वॉल्यूमेट्रिक पुनर्निर्माण के लिए एक कदम-दर-चरण प्रक्रिया प्रदान करता है (एस- एच2ओ2 - एंटीजन आरएट्रीवल - 2,2'-थियोडायथेनॉल [टीडीई]) एक नियमित रूप से उच्च-थ्रूपुट प्रोटोकॉल में प्रकाश-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के साथ लघु ऊतक परिवर्तन तकनीक।

Abstract

पिछले दशक में उभरी कई समाशोधन तकनीकों के बावजूद, पोस्टमॉर्टम मानव दिमाग को संसाधित करना इसके आयामों और जटिलता के कारण एक चुनौतीपूर्ण कार्य बना हुआ है, जो माइक्रोमीटर रिज़ॉल्यूशन के साथ इमेजिंग को विशेष रूप से कठिन बनाते हैं। यह पत्र एक साथ लघु (एस- एच2ओ2 - एंटीजन आरएट्रीवल - 2,2'-थियोडायथेनॉल [टीडीई]) ऊतक परिवर्तन प्रोटोकॉल के साथ दसियों वर्गों को संसाधित करके मानव मस्तिष्क के वॉल्यूमेट्रिक भागों के पुनर्निर्माण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जो प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (एलएसएफएम) के साथ नमूनों के समाशोधन, लेबलिंग और अनुक्रमिक इमेजिंग को सक्षम बनाता है। शॉर्ट कई न्यूरोनल मार्करों के साथ मोटी स्लाइस के तेजी से ऊतक समाशोधन और सजातीय बहु-लेबलिंग प्रदान करता है, जिससे सफेद और ग्रे दोनों पदार्थों में विभिन्न न्यूरोनल उप-जनसंख्या की पहचान सक्षम होती है। समाशोधन के बाद, स्लाइस माइक्रोमीटर संकल्प के साथ LSFM के माध्यम से और एक तेजी से 3 डी पुनर्निर्माण के लिए एक साथ कई चैनलों में imaged रहे हैं. नियमित रूप से उच्च-थ्रूपुट प्रोटोकॉल के भीतर एलएसएफएम विश्लेषण के साथ शॉर्ट के संयोजन से, थोड़े समय में उच्च रिज़ॉल्यूशन पर बड़े वॉल्यूमेट्रिक क्षेत्रों के 3 डी साइटोआर्किटेक्चर पुनर्निर्माण को प्राप्त करना संभव है, इस प्रकार मानव मस्तिष्क के व्यापक संरचनात्मक लक्षण वर्णन को सक्षम करना संभव है।

Introduction

मानव मस्तिष्क के बड़े संस्करणों के 3 डी आणविक संगठन और साइटोआर्किटेक्चर का विश्लेषण करने के लिए नमूनों की ऑप्टिकल पारदर्शिता की आवश्यकता होती है, जो व्यापक प्रसंस्करण समय के साथ प्रोटोकॉल के माध्यम से प्राप्त की जाती है। ऑप्टिकल समाशोधन तकनीक ऊतकों के भीतर अपवर्तक सूचकांक (आरआई) में विषमता को कम करने के लिए विकसित किए गए थे, जिससे प्रकाश बिखरने को कम करने और उच्च संकल्प इमेजिंग 1,2,3,4,5 के लिए प्रकाश प्रवेश गहराई में वृद्धि हुई. समाशोधन और गहरी ऊतक लेबलिंग तरीकों में वर्तमान प्रगति अत्याधुनिक माइक्रोस्कोपी तकनीक 6,7,8,9,10,11,12 शोषण द्वारा बरकरार कृंतक अंगों और भ्रूण की वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग की अनुमति देते हैं.

हालांकि, पोस्टमॉर्टम मानव मस्तिष्क के बड़े क्षेत्रों का वॉल्यूमेट्रिक 3 डी पुनर्निर्माण अभी भी मॉडल जीवों की तुलना में एक चुनौतीपूर्ण कार्य का प्रतिनिधित्व करता है। जटिल जैविक संरचना और चर पोस्टमॉर्टम निर्धारण और भंडारण की स्थिति ऊतक समाशोधन दक्षता, एंटीबॉडी प्रवेश गहराई, और एपिटोप मान्यता 13,14,15,16,17,18,19से समझौता कर सकती है। इसके अलावा, यांत्रिक ऊतक सेक्शनिंग और बाद में समाशोधन और प्रत्येक टुकड़ा के लेबलिंग अभी भी एक कुशल समाशोधन और बड़े मानव मस्तिष्क क्षेत्रों की वर्दी लेबलिंग प्राप्त करने के लिए आवश्यक है, जिसके परिणामस्वरूप लंबे प्रसंस्करण समय और परिष्कृत कस्टम उपकरण की आवश्यकता होती है, मॉडल जीवों 15,20,21,22 की तुलना में।

एस- एच2हे2 - प्रतिजन आरएट्रीवल-टी डीई (लघु) ऊतक परिवर्तन तकनीक विशेष रूप से मानव मस्तिष्क18,23 की बड़ी मात्रा का विश्लेषण करने के लिए विकसित की गई है। यह विधि एपिटोप बहाली के साथ संयोजन में, ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करने के लिए स्विच प्रोटोकॉल11 के ऊतक संरचनात्मक संरक्षण और पेरोक्साइड हाइड्रोजन की उच्च सांद्रता को नियोजित करती है। लघु विभिन्न न्यूरोनल उपप्रकार, glial कोशिकाओं, वाहिका, और myelinated फाइबर18,24 के लिए मार्करों के साथ मानव मस्तिष्क स्लाइस की वर्दी धुंधला की अनुमति देता है. इसके परिणाम कम और उच्च घनत्व वाले प्रोटीन दोनों के विश्लेषण के साथ संगत हैं। जिसके परिणामस्वरूप उच्च पारदर्शिता का स्तर और वर्दी लेबलिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ मोटी स्लाइस के वॉल्यूमेट्रिक पुनर्निर्माण सक्षम, विशेष रूप से, तेजी से अधिग्रहण प्रकाश शीट तंत्र के लिए 18,24,25,26,27इस्तेमाल किया जा सकता है.

इस काम में, हम वर्णन करते हैं कि कैसे लघु ऊतक परिवर्तन तकनीक का उपयोग एक साथ समाशोधन और दसियों फॉर्मलिन-फिक्स्ड मानव मस्तिष्क वर्गों के बहु-दौर लेबलिंग के लिए किया जा सकता है। चार अलग-अलग फ्लोरोसेंट मार्करों का एक साथ उपयोग किया जा सकता है, जिससे विभिन्न सेलुलर उप-आबादी की पहचान हो सकती है। समाशोधन के बाद, उच्च संकल्प वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ किया जा सकता है. यहां, हमने एक कस्टम-निर्मित उल्टे एलएसएफएम 18,24,25,26,27 का उपयोग किया, जो नमूना के तेजी से ऑप्टिकल सेक्शनिंग और समानांतर में कई चैनलों के तेजी से अधिग्रहण को सक्षम बनाता है। इस नियमित रूप से उच्च throughput प्रोटोकॉल के साथ, यह मानव मस्तिष्क के बड़े क्षेत्रों की एक उप सेलुलर संकल्प के साथ एक व्यापक सेलुलर और संरचनात्मक लक्षण वर्णन प्राप्त करने के लिए संभव है के रूप में पहले से ही एक पूरे ब्रोका के क्षेत्र23 के मानचित्रण में प्रदर्शन किया.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल (एमजीएच) ऑटोप्सी सर्विस (बोस्टन, यूएसए) में न्यूरोपैथोलॉजी विभाग द्वारा फॉर्मलिन-फिक्स्ड मानव ऊतक के नमूने प्रदान किए गए थे। पार्टनर्स इंस्टीट्यूशनल बायोसेफ्टी कमेटी (PIBC, प्रोटोकॉल 2003P001937) से IRB-अनुमोदित ऊतक संग्रह प्रोटोकॉल के बाद, मृत्यु से पहले स्वस्थ प्रतिभागियों से लिखित सहमति प्राप्त की गई थी। प्राधिकरण दस्तावेज बोस्टन, एमए, संयुक्त राज्य अमेरिका में एमजीएच ऑटोप्सी सेवाओं के साथ रखे गए हैं, और अनुरोध पर उपलब्ध हैं।

1. Agarose एम्बेडिंग और नमूना काटने

  1. एक बीकर में 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस, पीएच 7.4) में 4% डब्ल्यू / वी अगारोज समाधान तैयार करें और ऊतक ब्लॉक को अंदर एम्बेड करें। कमरे के तापमान (आरटी) तक पहुंचने तक प्रतीक्षा करें और फिर 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. उच्च परिशुद्धता वर्गों को प्राप्त करने के लिए, वाइब्रेटोम के नमूना डिस्क पर नमूना गोंद करें और ट्रे को ठंडे 1x पीबीएस (पीएच 7.4) से भरें। कटा हुआ ऊतक के प्रकार के अनुसार आवृत्ति, आयाम, और गति जैसे वाइब्रेटोम मापदंडों को समायोजित करें (उपयोग किए गए मान: आवृत्ति = 5 (50 हर्ट्ज); आयाम = 0.4; गति = 3 (0.15 मिमी /
    नोट: नमूना मात्रा के आधार पर विभिन्न वाइब्रेटोम का उपयोग किया जाना चाहिए। 70 x 40 x 15 मिमी की अधिकतम मात्रा वाले नमूनों के लिए, एक वाइब्रेटोम (जैसे, लीका वीटी 1000 एस) का उपयोग किया जा सकता है; ठूलो नमूनाहरूको लागि, यो एक compresstome (जस्तै, VF-900-0Z Microtome18) वा एक कस्टम निर्मित उपकरण21 प्रयोग गर्न सम्भव छ। यहाँ, हम या तो 400 माइक्रोन या 500 माइक्रोन की मोटाई के साथ कटौती स्लाइस प्रस्तुत करते हैं।
  3. काटने के बाद, 0.01% w/v सोडियम एज़ाइड (NaN3) के साथ 1x पीबीएस (पीएच 7.4) से बना एक संरक्षक समाधान में सभी स्लाइस डालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: एम्बेड करने से पहले, तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि एगरोज समाधान 37 डिग्री सेल्सियस तक न पहुंच जाए। एक उच्च तापमान नमूने को नुकसान पहुंचा सकता है। यह लंबे समय तक निर्धारण एंटीजन को नुकसान पहुंचाने और ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस को बढ़ाकर लेबलिंग प्रक्रिया में हस्तक्षेप कर सकता है के रूप में 48 घंटे से अधिक के लिए पीएफए में नमूने नहीं छोड़ने की सिफारिश की है. मानव ऊतकों के दीर्घकालिक भंडारण के लिए, एनएएन3 के साथ पीबीएस का उपयोग माइक्रोबियल संदूषण को रोकने के लिए किया जाता है। NaN3 की विषाक्तता के कारण, एक रासायनिक हुड के तहत संरक्षक समाधान तैयार करें।

2. ऊतक निर्धारण

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी समाधान बड़ी मात्रा में तैयार किए जाते हैं, जो एक ही ऊतक ब्लॉक के सभी स्लाइस को संसाधित करने और तकनीकी परिवर्तनशीलता को कम करने और व्यक्तिगत चरणों के लिए समय कम करने के लिए पर्याप्त हैं।

  1. 50% v/v 1x PBS pH 3, 25% v/v 0.1 M हाइड्रोक्लोरिक एसिड (HCl), 25% v/v 0.1 M पोटेशियम हाइड्रोजन phthalate (KHP), और ताजा 4% v/v ग्लूटार्डाल्डिहाइड के साथ स्विच-ऑफ समाधान तैयार करें। पेंच ढक्कन (70 x 23 मिमी) के साथ व्यंजन में सभी नमूने प्लेस और उन्हें 1 दिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल मिलाते हुए के साथ स्विच-ऑफ समाधान के साथ सेते हैं, उन्हें एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्रकाश से बचाव.
  2. 1x पीबीएस (पीएच 7.4) और ताजा 1% वी/वी ग्लूटार्डाल्डिहाइड के साथ स्विच-ऑन समाधान तैयार करें। नए व्यंजनों में सभी नमूने प्लेस और 1 दिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल मिलाते हुए के साथ स्विच-ऑन समाधान के साथ उन्हें सेते हैं, उन्हें एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्रकाश से बचाव.
    नोट: ग्लूटार्डाल्डिहाइड की उच्च विषाक्तता और प्रकाश संवेदनशीलता के कारण, स्विच-ऑफ और स्विच-ऑन समाधान दोनों को हमेशा ताजा तैयार किया जाना चाहिए और बर्फ पर रासायनिक हुड के नीचे रखा जाना चाहिए। हमेशा प्रत्येक समाधान के 20 एमएल के साथ पकवान भरें और इसे पैराफिल्म के साथ सील करें।

3. निष्क्रियता और समाशोधन

नोट: नमूनों में प्रतिक्रियाशील ग्लूटार्डाल्डिहाइड को 1x पीबीएस पीएच 7.4, 4% w/v एसिटामाइड, 4% w/v ग्लाइसिन, पीएच 9.0 से युक्त निष्क्रियता समाधान के साथ इनक्यूबेशन द्वारा निष्क्रिय किया जाना चाहिए। समाधान अप करने के लिए 3 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है. लिपिड को हटाने और ऊतक को पारदर्शी बनाने के लिए, हम 200 एमएम सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस), 20 एमएम सोडियम सल्फाइट (ना2एसओ3), और 20 एमएम बोरिक एसिड (एच3बीओ3), पीएच 9.0 से मिलकर समाशोधन समाधान का उपयोग करते हैं। समाधान आरटी पर संग्रहित किया जाना चाहिए के रूप में एसडीएस अवक्षेपित 4 डिग्री सेल्सियस पर. निम्नलिखित सभी चरणों को समाधान से भरे ट्यूबों में किया जाएगा।

  1. व्यंजनों से नमूनों को ट्यूबों में ले जाएं और कोमल झटकों में आरटी पर 1x पीबीएस पीएच 7.4 के साथ 3 x 2 घंटे के लिए धोएं।
    नोट: चरण 3.1 के लिए, ग्लूटार्डाल्डिहाइड विषाक्तता के कारण रासायनिक हुड के तहत काम करना आवश्यक है। एसिटामाइड, एसडीएस, और बोरिक एसिड भी जहरीले अभिकर्मक हैं, और उन्हें एक रासायनिक हुड के तहत संभाला जाना चाहिए। ट्यूब को हमेशा प्रत्येक घोल के 50 एमएल से भरें।
  2. रात भर पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर निष्क्रियता समाधान में नमूनों को इनक्यूबेट करें (ओ / एन)।
  3. कोमल झटकों में आरटी पर 1x पीबीएस पीएच 7.4 में 3 x 2 घंटे के लिए धो लें।
  4. 3-7 दिनों के लिए पानी के स्नान में 55 डिग्री सेल्सियस पर समाशोधन समाधान में नमूनों को इनक्यूबेट करें। हर 2 दिनों में समाधान बदलें (तालिका 1)।

4. इम्यूनोलेबलिंग

नोट: लेबलिंग चरण से पहले, अवशिष्ट एसडीएस को हटाना, ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करना, और 10 एमएम ट्रिस बेस, 1 एमएम ईडीटीए, और 0.05% वी/वी ट्वीन 20, पीएच 9 से मिलकर एंटीजन पुनर्प्राप्ति समाधान के साथ एपिटोप्स को अनमास्क करना आवश्यक है। 9 के समाधान का पीएच एक कुशल पुनर्प्राप्ति प्रक्रिया के लिए अनुकूलित है; ट्रिस बेस एक स्थिर पीएच वातावरण बनाए रखने के लिए एक बफरिंग एजेंट के रूप में कार्य करता है; EDTA, जो एक chelating एजेंट है, एंटीजन की पहुंच को बढ़ाता है। नॉनऑनिक डिटर्जेंट ट्वीन 20 ऊतक की पारगम्यता में सुधार करने में सहायता करता है। इस समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एंटीजन पुनर्प्राप्ति चरण के साथ संयुक्त हाइड्रोजन पेरोक्साइड का गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि संकेत (जैसे लिपोफ्यूसिन) के लिए जिम्मेदार अंतर्जात फ्लोरोफोर्स को तोड़कर और/या संशोधित करके, ऑटोफ्लोरेसेंस सिग्नल को कम करने में एक सहक्रियात्मक प्रभाव पड़ता है।

  1. 0.1% वी/वी ट्राइटन एक्स-100 (पीबीएसटी) के साथ 1x पीबीएस तैयार करें, इसे 37 डिग्री सेल्सियस तक प्रीवार्म करें, और इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोमल झटकों में दिन के दौरान नमूने 3 x 3 घंटे धोएं। अंतिम धोने ओ / एन छोड़ दें।
    नोट: पीबीएसटी स्टॉक समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। ऊतक से एसडीएस को निकालना महत्वपूर्ण है क्योंकि यह कम तापमान पर अघुलनशील अवक्षेप बना सकता है जो बाद की अधिग्रहण प्रक्रियाओं में हस्तक्षेप कर सकता है।
  2. अगले दिन, प्रत्येक नमूने में 30% वी/वी हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2) के 10 एमएल जोड़ें और इसे 45 मिनट के लिए आरटी पर कोमल झटकों के साथ छोड़ दें।
  3. आरटी पर कोमल मिलाते हुए के साथ 1x पीबीएस (पीएच 7.4) के साथ 3 x 10 मिनट धो लें।
  4. पानी के स्नान में 95 डिग्री सेल्सियस पर एंटीजन पुनर्प्राप्ति समाधान को पहले से गरम करें; नमूनों को गर्म समाधान में स्थानांतरित करें और उन्हें 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
  5. नमूनों को कोमल झटकों में 40 मिनट के लिए आरटी तक ठंडा होने दें।
  6. कोमल मिलाते हुए में विआयनीकृत पानी के साथ 3 x 5 मिनट धो लें.
  7. 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में नमूनों को संतुलित करें।
  8. 0.01% w/v NaN3 के साथ PBST से बने ताजा एंटीबॉडी समाधान तैयार करें (चरण 1.3 के लिए नोट देखें) और प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें। कोमल मिलाते हुए और प्रकाश से सुरक्षा (तालिका 2) के साथ एक इनक्यूबेटर में एन दिनों (1-7) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पेंच ढक्कन के साथ व्यंजन में समाधान के साथ नमूने सेते हैं।
    नोट: इनक्यूबेशन समय आकार- और मोटी-निर्भर (तालिका 1 और तालिका 2) है।
  9. एन दिनों के बाद, ट्यूबों में नमूने ले जाने और इनक्यूबेटर में कोमल मिलाते हुए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर prewarmed PBST के साथ 3 एक्स 2 घंटे धो लें.
  10. 0.01% डब्ल्यू / वी एनएएन3 के साथ पीबीएसटी में माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें और कोमल झटकों के साथ एक इनक्यूबेटर में एन दिनों (1-6) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पेंच ढक्कन के साथ नए व्यंजन में नमूने सेते हैं और प्रकाश से संरक्षित (तालिका 1 और तालिका 2)।
  11. एन दिनों के बाद, ट्यूबों के लिए नमूने हस्तांतरण और एक कोमल मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर prewarmed PBST के साथ दिन के दौरान 3 एक्स 3 घंटे धोने. अंतिम धोने ओ / एन छोड़ दें।
    नोट: जैसा कि ट्राइटन एक्स -100 और ट्वीन 20 चिपचिपा हैं, टिप को भरने की अनुमति देने के लिए धीरे-धीरे विंदुक करें। ट्यूब को हमेशा प्रत्येक घोल के 50 एमएल से भरें। प्रत्येक नमूने के लिए एंटीबॉडी समाधान के 10 एमएल का उपयोग करें और समाधान के वाष्पीकरण को रोकने के लिए पैराफिल्म के साथ पकवान को सील करें। चूंकि एंटीबॉडी समाधान में एनएएन 3 होता है, इसलिए उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और 2 सप्ताह के भीतर नए नमूनों को लेबल करने के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है।

5. अपवर्तक सूचकांक मिलान

नोट: उच्च स्तर की पारदर्शिता प्राप्त करने के लिए, ऊतक अपवर्तक सूचकांक को समरूप बनाना आवश्यक है। यहां हम 1x पीबीएस में पतला 2,2'-थियोडायथेनॉल (टीडीई) का उपयोग करते हैं। टीडीई समाधान आरटी पर संग्रहीत किया जाना चाहिए।

  1. नमूनों को नए व्यंजनों में स्थानांतरित करें, 30% वी/वी टीडीई जोड़ें, और उन्हें आरटी पर कोमल झटकों के साथ 4 घंटे के लिए छोड़ दें।
  2. 30% वी/वी टीडीई समाधान निकालें, नमूनों में 68% वी/वी टीडीई जोड़ें, और उन्हें आरटी पर कोमल झटकों के साथ छोड़ दें।
    नोट: चूंकि टीडीई चिपचिपा है, टिप को भरने की अनुमति देने के लिए धीरे-धीरे विंदुक है। टीडीई वाष्प या धुंध की साँस लेना श्वसन प्रणाली को परेशान कर सकता है। इसलिए, एक अच्छी तरह हवादार क्षेत्र में काम करना या जोखिम को कम करने के लिए धूआं हुड का उपयोग करना उचित है। टीडीई समाधानों को आरटी पर संग्रहित किया जाना चाहिए। प्रत्येक नमूने के लिए टीडीई समाधान के 10 एमएल का उपयोग करें।

6. नमूना बढ़ते

नोट: नमूना बढ़ते और LSFM छवि अधिग्रहण की सुविधा के लिए, हम एक कस्टम-निर्मित, सील नमूना धारक (जिसे "सैंडविच" कहा जाता है) का उपयोग करते हैं, जिसमें तीन भाग होते हैं: एक माइक्रोस्कोप स्लाइड, एक स्पेसर और एक कवरस्लिप।

  1. स्टील स्पेसर (56 एक्स 56 एक्स 0.5 मिमी3) माइक्रोस्कोप स्लाइड (60 एक्स 60 एक्स 1 मिमी3) पर रखो और माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर नमूना रखना.
  2. ध्यान से क्वार्ट्ज coverslip (60 x 60 x 0.5 मिमी3) डाल दिया, सब कुछ एक साथ क्लिप, और एक 1: 1 अनुपात में एक दो घटक सिलिकॉन गोंद तैयार. अपवर्तक सूचकांक से मेल खाने और अधिग्रहण प्रक्रिया के दौरान ऑप्टिकल विपथन को कम करने के लिए एक क्वार्ट्ज coverslip का प्रयोग करें.
  3. एक 1 एमएल सिरिंज का प्रयोग, एक दो घटक सिलिकॉन गोंद के साथ स्पेसर और coverslip के बीच की जगह भरें और यह 10 मिनट के लिए सूखी चलो.
  4. क्लिप निकालें और 68% v/v TDE के साथ पूरे सैंडविच को धीरे-धीरे भरने के लिए एक छोटी सुई का उपयोग करें।
  5. ताजा गोंद बनाएं और सैंडविच को सील करें।
    नोट: यदि टीडीई गलती से चरण 6.1 में स्पेसर तक पहुंच जाता है, तो गोंद ठीक नहीं होगा। सुनिश्चित करें कि कोई हवाई बुलबुले कदम 6.2 के दौरान फार्म.

7. स्ट्रिपिंग

नोट: संरचनात्मक संरक्षण और शॉर्ट की बढ़ी हुई एपिटोप पहुंच एंटीबॉडी को हटाकर और अन्य मार्करों के साथ नमूनों को बनाए रखकर स्लाइस के बहु-दौर लेबलिंग की अनुमति देती है।

  1. एक ब्लेड के साथ सैंडविच खोलें, नमूनों को 30% वी / वी टीडीई से भरे पेंच ढक्कन के साथ नए व्यंजनों में डालें, और उन्हें 3 घंटे के लिए छोड़ दें।
  2. नमूनों को ट्यूबों में स्थानांतरित करें, कोमल झटकों के साथ आरटी पर 1x पीबीएस (पीएच 7.4) में 3 x 2 घंटे के लिए धोएं, और अंतिम धोने ओ / एन छोड़ दें।
  3. 4 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में समाशोधन समाधान में नमूने रखें.
  4. कोमल मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1x पीबीएसटी (पीएच 7.4) में 3 x 2 घंटे के लिए धो लें और अंतिम धोने ओ / एन छोड़ दें। अब नमूना चरण 4.8 से शुरू फिर से लेबल किया जा करने के लिए तैयार है.
    नोट: हमेशा ट्यूब को प्रत्येक समाधान के 50 एमएल से भरें। प्रत्येक नमूने के लिए टीडीई समाधान के 10 एमएल का उपयोग करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल लघु विधि का उपयोग कर, 100 माइक्रोन से 500 माइक्रोन तक मोटाई में लेकर, कई स्लाइस के एक साथ उपचार सक्षम बनाता है. यह दृष्टिकोण पूरी प्रक्रिया के लिए समग्र प्रसंस्करण समय को काफी कम कर देता है। इस काम में, हम एक साथ कई पोस्टमॉर्टम मानव मस्तिष्क मोटी वर्गों प्रसंस्करण के लिए पूरी पाइपलाइन (चित्रा 1) का एक व्यापक विवरण प्रदान करते हैं और हम एक बार में 24 स्लाइस पर प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करते हैं (चित्रा 2 ए)। समाशोधन और सह-लेबलिंग की अवधि 11 से 30 दिनों तक होती है, नमूने के आकार और मोटाई (तालिका 1) पर विचार करते हुए, इमेजिंग और पोस्टइमेजिंग प्रसंस्करण को छोड़कर। टीडीई में लिपिडेशन और अपवर्तक सूचकांक मिलान के बाद, सभी ऊतक स्लाइस की इष्टतम और सजातीय पारदर्शिता ग्रे और सफेद पदार्थ(चित्रा 2बी)दोनों में हासिल की जाती है।

छवि अधिग्रहण confocal25 और दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी14 सहित विभिन्न उन्नत प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप, के साथ किया जा सकता है. यहां, हमने चार उत्तेजना लेजर लाइनों से लैस एक कस्टम-निर्मित उल्टे एलएसएफएम18,23 का उपयोग किया: 405 एनएम, 488 एनएम, 561 एनएम, और 638 एनएम, फ्लोरोफोरे-संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ लेबल किए गए चार अलग-अलग जैविक विशेषताओं को प्राप्त करने में सक्षम। चित्रा 3 ए मानव ब्रोका के क्षेत्र से 400 माइक्रोन-मोटी स्लाइस की प्रतिनिधि छवियां दिखाता है, जो न्यूएन, एक पैन-न्यूरोनल मार्कर, सोमाटोस्टैटिन (एसएसटी), और कैलेटिनिन (सीआर) के लिए सह-लेबल किया गया है, जो इंटरन्यूरॉन्स के दो अलग-अलग उप-जनसंख्या और परमाणु मार्कर डीएपीआई (चित्रा 3ए, बी)को लेबल करता है। 400 माइक्रोन मोटी स्लैब में, हमने देखा कि जेड के साथ वैश्विक प्रतिदीप्ति सतह तक सीमित नहीं है, लेकिन यह ऊतक गहराई में लगभग समान है, हालांकि सिग्नल की तीव्रता बीच में थोड़ी कम हो जाती है (चित्रा 3सी)।

मानव मस्तिष्क के ऊतकों के अधिक व्यापक सेलुलर लक्षण वर्णन को प्राप्त करने के लिए, एंटीबॉडी को अलग करके और लघु मूल पेपर में दिखाए गए नमूने को फिर से लेबल करके एक ही नमूनों के बहु-दौर लेबलिंग करना संभव है। चित्रा 4 (Pesce एट अल 18 से अनुकूलित) इम्यूनोस्टेनिंग के लगातार तीन राउंड में शॉर्ट के साथ संसाधित 500 माइक्रोन-मोटी ऊतक स्लाइस पर सात अलग-अलग एंटीबॉडी के संभावित अनुप्रयोग को दर्शाता है। उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी में न्यूएन, एसएसटी, सीआर, परवलबुमिन (पीवी), और वासोएक्टिव आंतों पेप्टाइड (वीआईपी) को निरोधात्मक न्यूरोनल मार्कर, ग्लियल कोशिकाओं के लिए ग्लियाल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) और वास्कुलचर (तालिका 2) के लिए विमेंटिन (वीआईएम) शामिल हैं। परिणाम विभिन्न स्ट्रिपिंग प्रक्रियाओं में ऊतक की जानकारी को संरक्षित करने, ऑटोफ्लोरेसेंस संकेतों को प्रभावी ढंग से कम करने और कुशल नमूना समाशोधन प्राप्त करने के लिए SHORT की उल्लेखनीय क्षमता प्रदर्शित करते हैं।

Figure 1
चित्र 1: लघु की समयरेखा। लघु प्रोटोकॉल के साथ नमूनों को संसाधित करने के लिए आवश्यक चरणों का प्रतिनिधित्व करने वाली योजना। प्रत्येक चरण में, दसियों मानव मस्तिष्क के ऊतकों के स्लैब को एक साथ संसाधित किया जाता है। agarose और टुकड़ा करने की क्रिया में एम्बेड करने के बाद, नमूने प्रत्येक 1 दिन के लिए स्विच-ऑन और स्विच-ऑफ समाधान में रखे जाते हैं; निष्क्रियता चरणों को रातोंरात किया जाता है जबकि समाशोधन समाधान में इनक्यूबेशन के माध्यम से लिपिडेशन के लिए 3-7 दिनों की आवश्यकता होती है। बाद में, नमूनों को क्रमशः अधिकतम 7 और 6 दिनों के लिए प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी समाधानों के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। अपवर्तक सूचकांक मिलान के बाद, नमूने एलएसएफएम इमेजिंग और भंडारण के लिए नमूना धारक (सैंडविच) में लगाए जाते हैं। सैंडविच असेंबली के बाद किसी भी समय, नमूने छीन लिए जा सकते हैं और विभिन्न मार्करों का पता लगाने के लिए पुन: लेबल किए जा सकते हैं। संक्षिप्ताक्षर: टीडीई = 2,2'-थियोडिथेनॉल; लघु = एस- एच2ओ2 - एंटीजन आरएट्रिवल -टीडीई; o/n = रातोंरात; RI = अपवर्तक सूचकांक; LSFM = प्रकाश चादर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एक ब्रोका क्षेत्र के ब्लॉक से मानव मस्तिष्क स्लाइस एक साथ संसाधित। (ए) लघु विधि के साथ प्रसंस्करण से पहले पीबीएस में 4 x 4 x 0.04 सेमी3 के ब्रोका के क्षेत्र से चौबीस लगातार स्लाइस। (बी) ए में एक ही नमूने लघु प्रसंस्करण के बाद दिखाया गया है। स्केल बार = 1 सेमी। संक्षिप्ताक्षर: टीडीई = 2,2'-थियोडिथेनॉल; लघु = एस- एच2ओ2 - एंटीजन आरएट्रिवल -टीडीई; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर खारा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. चार अलग मार्करों के साथ लेबल एक स्पष्ट टुकड़ा के प्रतिनिधि LSFM छवियों. (ए) अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण छवियां (3.3 x 3.3 x 3.3 माइक्रोन3 का संकल्प) ब्रोका के क्षेत्र के एक लघु-संसाधित टुकड़े का एक मेसोस्कोपिक पुनर्निर्माण दिखा रही है जिसे न्यूएन, सोमाटोस्टैटिन, कैलेटिनिन और परमाणु मार्कर डीएपीआई के लिए लेबल किया गया है। दाईं ओर, मर्ज की गई छवि (NeuN-SST-CR-DAPI) दिखाई गई है। स्केल बार = 0.5 सेमी। (बी) ए में मर्ज किए गए छवि का आवर्धित निवेशन। स्केल बार = 100 माइक्रोन। (सी) उच्च संकल्प (0.55 x 0.55 x 3.3 माइक्रोन) yz छवियों से (बी). स्केल बार = 100 माइक्रोन। संक्षिप्ताक्षर: टीडीई = 2,2'-थियोडिथेनॉल; लघु = एस- एच2ओ2 - एंटीजन आरएट्रिवल -टीडीई; LSFM = प्रकाश चादर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी; NeuN = न्यूरोनल न्यूक्लियर एंटीजन; एसएसटी = सोमाटोस्टैटिन; सीआर = कैलेटिनिन; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: लघु संसाधित स्लाइस में बहु दौर धुंधला हो जाना के प्रतिनिधि LSFM छवियों. (ए) एक मानव मस्तिष्क टुकड़ा preclearing की छवियाँ (पीबीएस में) और अपवर्तक सूचकांक मिलान (68% TDE) के साथ बहु दौर लेबलिंग के बाद. स्केल बार = 1 सेमी। (बी) तीन बाद के बहु-दौर के दौरान प्राप्त विभिन्न चैनलों का विलय। छवि वासोएक्टिव आंतों पेप्टाइड, सोमाटोस्टैटिन, पार्वलबुमिन, कैलेटिनिन, न्यूरोनल न्यूक्लियर एंटीजन, ग्लियल फाइब्रिलरी एसिडिक प्रोटीन और विमेंटिन के साथ लेबल किए गए सफेद और भूरे रंग के पदार्थ दोनों को दिखाती है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन (0.55 x 0.55 x 3.3 माइक्रोन का रिज़ॉल्यूशन), एकल-चैनल छवियां दाईं ओर और छवि के नीचे दिखाई जाती हैं। GFAP (स्केल बार 10 = μm) को छोड़कर सभी छवियों के लिए स्केल बार = 100 माइक्रोन। (सी)500 माइक्रोन-मोटी टुकड़ा की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण छवियों immunostaining के तीन अनुक्रमिक दौर में इस्तेमाल किया सात अलग एंटीबॉडी से संकेत दिखा. राउंड 1: PV-SST-VIP; राउंड 2: सीआर-एसएसटी-एनईयूएन; राउंड 3: वीआईएम-एसएसटी-जीएफएपी। स्केल बार = 1 मिमी। यह आंकड़ा Pesce et al.18 से संशोधित किया गया था। संक्षिप्ताक्षर: टीडीई = 2,2'-थियोडिथेनॉल; लघु = एस- एच2ओ2 - एंटीजन आरएट्रिवल -टीडीई; LSFM = प्रकाश चादर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी; NeuN = न्यूरोनल न्यूक्लियर एंटीजन; एसएसटी = सोमाटोस्टैटिन; सीआर = कैलेटिनिन; पीवी = पैरावलब्यूमिन; GFAP = ग्लियाल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन; विम = विमेंटिन; वीआईपी = वासोएक्टिव आंतों पेप्टाइड। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: क्षेत्रों और मोटाई की एक श्रृंखला के साथ नमूनों के लिए SHORT की प्रतिनिधि समय लंबाई। विभिन्न क्षेत्रों और मोटाई वाले नमूनों को समाशोधन और एंटीबॉडी समाधानों में एक चर इनक्यूबेशन समय की आवश्यकता होती है, जिसके परिणामस्वरूप पूरे शॉर्ट पाइपलाइन के लिए अलग-अलग समय लंबाई होती है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 2: शॉर्ट के साथ संगत एंटीबॉडी। तालिका उन सभी एंटीबॉडी को सूचीबद्ध करती है जिन्हें शॉर्ट प्रोटोकॉल के साथ परीक्षण किया गया था और 400-500 माइक्रोन मोटी मानव मस्तिष्क के नमूनों में विशिष्ट धुंधला दिखाया गया था। P/M कॉलम पॉलीक्लोनल और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी को दर्शाता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

बड़े मानव मस्तिष्क क्षेत्रों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग और 3 डी पुनर्निर्माण के लिए ऑप्टिकल समाशोधन और एकल स्लाइस के इम्यूनोलेबलिंग के बाद यांत्रिक ऊतक सेक्शनिंग की आवश्यकता होती है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल LSFM के साथ एक उपकोशिकीय संकल्प के साथ 3 डी मस्तिष्क पुनर्निर्माण के लिए कई मानव मस्तिष्क मोटी वर्गों के तेजी से और एक साथ प्रसंस्करण के लिए लघु ऊतक परिवर्तन विधि का उपयोग कैसे किया जा सकता है का वर्णन करता है.

अन्य दृष्टिकोणों के विपरीत, शॉर्ट विधि के साथ समाशोधन और बहु-लेबलिंग चरणों को परिष्कृत अनुकूलित उपकरणों की आवश्यकता नहीं होती है। नमूनों का एक बड़ा हिस्सा पूरी तरह से संसाधित किया जा सकता है, बड़े मानव मस्तिष्क के ऊतकों के प्रसंस्करण समय को कम करता है और तकनीकी परिवर्तनशीलता को कम करता है।

वृद्ध, फॉर्मेलिन-फिक्स्ड मानव ऊतकों के साथ काम करते समय डिकोलोराइजेशन और एपिटोप अनमास्किंग उपचार महत्वपूर्ण हैं। हाइड्रोजन पेरोक्साइड और क्षारीय प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान का उपयोग अन्य समाशोधन विधियों जैसे कि iDISCO 6,28, स्पष्टता, स्विच और SHIELD24 के संयोजन में भी किया जा सकता है।

एपिटोपल जानकारी के संरक्षण को सुनिश्चित करने और ग्रे और सफेद पदार्थ दोनों के समान समाशोधन को प्राप्त करने के लिए, नमूने को जेल / ऊतक संकर में बदलना आवश्यक है जो गर्मी और रासायनिक अभिकर्मकों के लिए प्रतिरोधी है। ग्लूटार्डाल्डिहाइड को इसकी उत्कृष्ट क्रॉसलिंकिंग क्षमता और कम पीएच (पीएच = 3) पर ऊतक स्लैब में घुसने की क्षमता के लिए चुना गया था। ग्लूटार्डाल्डिहाइड की एकाग्रता ऊतक की ताकत और स्पष्टता का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण कारक है। एक उच्च एकाग्रता ऊतक संरचना के बेहतर संरक्षण की ओर जाता है, लेकिन समाशोधन के लिए आवश्यक समय भी बढ़ाता है। यह विकल्प एपिटोप संरक्षण और सजातीय समाशोधन के संदर्भ में वांछित परिणामों को सक्षम बनाता है। स्विच-ऑफ समाधान (प्रोटोकॉल चरण 2.1) के मामले में, ग्लूटार्डाल्डिहाइड की एकाग्रता को ध्यान से चुना गया है और प्रभावी क्रॉसलिंकिंग और तेजी से समाशोधन18,25 के बीच संतुलन बनाने के लिए अनुकूलित किया गया है। लघु विशेष रूप से ब्रोका के क्षेत्र, हिप्पोकैम्पस, और cortical प्रांतस्था 18,23,25 से formalin-तय मानव मस्तिष्क स्लाइस के साथ काम करने के लिए सिलवाया है. हालांकि, अन्य जैविक मॉडल या विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों के साथ काम करते समय, ग्रे और सफेद पदार्थ की संरचना में भिन्नता के कारण कुछ संशोधन आवश्यक हो सकते हैं।

इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण कार्य समाशोधन (प्रोटोकॉल चरण 3.4) और एंटीबॉडी समाधान (प्रोटोकॉल चरण 4.8 और 4.10) में इनक्यूबेशन समय का अनुकूलन भी है, मुख्य रूप से नमूना आकार और ऊतक जैविक संरचना से संबंधित है। हमने अनुमान लगाया है कि 500 माइक्रोन सफेद और भूरे रंग के पदार्थ दोनों में इष्टतम पारदर्शिता प्राप्त करने के लिए ऊतक मोटाई सीमा का प्रतिनिधित्व करते हैं और कई एंटीबॉडी धुंधला (तालिका 2) के लिए ऊतक गहराई में वर्दी लेबलिंग करते हैं। इन प्रक्रियाओं का विस्तृत विवरण Pesce et al.18 और Scardigli et al.24 में पाया जा सकता है। विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में लिपिड और प्रोटीन में एक अलग संरचना हो सकती है, और वृद्ध दिमाग लिपोफ्यूसिन-प्रकार के पिगमेंट और न्यूरोमेलेनिन की एक उच्च सामग्री विकसित करते हैं जो एक मजबूत ऑटोफ्लोरेसेंस सिग्नल उत्पन्न करते हैं और पूरे ऊतक में जांच प्रसार को बदलते हैं। एक उदाहरण के रूप में, मानव ब्रोका के क्षेत्र से 16 सेमी2 के 400 माइक्रोन मोटी स्लाइस को उच्च स्तर के लिपिकरण तक पहुंचने के लिए समाशोधन समाधान के साथ 7 दिनों के उपचार की आवश्यकता होती है। ऊतक गहराई भर में एक समान धुंधला सुनिश्चित करने के लिए, यह क्रमशः 7 और 6 दिनों के लिए प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ इनक्यूबेशन की आवश्यकता है(चित्रा 3). समाशोधन और लेबलिंग चरणों के लिए एक अच्छा अनुकूलन इसलिए यहां वर्णित उच्च-थ्रूपुट प्रोटोकॉल के आवेदन से पहले आवश्यक है।

शॉर्ट कस्टम-निर्मित इमेजिंग धारक में नमूनों को संग्रहीत करने में सक्षम बनाता है क्योंकि यह प्रदर्शित किया गया है कि फ्लोरोसेंट सिग्नल कम से कम एक वर्ष के लिए संरक्षित है। इसलिए शोधकर्ता सभी सैंडविच को पहले से तैयार कर सकते हैं और उन्हें इमेजिंग चरण के लिए स्टोर कर सकते हैं जो बाद में किया जा सकता है। विशेष रूप से, सैंडविच तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले माइक्रोस्कोप स्लाइड, स्पेसर और कवर ग्लास को नमूने के आकार के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है।

यहाँ वर्णित लघु प्रोटोकॉल के साथ संसाधित नमूने एक कस्टम बनाया उल्टे LSFM18,23 का उपयोग कर विश्लेषण किया गया. इस सेटअप में अपवर्तक सूचकांक (आरआई) सुधार कॉलर के साथ 12x कस्टम-निर्मित उद्देश्यों से लैस दो हथियार शामिल हैं। प्रत्येक उद्देश्य एक ही समय में एक रोशनी और पहचान शाखा के रूप में कार्य करता है, जिससे 0.16 सेमी3 / घंटा की वॉल्यूमेट्रिक गति से दो चैनलों के एक साथ अधिग्रहण की अनुमति मिलती है। नमूना धारक एक समय में दो सैंडविच समायोजित कर सकते हैं के रूप में, हम लगातार 10 घंटे में दो स्लाइस में चार चैनलों छवि करने में सक्षम हैं. श्वसन प्रणाली के लिए टीडीई वाष्प की हल्की विषाक्तता के कारण, गोलाकार विपथन से बचने के लिए, नमूना धारक 91% वी/वी ग्लिसरॉल/पानी के घोल से भरा होता है जो क्वार्ट्ज कवरस्लिप और टीडीई समाधान दोनों के आरआई (1.46) से मेल खाता है। धूल संदूषण से बचने के लिए 91% वी/वी ग्लिसरॉल/पानी के घोल को हर 3 दिनों में बदलना चाहिए। इसलिए, हमारे एलएसएफएम 18,23,29 के बाद 3.6 माइक्रोन के आइसोट्रोपिक रिज़ॉल्यूशन पर कम फोटोब्लीचिंग के साथ नमूनों के तेजी से अधिग्रहण को सक्षम बनाता है। उत्पादित डेटा की बड़ी मात्रा को एक स्व-विकसित सॉफ्टवेयर, ज़ेटास्टिचर (https://github.com/lens-biophotonics/ZetaStitcher)23,29का उपयोग करके छवि स्टैक के पुन: टुकड़ा करने की क्रिया और सिलाई के लिए एक परिभाषित पाइपलाइन का उपयोग करके संसाधित किया गया था।

यद्यपि हमने प्रकाश-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में लघु का उपयोग किया, प्रयोगशाला और विशिष्ट अनुप्रयोगों की उपलब्धता के आधार पर अधिग्रहण के लिए विभिन्न प्रकार की प्रतिदीप्ति इमेजिंग तकनीकों को नियोजित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी25 या दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी14 का उपयोग साफ नमूनों का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। विश्लेषण के इस प्रकार के अपेक्षाकृत छोटे संस्करणों के साथ नमूने के लिए सिफारिश की है के बाद से वे स्कैनिंग आधारित सिस्टम हैं और बड़े ऊतक क्षेत्रों के लिए अधिग्रहण समय बहुत लंबा30 है. तेजी से इमेजिंग और decoupling पार्श्व और अक्षीय संकल्प को प्राप्त करके, प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी मंजूरी दे दी नमूनों 3,4,18,31,32,33 की बड़ी मात्रा इमेजिंग के लिए पसंदीदा तरीका है.

संक्षेप में, हमने एक साथ समाशोधन, सजातीय सह-लेबलिंग, और दर्जनों पोस्टमॉर्टम मानव मस्तिष्क वर्गों के 3 डी वॉल्यूमेट्रिक पुनर्निर्माण के लिए एक तेजी से उच्च-थ्रूपुट प्रोटोकॉल का वर्णन किया। एलएसएफएम इमेजिंग और कम्प्यूटेशनल विश्लेषण के साथ शॉर्ट के संयोजन से, मानव मस्तिष्क के व्यापक सेल जनगणना और प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए त्रि-आयामी डेटा प्राप्त करना संभव है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि अनुसंधान किसी भी वाणिज्यिक या वित्तीय संबंधों की अनुपस्थिति में आयोजित किया गया था जिसे संभावित हितों के टकराव के रूप में माना जा सकता है।

Acknowledgments

हम इस अध्ययन में विश्लेषण किए गए मानव मस्तिष्क के नमूने प्रदान करने के लिए ब्रूस फिशल, मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल, एए मार्टिनोस सेंटर फॉर बायोमेडिकल इमेजिंग, रेडियोलॉजी विभाग का धन्यवाद करते हैं। इस परियोजना को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार फ्रेमवर्क कार्यक्रम से अनुदान समझौते संख्या 654148 (लेसरलैब-यूरोप) के तहत, विशिष्ट अनुदान समझौते संख्या 785907 (मानव मस्तिष्क परियोजना SGA2) और नंबर 945539 (मानव मस्तिष्क परियोजना SGA3) के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के जनरल हॉस्पिटल कॉर्पोरेशन सेंटर से विशिष्ट अनुदान समझौते संख्या (मानव मस्तिष्क परियोजना SGA2) के MH117023 तहत अनुसंधान और नवाचार के लिए यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से वित्त पोषण प्राप्त हुआ। और यूरो-बायोइमेजिंग इतालवी नोड (ईएसएफआरआई अनुसंधान बुनियादी ढांचे) के ढांचे में शिक्षा के लिए इतालवी मंत्रालय से। अंत में, यह शोध "फोंडाजियोन सीआर फिरेंज़े" के योगदान के साथ किया गया था। इस काम की सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करें। चित्रा 1 BioRender.com के साथ बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,2'-thiodiethanol Merck Life Science S.R.L. 166782
Acetamide >= 99.0% (GC) Merck Life Science S.R.L. 160
Agarose High EEO Merck Life Science S.R.L. A9793
Boric Acid Merck Life Science S.R.L. B7901
Compressome VF-900-0Z Microtome Precisionary /
Coverslips LaserOptex / customized
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Merck Life Science S.R.L. E5134
Glutaraldehyde Merck Life Science S.R.L. G7651
Glycine Santa Cruz Biotechnology SC_29096
Hydrogen Peroxide 30% Merck Life Science S.R.L.
Incubator ISS-4075 Lab companion  /
Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) / / custom-made
Loctite Attak Henkel Italia srl /
Microscope slides Laborchimica / customized
Phospate buffer saline tablet Merck Life Science S.R.L. P4417
Picodent Twinsil Picodent 13005002 out of production
Potassium Hydrogen Phtalate Merck Life Science S.R.L. P1088
Sodium Azide Merck Life Science S.R.L. S2002
Sodium Dodecyl Sulfate Merck Life Science S.R.L. L3771
Sodium Sulfite Merck Life Science S.R.L. S0505
Spacers Microlaser srl customized
Sputum Containers (dishes with screw lids) Paul Boettger GmbH & Co. KG 07.061.2000
Tris Base PanReac AppliChem (ITW reagents) A4577,0500
Triton X-100 Merck Life Science S.R.L. T8787
Tubes Sarstedt 62 547254
Tween 20 Merck Life Science S.R.L. P9416
Vibratome VT1000S Leica Biosystem /
Water bath  Memmert WNB 7-45
Antibodies and Dyes
Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immuno Reasearch 611-545-215 Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) Jackson Immuno Reasearch 805-545-180 Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immuno Reasearch 611-605-215 Dilution used, 1:200
Anti-NeuN Antibody Merck Life Science S.R.L. ABN91 Dilution used, 1:100
Anti-Parvalbumin antibody (PV) Abcam ab32895 Dilution used, 1:200
Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM) Abcam ab8069 Dilution used, 1:200
Calretinin Polyclonal antibody ProteinTech 12278_1_AP Dilution used, 1:200
DAPI ThermoFisher D3571 Dilution used, 1:100
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) Abcam ab175700 Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) Abcam ab150107 Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) Abcam ab175470 Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed Abcam ab175475 Dilution used, 1:200
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) Abcam ab150169 Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) Abcam ab175711 Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) Abcam ab150171 Dilution used, 1:500
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) Abcam ab150077 Dilution used, 1:200
Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody Abcam ab194324 Dilution used, 1:200
Somatostatin Antibody YC7 Santa Cruz Biotechnology sc-47706 Dilution used, 1:200
Vasoactive intestinal peptide (VIP) ProteinTech 16233-1-AP Dilution used, 1:200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251 (2019).
  2. Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).
  3. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
  4. Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nature Protocols. 16 (6), 2732-2748 (2021).
  5. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 713-741 (2016).
  6. Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  7. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
  8. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6 (1), 18631 (2016).
  9. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
  10. Lee, H., Park, J. -H., Seo, I., Park, S. -H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14 (1), 48 (2014).
  11. Murray, E., et al. Simple, Scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
  12. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
  13. Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
  14. Costantini, I., et al. Large-scale, cell-resolution volumetric mapping allows layer-specific investigation of human brain cytoarchitecture. Biomedical Optics Express. 12 (6), 3684 (2021).
  15. Lai, H. M., et al. Next generation histology methods for three-dimensional imaging of fresh and archival human brain tissues. Nature Communications. 9 (1), 1066 (2018).
  16. Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812.e19 (2020).
  17. Costantini, I., et al. Autofluorescence enhancement for label-free imaging of myelinated fibers in mammalian brains. Scientific Reports. 11 (1), 8038 (2021).
  18. Pesce, L., et al. 3D molecular phenotyping of cleared human brain tissues with light-sheet fluorescence microscopy. Communications Biology. 5 (1), 447 (2022).
  19. Schueth, A., et al. Efficient 3D light-sheet imaging of very large-scale optically cleared human brain and prostate tissue samples. Communications Biology. 6 (1), 170 (2023).
  20. Morawski, M., et al. Developing 3D microscopy with CLARITY on human brain tissue: Towards a tool for informing and validating MRI-based histology. NeuroImage. 182, 417-428 (2018).
  21. Park, J., et al. Integrated platform for multi-scale molecular imaging and phenotyping of the human brain. bioRxiv. , (2022).
  22. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  23. Costantini, I., et al. A cellular resolution atlas of Broca's area. Science Advances. (9), eadg3844 (2023).
  24. Scardigli, M., et al. Comparison of different tissue clearing methods for three-dimensional reconstruction of human brain cellular anatomy using advanced imaging techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 752234 (2021).
  25. Pesce, L., et al. Exploring the human cerebral cortex using confocal microscopy. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 168, 3-9 (2022).
  26. Keller, P. J., Dodt, H. -U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
  27. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  28. Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173.e12 (2017).
  29. Sorelli, M., et al. Fiber enhancement and 3D orientation analysis in label-free two-photon fluorescence microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 4160 (2023).
  30. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  31. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369 (2021).
  32. Costantini, I., et al. Editorial: The human brain multiscale imaging challenge. Frontiers in Neuroanatomy. (16), 1060405 (2022).
  33. Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5 (1), 9808 (2015).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 203
ऑप्टिकल समाशोधन और बड़े पैमाने पर मानव मस्तिष्क इमेजिंग में प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए लेबलिंग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Di Meo, D., Ramazzotti, J.,… More

Di Meo, D., Ramazzotti, J., Scardigli, M., Cheli, F., Pesce, L., Brady, N., Mazzamuto, G., Costantini, I., Pavone, F. S. Optical Clearing and Labeling for Light-sheet Fluorescence Microscopy in Large-scale Human Brain Imaging. J. Vis. Exp. (203), e65960, doi:10.3791/65960 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter