Summary
본 프로토콜은 (SWITCH - H 2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT 조직 형질 전환 기법과 광시트 형광 현미경 이미징을 일상적으로 높은 처리량 프로토콜로 결합하여 수십 개의 사후 인간 뇌 절편의 신속하고 동시적인 광학 투명화, 다중 라운드 라벨링 및 3D 체적 재구성을 위한 단계별 절차를 제공합니다.
Abstract
지난 10년 동안 등장한 수많은 클리어링 기술에도 불구하고 사후 인간 뇌를 처리하는 것은 크기와 복잡성으로 인해 마이크로미터 해상도의 이미징을 특히 어렵게 만드는 어려운 작업으로 남아 있습니다. 이 논문은 광시트 형광 현미경(LSFM)으로 샘플의 투명화, 라벨링 및 순차 이미징을 가능하게 하는 SHORT(SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) 조직 형질 전환 프로토콜로 수십 개의 섹션을 동시에 처리하여 인간 뇌의 체적 부분을 재구성하는 프로토콜을 제시합니다. SHORT는 여러 신경 세포 마커가 있는 두꺼운 절편의 신속한 조직 투명화 및 균질한 다중 표지를 제공하여 백질 및 회백질 모두에서 다양한 신경 하위 집단을 식별할 수 있습니다. 클리어링 후 슬라이스는 LSFM을 통해 마이크로미터 해상도로 여러 채널에서 동시에 이미징되어 신속한 3D 재구성이 가능합니다. 일상적으로 높은 처리량의 프로토콜 내에서 SHORT와 LSFM 분석을 결합함으로써 짧은 시간에 고해상도로 큰 부피 영역의 3D 세포 구조 재구성을 얻을 수 있으므로 인간 뇌의 포괄적인 구조적 특성 분석이 가능합니다.
Introduction
대량의 인간 뇌의 3D 분자 조직과 세포 구조를 분석하려면 광범위한 처리 시간이 소요되는 프로토콜을 통해 표본의 광학적 투명성이 필요합니다. 광학 투명화 기술은 조직 내 굴절률(RI)의 이질성을 최소화하여 광 산란을 줄이고 고해상도 이미징을 위한 광 투과 깊이를 증가시키기 위해 개발되었습니다 1,2,3,4,5. 투명화 및 심층 조직 표지 방법의 현재 발전은 최첨단 현미경 기술 6,7,8,9,10,11,12 을 활용하여 온전한 설치류 장기 및 배아의 체적 이미징을 가능하게 합니다.
그러나 사후 인간 뇌의 넓은 영역에 대한 체적 3D 재구성은 모델 유기체에 비해 여전히 어려운 작업입니다. 복잡한 생물학적 조성과 가변적인 사후 고정 및 보관 조건은 조직 투명화 효율, 항체 침투 깊이 및 항원결정기 인식을 손상시킬 수 있습니다 13,14,15,16,17,18,19. 더욱이, 큰 인간 뇌 영역의 효율적인 투명화 및 균일한 표지를 달성하기 위해서는 기계적 조직 절편과 각 절편의 후속 투명화 및 표지가 여전히 필요하며, 그 결과 모델 유기체에 비해 처리 시간이 길고 정교한 맞춤형 장비가 필요합니다 15,20,21,22.
SWITCH - H 2O2 - antigen Retrieval -TDE (SHORT) 조직 형질전환 기술은 인간 뇌18,23의 많은 양을 분석하기 위해 특별히 개발되었다. 이 방법은 에피토프 복원과 함께 SWITCH 프로토콜11의 조직 구조 보존과 고농도의 과산화수소를 사용하여 조직 자가형광을 감소시킵니다. SHORT는 다양한 신경 아형, 신경교세포, 혈관 및 수초화 섬유에 대한 마커를 사용하여 인간 뇌 절편의 균일한 염색을 허용합니다18,24. 그 결과는 저밀도 및 고밀도 단백질의 분석과 모두 호환됩니다. 그 결과 높은 투명도 수준과 균일한 라벨링은 형광 현미경으로 두꺼운 슬라이스의 체적 재구성을 가능하게 하며, 특히 빠른 획득을 위해 광시트 장치를 사용할 수 있습니다 18,24,25,26,27.
이 연구에서는 SHORT 조직 형질전환 기법을 사용하여 수십 개의 포르말린 고정 인간 뇌 절편을 동시에 투명화하고 다중으로 표지하는 방법을 설명합니다. 4개의 서로 다른 형광 마커를 함께 사용할 수 있어 서로 다른 세포 하위 집단을 식별할 수 있습니다. 투명화 후 형광 현미경으로 고해상도 체적 이미징을 수행할 수 있습니다. 여기서는 맞춤형 도립 LSFM 18,24,25,26,27을 사용하여 샘플의 빠른 광학 절편과 여러 채널을 병렬로 빠르게 수집할 수 있습니다. 이러한 일상적으로 높은 처리량의 프로토콜을 사용하여, 전체 Broca의 영역(23)의 매핑에서 이미 입증된 바와 같이 인간 뇌의 넓은 영역에 대한 세포 내 분해능으로 포괄적인 세포 및 구조적 특성 분석을 얻을 수 있습니다.
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Protocol
포르말린 고정 인체 조직 샘플은 매사추세츠 종합병원(MGH) 부검 서비스(미국 보스턴)의 신경병리학과에서 제공하였다. 서면 동의는 Partners Institutional Biosafety Committee(PIBC, 프로토콜 2003P001937)의 IRB 승인 조직 수집 프로토콜에 따라 사망 전에 건강한 참가자로부터 얻었습니다. 승인 문서는 미국 매사추세츠주 보스턴에 있는 MGH 부검 서비스에 보관되며 요청 시 제공됩니다.
1. 아가로스 임베딩 및 시료 절단
- 비커에 4x 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4)에 1% w/v 아가로스 용액을 준비하고 내부에 조직 블록을 삽입합니다. 실온(RT)에 도달할 때까지 기다렸다가 4°C에서 24시간 동안 보관합니다.
- 고정밀 절편을 얻으려면 샘플을 비브라톰의 시편 디스크에 붙이고 트레이를 차가운 1x PBS(pH 7.4)로 채웁니다. 슬라이스할 조직의 유형에 따라 주파수, 진폭 및 속도와 같은 진동 매개변수를 조정합니다(사용된 값: 주파수 = 5(50Hz), 진폭 = 0.4, 속도 = 3(0.15mm/s).
알림: 샘플 볼륨에 따라 다른 진동을 사용해야 합니다. 최대 부피가 70 x 40 x 15 mm인 샘플의 경우 진동체(예: Leica VT1000 S)를 사용할 수 있습니다. 더 큰 샘플의 경우, 압축체(예를 들어, VF-900-0Z 마이크로톰(18)) 또는 주문형 장치(21)를 사용할 수 있다. 여기에서는 400μm 또는 500μm 두께로 절단된 슬라이스를 제공합니다. - 절단 후 모든 슬라이스를 1x PBS(pH 7.4)와 0.01% w/v 아지드화나트륨(NaN3)으로 구성된 보존제 용액에 넣고 4°C에서 보관합니다.
알림: 삽입하기 전에 아가로스 용액이 37°C에 도달할 때까지 기다리십시오. 온도가 높으면 시편이 손상될 수 있습니다. 장기간 고정하면 항원이 손상되고 조직 자가형광이 증가하여 라벨링 절차를 방해할 수 있으므로 샘플을 PFA에 48시간 이상 방치하지 않는 것이 좋습니다. 인체 조직의 장기 보관을 위해 NaN3 가 함유 된 PBS를 사용하여 미생물 오염을 방지합니다. NaN3 의 독성으로 인해 화학 후드 아래에서 보존제 용액을 준비하십시오.
2. 조직 고정
참고: 다음 프로토콜에 사용된 모든 용액은 동일한 조직 블록의 모든 슬라이스를 처리하고 기술적 변동성을 최소화하며 개별 단계의 시간을 줄이기에 충분한 대량으로 준비됩니다.
- 50% v/v 1x PBS pH 3, 25% v/v 0.1M 염산(HCl), 25% v/v 0.1M 칼륨 수소 프탈레이트(KHP) 및 신선한 4% v/v 글루타르알데히드로 스위치 끄기 용액을 준비합니다. 모든 샘플을 나사 뚜껑(70 x 23mm)이 있는 접시에 넣고 4°C에서 1일 동안 부드럽게 흔들어 스위치 끄기 용액으로 배양하고 알루미늄 호일로 빛으로부터 보호합니다.
- 1x PBS(pH 7.4)와 신선한 1% v/v 글루타르알데히드로 스위치 온 용액을 준비합니다. 모든 샘플을 새 접시에 넣고 4°C에서 1일 동안 부드럽게 흔들면서 스위치 온 용액으로 배양하고 알루미늄 호일로 빛으로부터 보호합니다.
알림: 글루타르알데히드의 높은 독성과 빛에 민감하기 때문에 스위치 오프 및 스위치 온 용액은 항상 신선하게 준비해야 하며 얼음 위의 화학 후드 아래에 보관해야 합니다. 항상 접시에 각 용액 20mL를 채우고 파라필름으로 밀봉합니다.
3. 비활성화 및 지우기
참고: 샘플의 반응성 글루타르알데히드는 1x PBS pH 7.4, 4% w/v 아세트아미드, 4% w/v 글리신, pH 9.0으로 구성된 불활성화 용액으로 배양하여 비활성화해야 합니다. 용액은 4°C에서 최대 3개월 동안 보관할 수 있습니다. 지질을 제거하고 조직을 투명하게 만들기 위해 200mM 도데실 설페이트(SDS), 20mM 아황산나트륨(Na2SO3) 및 20mM 붕산(H3BO3), pH 9.0으로 구성된 투명화 용액을 사용합니다. 용액은 SDS가 4°C에서 침전되므로 RT에 보관해야 합니다. 다음 단계는 모두 용액으로 채워진 튜브에서 수행됩니다.
- 샘플을 접시에서 튜브로 옮기고 RT에서 1x PBS pH 7.4로 3 x 2시간 동안 부드럽게 흔들어 세척합니다.
알림: 3.1단계의 경우 글루타르알데히드 독성 때문에 화학 후드 아래에서 작업해야 합니다. 아세트아미드, SDS 및 붕산도 독성 시약이므로 화학 후드 아래에서 취급해야 합니다. 항상 각 용액 50mL를 튜브에 채웁니다. - 샘플을 37°C의 불활화 용액에 넣고 수조에서 밤새 배양합니다(o/n).
- RT에서 1x PBS pH 7.4에서 3 x 2시간 동안 부드럽게 흔들어 세척합니다.
- 샘플을 55°C의 세척액에서 3-7일 동안 수조에서 배양합니다. 2일마다 용액을 교체하십시오(표 1).
4. 면역표지
참고: 라벨링 단계 전에 잔류 SDS를 제거하고, 자가형광을 줄이고, 10mM Tris 염기, 1mM EDTA 및 0.05% v/v 트윈 20, pH 9로 구성된 항원 회수 용액으로 에피토프를 가림을 해제해야 합니다. 용액의 pH 9는 효율적인 회수 공정에 최적화되어 있습니다. 트리스 베이스는 안정적인 pH 환경을 유지하기 위한 완충제 역할을 합니다. 킬레이트제인 EDTA는 항원의 접근성을 향상시킵니다. 비이온성 세제 Tween 20은 조직의 투과성을 개선하는 데 도움이 됩니다. 이 용액은 4°C에서 보관할 수 있습니다. 항원 회수 단계와 결합된 과산화수소는 비특이적 배경 신호(예: 리포푸신)를 담당하는 내인성 형광단을 분해 및/또는 변형하여 자가형광 신호를 감소시키는 데 시너지 효과를 갖는다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
- 0.1% v/v Triton X-100(PBST)으로 PBS 1개를 준비하고 37°C로 예열한 다음 인큐베이터에서 37°C에서 부드럽게 흔들면서 낮 동안 3 x 3시간 동안 샘플을 세척합니다. 마지막 세탁 o/n은 그대로 두십시오.
알림: PBST 원액을 4°C에서 보관하십시오. SDS는 후속 취득 과정을 방해할 수 있는 저온에서 불용성 침전물을 형성할 수 있으므로 조직에서 제거하는 것이 중요합니다. - 다음날 각 샘플에 30% v/v 과산화수소(H2O2) 10mL를 넣고 실온에서 45분 동안 부드럽게 흔들어 둡니다.
- 1x PBS(pH 7.4)로 3 x 10분 동안 RT에서 부드럽게 흔들어 세척합니다.
- 항원 회수 용액을 수조에서 95°C로 예열합니다. 샘플을 가열된 용액으로 옮기고 95°C에서 10분 동안 그대로 둡니다.
- 표본을 부드럽게 흔들면서 40분 동안 RT로 식히십시오.
- 3 x 5 분 동안 탈 이온수로 부드럽게 흔들어 씻으십시오.
- PBS에서 4°C에서 15분 동안 평형을 유지합니다.
- 0.01% w/vNaN3 (1.3단계 참고 참조)의 PBST로 만든 새로운 항체 용액을 준비하고 1차 항체를 추가합니다. 부드럽게 흔들고 빛으로부터 보호하는 인큐베이터에서 37°C에서 n일(1-7) 동안 스크류 뚜껑이 있는 접시에 용액과 함께 샘플을 배양합니다(표 2).
참고: 배양 시간은 크기와 두께에 따라 다릅니다(표 1 및 표 2). - n일 후 샘플을 튜브로 옮기고 인큐베이터에서 부드럽게 흔들면서 37°C에서 예열된 PBST로 3 x 2시간 세척합니다.
- 0.01% w/vNaN3 의 PBST에 2차 항체를 추가하고 부드럽게 흔들고 빛으로부터 보호되는 인큐베이터에서 n일 동안 37°C(1-6)의 나사 뚜껑이 있는 새 접시에 샘플을 배양합니다(표 1 및 표 2).
- n일 후 샘플을 튜브로 옮기고 부드럽게 흔드는 인큐베이터에서 37°C에서 예열된 PBST로 낮 동안 3 x 3시간 동안 세척합니다. 마지막 세탁 o/n은 그대로 두십시오.
참고: Triton X-100 및 Tween 20은 점성이 있으므로 팁이 채워질 수 있도록 천천히 피펫팅합니다. 항상 각 용액 50mL를 튜브에 채웁니다. 각 샘플에 대해 10mL의 항체 용액을 사용하고 용액의 증발을 방지하기 위해 파라필름으로 접시를 밀봉합니다. 항체 용액에는 NaN3 가 포함되어 있기 때문에 4 °C에서 보관하고 2 주 이내에 새 검체를 라벨링하는 데 재사용할 수 있습니다.
5. 굴절률 매칭
알림: 높은 수준의 투명도를 얻으려면 조직 굴절률을 균질화해야 합니다. 여기서는 1x PBS에 희석된 2,2'-티오디에탄올(TDE)을 사용합니다. TDE 솔루션은 RT에 저장해야 합니다.
- 샘플을 새 접시로 옮기고 30% v/v TDE를 추가한 다음 RT에서 부드럽게 흔들면서 4시간 동안 그대로 둡니다.
- 30% v/v TDE 용액을 제거하고 샘플에 68% v/v TDE를 추가한 다음 RT에서 부드럽게 흔들어 둡니다.
알림: TDE는 점성이 있으므로 팁이 채워질 수 있도록 천천히 피펫팅합니다. TDE 증기 또는 미스트 흡입은 호흡기를 자극할 수 있습니다. 따라서 환기가 잘 되는 곳에서 작업하거나 흄 후드를 사용하여 노출을 최소화하는 것이 좋습니다. TDE 용액은 RT에 보관해야 합니다. 각 샘플에 대해 10mL의 TDE 용액을 사용합니다.
6. 샘플 장착
참고: 샘플 장착 및 LSFM 이미지 획득을 용이하게 하기 위해 현미경 슬라이드, 스페이서 및 커버슬립의 세 부분으로 구성된 맞춤형 밀봉된 샘플 홀더("샌드위치"라고 함)를 사용합니다.
- 강철 스페이서(56 x 56 x 0.5mm3)를 현미경 슬라이드(60 x 60 x 1mm3) 위에 놓고 샘플을 현미경 슬라이드에 놓습니다.
- 석영 커버슬립(60 x 60 x 0.5mm3)을 조심스럽게 넣고 모든 것을 함께 클립으로 고정하고 1:1 비율로 2액형 실리콘 접착제를 준비합니다. 석영 커버슬립을 사용하여 굴절률을 일치시키고 획득 과정에서 광학 수차를 줄입니다.
- 1mL 주사기를 사용하여 스페이서와 커버슬립 사이의 공간을 2액형 실리콘 접착제로 채우고 10분 동안 건조시킵니다.
- 클립을 제거하고 작은 바늘을 사용하여 샌드위치 전체를 68% v/v TDE로 천천히 채웁니다.
- 신선한 접착제를 만들고 샌드위치를 밀봉하십시오.
알림: TDE가 6.1단계에서 실수로 스페이서에 도달하면 접착제가 경화되지 않습니다. 6.2단계에서 기포가 형성되지 않도록 하십시오.
7. 스트리핑
참고: SHORT의 구조적 보존과 향상된 에피토프 접근성은 항체를 제거하고 다른 마커로 샘플을 다시 염색하여 절편의 다중 라운드 라벨링을 가능하게 합니다.
- 칼날로 샌드위치를 열고 30% v/v TDE로 채워진 나사 뚜껑이 있는 새 접시에 표본을 넣고 3시간 동안 그대로 둡니다.
- 샘플을 튜브로 옮기고 RT에서 1x PBS(pH 7.4)에서 부드럽게 흔들어 3 x 2시간 동안 세척한 다음 마지막 세척 o/n을 그대로 둡니다.
- 샘플을 80°C의 수조에서 4시간 동안 세척액에 넣습니다.
- 37°C에서 1x PBST(pH 7.4)에서 3 x 2시간 동안 부드럽게 흔들어 세척하고 마지막 세척 o/n을 그대로 둡니다. 이제 4.8단계부터 샘플에 다시 레이블을 지정할 준비가 되었습니다.
알림: 항상 튜브에 각 용액 50mL를 채우십시오. 각 샘플에 10mL의 TDE 용액을 사용합니다.
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Representative Results
여기에 설명된 프로토콜은 SHORT 방법을 사용하여 두께가 100μm에서 500μm에 이르는 여러 슬라이스를 동시에 처리할 수 있습니다. 이 접근 방식은 전체 절차의 전체 처리 시간을 크게 줄입니다. 이 작업에서는 여러 사후 인간 뇌 두께 절편을 동시에 처리하기 위한 전체 파이프라인(그림 1)에 대한 포괄적인 설명을 제공하고 한 번에 24개 슬라이스에 대한 프로토콜을 시연합니다(그림 2A). 투명화 및 공동 라벨링 기간은 이미징 및 이미징 후 처리를 제외하고 샘플의 크기와 두께를 고려하여 11일에서 30일 사이입니다(표 1). TDE에서 탈지질화 및 굴절률 매칭 후 회백질과 백질 모두에서 모든 조직 절편의 최적이고 균일한 투명도가 달성됩니다(그림 2B).
이미지 획득은 컨포칼25 및 이광자 현미경14를 포함한 다양한 고급 형광 현미경으로 수행할 수 있습니다. 여기서는 형광단 접합 항체로 표지된 4가지 생물학적 특징을 획득할 수 있는 4개의 excitation 레이저 라인(405nm, 488nm, 561nm, 638nm)이 장착된 맞춤형 도립 LSFM18,23을 사용했습니다. 그림 3A는 NeuN, 범 뉴런 마커, 소마토스타틴(SST) 및 칼레티닌(CR)에 대해 공동 표지된 인간 Broca 영역의 400μm 두께 절편의 대표 이미지를 보여주며, 이는 두 개의 서로 다른 뉴런 하위 집단과 핵 마커 DAPI를 표지합니다(그림 3A,B). 400μm 두께의 슬래브에서 Z를 따라 전체 형광이 표면에 국한되지 않고 중간에 신호 강도가 약간 감소하지만 조직 깊이 전체에 걸쳐 거의 균일하다는 것을 관찰했습니다(그림 3C).
인간 뇌 조직에 대한 보다 포괄적인 세포 특성 분석을 달성하기 위해 SHORT 원본 논문에 설명된 대로 항체를 제거하고 샘플에 다시 라벨링하여 동일한 검체에 대해 다중 라운드 라벨링을 수행할 수 있습니다. 그림 4 (Pesce et al.18에서 발췌)는 3회 연속 면역염색에서 SHORT로 처리된 500μm 두께의 조직 절편에 7개의 서로 다른 항체를 적용할 수 있는 가능성을 보여줍니다. 사용된 항체에는 억제성 신경 표지자인 NeuN, SST, CR, Parvalbumin(PV) 및 혈관 활성 장 펩타이드(VIP), 신경교세포를 위한 신경교세포용 신경교섬유산성 단백질(GFAP), 혈관구조용 비멘틴(VIM)이 포함됩니다 (표 2). 그 결과는 다양한 스트리핑 절차에서 조직 정보를 보존하고, 자가형광 신호를 효과적으로 감소시키며, 효율적인 검체 투명화를 달성하는 SHORT의 놀라운 능력을 보여줍니다.
그림 1: SHORT의 타임라인. SHORT 프로토콜로 샘플을 처리하는 데 필요한 단계를 나타내는 체계입니다. 각 단계에서 수십 개의 인간 뇌 조직 석판이 함께 처리됩니다. 아가로스 및 슬라이싱에 매립한 후 샘플을 각각 1일 동안 Switch-on 및 Switch-off 용액에 넣습니다. 불활화 단계는 하룻밤 동안 수행되는 반면 청정액에서 배양을 통한 탈지질화는 3-7일이 소요됩니다. 그 후, 샘플은 각각 최대 7일 및 6일 동안 1차 및 2차 항체 용액으로 배양됩니다. 굴절률 매칭 후 LSFM 이미징 및 보관을 위해 시료를 시료 홀더(샌드위치)에 장착합니다. 샌드위치 조립 후 언제든지 샘플을 벗겨내고 다른 마커를 검출하기 위해 라벨을 다시 붙일 수 있습니다. 약어: TDE = 2,2'-티오디에탄올; SHORT = S마녀 - H2O2 - 항원 R회수 -TDE; o/n = 하룻밤; RI = 굴절률; LSFM = 광시트 형광 현미경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: Broca 영역의 블록에서 동시에 처리된 인간의 뇌 절편. (A) SHORT 방법으로 처리하기 전에 PBS에서 4 x 4 x 0.04 cm3 의 Broca 영역에서 24개의 연속 슬라이스. (B) SHORT 처리 후 표시된 A 의 동일한 시편. 눈금 막대 = 1cm. 약어: TDE = 2,2'-티오디에탄올; SHORT = S마녀 - H2O2 - 항원 R회수 -TDE; PBS = 인산염 완충 식염수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 4개의 서로 다른 마커로 라벨링된 투명화된 슬라이스의 대표적인 LSFM 이미지. (A) 최대 강도 투영 이미지(해상도 3.3 x 3.3 x 3.3 μm3)는 NeuN, Somatostatin, Calretinin 및 핵 마커 DAPI로 표지된 Broca 영역의 SHORT 처리된 절편의 메조스코픽 재구성을 보여줍니다. 오른쪽에는 병합된 이미지(NeuN-SST-CR-DAPI)가 표시됩니다. 축척 막대 = 0.5cm. (B) A에 병합된 이미지를 확대하여 삽입합니다. 스케일 바 = 100 μm. (C) (B)의 고해상도(0.55 x 0.55 x 3.3 μm) yz 이미지. 눈금 막대 = 100μm. 약어: TDE = 2,2'-티오디에탄올; SHORT = S마녀 - H2O2 - 항원 R회수 -TDE; LSFM = 광시트 형광 현미경; NeuN = 신경 핵 항원; SST = 소마토스타틴; CR = 칼레티닌; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: SHORT-processed 슬라이스에서 다중 라운드 염색의 대표적인 LSFM 이미지. (A) 굴절률 일치(68% TDE)를 사용한 다중 라운드 라벨링 후의 인간 뇌 절편 사전 클리어링 이미지(PBS). 눈금 막대 = 1cm. (B) 세 번의 후속 다중 라운드 동안 획득한 다양한 채널의 병합. 이 이미지는 혈관 활성 장 펩타이드, 소마토스타틴, 파브알부민, 칼레티닌, 신경 핵 항원, 신경교 섬유산성 단백질 및 비멘틴으로 표지된 백질과 회백질을 모두 보여줍니다. 고해상도(0.55 x 0.55 x 3.3μm의 해상도), 단일 채널 이미지가 이미지 오른쪽과 아래에 표시됩니다. GFAP를 제외한 모든 이미지에 대해 축척 막대 = 100μm(축척 막대 10 = μm). (C) 500μm 두께의 슬라이스 최대 강도 투영 이미지로, 3차례의 순차적 면역염색에 사용된 7개의 서로 다른 항체의 신호를 보여줍니다. 라운드 1: PV-SST-VIP; 라운드 2: CR-SST-NeuN; 라운드 3: VIM-SST-GFAP. 축척 막대 = 1mm. 이 그림은 Pesce et al.18에서 수정되었습니다. 약어: TDE = 2,2'-티오디에탄올; SHORT = S마녀 - H2O2 - 항원 R회수 -TDE; LSFM = 광시트 형광 현미경; NeuN = 신경 핵 항원; SST = 소마토스타틴; CR = 칼레티닌; PV = 파브알부민; GFAP = 신경교세포의 섬유성 산성 단백질; VIM = 비멘틴; VIP = 혈관 활성 장 펩타이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 다양한 면적과 두께를 가진 샘플에 대한 SHORT의 대표적인 시간 길이. 면적과 두께가 다른 표본은 투명화 및 항체 용액에서 다양한 배양 시간이 필요하므로 전체 SHORT 파이프라인에 대해 뚜렷한 시간 길이가 발생합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: SHORT와 호환되는 항체. 표에는 SHORT 프로토콜로 테스트하고 400-500μm 두께의 인간 뇌 표본에서 특이적 염색을 보인 모든 항체가 나열되어 있습니다. P/M 열은 다클론 항체 및 단클론 항체를 나타냅니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
인간의 큰 뇌 부위를 고분해능 이미징 및 3D로 재구성하려면 기계적 조직 절편에 이어 광학 투명화 및 단일 절편의 면역 표지가 필요합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 LSFM을 사용한 세포 내 분해능으로 3D 뇌 재구성을 위해 여러 인간 뇌 두께 절편의 신속한 동시 처리에 SHORT 조직 형질전환 방법을 사용할 수 있는 방법을 설명합니다.
다른 접근 방식과 달리 SHORT 방법을 사용하면 클리어링 및 다중 라벨링 단계에 정교한 맞춤형 장비가 필요하지 않습니다. 대량의 검체를 모두 처리할 수 있어 대형 인간 뇌 조직 블록의 처리 시간을 단축하고 기술적 변동성을 최소화할 수 있습니다.
탈색 및 에피토프 마스킹 해제 처리는 노후화되고 포르말린으로 고정된 인체 조직으로 작업할 때 매우 중요합니다. 과산화수소 및 알칼리 항원 회수 용액은 iDISCO 6,28, CLARITY, SWITCH 및 SHIELD24와 같은 다른 투명화 방법과 함께 사용할 수도 있습니다.
상피 정보의 보존을 보장하고 회백질과 백질 모두를 균일하게 투명화하려면 샘플을 열과 화학 시약에 내성이 있는 겔/조직 하이브리드로 변환해야 합니다. 글루타르알데히드는 우수한 가교 능력과 낮은 pH(pH = 3)에서 조직 슬래브를 관통하는 능력으로 인해 선택되었습니다. 글루타르알데히드의 농도는 조직의 강도와 투명도를 결정하는 데 중요한 요소입니다. 농도가 높을수록 조직 구조가 더 잘 보존되지만 청소에 필요한 시간도 늘어납니다. 이 선택은 에피토프 보존 및 균질 투명화 측면에서 원하는 결과를 가능하게 합니다. 스위치 오프 용액(프로토콜 단계 2.1)의 경우, 글루타르알데히드의 농도는 효과적인 가교결합과 신속한 청결 사이의 균형을 맞추기 위해 신중하게 선택되고 최적화되었다(18,25). SHORT는 브로카 영역, 해마 및 피질 피질 18,23,25의 포르말린 고정 인간 뇌 절편을 연구하기 위해 특별히 고안되었습니다. 그러나 다른 생물학적 모델이나 다른 뇌 영역으로 작업할 때 회백질 구성의 변화로 인해 일부 수정이 필요할 수 있습니다.
이 프로토콜의 중요한 작업 중 하나는 주로 표본 크기 및 조직 생물학적 구성과 관련된 투명화(프로토콜 단계 3.4) 및 항체 용액(프로토콜 단계 4.8 및 4.10)에서 배양 시간을 최적화하는 것입니다. 500μm는 여러 항체 염색을 위해 백질 및 회백질 모두에서 최적의 투명성과 조직 깊이 전체에 걸쳐 균일한 라벨링을 달성하기 위한 조직 두께 한계를 나타내는 것으로 추정했습니다(표 2). 이러한 프로세스에 대한 자세한 설명은 Pesce et al.18 및 Scardigli et al.24에서 찾을 수 있습니다. 뇌 부위에 따라 지질과 단백질의 구성이 다를 수 있으며, 노화된 뇌는 강력한 자가형광 신호를 생성하고 조직 전체의 프로브 확산을 변화시키는 리포푸신형 색소와 뉴로멜라닌 함량이 높습니다. 예를 들어, 인간 브로카 부위의 400μm 두께의 16cm2 절편은 높은 수준의 탈지질에 도달하기 위해 투명화 용액으로 7일 동안 처리해야 합니다. 조직 깊이 전체에 걸쳐 균일한 염색을 보장하려면 각각 7일과 6일 동안 1차 및 2차 항체 용액으로 배양해야 합니다(그림 3). 따라서 여기에 설명된 고처리량 프로토콜을 적용하기 전에 지우기 및 라벨링 단계에 대한 미세한 최적화가 필요합니다.
SHORT는 형광 신호가 최소 1년 동안 보존된다는 것이 입증되었기 때문에 맞춤형 이미징 홀더에 샘플을 저장할 수 있습니다. 따라서 연구원들은 모든 샌드위치를 미리 준비하고 나중에 수행할 수 있는 이미징 단계를 위해 보관할 수 있습니다. 특히, 샌드위치를 준비하는 데 사용되는 현미경 슬라이드, 스페이서 및 커버 유리는 표본의 크기에 따라 맞춤화할 수 있습니다.
여기에 설명된 SHORT 프로토콜로 처리된 샘플은 맞춤형 반전 LSFM18,23을 사용하여 분석되었습니다. 이 설정은 굴절률(RI) 보정환이 있는 12x 맞춤형 대물렌즈가 장착된 두 개의 암으로 구성됩니다. 각 대물렌즈는 조명 및 검출 암(arm) 역할을 동시에 수행하여 0.16cm3/h의 체적 속도로 두 채널을 동시에 수집할 수 있습니다. 표본 홀더는 한 번에 두 개의 샌드위치를 수용할 수 있기 때문에 10시간 동안 두 개의 슬라이스로 4개의 채널을 연속적으로 이미징할 수 있습니다. 호흡기에 대한 TDE 증기의 경미한 독성으로 인해 구면 수차를 피하기 위해 시편 홀더는 석영 커버슬립과 TDE 용액의 RI(1.46)와 일치하는 91% v/v 글리세롤/물 용액으로 채워집니다. 91% v/v 글리세롤/물 용액은 먼지 오염을 방지하기 위해 3일마다 교체해야 합니다. 따라서 당사의 LSFM은 후처리 18,23,29 후 3.6μm의 등방성 분해능에서 낮은 광표백으로 시편을 빠르게 획득할 수 있습니다. 생성된 많은 양의 데이터는 자체 개발한 소프트웨어인 ZetaStitcher (https://github.com/lens-biophotonics/ZetaStitcher)23,29를 사용하여 이미지 스택의 재슬라이싱 및 스티칭을 위해 정의된 파이프라인을 사용하여 처리되었습니다.
광시트 형광 현미경과 함께 SHORT를 사용했지만, 실험실의 가용성과 특정 응용 분야에 따라 다양한 종류의 형광 이미징 기술을 사용하여 획득할 수 있습니다. 예를 들어, 공초점 현미경(25) 또는 이광자 현미경(14)을 사용하여 투명화된 표본을 분석할 수 있습니다. 이러한 유형의 분석은 스캐닝 기반 시스템이고 큰 조직 영역에 대한 획득 시간이 매우 길기 때문에 상대적으로 작은 부피를 가진 샘플에 권장됩니다30. 광시트 형광 현미경은 더 빠른 이미징을 달성하고 측면 및 축 해상도를 분리함으로써 대량의 투명화된 샘플 3,4,18,31,32,33 을 이미징하는 데 선호되는 방법입니다.
요약하자면, 우리는 동시 클리어링, 균질 공동 라벨링 및 수십 개의 사후 인간 뇌 절편의 3D 체적 재구성을 위한 신속한 고처리량 프로토콜에 대해 설명했습니다. SHORT를 LSFM 이미징 및 컴퓨터 분석과 결합하면 인간 뇌의 포괄적인 세포 조사 및 단백질체 분석을 위한 3차원 데이터를 얻을 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이 연구가 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 수행되었음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구에서 분석된 인간 뇌 표본을 제공해 주신 매사추세츠 종합 병원, A.A. Martinos Center for Biomedical Imaging, Department of Radiology의 Bruce Fischl에게 감사드립니다. 이 프로젝트는 보조금 계약 번호 654148(Laserlab-Europe)에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프레임워크 프로그램으로부터, 특정 보조금 계약 번호 785907(Human Brain Project SGA2) 및 No. 945539(Human Brain Project SGA3)에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 Framework Programme for Research and Innovation으로부터 자금을 지원받았으며, 수상 번호 U01 MH117023에 따라 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 종합병원 법인 센터(General Hospital Corporation Center)로부터 보조금을 받았습니다. Euro-Bioimaging Italian Node (ESFRI 연구 인프라)의 틀에서 이탈리아 교육부에서. 마지막으로, 이 연구는 "Fondazione CR Firenze"의 기여로 수행되었습니다. 이 작업의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 그림 1 은 BioRender.com 사용하여 만들었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2'-thiodiethanol | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
| Acetamide >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| Agarose High EEO | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
| Boric Acid | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
| Coverslips | LaserOptex | / | customized |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| Glutaraldehyde | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
| Glycine | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
| Hydrogen Peroxide 30% | Merck Life Science S.R.L. | ||
| Incubator ISS-4075 | Lab companion | / | |
| Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) | / | / | custom-made |
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| Microscope slides | Laborchimica | / | customized |
| Phospate buffer saline tablet | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | out of production |
| Potassium Hydrogen Phtalate | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| Sodium Azide | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
| Sodium Sulfite | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
| Spacers | Microlaser srl | customized | |
| Sputum Containers (dishes with screw lids) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| Tris Base | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
| Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
| Tubes | Sarstedt | 62 547254 | |
| Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| Water bath | Memmert | WNB 7-45 | |
| Antibodies and Dyes | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-NeuN Antibody | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | Dilution used, 1:100 |
| Anti-Parvalbumin antibody (PV) | Abcam | ab32895 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM) | Abcam | ab8069 | Dilution used, 1:200 |
| Calretinin Polyclonal antibody | ProteinTech | 12278_1_AP | Dilution used, 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | Dilution used, 1:100 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed | Abcam | ab175475 | Dilution used, 1:200 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | Dilution used, 1:200 |
| Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody | Abcam | ab194324 | Dilution used, 1:200 |
| Somatostatin Antibody YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | Dilution used, 1:200 |
| Vasoactive intestinal peptide (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | Dilution used, 1:200 |
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