Summary
Det nuvarande protokollet tillhandahåller en steg-för-steg-procedur för snabb och samtidig optisk clearing, muti-round-märkning och 3D-volymetrisk rekonstruktion av tiotals postmortem-sektioner av mänsklig hjärna genom att kombinera (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-tiodietanol [TDE]) kortvävnadstransformationsteknik med fluorescensmikroskopiavbildning i lätta ark i ett rutinmässigt protokoll med hög genomströmning.
Abstract
Trots de många clearingtekniker som dykt upp under det senaste decenniet är bearbetning av mänskliga hjärnor efter döden fortfarande en utmanande uppgift på grund av dess dimensioner och komplexitet, vilket gör avbildning med mikrometerupplösning särskilt svår. Denna artikel presenterar ett protokoll för att utföra rekonstruktionen av volymetriska delar av den mänskliga hjärnan genom att samtidigt bearbeta tiotals sektioner med SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-tiodietanol [TDE]) vävnadstransformationsprotokoll, vilket möjliggör clearing, märkning och sekventiell avbildning av proverna med light-sheet fluorescence mikroskopi (LSFM). SHORT ger snabb vävnadsrensning och homogen multimärkning av tjocka skivor med flera neuronala markörer, vilket möjliggör identifiering av olika neuronala subpopulationer i både vit och grå substans. Efter rensning avbildas skivorna via LSFM med mikrometerupplösning och i flera kanaler samtidigt för en snabb 3D-rekonstruktion. Genom att kombinera SHORT med LSFM-analys inom ett rutinmässigt protokoll med hög genomströmning är det möjligt att erhålla 3D-cytoarkitekturrekonstruktion av stora volymetriska områden med hög upplösning på kort tid, vilket möjliggör omfattande strukturell karakterisering av den mänskliga hjärnan.
Introduction
Att analysera den molekylära 3D-organisationen och cytoarkitekturen hos stora volymer av den mänskliga hjärnan kräver optisk transparens av prover, vilket uppnås genom protokoll med lång bearbetningstid. Optiska rensningstekniker utvecklades för att minimera heterogeniteten i brytningsindex (RI) i vävnaderna, vilket minskar ljusspridningen och ökar ljusgenomträngningsdjupet för högupplöst avbildning 1,2,3,4,5. Nuvarande framsteg inom clearing- och djupvävnadsmärkningsmetoder möjliggör volymetrisk avbildning av intakta gnagarorgan och embryon genom att utnyttja banbrytande mikroskopitekniker 6,7,8,9,10,11,12.
Volymetrisk 3D-rekonstruktion av stora delar av den mänskliga hjärnan efter döden är dock fortfarande en utmanande uppgift jämfört med modellorganismer. Den komplexa biologiska sammansättningen och de varierande fixerings- och lagringsförhållandena efter döden kan äventyra vävnadsrensningseffektiviteten, antikroppspenetrationsdjupet och epitopigenkänningen 13,14,15,16,17,18,19. Dessutom krävs fortfarande mekanisk vävnadssnittning och efterföljande rensning och märkning av varje skiva för att uppnå en effektiv rensning och enhetlig märkning av stora mänskliga hjärnområden, vilket resulterar i långa bearbetningstider och behovet av sofistikerad anpassad utrustning, jämfört med modellorganismer 15,20,21,22.
Vävnadstransformationstekniken SWITCH - H2O2 - antigen Retrieval -TDE (SHORT) har utvecklats specifikt för att analysera stora volymer av den mänskliga hjärnan18,23. Denna metod använder vävnadsstrukturellt bevarande av SWITCH-protokoll11 och höga koncentrationer av peroxidväte för att minska vävnadens autofluorescens, i kombination med epitoprestaurering. SHORT möjliggör enhetlig färgning av mänskliga hjärnskivor med markörer för olika neuronala subtyper, gliaceller, kärl och myeliniserade fibrer18,24. Dess resultat är kompatibla med analys av både låg- och högdensitetsproteiner. De resulterande höga transparensnivåerna och enhetlig märkning möjliggör volymetrisk rekonstruktion av tjocka skivor med fluorescensmikroskopi, i synnerhet för snabb insamling kan lätta arkapparater användas 18,24,25,26,27.
I detta arbete beskriver vi hur vävnadstransformationstekniken SHORT kan användas för samtidig rensning och multi-round märkning av tiotals formalinfixerade mänskliga hjärnsnitt. Fyra olika fluorescerande markörer kan användas tillsammans, vilket leder till identifiering av olika cellulära subpopulationer. Efter rensning kan högupplöst volymetrisk avbildning utföras med fluorescensmikroskopi. Här använde vi en skräddarsydd inverterad LSFM 18,24,25,26,27, som möjliggör snabb optisk snittning av provet och snabb insamling av flera kanaler parallellt. Med detta protokoll med rutinmässig hög genomströmning är det möjligt att få en omfattande cellulär och strukturell karakterisering med en subcellulär upplösning av stora områden av den mänskliga hjärnan, vilket redan visats i kartläggningen av ett helt Brocas område23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Formalinfixerade humana vävnadsprover tillhandahölls av avdelningen för neuropatologi vid Massachusetts General Hospital (MGH) Autopsy Service (Boston, USA). Skriftligt samtycke erhölls från friska deltagare före dödsfallet, i enlighet med IRB-godkända vävnadsinsamlingsprotokoll från Partners Institutional Biosafety Committee (PIBC, protokoll 2003P001937). Auktoriseringsdokumenten förvaras hos MGH Autopsy Services i Boston, MA, USA, och är tillgängliga på begäran.
1. Agarosinbäddning och provskärning
- Bered en 4 % w/v agaroslösning i 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS, pH 7,4) i en bägare och bädda in vävnadsblocket inuti. Vänta tills den når rumstemperatur (RT) och förvara sedan vid 4 °C i 24 timmar.
- För att få sektioner med hög precision, limma provet på vibratomens provskiva och fyll brickan med kall 1x PBS (pH 7,4). Justera vibratomparametrarna som frekvens, amplitud och hastighet beroende på vilken typ av vävnad som ska skivas (använda värden: frekvens = 5 (50 Hz); amplitud = 0.4; hastighet = 3 (0.15 mm/s).
OBS: Olika vibratomer bör användas beroende på sample volym. För prover med en maximal volym på 70 x 40 x 15 mm kan en vibratom (t.ex. Leica VT1000 S) användas; för större prover är det möjligt att använda en kompresstom (t.ex. VF-900-0Z Microtome18) eller en specialtillverkad apparat21. Här presenterar vi skivor skurna med en tjocklek på antingen 400 μm eller 500 μm. - Efter skärning, lägg alla skivor i en konserveringslösning bestående av 1x PBS (pH 7,4) med 0,01 % w/v natriumazid (NaN3) och förvara vid 4 °C.
OBS: Innan inbäddning, vänta tills agaroslösningen når 37 °C. En högre temperatur kan skada provet. Det rekommenderas att inte lämna samples i PFA i mer än 48 timmar eftersom långvarig fixering kan störa märkningsproceduren genom att skada antigener och öka vävnadsautofluorescens. För långtidsförvaring av mänskliga vävnader används PBS med NaN3 för att förhindra mikrobiell kontaminering. På grund av toxiciteten hos NaN3, förbered konserveringslösningen under en kemisk huv.
2. Fixering av vävnad
OBS: Alla lösningar som används i följande protokoll bereds i stora volymer, tillräckliga för att bearbeta alla skivor av samma vävnadsblock och minimera den tekniska variationen och minska tiden för enskilda steg.
- Bered avstängningslösningen med 50 % v/v 1x PBS pH 3, 25 % v/v 0.1 M saltsyra (HCl), 25 % v/v 0.1 M kaliumväteftalat (KHP) och färsk 4 % v/v glutaraldehyd. Lägg alla prover i skålar med skruvlock (70 x 23 mm) och inkubera dem med avstängningslösningen genom att skaka dem försiktigt vid 4 °C i 1 dag, skydda dem från ljus med aluminiumfolie.
- Bered Switch-on-lösningen med 1x PBS (pH 7.4) och färsk 1% v/v glutaraldehyd. Lägg alla prover i nya skålar och inkubera dem med Switch-on-lösningen med lätt skakning vid 4 °C i 1 dag, skydda dem från ljus med aluminiumfolie.
OBS: På grund av glutaraldehydens höga toxicitet och ljuskänslighet måste både avstängnings- och påslagningslösningar alltid beredas färska och förvaras under kemikaliehuven på is. Fyll alltid skålen med 20 ml av varje lösning och försegla den med parafilm.
3. Inaktivering och rensning
OBS: Reaktiv glutaraldehyd i proverna måste inaktiveras genom inkubation med en inaktiveringslösning bestående av 1x PBS pH 7.4, 4% w/v acetamid, 4% w/v glycin, pH 9.0. Lösningen kan förvaras vid 4 °C i upp till 3 månader. För att avlägsna lipider och göra vävnaden transparent använder vi clearinglösningen som består av 200 mM natriumdodecylsulfat (SDS), 20 mM natriumsulfit (Na2SO3) och 20 mM borsyra (H3BO3), pH 9,0. Lösningen måste förvaras vid RT som SDS-utfällning vid 4 °C. Alla följande steg kommer att göras i rör fyllda med lösningen.
- Flytta proverna från disken till rör och tvätta i 3 x 2 timmar med 1x PBS pH 7,4 vid RT i försiktig skakning.
OBS: För steg 3.1 är det nödvändigt att arbeta under kemikaliehuven på grund av glutaraldehydtoxiciteten. Acetamid, SDS och borsyra är också giftiga reagenser, och de måste hanteras under en kemisk huva. Fyll alltid röret med 50 ml av varje lösning. - Inkubera proverna i inaktiveringslösning vid 37 °C i ett vattenbad över natten (o/n).
- Tvätta i 3 x 2 timmar i 1x PBS pH 7,4 vid RT i försiktig skakning.
- Inkubera proverna i en lösning vid 55 °C i ett vattenbad i 3-7 dagar. Byt lösning varannan dag (tabell 1).
4. Immunmärkning
OBS: Före märkningssteget är det nödvändigt att ta bort det kvarvarande SDS-kortet, minska autofluorescensen och avmaskera epitoperna med en antigenhämtningslösning bestående av 10 mM Tris-bas, 1 mM EDTA och 0.05 % v/v Tween 20, pH 9. Lösningens pH på 9 är optimerat för en effektiv hämtningsprocess; Tris-bas fungerar som ett buffertmedel för att upprätthålla en stabil pH-miljö; EDTA, som är ett kelatbildande medel, förbättrar antigenets tillgänglighet. Det nonjoniska rengöringsmedlet Tween 20 hjälper till att förbättra vävnadens permeabilitet. Denna lösning kan förvaras vid 4 °C. Det är viktigt att notera att väteperoxid i kombination med antigenhämtningssteget har en synergistisk effekt när det gäller att minska autofluorescenssignalen genom att bryta ner och/eller modifiera de endogena fluoroforer som är ansvariga för icke-specifika bakgrundssignaler (t.ex. lipofuscin).
- Bered 1x PBS med 0,1 % v/v Triton X-100 (PBST), förvärm den till 37 °C och tvätta proverna 3 x 3 timmar under dagen under lätt skakning vid 37 °C i inkubatorn. Låt den sista tvätten vara o/n.
OBS: Förvara PBST-stamlösningen vid 4 °C. Det är viktigt att avlägsna SDS från vävnaden eftersom det kan bilda olösliga utfällningar vid låga temperaturer som kan störa efterföljande förvärvsprocesser. - Dagen efter, tillsätt 10 ml 30 % v/v väteperoxid (H2O2) till varje prov och låt det skakas försiktigt vid RT i 45 minuter.
- Tvätta 3 x 10 min med 1x PBS (pH 7,4) med lätt skakning vid RT.
- Förvärm antigenuttagningslösningen vid 95 °C i ett vattenbad. Överför proverna till den uppvärmda lösningen och låt dem stå vid 95 °C i 10 minuter.
- Låt proverna svalna till RT i 40 minuter under lätt skakning.
- Tvätta 3 x 5 min med avjoniserat vatten under lätt skakning.
- Utjämna proverna i PBS vid 4 °C i 15 minuter.
- Bered ny antikroppslösning av PBST med 0,01 % vikt/volymNaN3 (se anmärkning för steg 1.3) och tillsätt primära antikroppar. Inkubera proverna med lösningen i skålar med skruvlock vid 37 °C i n dagar (1–7) i en inkubator med lätt skakning och skydd mot ljus (tabell 2).
OBS: Inkubationstiden är storleks- och tjockberoende (tabell 1 och tabell 2). - Efter n dagar flyttar du proverna till rör och tvättar 3 x 2 timmar med förvärmd PBST vid 37 °C med lätt skakning i inkubatorn.
- Tillsätt sekundära antikroppar i PBST med 0,01 % w/vNaN3 och inkubera proverna i nya skålar med skruvlock vid 37 °C i n dagar (1-6) i en inkubator med lätt skakning och skyddad från ljus (tabell 1 och tabell 2).
- Efter n dagar överförs proverna till rör och tvättas 3 x 3 timmar under dagen med förvärmd PBST vid 37 °C i en mild skakinkubator. Låt den sista tvätten vara o/n.
OBS: Eftersom Triton X-100 och Tween 20 är trögflytande, pipettera långsamt så att spetsen kan fyllas. Fyll alltid röret med 50 ml av varje lösning. Använd 10 ml antikroppslösningar för varje prov och försegla skålen med parafilm för att förhindra avdunstning av lösningen. Eftersom antikroppslösningarna innehållerNaN3 kan de förvaras vid 4 °C och återanvändas för att märka nya prover inom 2 veckor.
5. Matchning av brytningsindex
OBS: För att uppnå en hög grad av transparens är det nödvändigt att homogenisera vävnadsbrytningsindexet. Här använder vi 2,2'-tiodietanol (TDE) utspädd i 1x PBS. TDE-lösningar måste förvaras på RT.
- Överför proverna till nya rätter, tillsätt 30 % v/v TDE och låt dem stå i 4 timmar med lätt skakning vid RT.
- Ta bort 30 % v/v TDE-lösningen, tillsätt 68 % v/v TDE till proverna och låt dem skaka försiktigt vid RT.
OBS: Eftersom TDE är trögflytande, pipettera långsamt så att spetsen kan fyllas. Inandning av TDE-ånga eller dimma kan irritera andningsorganen. Därför är det lämpligt att arbeta i ett välventilerat utrymme eller använda dragskåp för att minimera exponeringen. TDE-lösningar måste förvaras vid RT. Använd 10 ml TDE-lösningar för varje sample.
6. Prov montering
OBS: För att underlätta provmontering och LSFM-bildtagning använder vi en skräddarsydd, förseglad provhållare (kallad "sandwich"), som består av tre delar: ett mikroskopglas, en distans och en täckglas.
- Sätt ståldistansen (56 x 56 x 0.5 mm3) över objektglaset (60 x 60 x 1 mm3) och lägg provet på objektglaset.
- Sätt försiktigt kvartstäckglaset (60 x 60 x 0,5 mm3), kläm ihop allt och förbered ett tvåkomponents silikonlim i förhållandet 1:1. Använd ett kvartstäckglas för att matcha brytningsindexet och minska den optiska aberrationen under insamlingsprocessen.
- Använd en 1 ml spruta, fyll utrymmet mellan distansen och täckglaset med ett tvåkomponents silikonlim och låt det torka i 10 minuter.
- Ta bort klämmorna och använd en liten nål för att långsamt fylla hela smörgåsen med 68 % v/v TDE.
- Gör nytt lim och försegla smörgåsen.
OBS: Om TDE av misstag når distansen i steg 6.1 kommer limmet inte att härda. Se till att inga luftbubblor bildas under steg 6.2.
7. Strippning
OBS: Det strukturella bevarandet och den förbättrade epitoptillgängligheten hos SHORT möjliggör flersidig märkning av skivor genom att ta bort antikropparna och färga om proverna med andra markörer.
- Öppna smörgåsen med ett blad, lägg proverna i nya formar med skruvlock fyllda med 30 % v/v TDE och låt dem stå i 3 timmar.
- Överför proverna till rör, tvätta i 3 x 2 timmar i 1x PBS (pH 7.4) vid RT med försiktig skakning och låt den sista tvätten vara o/n.
- Placera proverna i en klar lösning i ett vattenbad vid 80 °C i 4 timmar.
- Tvätta i 3 x 2 timmar i 1x PBST (pH 7.4) vid 37 °C i lätt skakning och låt den sista tvätten vara o/n. Nu är exemplet redo att märkas igen från och med steg 4.8.
OBS: Fyll alltid röret med 50 ml av varje lösning. Använd 10 ml TDE-lösning för varje sample.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet som beskrivs här möjliggör samtidig behandling av flera skivor, med tjocklek från 100 μm till 500 μm, med hjälp av SHORT-metoden. Detta tillvägagångssätt minskar avsevärt den totala handläggningstiden för hela proceduren. I detta arbete ger vi en omfattande beskrivning av hela pipelinen (Figur 1) för bearbetning av flera postmortem mänskliga hjärnans tjocka snitt samtidigt och vi demonstrerar protokollet på 24 skivor samtidigt (Figur 2A). Tiden för clearing och sammärkning varierar från 11 till 30 dagar, med hänsyn till provernas storlek och tjocklek (tabell 1), exklusive bildbehandling och efterbehandling. Efter delipidering och matchning av brytningsindex i TDE uppnås optimal och homogen transparens hos alla vävnadsskivor i både grå och vit substans (figur 2B).
Bildinsamlingen kan utföras med olika avancerade fluorescensmikroskop, inklusive konfokal25 och tvåfotonmikroskopi14. Här använde vi en skräddarsydd inverterad LSFM18,23 utrustad med fyra excitationslaserlinjer: 405 nm, 488 nm, 561 nm och 638 nm, som kan förvärva fyra olika biologiska egenskaper märkta med fluoroforkonjugerade antikroppar. Figur 3A visar representativa bilder av en 400 μm tjock skiva från ett mänskligt Broca-område som är medmärkt för NeuN, en panneuronal markör, somatostatin (SST) och kalretinin (CR), som betecknar två olika subpopulationer av interneuroner och kärnmarkören DAPI (figur 3A,B). I den 400 μm tjocka plattan observerade vi att den globala fluorescensen längs Z inte är begränsad till ytan, utan den är nästan enhetlig över hela vävnadsdjupet, även om signalintensiteten minskar något i mitten (Figur 3C).
För att uppnå en mer omfattande cellulär karakterisering av mänsklig hjärnvävnad är det möjligt att utföra flerroundmärkning av samma prover genom att ta bort antikropparna och märka om provet som visas i SHORT-originalartikeln. Figur 4 (anpassad från Pesce et al.18) visar den potentiella appliceringen av sju olika antikroppar på en 500 μm tjock vävnadsskiva som bearbetats med SHORT i tre på varandra följande omgångar av immunfärgning. De antikroppar som används inkluderar NeuN, SST, CR, Parvalbumin (PV) och vasoaktiv tarmpeptid (VIP) som hämmande neuronala markörer, gliafibrillärt surt protein (GFAP) för gliaceller och vimentin (VIM) för kärl (tabell 2). Resultaten visar den anmärkningsvärda förmågan hos SHORT att bevara vävnadsinformation genom olika strippningsprocedurer, effektivt minska autofluorescenssignaler och uppnå effektiv provrensning.
Figur 1: Tidslinje för SHORT. Schema som representerar de steg som krävs för att bearbeta proverna med SHORT-protokollet. I varje steg bearbetas tiotals mänskliga hjärnvävnadsplattor tillsammans. Efter inbäddning i agaros och skivning placeras proverna i på- och avstängningslösningar i 1 dag vardera; Inaktiveringsstegen utförs över natten medan delipidering genom inkubation i clearinglösning tar 3-7 dagar. Därefter inkuberas proverna med primära och sekundära antikroppslösningar i högst 7 respektive 6 dagar. Efter matchning av brytningsindex monteras proverna i provhållaren (sandwich) för LSFM-avbildning och lagring. När som helst efter sandwichmontering kan prover strippas och märkas om för detektering av olika markörer. Förkortningar: TDE = 2,2'-tiodietanol KORT = SHÄXA - H2O2 - Antigen Retrieval -TDE; o/n = över natten; RI = brytningsindex; LSFM = fluorescensmikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Mänskliga hjärnskivor från ett Broca-områdes block som bearbetas samtidigt. (A) Tjugofyra på varandra följande skivor från Brocas yta på 4 x 4 x 0,04 cm3 i PBS före bearbetning med SHORT-metoden. B) Samma prover i A visas efter den KORTA bearbetningen. Skalstreck = 1 cm. Förkortningar: TDE = 2,2'-tiodietanol KORT = SHÄXA - H2O2 - Antigen Retrieval -TDE; PBS = fosfatbuffrad koksaltlösning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3. Representativa LSFM-bilder av ett klargjort segment märkt med fyra olika markörer. (A) Projektionsbilder med maximal intensitet (upplösning på 3,3 x 3,3 x 3,3 μm3) som visar en mesoskopisk rekonstruktion av en SHORT-bearbetad del av Brocas område märkt för NeuN, Somatostatin, Calretinin och kärnmarkören DAPI. Till höger visas den sammanslagna bilden (NeuN-SST-CR-DAPI). Skalstreck = 0,5 cm. (B) Förstorad infogning av den sammanfogade bilden i A. Skalstapel = 100 μm. (C) Högupplösta (0,55 x 0,55 x 3,3 μm) yz-bilder från (B). Skalstapel = 100 μm. Förkortningar: TDE = 2,2'-tiodietanol KORT = SHÄXA - H2O2 - Antigen Retrieval -TDE; LSFM = fluorescensmikroskopi i ljusark; NeuN = neuronalt nukleärt antigen; SST = somatostatin; CR = kalretinin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa LSFM-bilder av flerrundad färgning i SHORT-bearbetade skivor. (A) Bilder av en preclearing av en mänsklig hjärnskiva (i PBS) och efter den flerrunda märkningen med brytningsindexmatchning (68 % TDE). Skalstreck = 1 cm. (B) Sammanslagning av de olika kanalerna som förvärvats under tre på varandra följande multirund. Bilden visar både vit och grå substans märkt med vasoaktiv tarmpeptid, somatostatin, parvalbumin, kalretinin, neuronalt nukleärt antigen, gliafibrillärt surt protein och vimentin. Enkanaliga bilder med hög upplösning (upplösning 0,55 x 0,55 x 3,3 μm) visas till höger och under bilden. Skalstapel = 100 μm för alla bilder, utom för GFAP (skalstapel 10 = μm). (C) Projektionsbilder med maximal intensitet av 500 μm tjock skiva som visar signalen från sju olika antikroppar som används i tre på varandra följande omgångar av immunfärgning. Varv 1: PV-SST-VIP; omgång 2: CR-SST-NeuN; varv 3: VIM-SST-GFAP. Skalstreck = 1 mm. Denna siffra har modifierats från Pesce et al.18. Förkortningar: TDE = 2,2'-tiodietanol KORT = SHÄXA - H2O2 - Antigen Retrieval -TDE; LSFM = fluorescensmikroskopi i ljusark; NeuN = neuronalt nukleärt antigen; SST = somatostatin; CR = kalretinin; PV = parvalbumin; GFAP = gliafibrillärt surt protein; VIM = vimentin; VIP = vasoaktiv tarmpeptid. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Representativ tidslängd för SHORT för prover med olika arealer och tjocklekar. Prover med olika ytor och tjocklekar kräver en variabel inkubationstid i clearing- och antikroppslösningar, vilket resulterar i distinkta tidslängder för hela SHORT-pipelinen. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Antikroppar kompatibla med SHORT. Tabellen listar alla antikroppar som testades med SHORT-protokollet och visade specifik färgning i 400-500 μm tjocka prover från mänsklig hjärna. P/M-kolumnen betecknar polyklonala och monoklonala antikroppar. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Högupplöst avbildning och 3D-rekonstruktion av stora mänskliga hjärnområden kräver mekanisk vävnadssnittning följt av optisk rensning och immunmärkning av enskilda skivor. Protokollet som presenteras här beskriver hur SHORT-vävnadstransformationsmetoden kan användas för snabb och samtidig bearbetning av flera tjocka snitt i den mänskliga hjärnan för 3D-hjärnrekonstruktion med en subcellulär upplösning med LSFM.
Till skillnad från andra tillvägagångssätt, med SHORT-metoden, kräver rensnings- och multimärkningsstegen inte sofistikerad anpassad utrustning. En stor del av proverna kan bearbetas helt och hållet, vilket minskar bearbetningstiden för stora mänskliga hjärnvävnadsblock och minimerar den tekniska variationen.
Avfärgning och epitopavmaskeringsbehandlingar är avgörande när man arbetar med åldrade, formalinfixerade mänskliga vävnader. Väteperoxiden och de alkaliska antigenhämtningslösningarna kan också användas i kombination med andra rensningsmetoder som iDISCO 6,28, CLARITY, SWITCH och SHIELD24.
För att säkerställa bevarandet av epitopinformation och uppnå enhetlig rensning av både grå och vit substans är det nödvändigt att omvandla provet till en gel/vävnadshybrid som är resistent mot värme och kemiska reagenser. Glutaraldehyd valdes för sin utmärkta tvärbindningsförmåga och sin förmåga att tränga in i vävnadsplattan vid lågt pH (pH = 3). Koncentrationen av glutaraldehyd är en kritisk faktor för att bestämma vävnadens styrka och klarhet. En högre koncentration leder till bättre bevarande av vävnadsstrukturen men ökar också den tid som krävs för rensning. Detta val möjliggör de önskade resultaten när det gäller epitopbevarande och homogen rensning. När det gäller avstängningslösningen (protokollsteg 2.1) har koncentrationen av glutaraldehyd noggrant valts ut och optimerats för att uppnå en balans mellan effektiv tvärbindning och snabb rensning18,25. SHORT är speciellt anpassad för att arbeta med formalinfixerade mänskliga hjärnskivor från Brocas område, hippocampus och kortikala cortex 18,23,25. Men när man arbetar med andra biologiska modeller eller olika hjärnregioner kan vissa modifieringar vara nödvändiga på grund av variationer i sammansättningen av grå och vit substans.
En viktig uppgift för detta protokoll är också optimering av inkubationstiden vid clearing (protokollsteg 3.4) och antikroppslösningar (protokollsteg 4.8 och 4.10), främst relaterade till provstorleken och vävnadens biologiska sammansättning. Vi uppskattade att 500 μm representerar gränsen för vävnadstjocklek för att uppnå optimal transparens i både vit och grå substans och enhetlig märkning över hela vävnadsdjupet för flera antikroppsfärgningar (tabell 2). En detaljerad beskrivning av dessa processer finns i Pesce et al.18 och Scardigli et al.24. Olika hjärnområden kan ha olika sammansättning av lipider och proteiner, och åldrade hjärnor utvecklar ett högt innehåll av lipofuscin-liknande pigment och neuromelanin som producerar en stark autofluorescenssignal och förändrar sonddiffusionen i hela vävnaden. Som ett exempel behöver en 400 μm tjock skiva på 16cm2 från Human Brocas område 7 dagars behandling med clearinglösningen för att nå en hög nivå av delipidering. För att säkerställa enhetlig färgning över hela vävnadsdjupet krävs inkubation med primära och sekundära antikroppslösningar i 7 respektive 6 dagar (figur 3). En finjustering för rensnings- och märkningsstegen krävs därför innan du tillämpar det protokoll för högt dataflöde som beskrivs här.
SHORT gör det möjligt att lagra prover i den skräddarsydda bildhållaren eftersom det har visats att den fluorescerande signalen bevaras i minst ett år. Forskarna kan därför förbereda alla smörgåsar i förväg och lagra dem för det avbildningssteg som kan göras senare. Noterbart är att mikroskopglaset, distansen och täckglaset som används för att förbereda smörgåsarna kan anpassas efter provets storlek.
Proverna som bearbetades med SHORT-protokollet som beskrivs här analyserades med hjälp av en skräddarsydd inverterad LSFM 18,23. Denna uppsättning består av två armar utrustade med 12x skräddarsydda objektiv med en korrigeringskrage för brytningsindex (RI). Varje objektiv fungerar som en belysnings- och detektionsarm samtidigt, vilket möjliggör samtidig registrering av två kanaler med en volymetrisk hastighet på 0,16 cm3/h. Eftersom provhållaren rymmer två smörgåsar åt gången kan vi avbilda fyra kanaler i följd i två skivor på 10 timmar. På grund av den milda toxiciteten hos TDE-ånga för andningsorganen, för att undvika sfärisk aberration, fylls provhållaren med 91 % v/v glycerol/vattenlösning som matchar RI (1.46) för både kvartstäckglaset och TDE-lösningen. 91 % v/v glycerol/vattenlösning måste bytas var 3:e dag för att undvika dammkontaminering. Därför möjliggör vår LSFM snabb insamling av prover med låg fotoblekning med en isotrop upplösning på 3,6 μm efter efterbehandling 18,23,29. Den stora mängden data som producerades bearbetades med hjälp av en definierad pipeline för omskivning och sammanfogning av bildstackarna med hjälp av en egenutvecklad programvara, ZetaStitcher (https://github.com/lens-biophotonics/ZetaStitcher)23,29.
Även om vi använde SHORT i kombination med fluorescensmikroskopi kan olika typer av fluorescensavbildningstekniker användas för insamlingen beroende på laboratoriets tillgänglighet och de specifika tillämpningarna. Till exempel kan konfokalmikroskopi25 eller tvåfotonmikroskopi14 användas för att analysera rensade prover. Denna typ av analys rekommenderas för prover med relativt små volymer eftersom de är skanningsbaserade system och insamlingstiden för stora vävnadsområden är mycket lång. Genom att uppnå snabbare avbildning och frikoppling av lateral och axiell upplösning är fluorescensmikroskopi av lätta ark den föredragna metoden för avbildning av stora volymer av rensade prover 3,4,18,31,32,33.
Sammanfattningsvis beskrev vi ett snabbt high-throughput-protokoll för samtidig clearing, homogen co-labeling och 3D-volymetrisk rekonstruktion av dussintals postmortem-sektioner av mänsklig hjärna. Genom att kombinera SHORT med LSFM-avbildning och beräkningsanalys är det möjligt att få tredimensionella data för en omfattande cellräkning och proteomikanalys av den mänskliga hjärnan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som skulle kunna tolkas som en potentiell intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi tackar Bruce Fischl, Massachusetts General Hospital, AA Martinos Center for Biomedical Imaging, Department of Radiology, för att ha tillhandahållit de mänskliga hjärnproverna som analyserats i denna studie. Detta projekt fick finansiering från EU:s ramprogram för forskning och innovation Horizon 2020 enligt bidragsavtal nr 654148 (Laserlab-Europe), från EU:s Horizon 2020 ramprogram för forskning och innovation enligt det specifika bidragsavtalet nr 785907 (Human Brain Project SGA2) och nr 945539 (Human Brain Project SGA3), från General Hospital Corporation Center of the National Institutes of Health under tilldelningsnummer U01 MH117023, och från det italienska utbildningsministeriet inom ramen för Euro-Bioimaging Italian Node (ESFRI:s forskningsinfrastruktur). Slutligen utfördes denna forskning med bidrag från "Fondazione CR Firenze". Innehållet i detta arbete är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health. Figur 1 skapades med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2'-thiodiethanol | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
| Acetamide >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| Agarose High EEO | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
| Boric Acid | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
| Coverslips | LaserOptex | / | customized |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| Glutaraldehyde | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
| Glycine | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
| Hydrogen Peroxide 30% | Merck Life Science S.R.L. | ||
| Incubator ISS-4075 | Lab companion | / | |
| Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) | / | / | custom-made |
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| Microscope slides | Laborchimica | / | customized |
| Phospate buffer saline tablet | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | out of production |
| Potassium Hydrogen Phtalate | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| Sodium Azide | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
| Sodium Sulfite | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
| Spacers | Microlaser srl | customized | |
| Sputum Containers (dishes with screw lids) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| Tris Base | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
| Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
| Tubes | Sarstedt | 62 547254 | |
| Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| Water bath | Memmert | WNB 7-45 | |
| Antibodies and Dyes | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-NeuN Antibody | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | Dilution used, 1:100 |
| Anti-Parvalbumin antibody (PV) | Abcam | ab32895 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM) | Abcam | ab8069 | Dilution used, 1:200 |
| Calretinin Polyclonal antibody | ProteinTech | 12278_1_AP | Dilution used, 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | Dilution used, 1:100 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed | Abcam | ab175475 | Dilution used, 1:200 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | Dilution used, 1:200 |
| Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody | Abcam | ab194324 | Dilution used, 1:200 |
| Somatostatin Antibody YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | Dilution used, 1:200 |
| Vasoactive intestinal peptide (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | Dilution used, 1:200 |
References
- Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251 (2019).
- Richardson, D. S., et al.
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nature Protocols. 16 (6), 2732-2748 (2021).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 713-741 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6 (1), 18631 (2016).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Lee, H., Park, J. -H., Seo, I., Park, S. -H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14 (1), 48 (2014).
- Murray, E., et al. Simple, Scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Costantini, I., et al. Large-scale, cell-resolution volumetric mapping allows layer-specific investigation of human brain cytoarchitecture. Biomedical Optics Express. 12 (6), 3684 (2021).
- Lai, H. M., et al. Next generation histology methods for three-dimensional imaging of fresh and archival human brain tissues. Nature Communications. 9 (1), 1066 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812.e19 (2020).
- Costantini, I., et al. Autofluorescence enhancement for label-free imaging of myelinated fibers in mammalian brains. Scientific Reports. 11 (1), 8038 (2021).
- Pesce, L., et al. 3D molecular phenotyping of cleared human brain tissues with light-sheet fluorescence microscopy. Communications Biology. 5 (1), 447 (2022).
- Schueth, A., et al. Efficient 3D light-sheet imaging of very large-scale optically cleared human brain and prostate tissue samples. Communications Biology. 6 (1), 170 (2023).
- Morawski, M., et al. Developing 3D microscopy with CLARITY on human brain tissue: Towards a tool for informing and validating MRI-based histology. NeuroImage. 182, 417-428 (2018).
- Park, J., et al. Integrated platform for multi-scale molecular imaging and phenotyping of the human brain. bioRxiv. , (2022).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Costantini, I., et al. A cellular resolution atlas of Broca's area. Science Advances. (9), eadg3844 (2023).
- Scardigli, M., et al. Comparison of different tissue clearing methods for three-dimensional reconstruction of human brain cellular anatomy using advanced imaging techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 752234 (2021).
- Pesce, L., et al. Exploring the human cerebral cortex using confocal microscopy. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 168, 3-9 (2022).
- Keller, P. J., Dodt, H. -U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173.e12 (2017).
- Sorelli, M., et al. Fiber enhancement and 3D orientation analysis in label-free two-photon fluorescence microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 4160 (2023).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369 (2021).
- Costantini, I., et al. Editorial: The human brain multiscale imaging challenge. Frontiers in Neuroanatomy. (16), 1060405 (2022).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5 (1), 9808 (2015).
