Summary
Het huidige protocol biedt een stapsgewijze procedure voor snelle en gelijktijdige optische clearing, multi-round labeling en 3D volumetrische reconstructie van tientallen postmortale menselijke hersensecties door de (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT weefseltransformatietechniek te combineren met light-sheet fluorescentiemicroscopiebeeldvorming in een routinematig high-throughput protocol.
Abstract
Ondanks de talrijke ophelderingstechnieken die in het afgelopen decennium zijn ontstaan, blijft het verwerken van postmortale menselijke hersenen een uitdagende taak vanwege de afmetingen en complexiteit, die beeldvorming met micrometerresolutie bijzonder moeilijk maken. Dit artikel presenteert een protocol om de reconstructie van volumetrische delen van het menselijk brein uit te voeren door tegelijkertijd tientallen secties te verwerken met het SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) weefseltransformatieprotocol, dat clearing, labeling en sequentiële beeldvorming van de monsters mogelijk maakt met light-sheet fluorescentiemicroscopie (LSFM). SHORT zorgt voor een snelle weefselopruiming en homogene multi-labeling van dikke plakken met verschillende neuronale markers, waardoor de identificatie van verschillende neuronale subpopulaties in zowel witte als grijze stof mogelijk wordt. Na het opruimen worden de plakjes via LSFM met micrometerresolutie en in meerdere kanalen tegelijk in beeld gebracht voor een snelle 3D-reconstructie. Door SHORT te combineren met LSFM-analyse binnen een routinematig high-throughput protocol, is het mogelijk om in korte tijd de 3D-cytoarchitectuurreconstructie van grote volumetrische gebieden met hoge resolutie te verkrijgen, waardoor een uitgebreide structurele karakterisering van het menselijk brein mogelijk wordt.
Introduction
Het analyseren van de 3D-moleculaire organisatie en cytoarchitectuur van grote volumes van het menselijk brein vereist optische transparantie van monsters, bereikt door protocollen met een lange verwerkingstijd. Optische ophelderingstechnieken werden ontwikkeld om de heterogeniteit in brekingsindex (RI) in de weefsels te minimaliseren, waardoor lichtverstrooiing wordt verminderd en de lichtpenetratiediepte wordt vergroot voor beeldvorming met hoge resolutie 1,2,3,4,5. De huidige vooruitgang op het gebied van opruimings- en diepe weefsellabelingmethoden maakt volumetrische beeldvorming van intacte knaagdierorganen en embryo's mogelijk door gebruik te maken van geavanceerde microscopietechnieken 6,7,8,9,10,11,12.
Volumetrische 3D-reconstructie van grote delen van het postmortale menselijke brein is echter nog steeds een uitdagende taak in vergelijking met modelorganismen. De complexe biologische samenstelling en de variabele postmortale fixatie- en opslagomstandigheden kunnen de efficiëntie van het opruimen van weefsel, de penetratiediepte van antilichamen en de epitoopherkenning in gevaar brengen 13,14,15,16,17,18,19. Bovendien is het mechanisch doorsnijden van weefsel en het vervolgens wissen en labelen van elke plak nog steeds nodig om een efficiënte opruiming en uniforme etikettering van grote menselijke hersengebieden te bereiken, wat resulteert in lange verwerkingstijden en de behoefte aan geavanceerde aangepaste apparatuur, vergeleken met modelorganismen 15,20,21,22.
De SWITCH - H2O2 - antigen Retrieval -TDE (KORTE) weefseltransformatietechniek is speciaal ontwikkeld om grote volumes van het menselijk brein te analyseren18,23. Deze methode maakt gebruik van het weefselstructurele behoud van het SWITCH-protocol11 en hoge concentraties peroxidewaterstof om weefselautofluorescentie te verminderen, in combinatie met epitoopherstel. SHORT maakt uniforme kleuring van menselijke hersenplakjes mogelijk met markers voor verschillende neuronale subtypes, gliacellen, vasculatuur en gemyeliniseerde vezels18,24. De resultaten zijn compatibel met de analyse van eiwitten met zowel lage als hoge dichtheid. De resulterende hoge transparantieniveaus en uniforme etikettering maken volumetrische reconstructie van dikke plakjes mogelijk met fluorescentiemicroscopie, met name voor snelle acquisitie kan light-sheet-apparatuur worden gebruikt 18,24,25,26,27.
In dit werk beschrijven we hoe de SHORT-weefseltransformatietechniek kan worden gebruikt voor het gelijktijdig opruimen en labelen van tientallen met formaline gefixeerde menselijke hersensecties. Vier verschillende fluorescerende markers kunnen samen worden gebruikt, wat leidt tot de identificatie van verschillende cellulaire subpopulaties. Na het klaren kan volumetrische beeldvorming met hoge resolutie worden uitgevoerd met fluorescentiemicroscopie. Hier gebruikten we een op maat gemaakte omgekeerde LSFM 18,24,25,26,27, die een snelle optische doorsnede van het monster en een snelle verwerving van meerdere kanalen parallel mogelijk maakt. Met dit routinematig high-throughput protocol is het mogelijk om een uitgebreide cellulaire en structurele karakterisering te verkrijgen met een subcellulaire resolutie van grote delen van het menselijk brein, zoals al is aangetoond in het in kaart brengen van een volledig Broca-gebied23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Formaline-gefixeerde menselijke weefselmonsters werden geleverd door de afdeling Neuropathologie van de Massachusetts General Hospital (MGH) Autopsy Service (Boston, VS). Schriftelijke toestemming werd verkregen van gezonde deelnemers voorafgaand aan het overlijden, volgens IRB-goedgekeurde weefselafnameprotocollen van de Partners Institutional Biosafety Committee (PIBC, protocol 2003P001937). De autorisatiedocumenten worden bewaard bij de MGH Autopsy Services in Boston, MA, Verenigde Staten, en zijn op verzoek verkrijgbaar.
1. Agarose-inbedding en monstersnijden
- Bereid een agarose-oplossing van 4% g/v in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) in een bekerglas en plaats het weefselblok erin. Wacht tot het op kamertemperatuur is (RT) en bewaar vervolgens 24 uur bij 4 °C.
- Om zeer nauwkeurige secties te verkrijgen, lijmt u het monster op de trilschijf van het monster en vult u de bak met koude 1x PBS (pH 7,4). Pas de trillingsparameters zoals frequentie, amplitude en snelheid aan op basis van het type weefsel dat moet worden gesneden (gebruikte waarden: frequentie = 5 (50 Hz); amplitude = 0,4; snelheid = 3 (0,15 mm/s).
OPMERKING: Afhankelijk van het monstervolume moeten verschillende vibratomen worden gebruikt. Voor monsters met een maximaal volume van 70 x 40 x 15 mm kan een vibratoom (bijv. Leica VT1000 S) worden gebruikt; voor grotere monsters is het mogelijk om een compresstoom (bijv. VF-900-0Z Microtome18) of een op maat gemaakt apparaat21 te gebruiken. Hier presenteren we plakjes gesneden met een dikte van 400 μm of 500 μm. - Leg na het snijden alle plakjes in een conserveringsoplossing bestaande uit 1x PBS (pH 7,4) met 0,01% m/v natriumazide (NaN3) en bewaar bij 4 °C.
OPMERKING: Wacht voor het inbedden tot de agarose-oplossing 37 °C bereikt. Een hogere temperatuur kan het preparaat beschadigen. Het wordt aanbevolen om de monsters niet langer dan 48 uur in PFA te laten staan, omdat langdurige fixatie de etiketteringsprocedure kan verstoren door antigenen te beschadigen en de autofluorescentie van het weefsel te verhogen. Voor langdurige opslag van menselijke weefsels wordt PBS met NaN3 gebruikt om microbiële besmetting te voorkomen. Vanwege de toxiciteit van NaN3 bereidt u de conserveringsoplossing onder een chemische kap.
2. Weefselfixatie
OPMERKING: Alle oplossingen die in het volgende protocol worden gebruikt, worden in grote hoeveelheden bereid, voldoende om alle plakjes van hetzelfde weefselblok te verwerken en de technische variabiliteit te minimaliseren en de tijd voor afzonderlijke stappen te verkorten.
- Bereid de uitschakeloplossing met 50% v/v 1x PBS pH 3, 25% v/v 0,1 M zoutzuur (HCl), 25% v/v 0,1 M kaliumwaterstofftalaat (KHP) en vers 4% v/v glutaaraldehyde. Plaats alle monsters in schalen met schroefdeksels (70 x 23 mm) en incubeer ze gedurende 1 dag met de uitschakeloplossing met zacht schudden bij 4 °C, waarbij u ze met aluminiumfolie tegen licht beschermt.
- Bereid de Switch-on oplossing met 1x PBS (pH 7,4) en verse 1% v/v glutaaraldehyde. Plaats alle monsters in nieuwe schalen en incubeer ze met de Switch-on-oplossing met zacht schudden bij 4 °C gedurende 1 dag, waarbij ze met aluminiumfolie tegen licht worden beschermd.
NOTITIE: Vanwege de hoge toxiciteit en lichtgevoeligheid van glutaaraldehyde, moeten zowel Switch-off- als Switch-on-oplossingen altijd vers worden bereid en onder de chemische kap op ijs worden bewaard. Vul de schaal altijd met 20 ml van elke oplossing en sluit deze af met parafilm.
3. Inactivatie en opruiming
OPMERKING: Reactief glutaaraldehyde in de monsters moet worden geïnactiveerd door incubatie met een inactiveringsoplossing bestaande uit 1x PBS pH 7,4, 4% w/v acetamide, 4% w/v glycine, pH 9,0. De oplossing kan maximaal 3 maanden bij 4 °C worden bewaard. Om lipiden te verwijderen en het weefsel transparant te maken, gebruiken we de klaringsoplossing bestaande uit 200 mM natriumdodecylsulfaat (SDS), 20 mM natriumsulfiet (Na2SO3) en 20 mM boorzuur (H3BO3), pH 9,0. De oplossing moet bij RT worden opgeslagen, aangezien SDS neerslaat bij 4 °C. Alle volgende stappen worden uitgevoerd in buizen gevuld met de oplossing.
- Verplaats de monsters van de vaat naar de buizen en was ze gedurende 3 x 2 uur met 1x PBS pH 7.4 bij RT in zacht schudden.
OPMERKING: Voor stap 3.1 is het noodzakelijk om onder de chemische kap te werken vanwege de glutaaraldehydetoxiciteit. De acetamide, SDS en boorzuur zijn ook giftige reagentia en moeten onder een chemische kap worden gehanteerd. Vul de tube altijd met 50 ml van elke oplossing. - Incubeer de monsters in een inactiveringsoplossing bij 37 °C in een waterbad gedurende een nacht (o/n).
- Was gedurende 3 x 2 uur in 1x PBS pH 7.4 bij RT in zacht schudden.
- Incubeer de monsters in een klaringsoplossing bij 55 °C in een waterbad gedurende 3-7 dagen. Vervang de oplossing om de 2 dagen (tabel 1).
4. Immuno-etikettering
NOTITIE: Vóór de etiketteringsstap is het noodzakelijk om de resterende SDS te verwijderen, de autofluorescentie te verminderen en de epitopen te ontmaskeren met een antigeenoplossing bestaande uit 10 mM Tris-base, 1 mM EDTA en 0.05% v/v Tween 20, pH 9. De pH van 9 van de oplossing is geoptimaliseerd voor een efficiënt ophaalproces; Tris-base werkt als een buffermiddel om een stabiele pH-omgeving te behouden; EDTA, een chelaatvormer, verbetert de toegankelijkheid van het antigeen. Het niet-ionische wasmiddel Tween 20 helpt bij het verbeteren van de doorlaatbaarheid van het weefsel. Deze oplossing kan worden bewaard bij 4 °C. Het is belangrijk op te merken dat waterstofperoxide in combinatie met de stap voor het ophalen van antigeen een synergetisch effect heeft bij het verminderen van het autofluorescentiesignaal, door de endogene fluoroforen die verantwoordelijk zijn voor niet-specifiek achtergrondsignaal (zoals lipofuscine) af te breken en/of te wijzigen.
- Bereid 1x PBS met 0,1% v/v Triton X-100 (PBST), verwarm het voor tot 37 °C en was de monsters 3 x 3 uur gedurende de dag in zacht schudden bij 37 °C in de incubator. Laat de laatste wasbeurt o/n.
OPMERKING: Bewaar de PBST-stockoplossing bij 4 °C. Het is van cruciaal belang om SDS uit het weefsel te verwijderen, omdat het bij lage temperaturen onoplosbare neerslag kan vormen die de daaropvolgende acquisitieprocessen kan verstoren. - Voeg de dag erna 10 ml 30% v/v waterstofperoxide (H2O2) toe aan elk monster en laat het 45 minuten zachtjes schudden bij RT.
- Was 3 x 10 min met 1x PBS (pH 7,4) met zacht schudden op RT.
- Verwarm de oplossing voor het terughalen van antigeen bij 95 °C in een waterbad; breng de monsters over in de verwarmde oplossing en laat ze gedurende 10 minuten op 95 °C staan.
- Laat de monsters 40 minuten afkoelen tot RT in zacht schudden.
- Was 3 x 5 min met gedeïoniseerd water in zacht schudden.
- Breng de monsters in evenwicht in PBS bij 4 °C gedurende 15 min.
- Bereid een verse antilichaamoplossing gemaakt van PBST met 0,01% w/v NaN3 (zie de OPMERKING bij stap 1.3) en voeg primaire antilichamen toe. Incubeer de monsters met de oplossing in schalen met schroefdeksel bij 37 °C gedurende n dagen (1-7) in een incubator met zacht schudden en bescherming tegen licht (tabel 2).
OPMERKING: De incubatietijd is afhankelijk van de grootte en de dikte (tabel 1 en tabel 2). - Verplaats de monsters na n dagen in buisjes en was ze 3 x 2 uur met voorverwarmde PBST op 37 °C met zacht schudden in de incubator.
- Voeg secundaire antilichamen toe in PBST met 0,01% m/v NaN3 en incubeer de monsters in nieuwe schalen met schroefdeksels bij 37 °C gedurende n dagen (1-6) in een incubator met zacht schudden en beschermd tegen licht (tabel 1 en tabel 2).
- Breng de monsters na n dagen over in buisjes en was ze gedurende de dag 3 x 3 uur met voorverwarmde PBST bij 37 °C in een voorzichtig schuddende incubator. Laat de laatste wasbeurt o/n.
OPMERKING: Aangezien Triton X-100 en Tween 20 stroperig zijn, pipet u langzaam zodat de punt zich kan vullen. Vul de tube altijd met 50 ml van elke oplossing. Gebruik 10 ml antilichaamoplossingen voor elk monster en sluit de schaal af met parafilm om verdamping van de oplossing te voorkomen. Omdat de antilichaamoplossingen NaN 3 bevatten, kunnen ze bij 4 °C worden bewaard en binnen 2 weken worden hergebruikt om nieuwe monsters te labelen.
5. Aanpassing van de brekingsindex
OPMERKING: Om een hoge mate van transparantie te bereiken, is het noodzakelijk om de brekingsindex van het weefsel te homogeniseren. Hier gebruiken we 2,2'-thiodiethanol (TDE) verdund in 1x PBS. TDE-oplossingen moeten bij RT worden opgeslagen.
- Breng de monsters over naar nieuwe gerechten, voeg 30% v/v TDE toe en laat ze 4 uur staan met zacht schudden bij RT.
- Verwijder de 30% v/v TDE-oplossing, voeg 68% v/v TDE toe aan de monsters en laat ze zachtjes schudden bij RT.
OPMERKING: Aangezien TDE stroperig is, pipet u langzaam zodat de punt zich kan vullen. Inademing van TDE-damp of -nevel kan de luchtwegen irriteren. Daarom is het raadzaam om in een goed geventileerde ruimte te werken of zuurkasten te gebruiken om de blootstelling tot een minimum te beperken. TDE-oplossingen moeten worden bewaard bij RT. Gebruik 10 ml TDE-oplossingen voor elk monster.
6. Steekproef montage
OPMERKING: Om de montage van monsters en het verkrijgen van LSFM-beelden te vergemakkelijken, gebruiken we een op maat gemaakte, verzegelde monsterhouder ("sandwich" genoemd), die uit drie delen bestaat: een microscoopglaasje, een afstandhouder en een dekglaasje.
- Plaats de stalen afstandhouder (56 x 56 x 0,5mm3) over het microscoopglaasje (60 x 60 x 1mm3) en leg het monster op het microscopieglaasje.
- Plaats het kwartsdekglaasje (60 x 60 x 0,5 mm3) voorzichtig, klem alles aan elkaar en bereid een tweecomponenten siliconenlijm in een verhouding van 1:1. Gebruik een dekglaasje van kwarts om de brekingsindex aan te passen en de optische aberratie tijdens het acquisitieproces te verminderen.
- Vul met een spuit van 1 ml de ruimte tussen de afstandhouder en het dekglaasje met een tweecomponenten siliconenlijm en laat deze 10 minuten drogen.
- Verwijder de clips en gebruik een kleine naald om de hele sandwich langzaam te vullen met 68% v/v TDE.
- Maak verse lijm en sluit de sandwich af.
OPMERKING: Als de TDE per ongeluk het afstandsstuk in stap 6.1 bereikt, zal de lijm niet uitharden. Zorg ervoor dat er tijdens stap 6.2 geen luchtbellen ontstaan.
7. Strippen
OPMERKING: De structurele conservering en de verbeterde epitooptoegankelijkheid van SHORT maken het mogelijk om plakjes in meerdere rondes te labelen door de antilichamen te verwijderen en de monsters opnieuw te kleuren met andere markers.
- Open de sandwich met een mes, leg de monsters in nieuwe schalen met schroefdeksels gevuld met 30% v/v TDE en laat ze 3 uur staan.
- Breng de monsters over in buizen, was gedurende 3 x 2 uur in 1x PBS (pH 7.4) bij RT met zacht schudden en laat de laatste was o/n.
- Breng de monsters gedurende 4 uur in een klaringsoplossing in een waterbad van 80 °C.
- 3 x 2 uur wassen in 1x PBST (pH 7,4) op 37 °C in zacht schudden en de laatste wasbeurt o/n laten. Nu is het monster klaar om opnieuw te worden geëtiketteerd vanaf stap 4.8.
NOTITIE: Vul de tube altijd met 50 ml van elke oplossing. Gebruik 10 ml TDE-oplossing voor elk monster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het hier beschreven protocol maakt het mogelijk om meerdere plakken, variërend in dikte van 100 μm tot 500 μm, gelijktijdig te behandelen met behulp van de SHORT-methode. Deze aanpak verkort de totale verwerkingstijd voor de hele procedure aanzienlijk. In dit werk geven we een uitgebreide beschrijving van de hele pijplijn (Figuur 1) voor het gelijktijdig verwerken van meerdere postmortale dikke secties van het menselijk brein en demonstreren we het protocol op 24 plakjes tegelijk (Figuur 2A). De duur van het wissen en co-labelen varieert van 11 tot 30 dagen, rekening houdend met de grootte en dikte van de monsters (tabel 1), exclusief beeldvorming en verwerking na beeldvorming. Na delipidatie en aanpassing van de brekingsindex in TDE wordt een optimale en homogene transparantie van alle weefselplakken bereikt in zowel grijze als witte stof (figuur 2B).
De beeldacquisitie kan worden uitgevoerd met verschillende geavanceerde fluorescentiemicroscopen, waaronder confocale25 en twee-fotonmicroscopie14. Hier gebruikten we een op maat gemaakte omgekeerde LSFM18,23 uitgerust met vier excitatielaserlijnen: 405 nm, 488 nm, 561 nm en 638 nm, die in staat zijn om vier verschillende biologische kenmerken te verkrijgen die zijn gelabeld met fluorofoor-geconjugeerde antilichamen. Figuur 3A toont representatieve beelden van een 400 μm dikke plak uit het gebied van Broca van een mens die mede is gelabeld voor NeuN, een panneuronale marker, somatostatine (SST) en calretinine (CR), die twee verschillende subpopulaties van interneuronen en de nucleaire marker DAPI labelen (Figuur 3A,B). In de 400 μm dikke plaat zagen we dat de globale fluorescentie langs Z niet beperkt is tot het oppervlak, maar bijna uniform is over de hele weefseldiepte, hoewel de signaalintensiteit in het midden iets afneemt (Figuur 3C).
Om een uitgebreidere cellulaire karakterisering van menselijk hersenweefsel te bereiken, is het mogelijk om meervoudige labeling van dezelfde monsters uit te voeren door de antilichamen te strippen en het monster opnieuw te labelen, zoals aangetoond in het originele artikel van SHORT. Figuur 4 (aangepast van Pesce et al.18) toont de mogelijke toepassing van zeven verschillende antilichamen op een 500 μm dik weefselplakje dat met SHORT is verwerkt in drie opeenvolgende rondes van immunokleuring. De gebruikte antilichamen omvatten NeuN, SST, CR, Parvalbumine (PV) en vasoactief intestinaal peptide (VIP) als remmende neuronale markers, gliaal fibrillair zuur eiwit (GFAP) voor gliacellen en vimentine (VIM) voor vasculatuur (Tabel 2). De resultaten tonen het opmerkelijke vermogen van SHORT om weefselinformatie te bewaren tijdens verschillende stripprocedures, autofluorescentiesignalen effectief te verminderen en een efficiënte monsteropruiming te bereiken.
Figuur 1: Tijdlijn van SHORT. Schema dat de stappen weergeeft die nodig zijn om de monsters te verwerken met het SHORT-protocol. In elke stap worden tientallen menselijke hersenweefselplaten samen verwerkt. Na het inbedden in agarose en het snijden worden de monsters gedurende 1 dag in in- en uitschakeloplossingen geplaatst; De inactiveringsstappen worden 's nachts uitgevoerd, terwijl de delipidatie door incubatie in de reinigingsoplossing 3-7 dagen duurt. Daarna worden monsters geïncubeerd met primaire en secundaire antilichaamoplossingen gedurende respectievelijk maximaal 7 en 6 dagen. Na het matchen van de brekingsindex worden monsters in de monsterhouder (sandwich) gemonteerd voor LSFM-beeldvorming en -opslag. Op elk moment na de assemblage van de sandwich kunnen monsters worden gestript en opnieuw worden geëtiketteerd voor de detectie van verschillende markers. Afkortingen: TDE = 2,2'-thiodiethanol; SHORT = SWITCH - H2O2 - Antigeen Retrieval -TDE; o/n = 's nachts; RI = brekingsindex; LSFM = light-sheet fluorescentie microscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Plakjes van het menselijk brein uit het blok van een Broca-gebied worden tegelijkertijd verwerkt. (A) Vierentwintig opeenvolgende plakjes van Broca's gebied van 4 x 4 x 0,04cm3 in PBS vóór verwerking met de SHORT-methode. (B) Dezelfde specimens in A getoond na de SHORT-verwerking. Schaalbalk = 1 cm. Afkortingen: TDE = 2,2'-thiodiethanol; SHORT = SWITCH - H2O2 - Antigeen Retrieval -TDE; PBS = fosfaatgebufferde zoutoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Representatieve LSFM-afbeeldingen van een verduidelijkte plak gelabeld met vier verschillende markeringen. (A) Projectiebeelden met maximale intensiteit (resolutie van 3,3 x 3,3 x 3,3 μm3) met een mesoscopische reconstructie van een KORT verwerkt deel van het gebied van Broca gelabeld voor NeuN, somatostatine, calretinine en de nucleaire marker DAPI. Aan de rechterkant wordt de samengevoegde afbeelding (NeuN-SST-CR-DAPI) getoond. Schaalbalk = 0,5 cm. (B) Vergroot invoegsel van de samengevoegde afbeelding in A. Schaalbalk = 100 μm. (C) Hoge resolutie (0,55 x 0,55 x 3,3 μm) yz-beelden van (B). Schaalbalk = 100 μm. Afkortingen: TDE = 2,2'-thiodiethanol; SHORT = SWITCH - H2O2 - Antigeen Retrieval -TDE; LSFM = light-sheet fluorescentiemicroscopie; NeuN = Neuronaal Nucleair Antigeen; SST = somatostatine; CR = calretinine; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve LSFM-beelden van meervoudige kleuring in KORT verwerkte plakjes. (A) Beelden van een menselijke hersenplak preclearing (in PBS) en na de meerronde labeling met brekingsindexmatching (68% TDE). Schaalbalk = 1 cm. (B) Samenvoeging van de verschillende kanalen die tijdens drie opeenvolgende meervoudige rondes zijn verkregen. De afbeelding toont zowel witte als grijze stof gelabeld met vasoactief intestinaal peptide, somatostatine, parvalbumine, calretinine, neuronaal nucleair antigeen, gliaal fibrillair zuur eiwit en vimentine. Hoge resolutie (resolutie van 0,55 x 0,55 x 3,3 μm), enkelkanaals beelden worden rechts en onder het beeld weergegeven. Schaalbalk = 100 μm voor alle afbeeldingen, behalve GFAP (schaalbalk 10 = μm). (C) Projectiebeelden met maximale intensiteit van een plak van 500 μm dik die het signaal tonen van zeven verschillende antilichamen die worden gebruikt in drie opeenvolgende rondes van immunokleuring. Ronde 1: PV-SST-VIP; ronde 2: CR-SST-NeuN; Ronde 3: VIM-SST-GFAP. Schaalbalk = 1 mm. Dit cijfer is aangepast ten opzichte van Pesce et al.18. Afkortingen: TDE = 2,2'-thiodiethanol; SHORT = SWITCH - H2O2 - Antigeen Retrieval -TDE; LSFM = light-sheet fluorescentiemicroscopie; NeuN = Neuronaal Nucleair Antigeen; SST = somatostatine; CR = calretinine; PV = parvalbumine; GFAP = gliaal fibrillair zuur eiwit; VIM = vimentin; VIP = vasoactief intestinaal peptide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Representatieve tijdsduur van SHORT voor monsters met verschillende oppervlakten en diktes. Monsters met verschillende oppervlakten en diktes vereisen een variabele incubatietijd in klarings- en antilichaamoplossingen, wat resulteert in verschillende tijdslengtes voor de hele SHORT-pijplijn. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Antilichamen die compatibel zijn met SHORT. De tabel geeft een overzicht van alle antilichamen die werden getest met het SHORT-protocol en specifieke kleuring vertoonden in 400-500 μm dikke menselijke hersenmonsters. De P/M-kolom geeft polyklonale en monoklonale antilichamen aan. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beeldvorming met hoge resolutie en 3D-reconstructie van grote menselijke hersengebieden vereisen mechanische weefselsectie, gevolgd door optische opheldering en immunolabeling van afzonderlijke plakjes. Het hier gepresenteerde protocol beschrijft hoe de SHORT-weefseltransformatiemethode kan worden gebruikt voor snelle en gelijktijdige verwerking van meerdere dikke secties van het menselijk brein voor 3D-hersenreconstructie met een subcellulaire resolutie met LSFM.
In tegenstelling tot andere benaderingen, vereisen de clearing- en multi-labeling-stappen met de SHORT-methode geen geavanceerde, op maat gemaakte apparatuur. Een groot deel van de monsters kan in zijn geheel worden verwerkt, waardoor de verwerkingstijd van grote menselijke hersenweefselblokken wordt verkort en de technische variabiliteit wordt geminimaliseerd.
Ontkleurings- en epitoopontmaskeringsbehandelingen zijn cruciaal bij het werken met verouderde, met formaline gefixeerde menselijke weefsels. De waterstofperoxide en de alkalische antigeenoplossingen kunnen ook worden gebruikt in combinatie met andere opruimmethoden zoals de iDISCO 6,28, CLARITY, SWITCH en SHIELD24.
Om het behoud van epitopale informatie te garanderen en een uniforme opruiming van zowel grijze als witte stof te bereiken, is het noodzakelijk om het monster om te zetten in een gel/weefselhybride die bestand is tegen hitte en chemische reagentia. Glutaaraldehyde werd geselecteerd vanwege zijn uitstekende verknopingsvermogen en zijn vermogen om bij lage pH (pH = 3) in de weefselplaat door te dringen. De concentratie glutaaraldehyde is een kritische factor bij het bepalen van de sterkte en helderheid van weefsel. Een hogere concentratie leidt tot een beter behoud van de weefselstructuur, maar verhoogt ook de tijd die nodig is voor het opruimen. Deze keuze maakt de gewenste resultaten mogelijk op het gebied van epitoopbehoud en homogene opruiming. In het geval van de uitschakeloplossing (protocolstap 2.1) is de concentratie glutaaraldehyde zorgvuldig gekozen en geoptimaliseerd om een evenwicht te vinden tussen effectieve verknoping en snelle klaring 18,25. SHORT is specifiek op maat gemaakt voor het werken met formaline-gefixeerde menselijke hersenplakjes uit het gebied van Broca, de hippocampus en de corticale cortex 18,23,25. Bij het werken met andere biologische modellen of verschillende hersengebieden kunnen echter enkele aanpassingen nodig zijn vanwege variaties in de samenstelling van grijze en witte stof.
Een cruciale taak van dit protocol is ook de optimalisatie van de incubatietijd bij het opruimen (protocolstap 3.4) en antilichaamoplossingen (protocolstappen 4.8 en 4.10), voornamelijk gerelateerd aan de grootte van het monster en de biologische samenstelling van het weefsel. We schatten dat 500 μm de weefseldiktelimiet vertegenwoordigt om optimale transparantie in zowel witte als grijze stof en uniforme etikettering over de hele weefseldiepte te bereiken voor verschillende antilichaamkleuring (tabel 2). Een gedetailleerde beschrijving van deze processen is te vinden in Pesce et al.18 en Scardigli et al.24. Verschillende hersengebieden kunnen een verschillende samenstelling hebben in lipiden en eiwitten, en verouderde hersenen ontwikkelen een hoog gehalte aan lipofuscine-achtige pigmenten en neuromelanine die een sterk autofluorescentiesignaal produceren en de sondediffusie door het weefsel veranderen. Een 400 μm dikke plak van 16cm2 uit het gebied van Broca van de mens heeft bijvoorbeeld 7 dagen behandeling met de reinigingsoplossing nodig om een hoog niveau van delipidatie te bereiken. Om een gelijkmatige kleuring over de hele weefseldiepte te garanderen, vereist het incubatie met primaire en secundaire antilichaamoplossingen gedurende respectievelijk 7 en 6 dagen (Figuur 3). Een fijne optimalisatie voor de clearing- en labelstappen is daarom vereist voordat het hier beschreven high-throughput-protocol wordt toegepast.
SHORT maakt het mogelijk om monsters op te slaan in de op maat gemaakte beeldvormingshouder, aangezien is aangetoond dat het fluorescerende signaal minimaal een jaar bewaard blijft. Onderzoekers kunnen daarom alle broodjes van tevoren klaarmaken en bewaren voor de beeldvormingsstap die vervolgens kan worden gedaan. Met name het microscoopglaasje, de afstandhouder en het afdekglas dat wordt gebruikt om de sandwiches te bereiden, kunnen worden aangepast aan de grootte van het monster.
De monsters die met het hier beschreven SHORT-protocol zijn verwerkt, zijn geanalyseerd met behulp van een op maat gemaakte omgekeerde LSFM18,23. Deze opstelling bestaat uit twee armen die zijn uitgerust met 12x op maat gemaakte objectieven met een brekingsindex (RI) correctiekraag. Elk objectief fungeert tegelijkertijd als een verlichtings- en detectiearm, waardoor de gelijktijdige verwerving van twee kanalen met een volumetrische snelheid van 0,16 cm3/h mogelijk is. Omdat de preparaathouder plaats biedt aan twee sandwiches tegelijk, zijn we in staat om in 10 uur vier kanalen in twee plakjes achter elkaar in beeld te brengen. Vanwege de milde toxiciteit van TDE-damp voor de luchtwegen, om sferische aberratie te voorkomen, is de monsterhouder gevuld met 91% v/v glycerol/wateroplossing die overeenkomt met de RI (1,46) van zowel het kwartsdekglaasje als de TDE-oplossing. De 91% v/v glycerol/wateroplossing moet om de 3 dagen worden ververst om stofverontreiniging te voorkomen. Daarom maakt onze LSFM een snelle verwerving mogelijk van monsters met een lage fotobleking met een isotrope resolutie van 3,6 μm na nabewerking 18,23,29. De grote hoeveelheid geproduceerde gegevens werd verwerkt met behulp van een gedefinieerde pijplijn voor het opnieuw snijden en samenvoegen van de beeldstapels met behulp van een zelf ontwikkelde software, ZetaStitcher (https://github.com/lens-biophotonics/ZetaStitcher)23,29.
Hoewel we SHORT hebben gebruikt in combinatie met light-sheet fluorescentiemicroscopie, kunnen verschillende soorten fluorescentiebeeldvormingstechnieken worden gebruikt voor de acquisitie, afhankelijk van de beschikbaarheid van het laboratorium en de specifieke toepassingen. Confocale microscopie25 of twee-fotonmicroscopie14 kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om vrijgemaakte monsters te analyseren. Dit type analyse wordt aanbevolen voor monsters met relatief kleine volumes, aangezien het op scannen gebaseerde systemen zijn en de acquisitietijd voor grote weefselgebieden erg langis30. Door snellere beeldvorming en ontkoppeling van laterale en axiale resolutie, is light-sheet fluorescentiemicroscopie de voorkeursmethode voor het afbeelden van grote hoeveelheden gewiste monsters 3,4,18,31,32,33.
Samenvattend beschreven we een snel high-throughput protocol voor gelijktijdige clearing, homogene co-labeling en 3D volumetrische reconstructie van tientallen postmortale menselijke hersensecties. Door SHORT te combineren met LSFM-beeldvorming en computationele analyse, is het mogelijk om driedimensionale gegevens te verkrijgen voor een uitgebreide celtelling en proteomische analyse van het menselijk brein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd zonder dat er commerciële of financiële relaties waren die als een potentieel belangenconflict zouden kunnen worden opgevat.
Acknowledgments
We danken Bruce Fischl, Massachusetts General Hospital, AA Martinos Center for Biomedical Imaging, Department of Radiology, voor het verstrekken van de menselijke hersenmonsters die in deze studie zijn geanalyseerd. Dit project ontving financiering van het Horizon 2020 Research and Innovation Framework Programme van de Europese Unie in het kader van subsidieovereenkomst nr. 654148 (Laserlab-Europe), van het Horizon 2020-kaderprogramma voor onderzoek en innovatie van de Europese Unie in het kader van de specifieke subsidieovereenkomst nr. 785907 (Human Brain Project SGA2) en nr. 945539 (Human Brain Project SGA3), van het General Hospital Corporation Center van de National Institutes of Health onder toekenningsnummer U01 MH117023, en van het Italiaanse ministerie van Onderwijs in het kader van Euro-Bioimaging Italian Node (ESFRI-onderzoeksinfrastructuur). Ten slotte werd dit onderzoek uitgevoerd met de bijdrage van "Fondazione CR Firenze". De inhoud van dit werk valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2'-thiodiethanol | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
| Acetamide >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| Agarose High EEO | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
| Boric Acid | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
| Coverslips | LaserOptex | / | customized |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| Glutaraldehyde | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
| Glycine | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
| Hydrogen Peroxide 30% | Merck Life Science S.R.L. | ||
| Incubator ISS-4075 | Lab companion | / | |
| Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) | / | / | custom-made |
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| Microscope slides | Laborchimica | / | customized |
| Phospate buffer saline tablet | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | out of production |
| Potassium Hydrogen Phtalate | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| Sodium Azide | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
| Sodium Sulfite | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
| Spacers | Microlaser srl | customized | |
| Sputum Containers (dishes with screw lids) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| Tris Base | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
| Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
| Tubes | Sarstedt | 62 547254 | |
| Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| Water bath | Memmert | WNB 7-45 | |
| Antibodies and Dyes | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-NeuN Antibody | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | Dilution used, 1:100 |
| Anti-Parvalbumin antibody (PV) | Abcam | ab32895 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM) | Abcam | ab8069 | Dilution used, 1:200 |
| Calretinin Polyclonal antibody | ProteinTech | 12278_1_AP | Dilution used, 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | Dilution used, 1:100 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed | Abcam | ab175475 | Dilution used, 1:200 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | Dilution used, 1:200 |
| Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody | Abcam | ab194324 | Dilution used, 1:200 |
| Somatostatin Antibody YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | Dilution used, 1:200 |
| Vasoactive intestinal peptide (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | Dilution used, 1:200 |
References
- Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251 (2019).
- Richardson, D. S., et al.
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nature Protocols. 16 (6), 2732-2748 (2021).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 713-741 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6 (1), 18631 (2016).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Lee, H., Park, J. -H., Seo, I., Park, S. -H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14 (1), 48 (2014).
- Murray, E., et al. Simple, Scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Costantini, I., et al. Large-scale, cell-resolution volumetric mapping allows layer-specific investigation of human brain cytoarchitecture. Biomedical Optics Express. 12 (6), 3684 (2021).
- Lai, H. M., et al. Next generation histology methods for three-dimensional imaging of fresh and archival human brain tissues. Nature Communications. 9 (1), 1066 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812.e19 (2020).
- Costantini, I., et al. Autofluorescence enhancement for label-free imaging of myelinated fibers in mammalian brains. Scientific Reports. 11 (1), 8038 (2021).
- Pesce, L., et al. 3D molecular phenotyping of cleared human brain tissues with light-sheet fluorescence microscopy. Communications Biology. 5 (1), 447 (2022).
- Schueth, A., et al. Efficient 3D light-sheet imaging of very large-scale optically cleared human brain and prostate tissue samples. Communications Biology. 6 (1), 170 (2023).
- Morawski, M., et al. Developing 3D microscopy with CLARITY on human brain tissue: Towards a tool for informing and validating MRI-based histology. NeuroImage. 182, 417-428 (2018).
- Park, J., et al. Integrated platform for multi-scale molecular imaging and phenotyping of the human brain. bioRxiv. , (2022).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Costantini, I., et al. A cellular resolution atlas of Broca's area. Science Advances. (9), eadg3844 (2023).
- Scardigli, M., et al. Comparison of different tissue clearing methods for three-dimensional reconstruction of human brain cellular anatomy using advanced imaging techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 752234 (2021).
- Pesce, L., et al. Exploring the human cerebral cortex using confocal microscopy. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 168, 3-9 (2022).
- Keller, P. J., Dodt, H. -U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173.e12 (2017).
- Sorelli, M., et al. Fiber enhancement and 3D orientation analysis in label-free two-photon fluorescence microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 4160 (2023).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369 (2021).
- Costantini, I., et al. Editorial: The human brain multiscale imaging challenge. Frontiers in Neuroanatomy. (16), 1060405 (2022).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5 (1), 9808 (2015).
