Summary
Den nåværende protokollen gir en trinnvis prosedyre for rask og samtidig optisk clearing, muti-round merking og 3D volumetrisk rekonstruksjon av titalls postmortem menneskelige hjerneseksjoner ved å kombinere (SWITCH - H 2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) KORT vevstransformasjonsteknikk med lysarkfluorescensmikroskopiavbildning i en rutinemessig høy gjennomstrømningsprotokoll.
Abstract
Til tross for de mange ryddeteknikkene som dukket opp i det siste tiåret, er behandling av menneskelige hjerner post mortem fortsatt en utfordrende oppgave på grunn av dens dimensjoner og kompleksitet, noe som gjør avbildning med mikrometeroppløsning spesielt vanskelig. Denne artikkelen presenterer en protokoll for å utføre rekonstruksjon av volumetriske deler av den menneskelige hjerne ved samtidig å behandle titalls seksjoner med SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) vevstransformasjonsprotokoll, som muliggjør clearing, merking og sekvensiell avbildning av prøvene med lysarkfluorescensmikroskopi (LSFM). SHORT gir rask vevsrydding og homogen multimerking av tykke skiver med flere nevrale markører, noe som gjør det mulig å identifisere forskjellige nevronale subpopulasjoner i både hvit og grå substans. Etter rydding avbildes skivene via LSFM med mikrometeroppløsning og i flere kanaler samtidig for en rask 3D-rekonstruksjon. Ved å kombinere SHORT med LSFM-analyse innenfor en rutinemessig høy gjennomstrømningsprotokoll, er det mulig å oppnå 3D-cytoarkitekturrekonstruksjon av store volumetriske områder med høy oppløsning på kort tid, og dermed muliggjøre omfattende strukturell karakterisering av den menneskelige hjerne.
Introduction
Analyse av 3D-molekylær organisering og cytoarkitektur av store volumer av den menneskelige hjerne krever optisk gjennomsiktighet av prøver, oppnådd gjennom protokoller med omfattende behandlingstid. Optiske clearingteknikker ble utviklet for å minimere heterogenitet i brytningsindeks (RI) i vevet, og dermed redusere lysspredning og øke lyspenetrasjonsdybden for høyoppløselig avbildning 1,2,3,4,5. Nåværende fremskritt innen clearing og dype vevsmerkingsmetoder tillater volumetrisk avbildning av intakte gnagerorganer og embryoer ved å utnytte banebrytende mikroskopiteknikker 6,7,8,9,10,11,12.
Imidlertid representerer volumetrisk 3D-rekonstruksjon av store områder av den menneskelige hjernen post mortem fortsatt en utfordrende oppgave sammenlignet med modellorganismer. Den komplekse biologiske sammensetningen og de variable postmortemfikserings- og lagringsforholdene kan kompromittere vevets clearingeffektivitet, antistoffpenetrasjonsdybden og epitopgjenkjenningen 13,14,15,16,17,18,19. Videre er mekanisk vevsseksjonering og påfølgende rydding og merking av hvert stykke fortsatt nødvendig for å oppnå en effektiv rydding og ensartet merking av store menneskelige hjerneområder, noe som resulterer i lange behandlingstider og behov for sofistikert tilpasset utstyr, sammenlignet med modellorganismer 15,20,21,22.
SWITCH - H 2O2 - antigen Retrieval -TDE (SHORT) vevstransformasjonsteknikk er utviklet spesielt for å analysere store mengder av den menneskelige hjerne18,23. Denne metoden benytter vevsstrukturell bevaring av SWITCH-protokollen11 og høye konsentrasjoner av peroksidhydrogen for å redusere vevsautofluorescens, i kombinasjon med epitoprestaurering. SHORT tillater jevn farging av menneskelige hjerneskiver med markører for forskjellige nevronale subtyper, gliaceller, vaskulatur og myeliniserte fibre18,24. Resultatene er kompatible med analysen av både proteiner med lav og høy tetthet. De resulterende høye gjennomsiktighetsnivåene og ensartet merking muliggjør volumetrisk rekonstruksjon av tykke skiver med fluorescensmikroskopi, spesielt for rask oppkjøp lysarkapparat kan brukes 18,24,25,26,27.
I dette arbeidet beskriver vi hvordan SHORT vevstransformasjonsteknikken kan brukes til samtidig clearing og multi-round merking av titalls formalinfikserte menneskelige hjerneseksjoner. Fire forskjellige fluorescerende markører kan brukes sammen, noe som fører til identifisering av forskjellige cellulære underpopulasjoner. Etter clearing kan høyoppløselig volumetrisk avbildning utføres med fluorescensmikroskopi. Her brukte vi en skreddersydd invertert LSFM 18,24,25,26,27, som muliggjør rask optisk seksjonering av prøven og rask innsamling av flere kanaler parallelt. Med denne rutinemessig høye gjennomstrømningsprotokollen er det mulig å oppnå en omfattende cellulær og strukturell karakterisering med en subcellulær oppløsning av store områder av den menneskelige hjerne som allerede demonstrert i kartleggingen av et helt Brocas område23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Formalinfikserte humane vevsprøver ble levert av Department of Neuropathology ved Massachusetts General Hospital (MGH) Autopsy Service (Boston, USA). Skriftlig samtykke ble innhentet fra friske deltakere før døden, etter IRB-godkjente vevsinnsamlingsprotokoller fra Partners Institutional Biosafety Committee (PIBC, protokoll 2003P001937). Autorisasjonsdokumentene oppbevares hos MGH Autopsy Services i Boston, MA, USA, og er tilgjengelige på forespørsel.
1. Agarose innebygging og prøveskjæring
- Forbered en 4% w / v agaroseoppløsning i 1x fosfatbufret saltvann (PBS, pH 7,4) i et beger og legg vevsblokken inni. Vent til den når romtemperatur (RT) og oppbevar deretter ved 4 °C i 24 timer.
- For å oppnå høypresisjonsseksjoner, lim prøven til vibratomens prøveplate og fyll brettet med kald 1x PBS (pH 7,4). Juster vibratomparametrene som frekvens, amplitude og hastighet i henhold til typen vev som skal skjæres (verdier som brukes: frekvens = 5 (50 Hz); amplitude = 0,4; hastighet = 3 (0,15 mm / s).
MERK: Ulike vibratomer bør brukes avhengig av prøvevolumet. For prøver med et maksimalt volum på 70 x 40 x 15 mm, kan en vibratome (f.eks. Leica VT1000 S) brukes; for større prøver er det mulig å bruke en kompresstomi (f.eks. VF-900-0Z Microtome18) eller et skreddersydd apparat21. Her presenterer vi skiver kuttet med en tykkelse på enten 400 μm eller 500 μm. - Etter skjæring legges alle skivene i en preserverløsning bestående av 1x PBS (pH 7,4) med 0,01 % w/v natriumazid (NaN3) og oppbevares ved 4 °C.
MERK: Før tilstøting, vent til agaroseoppløsningen når 37 °C. En høyere temperatur kan skade prøven. Det anbefales ikke å la prøvene være i PFA i mer enn 48 timer, da langvarig fiksering kan forstyrre merkingsprosedyren ved å skade antigener og øke vevsautofluorescens. For langtidslagring av humant vev brukes PBS med NaN3 for å forhindre mikrobiell forurensning. På grunn av toksisiteten til NaN3, klargjør konserverløsningen under en kjemisk hette.
2. Vev fiksering
MERK: Alle løsningene som brukes i følgende protokoll er utarbeidet i store mengder, tilstrekkelig til å behandle alle skivene av samme vevsblokk og minimere den tekniske variabiliteten og redusere tiden for individuelle trinn.
- Klargjør slukkeløsningen med 50 % v/v 1x PBS pH 3, 25 % v/v 0,1 M saltsyre (HCl), 25 % v/v 0,1 M kaliumhydrogenftalat (KHP) og ferskt 4 % v/v glutaraldehyd. Legg alle prøvene i fat med skruelokk (70 x 23 mm) og inkuber dem med avstengningsløsningen med forsiktig risting ved 4 °C i 1 dag, og beskytt dem mot lys med aluminiumsfolie.
- Klargjør Switch-on oppløsningen med 1x PBS (pH 7,4) og fersk 1% v/v glutaraldehyd. Legg alle prøvene i nye tallerkener og inkuber dem med Switch-on-løsningen med forsiktig risting ved 4 °C i 1 dag, og beskytt dem mot lys med aluminiumsfolie.
MERK: På grunn av glutaraldehyds høye toksisitet og lysfølsomhet, må både av- og påkoblingsløsninger alltid tilberedes friske og oppbevares under kjemikaliehetten på is. Fyll alltid fatet med 20 ml av hver oppløsning og forsegl det med parafilm.
3. Deaktivering og rydding
MERK: Reaktivt glutaraldehyd i prøvene må inaktiveres ved inkubasjon med en inaktiveringsløsning bestående av 1x PBS pH 7,4, 4% w/v acetamid, 4% w/v glycin, pH 9,0. Oppløsningen kan oppbevares ved 4 °C i opptil 3 måneder. For å fjerne lipider og gjøre vevet gjennomsiktig bruker vi clearingløsningen bestående av 200 mM natriumdodecylsulfat (SDS), 20 mM natriumsulfitt (Na2SO3) og 20 mM borsyre (H3BO3), pH 9,0. Oppløsningen må oppbevares ved RT da SDS felles ut ved 4 °C. Alle følgende trinn vil bli gjort i rør fylt med løsningen.
- Flytt prøvene fra oppvasken til rørene og vask i 3 x 2 timer med 1x PBS pH 7,4 ved RT ved forsiktig risting.
MERK: For trinn 3.1 er det nødvendig å arbeide under den kjemiske hetten på grunn av glutaraldehydtoksisiteten. Acetamid, SDS og borsyre er også giftige reagenser, og de må håndteres under en kjemisk hette. Fyll alltid tuben med 50 ml av hver oppløsning. - Inkuber prøvene i inaktiveringsoppløsning ved 37 °C i et vannbad over natten (o/n).
- Vask i 3 x 2 timer i 1x PBS pH 7,4 ved RT ved forsiktig risting.
- Inkuber prøvene i ryddeoppløsning ved 55 °C i vannbad i 3-7 dager. Bytt oppløsningen hver 2. dag (tabell 1).
4. Immunmerking
MERK: Før merkingstrinnet er det nødvendig å fjerne gjenværende SDS, redusere autofluorescensen og avdekke epitopene med en antigeninnhentingsløsning bestående av 10 mM Tris-base, 1 mM EDTA og 0,05% v/v Tween 20, pH 9. Løsningens pH på 9 er optimalisert for en effektiv gjenfinningsprosess. Tris-base fungerer som et buffermiddel for å opprettholde et stabilt pH-miljø; EDTA, som er et chelaterende middel, forbedrer antigenets tilgjengelighet. Det ikke-ioniske vaskemiddelet Tween 20 hjelper til med å forbedre permeabiliteten til vevet. Denne oppløsningen kan oppbevares ved 4 °C. Det er viktig å merke seg at hydrogenperoksid kombinert med antigeninnhentingstrinnet har en synergistisk effekt ved å redusere autofluorescenssignalet ved å bryte ned og/eller modifisere de endogene fluoroforene som er ansvarlige for ikke-spesifikt bakgrunnssignal (som lipofuscin).
- Forbered 1x PBS med 0,1% v / v Triton X-100 (PBST), forvarm den til 37 ° C, og vask prøvene 3 x 3 timer i løpet av dagen i forsiktig risting ved 37 ° C i inkubatoren. La siste vask o/n.
MERK: Oppbevar PBST-lageroppløsningen ved 4 °C. Det er avgjørende å fjerne SDS fra vevet, da det kan danne uoppløselige utfellinger ved lave temperaturer som kan forstyrre påfølgende innsamlingsprosesser. - Dagen etter, tilsett 10 ml 30% v/v hydrogenperoksid (H2O2) til hver prøve og la den riste forsiktig ved RT i 45 minutter.
- Vask 3 x 10 min med 1x PBS (pH 7,4) med lett risting ved RT.
- Forvarm antigenoppsamlingsoppløsningen ved 95 °C i et vannbad; overføre prøvene til den oppvarmede oppløsningen og la dem stå ved 95 °C i 10 minutter.
- La prøvene avkjøles til RT i 40 min ved forsiktig risting.
- Vask 3 x 5 min med avionisert vann i forsiktig risting.
- Balanser prøvene i PBS ved 4 °C i 15 minutter.
- Tilbered fersk antistoffoppløsning laget av PBST med 0,01 % w/v NaN3 (se NOTE for trinn 1.3) og tilsett primære antistoffer. Inkuber prøvene med løsningen i skåler med skrulokk ved 37 °C i n dager (1-7) i en inkubator med lett risting og beskyttelse mot lys (tabell 2).
MERK: Inkubasjonstiden er størrelses- og tykkelsesavhengig (tabell 1 og tabell 2). - Etter n dager, flytt prøvene inn i rør og vask 3 x 2 timer med forvarmet PBST ved 37 °C med forsiktig risting i inkubatoren.
- Tilsett sekundære antistoffer i PBST med 0,01 % w/v NaN3 og inkuber prøvene i nye skåler med skrulokk ved 37 °C i n dager (1-6) i en inkubator med lett risting og beskyttet mot lys (tabell 1 og tabell 2).
- Etter n dager, overfør prøvene til rør og vask 3 x 3 timer i løpet av dagen med forvarmet PBST ved 37 °C i en lett ristende inkubator. La siste vask o/n.
MERK: Siden Triton X-100 og Tween 20 er tyktflytende, pipetter du sakte slik at spissen fylles. Fyll alltid tuben med 50 ml av hver oppløsning. Bruk 10 ml antistoffløsninger for hver prøve og forsegl parabolen med parafilm for å forhindre fordampning av løsningen. Siden antistoffløsningene inneholder NaN3, kan de oppbevares ved 4 °C og gjenbrukes til å merke nye prøver innen 2 uker.
5. Matching av brytningsindeks
MERK: For å oppnå et høyt nivå av gjennomsiktighet, er det nødvendig å homogenisere vevsbrytningsindeksen. Her bruker vi 2,2'-tiodietanol (TDE) fortynnet i 1x PBS. TDE-løsninger skal lagres hos RT.
- Overfør prøvene til nye retter, tilsett 30% v/v TDE, og la dem stå i 4 timer med forsiktig risting ved RT.
- Fjern 30% v / v TDE-løsningen, tilsett 68% v / v TDE til prøvene, og la dem riste forsiktig ved RT.
MERK: Siden TDE er tyktflytende, pipetter du sakte slik at spissen fylles. Innånding av TDE-damp eller tåke kan irritere luftveiene. Derfor anbefales det å arbeide i et godt ventilert område eller bruke avtrekkshetter for å minimere eksponeringen. TDE-løsninger må lagres ved RT. Bruk 10 ml TDE-løsninger for hver prøve.
6. Montering av prøve
MERK: For å lette prøvemontering og LSFM-bildeopptak bruker vi en skreddersydd, forseglet prøveholder (kalt "sandwich"), som består av tre deler: et mikroskoplysbilde, et avstandsstykke og et deksel.
- Sett avstandsstykket i stål (56 x 56 x 0,5 mm3) over mikroskoplysbildet (60 x 60 x 1 mm3) og legg prøven på mikroskopilysbildet.
- Legg forsiktig kvartsdekselet (60 x 60 x 0,5 mm3), klipp alt sammen, og lag et to-komponent silisium lim i forholdet 1: 1. Bruk et kvartsdeksel for å matche brytningsindeksen og redusere optisk aberrasjon under innsamlingsprosessen.
- Bruk en 1 ml sprøyte, fyll mellomrommet mellom inhalasjonskammeret og dekselet med et to-komponent silisium lim og la det tørke i 10 minutter.
- Fjern klipsene og bruk en liten nål til å sakte fylle hele sandwichen med 68% v / v TDE.
- Lag ferskt lim og forsegl smørbrødet.
NOTAT: Hvis TDE ved et uhell når avstandsstykket i trinn 6.1, vil limet ikke herde. Forsikre deg om at det ikke dannes luftbobler under trinn 6.2.
7. Stripping
MERK: Den strukturelle bevaringen og den forbedrede epitoptilgjengeligheten til SHORT tillater flerrundemerking av skiver ved å fjerne antistoffene og beholde prøvene med andre markører.
- Åpne smørbrødet med et blad, legg prøvene i nye retter med skrulokk fylt med 30% v / v TDE, og la dem stå i 3 timer.
- Overfør prøvene til rør, vask i 3 x 2 timer i 1x PBS (pH 7,4) ved RT med forsiktig risting, og la siste vask o / n.
- Legg prøvene i renseoppløsning i vannbad ved 80 °C i 4 timer.
- Vask i 3 x 2 timer i 1x PBST (pH 7,4) ved 37 °C ved forsiktig risting og la siste vask o/n. Nå er prøven klar til å merkes igjen fra trinn 4.8.
MERK: Fyll alltid tuben med 50 ml av hver oppløsning. Bruk 10 ml TDE-oppløsning for hver prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskrevet her muliggjør samtidig behandling av flere skiver, som varierer i tykkelse fra 100 μm til 500 μm, ved hjelp av SHORT-metoden. Denne tilnærmingen reduserer den totale behandlingstiden for hele prosedyren betydelig. I dette arbeidet gir vi en omfattende beskrivelse av hele rørledningen (figur 1) for behandling av flere postmortem menneskelige hjernetykke seksjoner samtidig, og vi demonstrerer protokollen på 24 skiver samtidig (figur 2A). Varigheten for clearing og samtidig merking varierer fra 11 til 30 dager, tatt i betraktning prøvenes størrelse og tykkelse (tabell 1), unntatt bildebehandling og postimaging behandling. Etter delipidering og brytningsindeksmatching i TDE oppnås optimal og homogen gjennomsiktighet av alle vevsskivene i både grå og hvit substans (figur 2B).
Bildeopptaket kan utføres med forskjellige avanserte fluorescensmikroskoper, inkludert konfokal25 og to-foton mikroskopi14. Her brukte vi en skreddersydd invertert LSFM18,23 utstyrt med fire eksitasjonslaserlinjer: 405 nm, 488 nm, 561 nm og 638 nm, i stand til å skaffe seg fire forskjellige biologiske egenskaper merket med fluoroforkonjugerte antistoffer. Figur 3A viser representative bilder av et 400 μm tykt stykke fra et menneskelig Brocas område co-merket for NeuN, en pan-neuronal markør, Somatostatin (SST) og Calretinin (CR), som merker to forskjellige underpopulasjoner av interneuroner og nukleærmarkøren DAPI (figur 3A, B). I den 400 μm tykke platen observerte vi at den globale fluorescensen langs Z ikke er begrenset til overflaten, men den er nesten jevn i hele vevsdybden, selv om signalintensiteten avtar litt i midten (figur 3C).
For å oppnå en mer omfattende cellulær karakterisering av humant hjernevev, er det mulig å utføre flerrundemerking av de samme prøvene ved å fjerne antistoffene og merke prøven på nytt som demonstrert i SHORT originalpapir. Figur 4 (tilpasset fra Pesce et al.18) viser potensiell anvendelse av syv forskjellige antistoffer på en 500 μm tykk vevsskive behandlet med SHORT i tre påfølgende runder med immunfarging. Antistoffene som brukes inkluderer NeuN, SST, CR, Parvalbumin (PV) og vasoaktivt intestinalt peptid (VIP) som hemmende nevronmarkører, glialfibrillært surt protein (GFAP) for gliaceller og vimentin (VIM) for vaskulatur (tabell 2). Resultatene viser den bemerkelsesverdige evnen til SHORT til å bevare vevsinformasjon gjennom ulike strippeprosedyrer, effektivt redusere autofluorescenssignaler og oppnå effektiv prøverydding.
Figur 1: Tidslinje for KORT. Ordning som representerer trinnene som kreves for å behandle prøvene med SHORT-protokollen. I hvert trinn behandles titalls menneskelige hjernevevplater sammen. Etter innebygging i agarose og skiver plasseres prøver i påkoblings- og utkoblingsløsninger i 1 dag hver; Inaktiveringstrinnene utføres over natten, mens delipideringen gjennom inkubasjon i ryddeoppløsning krever 3-7 dager. Deretter inkuberes prøvene med primære og sekundære antistoffløsninger i henholdsvis 7 og 6 dager. Etter brytningsindeksmatching monteres prøver i prøveholderen (sandwich) for LSFM-avbildning og lagring. Når som helst etter sandwichmontering, kan prøvene strippes og merkes på nytt for påvisning av forskjellige markører. Forkortelser: TDE = 2,2'-tiodietanol; KORT = SHEKSA - H2O2 - Antigen Retrieval -TDE; o / n = over natten; RI = brytningsindeks; LSFM = lysarkfluorescensmikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Menneskelige hjerneskiver fra et Broca-områdes blokk behandlet samtidig. (A) Tjuefire påfølgende skiver fra Brocas område på 4 x 4 x 0,04 cm3 i PBS før behandling med SHORT-metoden. (B) De samme prøvene i A vist etter SHORT-behandlingen. Skala bar = 1 cm. Forkortelser: TDE = 2,2'-tiodietanol; KORT = SHEKSA - H2O2 - Antigen Retrieval -TDE; PBS = fosfatbufret saltvann. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Representative LSFM-bilder av et tydeliggjort stykke merket med fire forskjellige markører. (A) Projeksjonsbilder med maksimal intensitet (oppløsning på 3,3 x 3,3 x 3,3 μm3) som viser en mesoskopisk rekonstruksjon av et KORTBEHANDLET stykke av Brocas område merket for NeuN, Somatostatin, Calretinin og nukleærmarkøren DAPI. Til høyre vises det sammenslåtte bildet (NeuN-SST-CR-DAPI). Skalastang = 0,5 cm. (B) Forstørret innsetting av det sammenslåtte bildet i A. Skalalinje = 100 μm. (C) Høy oppløsning (0,55 x 0,55 x 3,3 μm) yz-bilder fra (B). Skala bar = 100 μm. Forkortelser: TDE = 2,2'-tiodietanol; KORT = SHEKSA - H2O2 - Antigen Retrieval -TDE; LSFM = lysarkfluorescensmikroskopi; NeuN = Neuronalt nukleært antigen; SST = somatostatin; CR = calretinin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative LSFM-bilder av flerrundfarging i SHORT-behandlede skiver. (A) Bilder av en menneskelig hjerneskive preclearing (i PBS) og etter flerrundemerking med brytningsindeksmatching (68% TDE). Skalastang = 1 cm. (B) Sammenslåing av de forskjellige kanalene som er oppnådd i løpet av tre påfølgende flerrunder. Bildet viser både hvit og grå substans merket med Vasoactive Intestinal Peptide, Somatostatin, Parvalbumin, Calretinin, Neuronal Nuclear antigen, Glial Fibrillary Acidic Protein og Vimentin. Høy oppløsning (oppløsning på 0,55 x 0,55 x 3,3 μm), enkeltkanalsbilder vises til høyre og under bildet. Skalalinje = 100 μm for alle bilder, bortsett fra GFAP (skalalinje 10 = μm). (C) Projeksjonsbilder med maksimal intensitet av 500 μm tykk skive som viser signalet fra syv forskjellige antistoffer brukt i tre sekvensielle runder med immunfarging. Runde 1: PV-SST-VIP; runde 2: CR-SST-NeuN; 3. RUNDE: VIM-SST-GFAP. Skala bar = 1 mm. Denne figuren er modifisert fra Pesce et al.18. Forkortelser: TDE = 2,2'-tiodietanol; KORT = SHEKSA - H2O2 - Antigen Retrieval -TDE; LSFM = lysarkfluorescensmikroskopi; NeuN = Neuronalt nukleært antigen; SST = somatostatin; CR = calretinin; PV = parvalbumin; GFAP = glial fibrillær surt protein; VIM = vimentin; VIP = vasoaktivt tarmpeptid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Representativ tidslengde på SHORT for prøver med en rekke områder og tykkelse. Prøver med forskjellige områder og tykkelser krever en variabel inkubasjonstid i clearing og antistoffløsninger, noe som resulterer i forskjellige tidslengder for hele SHORT-rørledningen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Antistoffer forenlig med SHORT. Tabellen viser alle antistoffene som ble testet med SHORT-protokollen og viste spesifikk farging i 400-500 μm tykke menneskelige hjerneprøver. P/M-kolonnen angir polyklonale og monoklonale antistoffer. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Høyoppløselig avbildning og 3D-rekonstruksjon av store menneskelige hjerneområder krever mekanisk vevsseksjonering etterfulgt av optisk clearing og immunmerking av enkeltskiver. Protokollen som presenteres her beskriver hvordan SHORT vevstransformasjonsmetoden kan brukes til rask og samtidig prosessering av flere tykke seksjoner av menneskelig hjerne for 3D-hjernerekonstruksjon med en subcellulær oppløsning med LSFM.
I motsetning til andre tilnærminger, med SHORT-metoden, krever ikke rydde- og multimerkingstrinnene sofistikert tilpasset utstyr. En stor del av prøvene kan behandles helt, noe som reduserer behandlingstiden for store menneskelige hjernevevsblokker og minimerer den tekniske variasjonen.
Avfarging og epitopavmaskeringsbehandlinger er avgjørende når du arbeider med eldre, formalinfikserte menneskelige vev. Hydrogenperoksid og alkaliske antigeninnhentingsløsninger kan også brukes i kombinasjon med andre clearingmetoder som iDISCO 6,28, CLARITY, SWITCH og SHIELD24.
For å sikre bevaring av epitopal informasjon og oppnå jevn clearing av både grå og hvit substans, er det nødvendig å transformere prøven til en gel / vevshybrid som er motstandsdyktig mot varme og kjemiske reagenser. Glutaraldehyd ble valgt på grunn av sin utmerkede tverrbindingsevne og evne til å trenge inn i vevsplaten ved lav pH (pH = 3). Konsentrasjonen av glutaraldehyd er en kritisk faktor for å bestemme styrken og klarheten i vevet. En høyere konsentrasjon fører til bedre bevaring av vevstrukturen, men øker også tiden som kreves for rydding. Dette valget muliggjør de ønskede resultatene når det gjelder epitopbevaring og homogen rydding. Når det gjelder slukkeløsningen (protokolltrinn 2.1), er konsentrasjonen av glutaraldehyd nøye utvalgt og optimalisert for å finne en balanse mellom effektiv tverrbinding og rask clearing18,25. SHORT er spesielt skreddersydd for å jobbe med formalinfikserte menneskelige hjerneskiver fra Brocas område, hippocampus og kortikale cortex 18,23,25. Men når du arbeider med andre biologiske modeller eller forskjellige hjernegrupper, kan det være nødvendig med noen modifikasjoner på grunn av variasjoner i sammensetningen av grå og hvit substans.
En kritisk oppgave for denne protokollen er også optimalisering av inkubasjonstiden ved clearing (protokolltrinn 3.4) og antistoffløsninger (protokolltrinn 4.8 og 4.10), hovedsakelig relatert til prøvestørrelsen og vevets biologiske sammensetning. Vi estimerte at 500 μm representerer vevstykkelsesgrensen for å oppnå optimal gjennomsiktighet i både hvit og grå substans og jevn merking i hele vevsdybden for flere antistofffarging (tabell 2). En detaljert beskrivelse av disse prosessene finnes i Pesce et al.18 og Scardigli et al.24. Ulike hjerneområder kan ha en annen sammensetning i lipider og proteiner, og alderen hjerner utvikler et høyt innhold av lipofuscin-type pigmenter og neuromelanin som produserer et sterkt autofluorescenssignal og endrer sondediffusjonen gjennom vevet. Som et eksempel trenger en 400 μm tykk skive på 16 cm2 fra menneskelig Brocas område 7 dagers behandling med ryddeløsningen for å oppnå et høyt nivå av delipidering. For å sikre jevn farging i hele vevsdybden krever det inkubering med primære og sekundære antistoffløsninger i henholdsvis 7 og 6 dager (figur 3). En fin optimalisering for clearing- og merkingstrinnene er derfor nødvendig før anvendelsen av protokollen med høy gjennomstrømning beskrevet her.
SHORT gjør det mulig å lagre prøver i den skreddersydde bildeholderen siden det er påvist at det fluorescerende signalet er bevart i minst ett år. Forskere kan derfor forberede alle smørbrødene på forhånd og lagre dem for avbildningstrinnet som kan gjøres senere. Spesielt kan mikroskoplysbildet, avstandsstykket og dekselglasset som brukes til å tilberede smørbrødene, tilpasses i henhold til størrelsen på prøven.
Prøvene behandlet med SHORT-protokollen beskrevet her ble analysert ved hjelp av en skreddersydd invertert LSFM18,23. Dette oppsettet består av to armer utstyrt med 12x skreddersydde mål med en brytningsindeks (RI) korreksjonskrage. Hvert mål fungerer som en belysnings- og deteksjonsarm samtidig, noe som muliggjør samtidig oppkjøp av to kanaler med en volumetrisk hastighet på 0,16 cm3 / t. Siden prøveholderen har plass til to smørbrød om gangen, kan vi fortløpende avbilde fire kanaler i to skiver på 10 timer. På grunn av den milde toksisiteten av TDE-damp for luftveiene, for å unngå sfærisk aberrasjon, er prøveholderen fylt med 91% v / v glyserol / vannoppløsning som samsvarer med RI (1,46) av både kvartsdekselet og TDE-løsningen. 91% v/v glyserol/vannoppløsning må skiftes hver 3. dag for å unngå støvforurensning. Derfor muliggjør vår LSFM rask innsamling av prøver med lav fotobleking ved en isotropisk oppløsning på 3,6 μm etter etterbehandling 18,23,29. Den store mengden data som ble produsert ble behandlet ved hjelp av en definert rørledning for re-slicing og sømming av bildestablene ved hjelp av en egenutviklet programvare, ZetaStitcher (https://github.com/lens-biophotonics/ZetaStitcher) 23,29.
Selv om vi brukte SHORT i kombinasjon med lysarkfluorescensmikroskopi, kan forskjellige typer fluorescensavbildningsteknikker brukes til innsamlingen, avhengig av tilgjengeligheten av laboratoriet og de spesifikke applikasjonene. For eksempel kan konfokalmikroskopi25 eller to-foton mikroskopi14 brukes til å analysere ryddede prøver. Denne typen analyse anbefales for prøver med relativt små volumer siden de er skannebaserte systemer og innsamlingstiden for store vevsområder er svært lang30. Ved å oppnå raskere avbildning og frakobling av lateral og aksial oppløsning, er lysarkfluorescensmikroskopi den foretrukne metoden for avbildning av store mengder ryddede prøver 3,4,18,31,32,33.
Oppsummert beskrev vi en rask høy gjennomstrømningsprotokoll for samtidig clearing, homogen sammerking og 3D volumetrisk rekonstruksjon av dusinvis av postmortem menneskelige hjerneseksjoner. Ved å kombinere SHORT med LSFM-avbildning og beregningsanalyse, er det mulig å oppnå tredimensjonale data for en omfattende celletelling og proteomisk analyse av den menneskelige hjerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersielle eller økonomiske forhold som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker Bruce Fischl, Massachusetts General Hospital, AA Martinos Center for Biomedical Imaging, Institutt for radiologi, for å gi de menneskelige hjerneprøvene analysert i denne studien. Dette prosjektet mottok finansiering fra EUs rammeprogram for forskning og innovasjon i Horizon 2020 under tilskuddsavtale nr. 654148 (Laserlab-Europe), fra EUs Horizon 2020-rammeprogram for forskning og innovasjon under den spesifikke tilskuddsavtalen nr. 785907 (Human Brain Project SGA2) og nr. 945539 (Human Brain Project SGA3), fra General Hospital Corporation Center of National Institutes of Health under tildelingsnummer U01 MH117023, og fra det italienske utdanningsdepartementet innenfor rammen av Euro-Bioimaging Italian Node (ESFRI forskningsinfrastruktur). Endelig ble denne undersøkelsen utført med bidrag fra "Fondazione CR Firenze." Innholdet i dette arbeidet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health. Figur 1 ble laget med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2'-thiodiethanol | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
| Acetamide >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| Agarose High EEO | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
| Boric Acid | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
| Coverslips | LaserOptex | / | customized |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| Glutaraldehyde | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
| Glycine | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
| Hydrogen Peroxide 30% | Merck Life Science S.R.L. | ||
| Incubator ISS-4075 | Lab companion | / | |
| Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) | / | / | custom-made |
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| Microscope slides | Laborchimica | / | customized |
| Phospate buffer saline tablet | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | out of production |
| Potassium Hydrogen Phtalate | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| Sodium Azide | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
| Sodium Sulfite | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
| Spacers | Microlaser srl | customized | |
| Sputum Containers (dishes with screw lids) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| Tris Base | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
| Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
| Tubes | Sarstedt | 62 547254 | |
| Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| Water bath | Memmert | WNB 7-45 | |
| Antibodies and Dyes | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-NeuN Antibody | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | Dilution used, 1:100 |
| Anti-Parvalbumin antibody (PV) | Abcam | ab32895 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM) | Abcam | ab8069 | Dilution used, 1:200 |
| Calretinin Polyclonal antibody | ProteinTech | 12278_1_AP | Dilution used, 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | Dilution used, 1:100 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed | Abcam | ab175475 | Dilution used, 1:200 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | Dilution used, 1:200 |
| Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody | Abcam | ab194324 | Dilution used, 1:200 |
| Somatostatin Antibody YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | Dilution used, 1:200 |
| Vasoactive intestinal peptide (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | Dilution used, 1:200 |
References
- Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251 (2019).
- Richardson, D. S., et al.
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nature Protocols. 16 (6), 2732-2748 (2021).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 713-741 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6 (1), 18631 (2016).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Lee, H., Park, J. -H., Seo, I., Park, S. -H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14 (1), 48 (2014).
- Murray, E., et al. Simple, Scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Costantini, I., et al. Large-scale, cell-resolution volumetric mapping allows layer-specific investigation of human brain cytoarchitecture. Biomedical Optics Express. 12 (6), 3684 (2021).
- Lai, H. M., et al. Next generation histology methods for three-dimensional imaging of fresh and archival human brain tissues. Nature Communications. 9 (1), 1066 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812.e19 (2020).
- Costantini, I., et al. Autofluorescence enhancement for label-free imaging of myelinated fibers in mammalian brains. Scientific Reports. 11 (1), 8038 (2021).
- Pesce, L., et al. 3D molecular phenotyping of cleared human brain tissues with light-sheet fluorescence microscopy. Communications Biology. 5 (1), 447 (2022).
- Schueth, A., et al. Efficient 3D light-sheet imaging of very large-scale optically cleared human brain and prostate tissue samples. Communications Biology. 6 (1), 170 (2023).
- Morawski, M., et al. Developing 3D microscopy with CLARITY on human brain tissue: Towards a tool for informing and validating MRI-based histology. NeuroImage. 182, 417-428 (2018).
- Park, J., et al. Integrated platform for multi-scale molecular imaging and phenotyping of the human brain. bioRxiv. , (2022).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Costantini, I., et al. A cellular resolution atlas of Broca's area. Science Advances. (9), eadg3844 (2023).
- Scardigli, M., et al. Comparison of different tissue clearing methods for three-dimensional reconstruction of human brain cellular anatomy using advanced imaging techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 752234 (2021).
- Pesce, L., et al. Exploring the human cerebral cortex using confocal microscopy. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 168, 3-9 (2022).
- Keller, P. J., Dodt, H. -U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173.e12 (2017).
- Sorelli, M., et al. Fiber enhancement and 3D orientation analysis in label-free two-photon fluorescence microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 4160 (2023).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369 (2021).
- Costantini, I., et al. Editorial: The human brain multiscale imaging challenge. Frontiers in Neuroanatomy. (16), 1060405 (2022).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5 (1), 9808 (2015).
