Summary
Le présent protocole fournit une procédure étape par étape pour l’effacement optique rapide et simultané, le marquage multi-rond et la reconstruction volumétrique 3D de dizaines de coupes de cerveau humain post-mortem en combinant la technique de transformation tissulaire courte (S WITCH - H 2O2 - Antigène Retrieval - 2,2'-thiodiéthanol [TDE]) avec l’imagerie par microscopie à fluorescence à feuille de lumière dans un protocole de routine à haut débit.
Abstract
Malgré les nombreuses techniques de nettoyage qui ont émergé au cours de la dernière décennie, le traitement des cerveaux humains post-mortem reste une tâche difficile en raison de ses dimensions et de sa complexité, qui rendent l’imagerie à résolution micrométrique particulièrement difficile. Cet article présente un protocole permettant d’effectuer la reconstruction de portions volumétriques du cerveau humain en traitant simultanément des dizaines de coupes avec le protocole de transformation tissulaire SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiéthanol [TDE]), qui permet l’élimination, le marquage et l’imagerie séquentielle des échantillons par microscopie à fluorescence à feuille de lumière (LSFM). SHORT permet un nettoyage rapide des tissus et un multi-marquage homogène de tranches épaisses avec plusieurs marqueurs neuronaux, permettant l’identification de différentes sous-populations neuronales dans la matière blanche et grise. Après le déblaiement, les tranches sont imagées via LSFM avec une résolution micrométrique et dans plusieurs canaux simultanément pour une reconstruction 3D rapide. En combinant l’analyse SHORT et LSFM dans le cadre d’un protocole de routine à haut débit, il est possible d’obtenir la reconstruction 3D de la cytoarchitecture de grandes surfaces volumétriques à haute résolution en peu de temps, permettant ainsi une caractérisation structurelle complète du cerveau humain.
Introduction
L’analyse de l’organisation moléculaire 3D et de la cytoarchitecture de grands volumes du cerveau humain nécessite une transparence optique des échantillons, obtenue grâce à des protocoles avec un temps de traitement important. Des techniques de clarification optique ont été développées pour minimiser l’hétérogénéité de l’indice de réfraction (IR) dans les tissus, réduisant ainsi la diffusion de la lumière et augmentant la profondeur de pénétration de la lumière pour l’imagerie haute résolution 1,2,3,4,5. Les progrès actuels dans les méthodes de nettoyage et de marquage des tissus profonds permettent l’imagerie volumétrique d’organes et d’embryons de rongeurs intacts en exploitant des techniques de microscopiede pointe 6,7,8,9,10,11,12.
Cependant, la reconstruction volumétrique 3D de grandes zones du cerveau humain post-mortem représente encore une tâche difficile par rapport aux organismes modèles. La composition biologique complexe et les conditions variables de fixation et de stockage post-mortem peuvent compromettre l’efficacité de l’élimination des tissus, la profondeur de pénétration des anticorps et la reconnaissance des épitopes 13,14,15,16,17,18,19. De plus, la section mécanique des tissus, ainsi que le nettoyage et l’étiquetage ultérieurs de chaque tranche, sont toujours nécessaires pour obtenir un nettoyage efficace et un marquage uniforme de grandes zones du cerveau humain, ce qui entraîne de longs temps de traitement et la nécessité d’un équipement personnalisé sophistiqué, par rapport aux organismes modèles 15,20,21,22.
La technique de transformation tissulaire S WITCH - H2O2 - antigène Retrieval -TDE (SHORT) a été développée spécifiquement pour analyser de grands volumes du cerveau humain18,23. Cette méthode utilise la préservation structurelle tissulaire du protocole SWITCH11 et des concentrations élevées de peroxyde d’hydrogène pour diminuer l’autofluorescence tissulaire, en combinaison avec la restauration d’épitopes. SHORT permet une coloration uniforme des tranches de cerveau humain avec des marqueurs pour différents sous-types neuronaux, cellules gliales, vascularisation et fibres myélinisées18,24. Ses résultats sont compatibles avec l’analyse des protéines de basse et de haute densité. Les niveaux élevés de transparence et l’uniformité du marquage qui en résultent permettent la reconstruction volumétrique de tranches épaisses par microscopie à fluorescence, en particulier pour l’acquisition rapide d’appareils à nappe de lumière pouvant être utilisés 18,24,25,26,27.
Dans ce travail, nous décrivons comment la technique de transformation tissulaire SHORT peut être utilisée pour le nettoyage simultané et le marquage multi-tours de dizaines de sections de cerveau humain fixées au formol. Quatre marqueurs fluorescents différents peuvent être utilisés ensemble, ce qui permet d’identifier différentes sous-populations cellulaires. Après le nettoyage, l’imagerie volumétrique à haute résolution peut être réalisée par microscopie à fluorescence. Ici, nous avons utilisé un LSFM inversé 18,24,25,26,27 sur mesure, qui permet une coupe optique rapide de l’échantillon et une acquisition rapide de plusieurs canaux en parallèle. Avec ce protocole à haut débit de routine, il est possible d’obtenir une caractérisation cellulaire et structurale complète avec une résolution subcellulaire de grandes zones du cerveau humain, comme cela a déjà été démontré dans la cartographie de l’ensemble de l’aire de Broca23.
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Protocol
Des échantillons de tissus humains fixés au formol ont été fournis par le département de neuropathologie du service d’autopsie du Massachusetts General Hospital (MGH) (Boston, États-Unis). Le consentement écrit des participants en bonne santé a été obtenu avant leur décès, conformément aux protocoles de prélèvement de tissus approuvés par la CISR et établis par le Comité de biosécurité de l’établissement des partenaires (PIBC, protocole 2003P001937). Les documents d’autorisation sont conservés auprès des services d’autopsie de l’HGM à Boston, MA, États-Unis, et sont disponibles sur demande.
1. Enrobage d’agarose et découpe d’échantillons
- Préparez une solution d’agarose à 4 % p/v dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4) dans un bécher et insérez le bloc de tissu à l’intérieur. Attendez qu’il atteigne la température ambiante (RT), puis conservez-le à 4 °C pendant 24 h.
- Pour obtenir des coupes de haute précision, collez l’échantillon sur le disque d’échantillon du vibratome et remplissez le plateau avec 1x PBS froid (pH 7,4). Ajustez les paramètres du vibratome tels que la fréquence, l’amplitude et la vitesse en fonction du type de tissu à trancher (valeurs utilisées : fréquence = 5 (50 Hz) ; amplitude = 0,4 ; vitesse = 3 (0,15 mm/s).
REMARQUE : Différents vibratomes doivent être utilisés en fonction du volume de l’échantillon. Pour les échantillons d’un volume maximal de 70 x 40 x 15 mm, un vibratome (par exemple, Leica VT1000 S) peut être utilisé ; pour les échantillons plus volumineux, il est possible d’utiliser un compresstome (par exemple, le microtome VF-900-0Z18) ou un appareil sur mesure21. Nous présentons ici des tranches découpées d’une épaisseur de 400 μm ou 500 μm. - Après la coupe, mettez toutes les tranches dans une solution de conservation composée de 1x PBS (pH 7,4) avec 0,01% p/v d’azoture de sodium (NaN3) et conservez à 4 °C.
REMARQUE : Avant d’enrober, attendez que la solution d’agarose atteigne 37 °C. Une température plus élevée pourrait endommager l’échantillon. Il est recommandé de ne pas laisser les échantillons dans la PFA pendant plus de 48 h car une fixation prolongée pourrait interférer avec la procédure de marquage en endommageant les antigènes et en augmentant l’autofluorescence des tissus. Pour le stockage à long terme des tissus humains, le PBS avec NaN3 est utilisé pour prévenir la contamination microbienne. En raison de la toxicité du NaN3, préparez la solution de conservateur sous une hotte chimique.
2. Fixation tissulaire
REMARQUE : Toutes les solutions utilisées dans le protocole suivant sont préparées en grands volumes, suffisants pour traiter toutes les tranches d’un même bloc de tissu et minimiser la variabilité technique et réduire le temps pour les étapes individuelles.
- Préparez la solution d’arrêt avec 50 % v/v 1x PBS pH 3, 25 % v/v 0,1 M d’acide chlorhydrique (HCl), 25 % v/v 0,1 M d’hydrogénophtalate de potassium (KHP) et du glutaraldéhyde frais 4 % v/v. Placez tous les échantillons dans des boîtes avec des couvercles à vis (70 x 23 mm) et incubez-les avec la solution Switch-off en agitant doucement à 4 °C pendant 1 jour, en les protégeant de la lumière avec du papier d’aluminium.
- Préparez la solution Switch-on avec 1x PBS (pH 7,4) et du glutaraldéhyde frais à 1% v/v. Placez tous les échantillons dans de nouvelles boîtes et incubez-les avec la solution Switch-on en agitant doucement à 4 °C pendant 1 jour, en les protégeant de la lumière avec du papier d’aluminium.
REMARQUE : En raison de la toxicité élevée et de la sensibilité à la lumière du glutaraldéhyde, les solutions d’arrêt et d’allumage doivent toujours être préparées fraîches et conservées sous la hotte chimique sur de la glace. Remplissez toujours le plat avec 20 mL de chaque solution et scellez-le avec du parafilm.
3. Inactivation et effacement
REMARQUE : Le glutaraldéhyde réactif dans les échantillons doit être inactivé par incubation avec une solution d’inactivation composée de 1x PBS pH 7,4, 4% p/v d’acétamide, 4% p/v de glycine, pH 9,0. La solution peut être conservée à 4 °C jusqu’à 3 mois. Pour éliminer les lipides et rendre le tissu transparent, nous utilisons la solution de clarification composée de 200 mM de dodécylsulfate de sodium (SDS), de 20 mM de sulfite de sodium (Na2SO3) et de 20 mM d’acide borique (H3BO3), pH 9,0. La solution doit être stockée à RT car le SDS précipite à 4 °C. Toutes les étapes suivantes seront effectuées dans des tubes remplis de la solution.
- Déplacez les échantillons de la vaisselle vers les tubes et lavez-les pendant 3 x 2 h avec 1x PBS pH 7,4 à RT en agitant doucement.
REMARQUE : Pour l’étape 3.1, il est nécessaire de travailler sous la hotte chimique en raison de la toxicité du glutaraldéhyde. L’acétamide, le SDS et l’acide borique sont également des réactifs toxiques et doivent être manipulés sous une hotte chimique. Remplissez toujours le tube avec 50 mL de chaque solution. - Incuber les échantillons dans une solution d’inactivation à 37 °C au bain-marie pendant une nuit (o/n).
- Laver pendant 3 x 2 h dans 1x PBS pH 7,4 à RT en agitant doucement.
- Incuber les échantillons dans une solution claire à 55 °C au bain-marie pendant 3 à 7 jours. Changez la solution tous les 2 jours (tableau 1).
4. Immunomarquage
REMARQUE : Avant l’étape de marquage, il est nécessaire d’enlever la FDS résiduelle, de réduire l’autofluorescence et de démasquer les épitopes avec une solution de récupération d’antigène composée de 10 mM de base Tris, 1 mM d’EDTA et 0,05 % v/v Tween 20, pH 9. Le pH de la solution de 9 est optimisé pour un processus de récupération efficace ; La base Tris agit comme un agent tampon pour maintenir un environnement de pH stable ; L’EDTA, qui est un agent chélateur, améliore l’accessibilité de l’antigène. Le détergent non ionique Tween 20 aide à améliorer la perméabilité des tissus. Cette solution peut être conservée à 4 °C. Il est important de noter que le peroxyde d’hydrogène combiné à l’étape de récupération de l’antigène ont un effet synergique dans la réduction du signal d’autofluorescence, en décomposant et/ou en modifiant les fluorophores endogènes responsables du signal de fond non spécifique (comme la lipofuscine).
- Préparez 1x PBS avec 0,1% v/v Triton X-100 (PBST), préchauffez-le à 37 °C et lavez les échantillons 3 x 3 h pendant la journée en agitant doucement à 37 °C dans l’incubateur. Laissez le dernier lavage o/n.
REMARQUE : Conserver la solution mère PBST à 4 °C. Il est crucial d’éliminer le SDS du tissu car il peut former des précipités insolubles à basse température qui peuvent interférer avec les processus d’acquisition ultérieurs. - Le lendemain, ajoutez 10 mL de peroxyde d’hydrogène (H2O2) à 30 % v/v à chaque échantillon et laissez-le agiter doucement à RT pendant 45 min.
- Laver 3 x 10 min avec 1x PBS (pH 7,4) en agitant doucement à RT.
- Préchauffer la solution de récupération d’antigène à 95 °C au bain-marie ; transférer les échantillons dans la solution chauffée et les laisser à 95 °C pendant 10 min.
- Laisser refroidir les échantillons jusqu’à ce qu’ils soient RT pendant 40 minutes en agitant doucement.
- Laver 3 x 5 min avec de l’eau déminéralisée en agitant doucement.
- Équilibrer les échantillons dans du PBS à 4 °C pendant 15 min.
- Préparer une nouvelle solution d’anticorps à base de PBST avec 0,01 % p/v de NaN3 (voir la NOTE pour l’étape 1.3) et ajouter les anticorps primaires. Incuber les échantillons avec la solution dans des boîtes à couvercle à vis à 37 °C pendant n jours (1-7) dans un incubateur en agitant doucement et à l’abri de la lumière (tableau 2).
REMARQUE : Le temps d’incubation dépend de la taille et de l’épaisseur (tableau 1 et tableau 2). - Après n jours, déplacer les échantillons dans des tubes et laver 3 x 2 h avec du PBST préchauffé à 37 °C en agitant doucement dans l’incubateur.
- Ajouter des anticorps secondaires dans du PBST contenant 0,01 % p/v de NaN3 et incuber les échantillons dans de nouvelles boîtes avec des couvercles à vis à 37 °C pendant n jours (1-6) dans un incubateur en agitant doucement et à l’abri de la lumière (Tableaux 1 et 2).
- Après n jours, transférer les échantillons dans des tubes et les laver 3 x 3 h pendant la journée avec du PBST préchauffé à 37 °C dans un incubateur à agitation douce. Laissez le dernier lavage o/n.
REMARQUE : Comme Triton X-100 et Tween 20 sont visqueux, pipetez lentement pour permettre à l’embout de se remplir. Remplissez toujours le tube avec 50 mL de chaque solution. Utilisez 10 mL de solutions d’anticorps pour chaque échantillon et scellez la boîte avec un parafilm pour empêcher l’évaporation de la solution. Étant donné que les solutions d’anticorps contiennent du NaN3, elles peuvent être stockées à 4 °C et réutilisées pour marquer de nouveaux échantillons dans un délai de 2 semaines.
5. Correspondance de l’indice de réfraction
REMARQUE : Pour obtenir un haut niveau de transparence, il est nécessaire d’homogénéiser l’indice de réfraction tissulaire. Ici, nous utilisons du 2,2'-thiodiéthanol (TDE) dilué dans 1x PBS. Les solutions TDE doivent être stockées à RT.
- Transférez les échantillons dans de nouveaux plats, ajoutez 30 % v/v de TDE et laissez-les pendant 4 h en agitant doucement à RT.
- Retirez la solution de TDE à 30 % v/v, ajoutez 68 % de TDE v/v aux échantillons et laissez-les en agitant doucement à RT.
REMARQUE : Comme le TDE est visqueux, pipetez lentement pour permettre à l’embout de se remplir. L’inhalation de vapeur ou de brouillard de TDE peut irriter le système respiratoire. Par conséquent, il est conseillé de travailler dans un endroit bien ventilé ou d’utiliser des hottes pour minimiser l’exposition. Les solutions de TDE doivent être entreposées à RT. Utiliser 10 mL de solutions de TDE pour chaque échantillon.
6. Montage de l’échantillon
REMARQUE : Pour faciliter le montage de l’échantillon et l’acquisition d’images LSFM, nous utilisons un porte-échantillon scellé sur mesure (appelé « sandwich »), qui se compose de trois parties : une lame de microscope, une entretoise et une lamelle.
- Placez l’entretoise en acier (56 x 56 x 0,5 mm3) sur la lame de microscope (60 x 60 x 1 mm3) et posez l’échantillon sur la lame de microscopie.
- Mettez soigneusement la lamelle de quartz (60 x 60 x 0,5 mm3), clipsez le tout ensemble et préparez une colle au silicone à deux composants dans un rapport de 1 :1. Utilisez une lamelle de quartz pour faire correspondre l’indice de réfraction et réduire l’aberration optique pendant le processus d’acquisition.
- À l’aide d’une seringue de 1 ml, remplissez l’espace entre l’entretoise et la lamelle avec une colle silicone à deux composants et laissez sécher pendant 10 min.
- Retirez les pinces et utilisez une petite aiguille pour remplir lentement tout le sandwich avec 68 % v/v TDE.
- Préparez de la colle fraîche et scellez le sandwich.
REMARQUE : Si le TDE atteint accidentellement l’entretoise à l’étape 6.1, la colle ne durcira pas. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air ne se forme à l’étape 6.2.
7. Décapage
REMARQUE : La préservation structurelle et l’accessibilité améliorée des épitopes de SHORT permettent un marquage multi-tours des tranches en retirant les anticorps et en recolorant les échantillons avec d’autres marqueurs.
- Ouvrez le sandwich à l’aide d’une lame, mettez les spécimens dans des plats neufs avec des couvercles à vis remplis de TDE à 30% v/v, et laissez-les pendant 3 h.
- Transférez les échantillons dans des tubes, lavez-les pendant 3 x 2 h dans 1x PBS (pH 7,4) à RT en agitant doucement et laissez le dernier lavage o/n.
- Placer les échantillons dans une solution claire au bain-marie à 80 °C pendant 4 h.
- Laver pendant 3 x 2 h dans 1x PBST (pH 7,4) à 37 °C en agitant doucement et laisser le dernier lavage o/n. L’échantillon est maintenant prêt à être étiqueté à nouveau à partir de l’étape 4.8.
REMARQUE : Remplissez toujours le tube avec 50 mL de chaque solution. Utiliser 10 mL de solution de TDE pour chaque échantillon.
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Representative Results
Le protocole décrit ici permet le traitement simultané de plusieurs tranches, d’une épaisseur allant de 100 μm à 500 μm, en utilisant la méthode SHORT. Cette approche réduit considérablement le temps de traitement global de l’ensemble de la procédure. Dans ce travail, nous fournissons une description complète de l’ensemble du pipeline (Figure 1) pour le traitement simultané de plusieurs coupes épaisses de cerveau humain post-mortem et nous démontrons le protocole sur 24 coupes à la fois (Figure 2A). La durée de l’élimination et du co-marquage varie de 11 à 30 jours, compte tenu de la taille et de l’épaisseur des échantillons (tableau 1), à l’exclusion du traitement par imagerie et post-imagerie. Après délipidation et appariement de l’indice de réfraction dans le TDE, une transparence optimale et homogène de toutes les coupes de tissu est obtenue dans la substance grise et la substance blanche (Figure 2B).
L’acquisition d’images peut être réalisée avec différents microscopes à fluorescence avancés, y compris la microscopie confocale25 et la microscopie à deux photons14. Ici, nous avons utilisé un LSFM18,23 inversé sur mesure équipé de quatre lignes laser d’excitation : 405 nm, 488 nm, 561 nm et 638 nm, capables d’acquérir quatre caractéristiques biologiques différentes marquées avec des anticorps conjugués aux fluorophores. La figure 3A montre des images représentatives d’une tranche de 400 μm d’épaisseur provenant de l’aire de Broca humaine co-marquée pour NeuN, un marqueur pan-neuronal, la somatostatine (SST) et la calrétinine (CR), qui marquent deux sous-populations différentes d’interneurones et le marqueur nucléaire DAPI (Figure 3A,B). Dans la dalle de 400 μm d’épaisseur, nous avons observé que la fluorescence globale le long de Z n’est pas limitée à la surface, mais qu’elle est presque uniforme sur toute la profondeur du tissu, bien que l’intensité du signal diminue légèrement au milieu (Figure 3C).
Pour obtenir une caractérisation cellulaire plus complète du tissu cérébral humain, il est possible d’effectuer un marquage multi-tours des mêmes échantillons en enlevant les anticorps et en réétiquetant l’échantillon, comme le démontre l’article original de SHORT. La figure 4 (adaptée de Pesce et al.18) montre l’application potentielle de sept anticorps différents sur une tranche de tissu de 500 μm d’épaisseur traitée avec SHORT en trois cycles consécutifs d’immunomarquage. Les anticorps utilisés comprennent le NeuN, LE SST, LE CR, la parvalbumine (PV) et le peptide intestinal vasoactif (VIP) comme marqueurs neuronaux inhibiteurs, la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) pour les cellules gliales et la vimentine (VIM) pour le système vasculaire (tableau 2). Les résultats démontrent la capacité remarquable de SHORT à préserver l’information tissulaire tout au long de diverses procédures de stripping, à réduire efficacement les signaux d’autofluorescence et à obtenir un nettoyage efficace des échantillons.
Figure 1 : Chronologie de SHORT. Schéma représentant les étapes nécessaires au traitement des échantillons avec le protocole SHORT. À chaque étape, des dizaines de plaques de tissu cérébral humain sont traitées ensemble. Après l’enrobage dans l’agarose et le tranchage, les échantillons sont placés dans des solutions d’allumage et d’arrêt pendant 1 jour chacune ; Les étapes d’inactivation sont effectuées pendant la nuit, tandis que la délipidation par incubation dans une solution claire nécessite 3 à 7 jours. Ensuite, les échantillons sont incubés avec des solutions d’anticorps primaires et secondaires pendant un maximum de 7 et 6 jours, respectivement. Après l’appariement de l’indice de réfraction, les échantillons sont montés dans le porte-échantillon (sandwich) pour l’imagerie LSFM et le stockage. À tout moment après l’assemblage en sandwich, les échantillons peuvent être dépouillés et réétiquetés pour la détection de différents marqueurs. Abréviations : TDE = 2,2'-thiodiéthanol ; COURT = SWITCH - H2O2 - Antigène Retrieval -TDE ; o/n = pendant la nuit ; RI = indice de réfraction ; LSFM = microscopie à fluorescence à nappe de lumière. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Tranches de cerveau humain d’un bloc de la zone de Broca traitées simultanément. (A) Vingt-quatre tranches consécutives de l’aire de Broca de 4 x 4 x 0,04 cm3 en PBS avant traitement avec la méthode SHORT. (B) Les mêmes spécimens en A montrés après le traitement SHORT. Barre d’échelle = 1 cm. Abréviations : TDE = 2,2'-thiodiéthanol ; COURT = SWITCH - H2O2 - Antigène Retrieval -TDE ; PBS = solution saline tamponnée au phosphate. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 3. Images LSFM représentatives d’une tranche clarifiée étiquetée avec quatre marqueurs différents. (A) Images de projection d’intensité maximale (résolution de 3,3 x 3,3 x 3,3 μm3) montrant une reconstruction mésoscopique d’une tranche de l’aire de Broca à traitement COURT marquée pour NeuN, Somatostatine, Calrétinine et le marqueur nucléaire DAPI. Sur la droite, l’image fusionnée (NeuN-SST-CR-DAPI) est affichée. Barre d’échelle = 0,5 cm. (B) Insertion agrandie de l’image fusionnée en A. Barre d’échelle = 100 μm. (C) Images yz haute résolution (0,55 x 0,55 x 3,3 μm) de (B). Barre d’échelle = 100 μm. Abréviations : TDE = 2,2'-thiodiéthanol ; COURT = SWITCH - H2O2 - Antigène Retrieval -TDE ; LSFM = microscopie à fluorescence à nappe de lumière ; NeuN = Antigène nucléaire neuronal ; SST = somatostatine ; CR = calrétinine ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Images LSFM représentatives de la coloration multi-tours dans des tranches COURTES-traitées. (A) Images d’un pré-découpage de tranches de cerveau humain (en PBS) et après le marquage multi-tours avec appariement de l’indice de réfraction (68% TDE). Barre d’échelle = 1 cm. (B) Fusion des différents canaux acquis au cours de trois tours successifs. L’image montre à la fois la substance blanche et la matière grise marquées avec le peptide intestinal vasoactif, la somatostatine, la parvalbumine, la calrétinine, l’antigène nucléaire neuronal, la protéine acide fibrillaire gliale et la vimentine. Des images haute résolution (résolution de 0,55 x 0,55 x 3,3 μm) à canal unique sont affichées à droite et en dessous de l’image. Barre d’échelle = 100 μm pour toutes les images, à l’exception de GFAP (barre d’échelle 10 = μm). (C) Images de projection d’intensité maximale d’une tranche de 500 μm d’épaisseur montrant le signal de sept anticorps différents utilisés dans trois cycles séquentiels d’immunomarquage. Manche 1 : PV-SST-VIP ; ronde 2 : CR-SST-NeuN ; Ronde 3 : VIM-SST-GFAP. Barre d’échelle = 1 mm. Ce chiffre a été modifié à partir de Pesce et al.18. Abréviations : TDE = 2,2'-thiodiéthanol ; COURT = SWITCH - H2O2 - Antigène Retrieval -TDE ; LSFM = microscopie à fluorescence à nappe de lumière ; NeuN = Antigène nucléaire neuronal ; SST = somatostatine ; CR = calrétinine ; PV = parvalbumine ; GFAP = protéine acide fibrillaire gliale ; VIM = vimentine ; VIP = peptide intestinal vasoactif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Durée temporelle représentative de SHORT pour les échantillons présentant une gamme de surfaces et d’épaisseurs. Les échantillons de zones et d’épaisseurs différentes nécessitent un temps d’incubation variable dans les solutions de clarification et d’anticorps, ce qui se traduit par des durées distinctes pour l’ensemble de la canalisation SHORT. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 2 : Anticorps compatibles avec SHORT. Le tableau répertorie tous les anticorps qui ont été testés avec le protocole SHORT et qui ont montré une coloration spécifique dans des échantillons de cerveau humain de 400 à 500 μm d’épaisseur. La colonne P/M indique les anticorps polyclonaux et monoclonaux. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
L’imagerie à haute résolution et la reconstruction 3D de grandes zones du cerveau humain nécessitent une coupe mécanique des tissus, suivie d’un nettoyage optique et d’un immunomarquage de tranches individuelles. Le protocole présenté ici décrit comment la méthode de transformation tissulaire SHORT peut être utilisée pour le traitement rapide et simultané de plusieurs coupes épaisses de cerveau humain pour la reconstruction cérébrale 3D avec une résolution subcellulaire avec LSFM.
Contrairement à d’autres approches, avec la méthode SHORT, les étapes de déblaiement et de multi-étiquetage ne nécessitent pas d’équipement sophistiqué et personnalisé. Une grande partie des échantillons peut être traitée dans son ensemble, ce qui réduit le temps de traitement des grands blocs de tissus cérébraux humains et minimise la variabilité technique.
Les traitements de décoloration et de démasquage des épitopes sont cruciaux lorsque l’on travaille avec des tissus humains âgés et fixés au formol. Le peroxyde d’hydrogène et les solutions de récupération d’antigènes alcalins peuvent également être utilisés en combinaison avec d’autres méthodes de nettoyage telles que l’iDISCO 6,28, le CLARITY, le SWITCH et le SHIELD24.
Pour assurer la préservation de l’information épitopale et obtenir une élimination uniforme de la matière grise et blanche, il est nécessaire de transformer l’échantillon en un hybride gel/tissu résistant à la chaleur et aux réactifs chimiques. Le glutaraldéhyde a été sélectionné pour son excellente capacité de réticulation et sa capacité à pénétrer dans la plaque tissulaire à faible pH (pH = 3). La concentration de glutaraldéhyde est un facteur essentiel pour déterminer la résistance et la clarté des tissus. Une concentration plus élevée conduit à une meilleure préservation de la structure tissulaire, mais augmente également le temps nécessaire à l’élimination. Ce choix permet d’obtenir les résultats souhaités en termes de préservation des épitopes et d’homogénéité. Dans le cas de la solution d’arrêt (étape 2.1 du protocole), la concentration de glutaraldéhyde a été soigneusement choisie et optimisée pour trouver un équilibre entre une réticulation efficace et une élimination rapide18,25. SHORT est spécialement conçu pour travailler avec des tranches de cerveau humain fixées au formol de l’aire de Broca, de l’hippocampe et du cortex cortical 18,23,25. Cependant, lorsque l’on travaille avec d’autres modèles biologiques ou différentes régions du cerveau, certaines modifications peuvent être nécessaires en raison des variations de la composition de la matière grise et blanche.
L’une des tâches critiques de ce protocole est également l’optimisation du temps d’incubation dans la clairance (étape 3.4 du protocole) et des solutions d’anticorps (étapes 4.8 et 4.10 du protocole), principalement en fonction de la taille de l’échantillon et de la composition biologique des tissus. Nous avons estimé que 500 μm représentaient la limite d’épaisseur du tissu pour obtenir une transparence optimale dans la matière blanche et grise et un marquage uniforme sur toute la profondeur du tissu pour la coloration de plusieurs anticorps (Tableau 2). Une description détaillée de ces processus peut être trouvée dans Pesce et al.18 et Scardigli et al.24. Différentes zones du cerveau peuvent avoir une composition différente en lipides et en protéines, et les cerveaux âgés développent une teneur élevée en pigments de type lipofuscine et en neuromélanine qui produisent un fort signal d’autofluorescence et modifient la diffusion de la sonde dans tout le tissu. À titre d’exemple, une tranche de 400 μm d’épaisseur de 16cm2 de l’aire de Broca humaine a besoin de 7 jours de traitement avec la solution de nettoyage pour atteindre un niveau élevé de délipidation. Pour assurer une coloration uniforme dans toute la profondeur du tissu, il faut une incubation avec des solutions d’anticorps primaires et secondaires pendant 7 et 6 jours, respectivement (Figure 3). Une optimisation fine des étapes de débroussaillage et d’étiquetage est donc nécessaire avant l’application du protocole haut débit décrit ici.
SHORT permet de stocker des échantillons dans le support d’imagerie sur mesure, car il a été démontré que le signal fluorescent est conservé pendant au moins un an. Les chercheurs peuvent donc préparer tous les sandwichs à l’avance et les stocker pour l’étape d’imagerie qui peut être effectuée par la suite. Notamment, la lame de microscope, l’entretoise et le verre de protection utilisés pour préparer les sandwichs peuvent être personnalisés en fonction de la taille de l’échantillon.
Les échantillons traités avec le protocole SHORT décrit ici ont été analysés à l’aide d’un LSFM 18,23 inversé sur mesure. Cette configuration comprend deux bras équipés de 12 objectifs sur mesure avec un collier de correction de l’indice de réfraction (IR). Chaque objectif agit à la fois comme un bras d’éclairage et de détection, permettant l’acquisition simultanée de deux canaux à une vitesse volumétrique de 0,16 cm3/h. Comme le porte-échantillon peut accueillir deux sandwichs à la fois, nous sommes en mesure d’imager consécutivement quatre canaux en deux tranches en 10 h. En raison de la légère toxicité de la vapeur de TDE pour le système respiratoire, afin d’éviter l’aberration sphérique, le porte-échantillon est rempli d’une solution glycérol/eau à 91 % v/v qui correspond à l’AR (1,46) de la lamelle de quartz et de la solution de TDE. La solution glycérol/eau à 91 % v/v doit être changée tous les 3 jours pour éviter toute contamination par la poussière. Par conséquent, notre LSFM permet l’acquisition rapide d’échantillons à faible photoblanchiment à une résolution isotrope de 3,6 μm après post-traitement 18,23,29. La grande quantité de données produites a été traitée à l’aide d’un pipeline défini pour le redécoupage et l’assemblage des piles d’images à l’aide d’un logiciel développé en interne, ZetaStitcher (https://github.com/lens-biophotonics/ZetaStitcher)23,29.
Bien que nous ayons utilisé SHORT en combinaison avec la microscopie à fluorescence à nappe de lumière, différents types de techniques d’imagerie par fluorescence peuvent être utilisés pour l’acquisition en fonction de la disponibilité du laboratoire et des applications spécifiques. Par exemple, la microscopie confocale25 ou la microscopie à deux photons14 peuvent être utilisées pour analyser les échantillons clairsemés. Ce type d’analyse est recommandé pour les échantillons avec des volumes relativement faibles car il s’agit de systèmes basés sur le balayage et le temps d’acquisition pour les grandes surfaces tissulaires est très long30. En obtenant une imagerie plus rapide et en découplant la résolution latérale et axiale, la microscopie à fluorescence à nappe de lumière est la méthode préférée pour l’imagerie de grands volumes d’échantillons clairs 3,4,18,31,32,33.
En résumé, nous avons décrit un protocole rapide à haut débit pour l’effacement simultané, le co-marquage homogène et la reconstruction volumétrique 3D de dizaines de coupes de cerveau humain post-mortem. En combinant SHORT avec l’imagerie LSFM et l’analyse computationnelle, il est possible d’obtenir des données tridimensionnelles pour un recensement cellulaire complet et une analyse protéomique du cerveau humain.
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Disclosures
Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.
Acknowledgments
Nous remercions Bruce Fischl, du Massachusetts General Hospital, A.A. Martinos Center for Biomedical Imaging, Department of Radiology, d’avoir fourni les échantillons de cerveau humain analysés dans le cadre de cette étude. Ce projet a reçu un financement du programme-cadre de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention n° 654148 (Laserlab-Europe), du programme-cadre Horizon 2020 de l’Union européenne pour la recherche et l’innovation dans le cadre de l’accord de subvention spécifique n° 785907 (Human Brain Project SGA2) et n° 945539 (Human Brain Project SGA3), du General Hospital Corporation Center des National Institutes of Health sous le numéro d’attribution U01 MH117023, et du ministère italien de l’Éducation dans le cadre de l’Euro-Bioimaging Italian Node (infrastructure de recherche ESFRI). Enfin, cette recherche a été réalisée avec la contribution de la « Fondazione CR Firenze ». Le contenu de ce travail relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health. La figure 1 a été créée avec BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2'-thiodiethanol | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
| Acetamide >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| Agarose High EEO | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
| Boric Acid | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
| Coverslips | LaserOptex | / | customized |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| Glutaraldehyde | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
| Glycine | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
| Hydrogen Peroxide 30% | Merck Life Science S.R.L. | ||
| Incubator ISS-4075 | Lab companion | / | |
| Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) | / | / | custom-made |
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| Microscope slides | Laborchimica | / | customized |
| Phospate buffer saline tablet | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | out of production |
| Potassium Hydrogen Phtalate | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| Sodium Azide | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
| Sodium Sulfite | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
| Spacers | Microlaser srl | customized | |
| Sputum Containers (dishes with screw lids) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| Tris Base | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
| Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
| Tubes | Sarstedt | 62 547254 | |
| Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| Water bath | Memmert | WNB 7-45 | |
| Antibodies and Dyes | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-NeuN Antibody | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | Dilution used, 1:100 |
| Anti-Parvalbumin antibody (PV) | Abcam | ab32895 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM) | Abcam | ab8069 | Dilution used, 1:200 |
| Calretinin Polyclonal antibody | ProteinTech | 12278_1_AP | Dilution used, 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | Dilution used, 1:100 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed | Abcam | ab175475 | Dilution used, 1:200 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | Dilution used, 1:200 |
| Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody | Abcam | ab194324 | Dilution used, 1:200 |
| Somatostatin Antibody YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | Dilution used, 1:200 |
| Vasoactive intestinal peptide (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | Dilution used, 1:200 |
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