Summary
El presente protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para la limpieza óptica rápida y simultánea, el marcaje multirredondo y la reconstrucción volumétrica en 3D de decenas de secciones cerebrales humanas postmortem mediante la combinación de la técnica de transformación tisular corta (S WITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-tiodiethanol [TDE]) con imágenes de microscopía de fluorescencia de lámina de luz en un protocolo rutinario de alto rendimiento.
Abstract
A pesar de las numerosas técnicas de aclaramiento que surgieron en la última década, el procesamiento de cerebros humanos post mortem sigue siendo una tarea desafiante debido a sus dimensiones y complejidad, que hacen que las imágenes con resolución micrométrica sean particularmente difíciles. En este trabajo se presenta un protocolo para realizar la reconstrucción de porciones volumétricas del cerebro humano mediante el procesamiento simultáneo de decenas de secciones con el protocolo de transformación tisular SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-tiodiethanol [TDE]), que permite la limpieza, el etiquetado y la obtención de imágenes secuenciales de las muestras con microscopía de fluorescencia de lámina de luz (LSFM). SHORT proporciona una rápida limpieza de tejidos y un etiquetado múltiple homogéneo de cortes gruesos con varios marcadores neuronales, lo que permite la identificación de diferentes subpoblaciones neuronales tanto en la sustancia blanca como en la gris. Después del borrado, las cortes se visualizan a través de LSFM con resolución micrométrica y en múltiples canales simultáneamente para una rápida reconstrucción en 3D. Al combinar SHORT con el análisis LSFM dentro de un protocolo rutinario de alto rendimiento, es posible obtener la reconstrucción de la citoarquitectura 3D de grandes áreas volumétricas a alta resolución en poco tiempo, lo que permite una caracterización estructural integral del cerebro humano.
Introduction
El análisis de la organización molecular 3D y la citoarquitectura de grandes volúmenes del cerebro humano requiere transparencia óptica de las muestras, lograda a través de protocolos con un tiempo de procesamiento extenso. Se desarrollaron técnicas de aclaramiento óptico para minimizar la heterogeneidad en el índice de refracción (IR) dentro de los tejidos, reduciendo así la dispersión de la luz y aumentando la profundidad de penetración de la luz para obtener imágenes de alta resolución 1,2,3,4,5. Los avances actuales en los métodos de limpieza y marcaje profundo de tejidos permiten obtener imágenes volumétricas de órganos y embriones de roedores intactos mediante la explotación de técnicas de microscopía de vanguardia 6,7,8,9,10,11,12.
Sin embargo, la reconstrucción volumétrica en 3D de grandes áreas del cerebro humano postmortem sigue representando una tarea difícil en comparación con los organismos modelo. La compleja composición biológica y las variables condiciones de fijación y almacenamiento postmortem pueden comprometer la eficiencia de limpieza de tejidos, la profundidad de penetración de anticuerpos y el reconocimiento de epítopos 13,14,15,16,17,18,19. Además, el corte mecánico de los tejidos y el posterior aclarado y etiquetado de cada rebanada siguen siendo necesarios para lograr un desbroce eficiente y un etiquetado uniforme de grandes áreas del cerebro humano, lo que resulta en largos tiempos de procesamiento y en la necesidad de equipos personalizados sofisticados, en comparación con los organismos modelo 15,20,21,22.
La técnica de transformación tisular SWITCH - H2O2 - antígeno Retrieval -TDE (SHORT) ha sido desarrollada específicamente para analizar grandes volúmenes del cerebro humano18,23. Este método emplea la preservación estructural tisular del protocolo SWITCH11 y altas concentraciones de peróxido de hidrógeno para disminuir la autofluorescencia tisular, en combinación con la restauración de epítopos. SHORT permite la tinción uniforme de cortes de cerebro humano con marcadores para diferentes subtipos neuronales, células gliales, vasculatura y fibras mielinizadas18,24. Sus resultados son compatibles con el análisis de proteínas de baja y alta densidad. Los altos niveles de transparencia resultantes y el etiquetado uniforme permiten la reconstrucción volumétrica de cortes gruesos con microscopía de fluorescencia, en particular, para una adquisición rápida se pueden utilizar aparatos de láminas ligeras 18,24,25,26,27.
En este trabajo, describimos cómo se puede utilizar la técnica de transformación tisular SHORT para la limpieza simultánea y el etiquetado multirredondo de decenas de secciones cerebrales humanas fijadas en formol. Se pueden utilizar cuatro marcadores fluorescentes diferentes juntos, lo que lleva a la identificación de diferentes subpoblaciones celulares. Después del aclaramiento, se pueden realizar imágenes volumétricas de alta resolución con microscopía de fluorescencia. En este caso, utilizamos un LSFM invertido 18,24,25,26,27 hecho a medida, que permite un rápido corte óptico de la muestra y una rápida adquisición de múltiples canales en paralelo. Con este protocolo rutinario de alto rendimiento, es posible obtener una caracterización celular y estructural completa con una resolución subcelular de grandes áreas del cerebro humano, como ya se demostró en el mapeo de toda un área de Broca23.
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Protocol
El Departamento de Neuropatología del Servicio de Autopsias del Hospital General de Massachusetts (MGH) (Boston, EE.UU.) proporcionó muestras de tejido humano fijadas en formol. Se obtuvo el consentimiento por escrito de los participantes sanos antes de la muerte, siguiendo los protocolos de recolección de tejidos aprobados por el IRB del Comité de Bioseguridad Institucional de Socios (PIBC, protocolo 2003P001937). Los documentos de autorización se conservan en los Servicios de Autopsia de MGH en Boston, MA, Estados Unidos, y están disponibles a pedido.
1. Inclusión de agarosa y corte de muestras
- Prepare una solución de agarosa al 4% p/v en solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS, pH 7,4) en un vaso de precipitados e incruste el bloque de tejido en su interior. Espere hasta que alcance la temperatura ambiente (RT) y luego guárdelo a 4 °C durante 24 h.
- Para obtener secciones de alta precisión, pegue la muestra al disco de muestra del vibrátomo y llene la bandeja con 1x PBS frío (pH 7,4). Ajustar los parámetros del vibrátomo, como la frecuencia, la amplitud y la velocidad, según el tipo de tejido a cortar (valores utilizados: frecuencia = 5 (50 Hz); amplitud = 0,4; velocidad = 3 (0,15 mm/s).
NOTA: Se deben utilizar diferentes vibrátomos dependiendo del volumen de la muestra. Para muestras con un volumen máximo de 70 x 40 x 15 mm, se puede utilizar un vibrátomo (por ejemplo, Leica VT1000 S); para muestras más grandes, es posible utilizar un compresótomo (por ejemplo, VF-900-0Z Microtomo18) o un aparato hecho a medida21. Aquí, presentamos lonchas cortadas con un grosor de 400 μm o 500 μm. - Después del corte, coloque todas las rodajas en una solución conservadora compuesta por 1x PBS (pH 7,4) con 0,01% p/v de azida sódica (NaN3) y almacene a 4 °C.
NOTA: Antes de incrustar, espere hasta que la solución de agarosa alcance los 37 °C. Una temperatura más alta podría dañar la muestra. Se recomienda no dejar las muestras en PFA durante más de 48 h, ya que la fijación prolongada podría interferir con el procedimiento de marcaje al dañar los antígenos y aumentar la autofluorescencia tisular. Para el almacenamiento a largo plazo de tejidos humanos, se utiliza PBS con NaN3 para prevenir la contaminación microbiana. Debido a la toxicidad del NaN3, prepare la solución conservadora bajo una cubierta química.
2. Fijación tisular
NOTA: Todas las soluciones utilizadas en el siguiente protocolo se preparan en grandes volúmenes, suficientes para procesar todos los cortes del mismo bloque tisular y minimizar la variabilidad técnica y reducir el tiempo de los pasos individuales.
- Prepare la solución de desconexión con 50% v/v 1x PBS pH 3, 25% v/v 0,1 M de ácido clorhídrico (HCl), 25% v/v 0,1 M de ftalato de hidrógeno de potasio (KHP) y glutaraldehído fresco al 4% v/v. Colocar todas las muestras en platos con tapa de rosca (70 x 23 mm) e incubarlas con la solución Switch-off agitando suavemente a 4 °C durante 1 día, protegiéndolas de la luz con papel de aluminio.
- Prepare la solución de encendido con 1x PBS (pH 7,4) y glutaraldehído fresco al 1% v/v. Coloque todas las muestras en platos nuevos e incubelas con la solución Switch-on agitando suavemente a 4 °C durante 1 día, protegiéndolas de la luz con papel de aluminio.
NOTA: Debido a la alta toxicidad y sensibilidad a la luz del glutaraldehído, tanto las soluciones de apagado como las de encendido deben prepararse siempre frescas y mantenerse bajo la cubierta química en hielo. Llene siempre el plato con 20 ml de cada solución y séllelo con parafilm.
3. Inactivación y borrado
NOTA: El glutaraldehído reactivo en las muestras debe ser inactivado por incubación con una solución de inactivación que consista en 1x PBS pH 7.4, 4% p/v acetamida, 4% p/v glicina, pH 9.0. La solución puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 3 meses. Para eliminar los lípidos y hacer que el tejido sea transparente, utilizamos la solución de limpieza que consiste en 200 mM de dodecil sulfato de sodio (SDS), 20 mM de sulfito de sodio (Na2SO3) y 20 mM de ácido bórico (H3BO3), pH 9.0. La solución debe almacenarse a RT a medida que la FDS precipita a 4 °C. Todos los pasos siguientes se realizarán en tubos llenos de la solución.
- Mover las muestras de los platos a los tubos y lavar durante 3 x 2 h con 1x PBS pH 7.4 a RT agitando suavemente.
NOTA: Para el paso 3.1, es necesario trabajar bajo la cubierta química debido a la toxicidad del glutaraldehído. La acetamida, el SDS y el ácido bórico también son reactivos tóxicos y deben manipularse bajo una cubierta química. Llene siempre el tubo con 50 ml de cada solución. - Incubar las muestras en solución de inactivación a 37 °C en un baño de agua durante la noche (o/n).
- Lavar durante 3 x 2 h en 1x PBS pH 7.4 a RT agitando suavemente.
- Incubar las muestras en solución aclarante a 55 °C en un baño de agua durante 3-7 días. Cambie la solución cada 2 días (Tabla 1).
4. Inmunomarcaje
NOTA: Antes del paso de etiquetado, es necesario eliminar la SDS residual, reducir la autofluorescencia y desenmascarar los epítopos con una solución de recuperación de antígenos que consta de 10 mM de base de Tris, 1 mM de EDTA y 0,05% v/v Tween 20, pH 9. El pH de la solución de 9 está optimizado para un proceso de recuperación eficiente; La base de Tris actúa como agente amortiguador para mantener un entorno de pH estable; El EDTA, que es un agente quelante, mejora la accesibilidad del antígeno. El detergente no iónico Tween 20 ayuda a mejorar la permeabilidad del tejido. Esta solución puede almacenarse a 4 °C. Es importante tener en cuenta que el peróxido de hidrógeno combinado con la etapa de recuperación de antígenos tiene un efecto sinérgico en la reducción de la señal de autofluorescencia, al descomponer y/o modificar los fluoróforos endógenos responsables de la señal de fondo no específica (como la lipofuscina).
- Preparar 1x PBS con Triton X-100 (PBST) al 0,1 % v/v, precalentarlo a 37 °C y lavar las muestras 3 x 3 h durante el día agitando suavemente a 37 °C en la incubadora. Dejar el último lavado o/n.
NOTA: Almacene la solución madre de PBST a 4 °C. Es crucial eliminar el SDS del tejido, ya que puede formar precipitados insolubles a bajas temperaturas que pueden interferir con los procesos de adquisición posteriores. - Al día siguiente, añadir 10 ml de peróxido de hidrógeno al 30% v/v (H2O2) a cada muestra y dejarla agitar suavemente a RT durante 45 min.
- Lavar 3 x 10 min con 1x PBS (pH 7.4) agitando suavemente a RT.
- Precalentar la solución de recuperación de antígenos a 95 °C en un baño de agua; transferir las muestras a la solución calentada y dejarlas a 95 °C durante 10 min.
- Deje que las muestras se enfríen a RT durante 40 minutos agitándolas suavemente.
- Lavar 3 x 5 min con agua desionizada agitando suavemente.
- Equilibrar las muestras en PBS a 4 °C durante 15 min.
- Prepare una solución de anticuerpos fresca hecha de PBST con NaN3 al 0,01% p/v (consulte la NOTA para el paso 1.3) y agregue anticuerpos primarios. Incubar las muestras con la solución en placas con tapas de rosca a 37 °C durante n días (1-7) en una incubadora con agitación suave y protección contra la luz (Tabla 2).
NOTA: El tiempo de incubación depende del tamaño y el espesor (Tabla 1 y Tabla 2). - Después de n días, mover las muestras a tubos y lavar 3 x 2 h con PBST precalentado a 37 °C agitando suavemente en la incubadora.
- Añadir anticuerpos secundarios en PBST con NaN3 al 0,01% p/v e incubar las muestras en placas nuevas con tapas de rosca a 37 °C durante n días (1-6) en una incubadora con agitación suave y protegida de la luz (Tabla 1 y Tabla 2).
- Después de n días, transfiera las muestras a tubos y lave 3 x 3 h durante el día con PBST precalentado a 37 °C en una incubadora de agitación suave. Dejar el último lavado o/n.
NOTA: Como Triton X-100 y Tween 20 son viscosos, pipetee lentamente para permitir que la punta se llene. Llene siempre el tubo con 50 ml de cada solución. Use 10 ml de soluciones de anticuerpos para cada muestra y selle la placa con parafilm para evitar la evaporación de la solución. Dado que las soluciones de anticuerpos contienen NaN3, pueden almacenarse a 4 °C y reutilizarse para etiquetar nuevas muestras en un plazo de 2 semanas.
5. Coincidencia del índice de refracción
NOTA: Para lograr un alto nivel de transparencia, es necesario homogeneizar el índice de refracción tisular. Aquí utilizamos 2,2'-tiodietanol (TDE) diluido en 1x PBS. Las soluciones TDE deben almacenarse en RT.
- Transfiera las muestras a platos nuevos, agregue un 30% v/v de TDE y déjelas durante 4 h agitando suavemente a RT.
- Retire la solución de TDE al 30% v/v, agregue TDE al 68% v/v a las muestras y déjelas agitar suavemente en RT.
NOTA: Como el TDE es viscoso, pipetee lentamente para permitir que la punta se llene. La inhalación de vapor o neblina de TDE puede irritar el sistema respiratorio. Por lo tanto, es recomendable trabajar en un área bien ventilada o usar campanas extractoras para minimizar la exposición. Las soluciones de TDE deben almacenarse en RT. Utilice 10 ml de soluciones de TDE para cada muestra.
6. Montaje de la muestra
NOTA: Para facilitar el montaje de la muestra y la adquisición de imágenes LSFM, utilizamos un portamuestras sellado hecho a medida (denominado "sándwich"), que consta de tres partes: un portaobjetos de microscopio, un espaciador y un cubreobjetos.
- Coloque el espaciador de acero (56 x 56 x 0,5 mm3) sobre el portaobjetos del microscopio (60 x 60 x 1 mm3) y coloque la muestra sobre el portaobjetos de microscopía.
- Coloque con cuidado el cubreobjetos de cuarzo (60 x 60 x 0,5 mm3), sujete todo junto y prepare un pegamento de silicona de dos componentes en una proporción de 1:1. Utilice un cubreobjetos de cuarzo para que coincida con el índice de refracción y reduzca la aberración óptica durante el proceso de adquisición.
- Con una jeringa de 1 ml, rellene el espacio entre el espaciador y el cubreobjetos con un pegamento de silicona de dos componentes y déjelo secar durante 10 minutos.
- Retire los clips y use una aguja pequeña para llenar lentamente todo el sándwich con 68% v/v TDE.
- Haz pegamento fresco y sella el sándwich.
NOTA: Si el TDE llega accidentalmente al espaciador en el paso 6.1, el pegamento no se curará. Asegúrese de que no se formen burbujas de aire durante el paso 6.2.
7. Decapado
NOTA: La preservación estructural y la accesibilidad mejorada de los epítopos de SHORT permiten el marcaje multirredondo de cortes mediante la eliminación de los anticuerpos y la retinción de las muestras con otros marcadores.
- Abra el sándwich con una cuchilla, coloque las muestras en platos nuevos con tapas de rosca llenas con 30% v/v TDE y déjelos durante 3 h.
- Transfiera las muestras a tubos, lave durante 3 x 2 h en 1x PBS (pH 7.4) a RT con una agitación suave y deje el último lavado o/n.
- Colocar las muestras en solución aclarante en un baño de agua a 80 °C durante 4 h.
- Lavar durante 3 x 2 h en 1x PBST (pH 7,4) a 37 °C agitando suavemente y dejar el último lavado o/n. Ahora la muestra está lista para ser etiquetada de nuevo a partir del paso 4.8.
NOTA: Llene siempre el tubo con 50 ml de cada solución. Utilice 10 ml de solución de TDE para cada muestra.
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Representative Results
El protocolo aquí descrito permite el tratamiento simultáneo de múltiples cortes, con espesores de 100 μm a 500 μm, utilizando el método SHORT. Este enfoque reduce significativamente el tiempo total de procesamiento de todo el procedimiento. En este trabajo, proporcionamos una descripción completa de toda la tubería (Figura 1) para procesar múltiples secciones gruesas de cerebro humano postmortem simultáneamente y demostramos el protocolo en 24 cortes a la vez (Figura 2A). La duración del aclarado y el co-etiquetado oscila entre 11 y 30 días, considerando el tamaño y el grosor de las muestras (Tabla 1), excluyendo el procesamiento de imágenes y post-imágenes. Tras la despidación y la coincidencia del índice de refracción en la TDE, se consigue una transparencia óptima y homogénea de todos los cortes de tejido tanto en la sustancia gris como en la blanca (Figura 2B).
La adquisición de imágenes se puede realizar con diferentes microscopios de fluorescencia avanzados, incluyendo el confocal25 y la microscopía de dos fotones14. En este caso, utilizamos un LSFM18,23 invertido hecho a medida equipado con cuatro líneas láser de excitación: 405 nm, 488 nm, 561 nm y 638 nm, capaces de adquirir cuatro características biológicas diferentes marcadas con anticuerpos conjugados con fluoróforos. La Figura 3A muestra imágenes representativas de un corte de 400 μm de espesor de un área de Broca humana co-marcada para NeuN, un marcador panneuronal, Somatostatina (SST) y Calretinina (CR), que marcan dos subpoblaciones diferentes de interneuronas y el marcador nuclear DAPI (Figura 3A, B). En la losa de 400 μm de espesor, observamos que la fluorescencia global a lo largo de Z no se limita a la superficie, sino que es casi uniforme en toda la profundidad del tejido, aunque la intensidad de la señal disminuye ligeramente en el centro (Figura 3C).
Para lograr una caracterización celular más completa del tejido cerebral humano, es posible realizar un marcaje multironda de las mismas muestras mediante la eliminación de los anticuerpos y el reetiquetado de la muestra, como se demuestra en el artículo original de SHORT. La Figura 4 (adaptada de Pesce et al.18) demuestra la posible aplicación de siete anticuerpos diferentes en un corte de tejido de 500 μm de espesor procesado con SHORT en tres rondas consecutivas de inmunotinción. Los anticuerpos utilizados incluyen NeuN, SST, CR, Parvalbúmina (PV) y péptido intestinal vasoactivo (VIP) como marcadores neuronales inhibidores, proteína ácida fibrilar glial (GFAP) para las células gliales y vimentina (VIM) para la vasculatura (Tabla 2). Los resultados muestran la notable capacidad de SHORT para preservar la información del tejido a lo largo de varios procedimientos de extracción, reducir eficazmente las señales de autofluorescencia y lograr una limpieza eficiente de las muestras.
Figura 1: Cronología de SHORT. Esquema que representa los pasos necesarios para procesar las muestras con el protocolo SHORT. En cada paso, decenas de losas de tejido cerebral humano se procesan juntas. Después de la inclusión en agarosa y el corte, las muestras se colocan en soluciones de encendido y apagado durante 1 día cada una; Los pasos de inactivación se realizan durante la noche, mientras que la deslipidación a través de la incubación en solución de aclarado requiere de 3 a 7 días. Posteriormente, las muestras se incuban con soluciones de anticuerpos primarios y secundarios durante un máximo de 7 y 6 días, respectivamente. Después de la coincidencia del índice de refracción, las muestras se montan en el portamuestras (sándwich) para la obtención de imágenes y el almacenamiento de LSFM. En cualquier momento después del ensamblaje del sándwich, las muestras se pueden quitar y volver a etiquetar para la detección de diferentes marcadores. Abreviaturas: TDE = 2,2'-tiodietanol; SHORT = SWITCH - H2O2 - Antígeno Retrieval -TDE; o/n = durante la noche; IR = índice de refracción; LSFM = microscopía de fluorescencia de lámina de luz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cortes de cerebro humano del bloque de un área de Broca procesados simultáneamente. (A) Veinticuatro cortes consecutivos del área de Broca de 4 x 4 x 0,04 cm3 en PBS antes de procesarlos con el método SHORT. (B) Los mismos especímenes en A que se muestran después del procesamiento CORTO. Barra de escala = 1 cm. Abreviaturas: TDE = 2,2'-tiodietanol; SHORT = SWITCH - H2O2 - Antígeno Retrieval -TDE; PBS = solución salina tamponada con fosfato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Imágenes LSFM representativas de un corte clarificado etiquetado con cuatro marcadores diferentes. (A) Imágenes de proyección de máxima intensidad (resolución de 3,3 x 3,3 x 3,3 μm3) que muestran una reconstrucción mesoscópica de un corte procesado SHORT del área de Broca marcado para NeuN, somatostatina, calretinina y el marcador nuclear DAPI. A la derecha, se muestra la imagen combinada (NeuN-SST-CR-DAPI). Barra de escala = 0,5 cm. (B) Inserción ampliada de la imagen combinada en A. Barra de escala = 100 μm. (C) Imágenes de alta resolución (0,55 x 0,55 x 3,3 μm) yz de (B). Barra de escala = 100 μm. Abreviaturas: TDE = 2,2'-tiodietanol; SHORT = SWITCH - H2O2 - Antígeno Retrieval -TDE; LSFM = microscopía de fluorescencia de lámina de luz; NeuN = antígeno nuclear neuronal; SST = somatostatina; CR = calretinina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes representativas de LSFM de tinción multirredonda en cortes procesados con SHORT. (A) Imágenes de un corte de cerebro humano antes de la aclaración (en PBS) y después del etiquetado multirredondo con coincidencia de índice de refracción (68% TDE). Barra de escala = 1 cm. (B) Fusión de los distintos canales adquiridos durante tres rondas múltiples posteriores. La imagen muestra tanto la materia blanca como la gris marcadas con péptido intestinal vasoactivo, somatostatina, parvalbúmina, calretinina, antígeno nuclear neuronal, proteína ácida fibrilar glial y vimentina. Las imágenes de alta resolución (resolución de 0,55 x 0,55 x 3,3 μm) y de un solo canal se muestran a la derecha y debajo de la imagen. Barra de escala = 100 μm para todas las imágenes, excepto GFAP (barra de escala 10 = μm). (C) Imágenes de proyección de máxima intensidad de un corte de 500 μm de espesor que muestran la señal de siete anticuerpos diferentes utilizados en tres rondas secuenciales de inmunotinción. Ronda 1: PV-SST-VIP; ronda 2: CR-SST-NeuN; Ronda 3: VIM-SST-GFAP. Barra de escala = 1 mm. Esta figura fue modificada a partir de Pesce et al.18. Abreviaturas: TDE = 2,2'-tiodietanol; SHORT = SWITCH - H2O2 - Antígeno Retrieval -TDE; LSFM = microscopía de fluorescencia de lámina de luz; NeuN = antígeno nuclear neuronal; SST = somatostatina; CR = calretinina; PV = parvalbúmina; GFAP = proteína ácida fibrilar glial; VIM = vimentina; VIP = péptido intestinal vasoactivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Duración representativa de SHORT para muestras con un rango de áreas y espesores. Las muestras con diferentes áreas y espesores requieren un tiempo de incubación variable en soluciones de aclaramiento y anticuerpos, lo que da como resultado distintas duraciones de tiempo para toda la tubería SHORT. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Anticuerpos compatibles con SHORT. La tabla enumera todos los anticuerpos que se probaron con el protocolo SHORT y mostraron tinción específica en muestras de cerebro humano de 400-500 μm de espesor. La columna P/M denota anticuerpos policlonales y monoclonales. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
Las imágenes de alta resolución y la reconstrucción en 3D de grandes áreas del cerebro humano requieren un corte mecánico de tejido seguido de un aclarado óptico y un inmunomarcaje de cortes individuales. El protocolo presentado aquí describe cómo se puede utilizar el método de transformación tisular SHORT para el procesamiento rápido y simultáneo de múltiples secciones gruesas del cerebro humano para la reconstrucción cerebral en 3D con una resolución subcelular con LSFM.
A diferencia de otros enfoques, con el método SHORT los pasos de limpieza y etiquetado múltiple no requieren equipos personalizados sofisticados. La mayor parte de los especímenes se pueden procesar en conjunto, lo que reduce el tiempo de procesamiento de grandes bloques de tejido cerebral humano y minimiza la variabilidad técnica.
Los tratamientos de decoloración y desenmascaramiento de epítopos son cruciales cuando se trabaja con tejidos humanos envejecidos y fijados en formol. El peróxido de hidrógeno y las soluciones alcalinas de recuperación de antígenos también se pueden utilizar en combinación con otros métodos de eliminación como iDISCO 6,28, CLARITY, SWITCH y SHIELD24.
Para garantizar la preservación de la información epitópica y lograr una eliminación uniforme de la materia gris y blanca, es necesario transformar la muestra en un híbrido gel/tejido que sea resistente al calor y a los reactivos químicos. El glutaraldehído fue seleccionado por su excelente capacidad de reticulación y su capacidad para penetrar en la losa de tejido a bajo pH (pH = 3). La concentración de glutaraldehído es un factor crítico para determinar la resistencia y claridad del tejido. Una concentración más alta conduce a una mejor preservación de la estructura del tejido, pero también aumenta el tiempo requerido para la limpieza. Esta elección permite obtener los resultados deseados en términos de preservación de epítopos y aclaramiento homogéneo. En el caso de la solución de desconexión (paso 2.1 del protocolo), la concentración de glutaraldehído se ha elegido cuidadosamente y se ha optimizado para lograr un equilibrio entre la reticulación eficaz y la eliminación rápida18,25. SHORT está diseñado específicamente para trabajar con cortes de cerebro humano fijados en formol del área de Broca, el hipocampo y la corteza cortical 18,23,25. Sin embargo, cuando se trabaja con otros modelos biológicos o diferentes regiones cerebrales, pueden ser necesarias algunas modificaciones debido a las variaciones en la composición de la materia gris y blanca.
Una tarea crítica de este protocolo es también la optimización del tiempo de incubación en el aclaramiento (paso 3.4 del protocolo) y las soluciones de anticuerpos (pasos 4.8 y 4.10 del protocolo), principalmente relacionadas con el tamaño de la muestra y la composición biológica del tejido. Estimamos que 500 μm representan el límite de espesor tisular para lograr una transparencia óptima tanto en la sustancia blanca como en la gris y un marcaje uniforme en toda la profundidad del tejido para la tinción de varios anticuerpos (Tabla 2). Una descripción detallada de estos procesos se puede encontrar en Pesce et al.18 y Scardigli et al.24. Diferentes áreas del cerebro pueden tener una composición diferente en lípidos y proteínas, y los cerebros envejecidos desarrollan un alto contenido de pigmentos de tipo lipofuscina y neuromelanina que producen una fuerte señal de autofluorescencia y alteran la difusión de la sonda en todo el tejido. A modo de ejemplo, una rebanada de 400 μm de espesor de 16cm2 de la zona de Broca humana necesita 7 días de tratamiento con la solución de limpieza para alcanzar un alto nivel de delipidación. Para garantizar una tinción uniforme en toda la profundidad del tejido, se requiere incubación con soluciones de anticuerpos primarios y secundarios durante 7 y 6 días, respectivamente (Figura 3). Por lo tanto, se requiere una optimización precisa de los pasos de limpieza y etiquetado antes de la aplicación del protocolo de alto rendimiento descrito aquí.
SHORT permite almacenar muestras en el soporte de imágenes hecho a medida, ya que se ha demostrado que la señal fluorescente se conserva durante al menos un año. Por lo tanto, los investigadores pueden preparar todos los sándwiches con anticipación y almacenarlos para el paso de imagen que se puede realizar posteriormente. En particular, el portaobjetos del microscopio, el espaciador y la cubierta de vidrio utilizados para preparar los sándwiches se pueden personalizar de acuerdo con el tamaño de la muestra.
Las muestras procesadas con el protocolo SHORT aquí descrito se analizaron utilizando un LSFM invertido hecho a medida18,23. Esta configuración consta de dos brazos equipados con 12 objetivos hechos a medida con un collar de corrección del índice de refracción (RI). Cada objetivo actúa como un brazo de iluminación y detección al mismo tiempo, permitiendo la adquisición simultánea de dos canales a una velocidad volumétrica de 0,16 cm3/h. Como el portamuestras puede acomodar dos sándwiches a la vez, podemos crear imágenes consecutivas de cuatro canales en dos rodajas en 10 h. Debido a la leve toxicidad del vapor de TDE para el sistema respiratorio, para evitar la aberración esférica, el portamuestras se llena con una solución de glicerol/agua al 91% v/v que coincide con el IR (1,46) tanto del cubreobjetos de cuarzo como de la solución de TDE. La solución de glicerol/agua al 91% v/v debe cambiarse cada 3 días para evitar la contaminación por polvo. Por lo tanto, nuestro LSFM permite la adquisición rápida de muestras con bajo fotoblanqueo a una resolución isotrópica de 3,6 μm después del posprocesamiento 18,23,29. La gran cantidad de datos producidos se procesó utilizando un canal definido para volver a cortar y unir las pilas de imágenes utilizando un software de desarrollo propio, ZetaStitcher (https://github.com/lens-biophotonics/ZetaStitcher)23,29.
Aunque utilizamos SHORT en combinación con microscopía de fluorescencia de hoja de luz, se pueden emplear diferentes tipos de técnicas de imagen de fluorescencia para la adquisición dependiendo de la disponibilidad del laboratorio y las aplicaciones específicas. Por ejemplo, la microscopía confocal25 o la microscopía de dos fotones14 se pueden utilizar para analizar muestras aclaradas. Este tipo de análisis se recomienda para muestras con volúmenes relativamente pequeños, ya que son sistemas basados en escaneo y el tiempo de adquisición para grandes áreas de tejido es muy largo30. Al lograr imágenes más rápidas y desacoplar la resolución lateral y axial, la microscopía de fluorescencia de lámina de luz es el método preferido para obtener imágenes de grandes volúmenes de muestras aclaradas 3,4,18,31,32,33.
En resumen, describimos un protocolo rápido de alto rendimiento para el aclaramiento simultáneo, el coetiquetado homogéneo y la reconstrucción volumétrica en 3D de docenas de secciones cerebrales humanas post mortem. Al combinar SHORT con imágenes LSFM y análisis computacional, es posible obtener datos tridimensionales para un censo celular completo y un análisis proteómico del cerebro humano.
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Disclosures
Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a Bruce Fischl, Hospital General de Massachusetts, Centro de Imágenes Biomédicas A.A. Martinos, Departamento de Radiología, por proporcionar las muestras de cerebro humano analizadas en este estudio. Este proyecto recibió financiación del Programa Marco de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención n.º 654148 (Laserlab-Europe), del Programa Marco de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del Acuerdo de Subvención Específico n.º 785907 (Proyecto Cerebro Humano SGA2) y N.º 945539 (Proyecto Cerebro Humano SGA3), del Centro de la Corporación Hospitalaria General de los Institutos Nacionales de Salud (PGN) con el número de adjudicación U01 MH117023, y del Ministerio de Educación italiano en el marco del Nodo Italiano de Euro-Bioimagen (infraestructura de investigación ESFRI). Finalmente, esta investigación se llevó a cabo con la contribución de la "Fondazione CR Firenze". El contenido de este trabajo es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. La figura 1 se creó con BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2'-thiodiethanol | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
| Acetamide >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| Agarose High EEO | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
| Boric Acid | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
| Coverslips | LaserOptex | / | customized |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| Glutaraldehyde | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
| Glycine | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
| Hydrogen Peroxide 30% | Merck Life Science S.R.L. | ||
| Incubator ISS-4075 | Lab companion | / | |
| Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) | / | / | custom-made |
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| Microscope slides | Laborchimica | / | customized |
| Phospate buffer saline tablet | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | out of production |
| Potassium Hydrogen Phtalate | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| Sodium Azide | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
| Sodium Sulfite | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
| Spacers | Microlaser srl | customized | |
| Sputum Containers (dishes with screw lids) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| Tris Base | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
| Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
| Tubes | Sarstedt | 62 547254 | |
| Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| Water bath | Memmert | WNB 7-45 | |
| Antibodies and Dyes | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-NeuN Antibody | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | Dilution used, 1:100 |
| Anti-Parvalbumin antibody (PV) | Abcam | ab32895 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM) | Abcam | ab8069 | Dilution used, 1:200 |
| Calretinin Polyclonal antibody | ProteinTech | 12278_1_AP | Dilution used, 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | Dilution used, 1:100 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed | Abcam | ab175475 | Dilution used, 1:200 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | Dilution used, 1:200 |
| Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody | Abcam | ab194324 | Dilution used, 1:200 |
| Somatostatin Antibody YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | Dilution used, 1:200 |
| Vasoactive intestinal peptide (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | Dilution used, 1:200 |
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