Summary
O presente protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para limpeza óptica rápida e simultânea, marcação multi-redonda e reconstrução volumétrica 3D de dezenas de cortes cerebrais humanos post-mortem, combinando a técnica de transformação de tecido curto (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) com imagens de microscopia de fluorescência de folha de luz em um protocolo de alto rendimento de rotina.
Abstract
Apesar das inúmeras técnicas de clareamento que surgiram na última década, o processamento de cérebros humanos post-mortem continua sendo uma tarefa desafiadora devido às suas dimensões e complexidade, que tornam as imagens com resolução micrométrica particularmente difíceis. Este trabalho apresenta um protocolo para realizar a reconstrução de porções volumétricas do cérebro humano por meio do processamento simultâneo de dezenas de cortes com o protocolo de transformação tecidual SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]), que permite a limpeza, marcação e obtenção de imagens sequenciais das amostras com microscopia de fluorescência em folha de luz (LSFM). O SHORT proporciona rápida limpeza tecidual e multimarcação homogênea de cortes espessos com vários marcadores neuronais, permitindo a identificação de diferentes subpopulações neuronais tanto na substância branca quanto na cinzenta. Após a limpeza, as fatias são fotografadas via LSFM com resolução micrométrica e em múltiplos canais simultaneamente para uma rápida reconstrução 3D. Combinando SHORT com LSFM dentro de um protocolo de alto rendimento de rotina, é possível obter a reconstrução da citoarquitetura 3D de grandes áreas volumétricas em alta resolução em um curto espaço de tempo, permitindo assim uma caracterização estrutural abrangente do cérebro humano.
Introduction
Analisar a organização molecular 3D e a citoarquitetura de grandes volumes do cérebro humano requer transparência óptica dos espécimes, conseguida através de protocolos com extenso tempo de processamento. Técnicas de clareamento óptico foram desenvolvidas para minimizar a heterogeneidade do índice de refração (IR) dentro dos tecidos, reduzindo o espalhamento de luz e aumentando a profundidade de penetração da luz para imagens de alta resolução 1,2,3,4,5. Os avanços atuais nos métodos de clareamento e marcação tecidual profunda permitem a obtenção volumétrica de órgãos e embriões de roedores intactos, utilizando técnicas de microscopia de ponta6,7,8,9,10,11,12.
No entanto, a reconstrução volumétrica 3D de grandes áreas do cérebro humano post-mortem ainda representa uma tarefa desafiadora em comparação com organismos modelo. A complexa composição biológica e as variáveis condições de fixação e armazenamento post-mortem podem comprometer a eficiência do clareamento tecidual, a profundidade de penetração de anticorpos e o reconhecimento de epítopos13,14,15,16,17,18,19. Além disso, a secção mecânica dos tecidos e a subsequente limpeza e marcação de cada corte ainda são necessárias para obter uma limpeza eficiente e marcação uniforme de grandes áreas cerebrais humanas, resultando em longos tempos de processamento e na necessidade de sofisticados equipamentos personalizados, em comparação com organismos modelo 15,20,21,22.
A técnica de transformação tecidual SWITCH - H2O2 - antigen Retrieval -TDE (SHORT) foi desenvolvida especificamente para analisar grandes volumes do cérebro humano18,23. Este método emprega a preservação estrutural tecidual do protocolo SWITCH11 e altas concentrações de hidrogênio peróxido para diminuir a autofluorescência tecidual, em combinação com a restauração de epítopos. O SHORT permite coloração uniforme de cortes cerebrais humanos com marcadores para diferentes subtipos neuronais, células gliais, vasculatura e fibras mielinizadas18,24. Seus resultados são compatíveis com a análise de proteínas de baixa e alta densidade. Os altos níveis de transparência resultantes e a marcação uniforme permitem a reconstrução volumétrica de cortes espessos com microscopia de fluorescência, em particular, para que equipamentos fotográficos de aquisição rápida possam ser utilizados 18,24,25,26,27.
Neste trabalho, descrevemos como a técnica de transformação de tecido SHORT pode ser usada para limpeza simultânea e marcação multi-redonda de dezenas de cortes cerebrais humanos fixados em formal. Quatro marcadores fluorescentes diferentes podem ser usados em conjunto, levando à identificação de diferentes subpopulações celulares. Após a limpeza, imagens volumétricas de alta resolução podem ser realizadas com microscopia de fluorescência. Neste trabalho, utilizou-se um LSFM invertido sob medida18,24,25,26,27, que permite rápida seccionagem óptica da amostra e rápida aquisição de múltiplos canais em paralelo. Com este protocolo de alto rendimento rotineiro, é possível obter uma caracterização celular e estrutural abrangente com resolução subcelular de grandes áreas do cérebro humano, como já demonstrado no mapeamento de toda uma área deBroca23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Amostras de tecido humano fixadas em formalina foram fornecidas pelo Departamento de Neuropatologia do Serviço de Autópsia do Massachusetts General Hospital (MGH) (Boston, EUA). O consentimento por escrito foi obtido dos participantes saudáveis antes do óbito, seguindo os protocolos de coleta de tecidos aprovados pelo IRB do Comitê Institucional de Biossegurança de Parceiros (PIBC, protocolo 2003P001937). Os documentos de autorização são mantidos com os Serviços de Autópsia MGH em Boston, MA, Estados Unidos, e estão disponíveis mediante solicitação.
1. Incorporação de agarose e corte da amostra
- Preparar uma solução de agarose a 4% p/v em solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS, pH 7,4) num copo e incorporar o bloco de tecido no seu interior. Aguarde até atingir a temperatura ambiente (TR) e, em seguida, conservar a 4 °C durante 24 horas.
- Para obter seções de alta precisão, cole a amostra no disco da amostra do vibratome e encha a bandeja com 1x PBS frio (pH 7,4). Ajustar os parâmetros do vibratom, como frequência, amplitude e velocidade, de acordo com o tipo de tecido a ser fatiado (valores utilizados: frequência = 5 (50 Hz); amplitude = 0,4; velocidade = 3 (0,15 mm/s).
NOTA: Vibratomes diferentes devem ser usados dependendo do volume da amostra. Para amostras com um volume máximo de 70 x 40 x 15 mm, um vibratótomo (por exemplo, Leica VT1000 S) pode ser usado; para amostras maiores, é possível utilizar um compressômico (por exemplo, Micrótomo VF-900-0Z18) ou um aparelho feito sob medida21. Aqui, apresentamos fatias cortadas com espessura de 400 μm ou 500 μm. - Após o corte, colocar todas as fatias em uma solução preservadora composta de 1x PBS (pH 7,4) com 0,01% p/v de Azida de Sódio (NaN3) e armazenar a 4 °C.
NOTA: Antes de incorporar, aguarde até que a solução de agarose atinja 37 °C. Uma temperatura mais alta pode danificar o espécime. Recomenda-se não deixar as amostras em PFA por mais de 48 h, pois a fixação prolongada pode interferir no procedimento de marcação, danificando antígenos e aumentando a autofluorescência tecidual. Para armazenamento a longo prazo de tecidos humanos, PBS com NaN3 é usado para evitar a contaminação microbiana. Devido à toxicidade do NaN3, prepare a solução preservadora sob uma capa química.
2. Fixação tecidual
OBS: Todas as soluções utilizadas no protocolo a seguir são preparadas em grandes volumes, suficientes para processar todos os cortes de um mesmo bloco tecidual e minimizar a variabilidade técnica e reduzir o tempo para etapas individuais.
- Preparar a solução de desligamento com 50% v/v 1x PBS pH 3, 25% v/v 0,1 M ácido clorídrico (HCl), 25% v/v 0,1 M ftalato de potássio (KHP) e 4% v/v glutaraldeído fresco. Coloque todas as amostras em placas com tampas de rosca (70 x 23 mm) e incube-as com a solução Switch-off com agitação suave a 4 °C por 1 dia, protegendo-as da luz com papel alumínio.
- Preparar a solução Switch-on com 1x PBS (pH 7,4) e glutaraldeído fresco a 1% v/v. Coloque todas as amostras em pratos novos e incube-as com a solução Switch-on com agitação suave a 4 °C durante 1 dia, protegendo-as da luz com papel alumínio.
NOTA: Devido à alta toxicidade e sensibilidade à luz do glutaraldeído, as soluções Switch-off e Switch-on devem ser sempre preparadas frescas e mantidas sob o capô químico sobre gelo. Encha sempre o prato com 20 mL de cada solução e sele com parafilme.
3. Inativação e compensação
NOTA: O glutaraldeído reativo nas amostras deve ser inativado por incubação com uma solução de inativação composta por 1x PBS pH 7,4, 4% p/v acetamida, 4% p/v glicina, pH 9,0. A solução pode ser armazenada a 4 °C por até 3 meses. Para remover os lipídios e tornar o tecido transparente, utilizamos a solução de clareamento composta por dodecil sulfato de sódio (SDS) 200 mM, sulfito de sódio 20 mM (Na2SO3) e ácido bórico 20 mM (H3BO3), pH 9,0. A solução deve ser armazenada em RT à medida que o SDS precipita a 4 °C. Todos os passos seguintes serão feitos em tubos preenchidos com a solução.
- Mova as amostras das placas para tubos e lave por 3 x 2 h com 1x PBS pH 7,4 em RT em agitação suave.
NOTA: Para a etapa 3.1, é necessário trabalhar sob o capô químico devido à toxicidade do glutaraldeído. A acetamida, o SDS e o ácido bórico também são reagentes tóxicos e devem ser manuseados sob uma capa química. Encha sempre o tubo com 50 ml de cada solução. - Incubar as amostras em solução de inactivação a 37 °C num banho-maria durante a noite (o/n).
- Lave por 3 x 2 h em 1x PBS pH 7,4 em RT agitando suavemente.
- Incubar as amostras em solução de limpeza a 55 °C em banho-maria durante 3-7 dias. Troque a solução a cada 2 dias (Tabela 1).
4. Imunomarcação
NOTA: Antes da etapa de marcação, é necessário remover o SDS residual, reduzir a autofluorescência e desmascarar os epítopos com uma solução de recuperação de antígeno consistindo de 10 mM Tris base, 1 mM EDTA e 0,05% v/v Tween 20, pH 9. O pH 9 da solução é otimizado para um processo de recuperação eficiente; Tris base atua como um agente tampão para manter um ambiente de pH estável; O EDTA, que é um agente quelante, aumenta a acessibilidade do antígeno. O detergente não iônico Tween 20 auxilia na melhora da permeabilidade do tecido. Esta solução pode ser armazenada a 4 °C. É importante notar que o peróxido de hidrogênio combinado com a etapa de recuperação do antígeno tem um efeito sinérgico na redução do sinal de autofluorescência, quebrando e/ou modificando os fluoróforos endógenos responsáveis pelo sinal de fundo inespecífico (como a lipofuscina).
- Preparar 1x PBS com 0,1% v/v Triton X-100 (PBST), pré-aquecer a 37 °C e lavar as amostras 3 x 3 h durante o dia em agitação suave a 37 °C na incubadora. Deixe a última lavagem o/n.
NOTA: Conservar a solução-mãe PBST a 4 °C. É crucial remover o SDS do tecido, pois ele pode formar precipitados insolúveis a baixas temperaturas que podem interferir nos processos de aquisição subsequentes. - No dia seguinte, adicionar 10 mL de peróxido de hidrogênio a 30% v/v (H2O2) a cada amostra e deixar agitar suavemente em TR por 45 min.
- Lave 3 x 10 min com 1x PBS (pH 7,4) com agitação suave em RT.
- Pré-aquecer a solução de recuperação de antigénio a 95 °C em banho-maria; transferir as amostras para a solução aquecida e deixá-las a 95 °C durante 10 min.
- Deixe os espécimes arrefecerem até RT durante 40 minutos em agitação suave.
- Lave 3 x 5 min com água deionizada em agitação suave.
- Equilibrar as amostras em PBS a 4 °C durante 15 min.
- Preparar uma solução fresca de anticorpos à base de PBST com 0,01% p/v NaN3 (ver NOTA para o passo 1.3) e adicionar anticorpos primários. Incubar as amostras com a solução em placas com tampas de rosca a 37 °C por n dias (1-7) em estufa com agitação suave e proteção contra a luz (Tabela 2).
OBS: O tempo de incubação é dependente do tamanho e da espessura (Tabela 1 e Tabela 2). - Após n dias, mover as amostras para tubos e lavar 3 x 2 h com PBST pré-aquecido a 37 °C com agitação suave na incubadora.
- Adicionar anticorpos secundários em PBST com 0,01% p/v NaN3 e incubar as amostras em novas placas com tampas de rosca a 37 °C por n dias (1-6) em estufa com agitação suave e protegida da luz (Tabela 1 e Tabela 2).
- Após n dias, transferir as amostras para tubos e lavar 3 x 3 h durante o dia com PBST pré-aquecido a 37 °C em uma incubadora de agitação suave. Deixe a última lavagem o/n.
NOTA: Como Triton X-100 e Tween 20 são viscosos, pipetar lentamente para permitir que a ponta enche. Encha sempre o tubo com 50 ml de cada solução. Utilizar 10 ml de soluções de anticorpos para cada amostra e selar o prato com parafilme para evitar a evaporação da solução. Como as soluções de anticorpos contêm NaN3, elas podem ser armazenadas a 4 °C e reutilizadas para rotular novas amostras dentro de 2 semanas.
5. Correspondência do índice de refração
NOTA: Para atingir um alto nível de transparência, é necessário homogeneizar o índice de refração tecidual. Aqui usamos 2,2'-tiodietanol (TDE) diluído em 1x PBS. As soluções TDE devem ser armazenadas em RT.
- Transfira as amostras para novos pratos, adicione 30% v/v TDE e deixe-as por 4 h com agitação suave no RT.
- Retire a solução de TDE a 30% v/v, adicione TDE a 68% v/v às amostras e deixe-as agitadas suavemente à RT.
NOTA: Como o TDE é viscoso, pipetar lentamente para permitir que a ponta enche. A inalação de vapor TDE ou névoa pode irritar o sistema respiratório. Portanto, é aconselhável trabalhar em uma área bem ventilada ou usar exaustores para minimizar a exposição. As soluções de TDE devem ser armazenadas em RT. Use 10 mL de soluções de TDE para cada amostra.
6. Montagem da amostra
NOTA: Para facilitar a montagem da amostra e a aquisição da imagem LSFM, usamos um porta-amostras selado sob medida (denominado "sanduíche"), que consiste em três partes: uma lâmina de microscópio, um espaçador e uma lamínula.
- Coloque o espaçador de aço (56 x 56 x 0,5 mm3) sobre a lâmina do microscópio (60 x 60 x 1 mm3) e coloque a amostra sobre a lâmina de microscopia.
- Coloque cuidadosamente a tampa de quartzo (60 x 60 x 0,5 mm3), prenda tudo e prepare uma cola de silicone de dois componentes na proporção de 1:1. Use uma lamínula de quartzo para corresponder ao índice de refração e reduzir a aberração óptica durante o processo de aquisição.
- Com uma seringa de 1 mL, preencha o espaço entre o espaçador e a lamínula com uma cola de silicone bicomponente e deixe secar por 10 min.
- Retire os clipes e use uma pequena agulha para encher lentamente todo o sanduíche com 68% v/v TDE.
- Faça cola fresca e sele o sanduíche.
NOTA: Se o TDE atingir acidentalmente o espaçador na etapa 6.1, a cola não irá curar. Certifique-se de que não se formam bolhas de ar durante o passo 6.2.
7. Decapagem
NOTA: A preservação estrutural e a acessibilidade aprimorada do epítopo do SHORT permitem a marcação multi-redonda de fatias, removendo os anticorpos e retendo as amostras com outros marcadores.
- Abra o sanduíche com uma lâmina, coloque os espécimes em pratos novos com tampas de rosca preenchidas com 30% v/v TDE, e deixe-os por 3 h.
- Transfira as amostras para tubos, lave por 3 x 2 h em 1x PBS (pH 7,4) em RT com agitação suave e deixe a última lavagem o/n.
- Colocar as amostras em solução de limpeza em banho-maria a 80 °C durante 4 horas.
- Lavar durante 3 x 2 h em 1x PBST (pH 7,4) a 37 °C em agitação suave e deixar a última lavagem o/n. Agora o exemplo está pronto para ser rotulado novamente a partir da etapa 4.8.
NOTA: Encha sempre o tubo com 50 ml de cada solução. Utilizar 10 ml de solução TDE para cada amostra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O protocolo aqui descrito permite o tratamento simultâneo de múltiplos cortes, variando em espessura de 100 μm a 500 μm, utilizando o método SHORT. Essa abordagem reduz significativamente o tempo total de processamento de todo o procedimento. Neste trabalho, fornecemos uma descrição abrangente de todo o pipeline (Figura 1) para processamento simultâneo de múltiplos cortes espessos do cérebro humano post-mortem e demonstramos o protocolo em 24 cortes de uma só vez (Figura 2A). O tempo de clareamento e comarcação varia de 11 a 30 dias, considerando o tamanho e a espessura das amostras (Tabela 1), excluindo-se os exames de imagem e o processamento pós-imagem. Após a correspondência entre a deslipidação e o índice de refração no TDE, obtém-se uma transparência ótima e homogênea de todos os cortes de tecido tanto na substância cinzenta quanto na branca (Figura 2B).
A aquisição das imagens pode ser realizada com diferentes microscópios avançados de fluorescência, incluindo microscopia confocal25 e de dois fótons14. Neste estudo, utilizamos um LSFM18,23 invertido feito sob medida, equipado com quatro linhas de laser de excitação: 405 nm, 488 nm, 561 nm e 638 nm, capaz de adquirir quatro características biológicas diferentes marcadas com anticorpos conjugados com fluoróforos. A Figura 3A mostra imagens representativas de um corte de 400 μm de espessura da área de Broca humana co-marcada para NeuN, um marcador pan-neuronal, somatostatina (SST) e calretinina (CR), que marcam duas subpopulações diferentes de interneurônios e o marcador nuclear DAPI (Figura 3A,B). Na laje de 400 μm de espessura, observamos que a fluorescência global ao longo de Z não se limita à superfície, mas é quase uniforme em toda a profundidade do tecido, embora a intensidade de sinal diminua ligeiramente no meio (Figura 3C).
Para alcançar uma caracterização celular mais abrangente do tecido cerebral humano, é possível realizar a marcação multi-redonda dos mesmos espécimes removendo os anticorpos e remarcando a amostra, como demonstrado no artigo original do SHORT. A Figura 4 (adaptada de Pesce et al.18) demonstra o potencial de aplicação de sete anticorpos diferentes em um corte de tecido de 500 μm de espessura processado com SHORT em três rodadas consecutivas de imunomarcação. Os anticorpos utilizados incluem NeuN, SST, CR, Parvalbumina (PV) e peptídeo intestinal vasoativo (VIP) como marcadores neuronais inibitórios, proteína glial fibrilar ácida (GFAP) para células gliais e vimentina (VIM) para vasculatura (Tabela 2). Os resultados mostram a notável capacidade do SHORT de preservar informações teciduais ao longo de vários procedimentos de decapagem, reduzir efetivamente os sinais de autofluorescência e alcançar uma limpeza eficiente do espécime.
Figura 1: Linha do tempo de SHORT. Esquema que representa as etapas necessárias para processar as amostras com o protocolo SHORT. Em cada etapa, dezenas de placas de tecido cerebral humano são processadas juntas. Após a incorporação em agarose e fatiamento, as amostras são colocadas em soluções Switch-on e Switch-off por 1 dia cada; As etapas de inativação são realizadas durante a noite, enquanto a deslipidação através da incubação em solução de limpeza requer 3-7 dias. Em seguida, as amostras são incubadas com soluções de anticorpos primários e secundários por no máximo 7 e 6 dias, respectivamente. Após a correspondência do índice de refração, as amostras são montadas no porta-amostras (sanduíche) para geração de imagens e armazenamento do LSFM. A qualquer momento após a montagem do sanduíche, as amostras podem ser retiradas e rerotuladas para a detecção de diferentes marcadores. Abreviações: TDE = 2,2'-tiodietanol; CURTO = SWITCH - H2O2 - Antígeno Retrieval -TDE; o/n = pernoite; IR = índice de refração; LSFM = microscopia de fluorescência de lâmina de luz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Cortes cerebrais humanos de um bloco da área de Broca processados simultaneamente. (A) Vinte e quatro cortes consecutivos da área de Broca de 4 x 4 x 0,04 cm3 em PBS antes do processamento com o método SHORT. (B) Os mesmos espécimes em A mostrados após o processamento SHORT. Barra de escala = 1 cm. Abreviações: TDE = 2,2'-tiodietanol; CURTO = SWITCH - H2O2 - Antígeno Retrieval -TDE; PBS = solução salina tamponada com fosfato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 3. Imagens representativas de LSFM de um corte clarificado marcado com quatro marcadores diferentes. (A) Imagens de projeção de intensidade máxima (resolução de 3,3 x 3,3 x 3,3 μm3) mostrando uma reconstrução mesoscópica de um corte CURTO da área de Broca marcada para NeuN, somatostatina, calretinina e o marcador nuclear DAPI. À direita, a imagem mesclada (NeuN-SST-CR-DAPI) é mostrada. Barra de escala = 0,5 cm. (B) Inserção ampliada da imagem mesclada em A. Barra de escala = 100 μm. (C) Imagens yz de alta resolução (0,55 x 0,55 x 3,3 μm) de (B). Barra de escala = 100 μm. Abreviações: TDE = 2,2'-tiodietanol; CURTO = SWITCH - H2O2 - Antígeno Retrieval -TDE; LSFM = microscopia de fluorescência de lâmina de luz; NeuN = antígeno nuclear neuronal; TSM = somatostatina; RC = calretinina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagens representativas de LSFM de coloração multi-round em cortes SHORT-processados. (A) Imagens de um corte cerebral humano pré-clareamento (em PBS) e após a marcação multi-round com correspondência de índice de refração (68% TDE). Barra de escala = 1 cm. (B) Fusão dos vários canais adquiridos durante três rodadas múltiplas subsequentes. A imagem mostra substância branca e cinzenta marcada com peptídeo intestinal vasoativo, somatostatina, parvalbumina, calretinina, antígeno nuclear neuronal, proteína ácida fibrilar glial e vimentina. Alta resolução (resolução de 0,55 x 0,55 x 3,3 μm), imagens de canal único são mostradas à direita e abaixo da imagem. Barra de escala = 100 μm para todas as imagens, exceto para GFAP (barra de escala 10 = μm). (C) Imagens de projeção de intensidade máxima de corte de 500 μm de espessura mostrando o sinal de sete anticorpos diferentes usados em três rodadas sequenciais de imunomarcação. 1ª rodada: PV-SST-VIP; 2ª rodada: CR-SST-NeuN; 3ª rodada: VIM-SST-GFAP. Barra de escala = 1 mm. Esse valor foi modificado de Pesce et al.18. Abreviações: TDE = 2,2'-tiodietanol; CURTO = SWITCH - H2O2 - Antígeno Retrieval -TDE; LSFM = microscopia de fluorescência de lâmina de luz; NeuN = antígeno nuclear neuronal; TSM = somatostatina; RC = calretinina; VP = parvalbumina; GFAP = proteína glial fibrilar ácida; VIM = vimentina; VIP = peptídeo intestinal vasoativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Duração representativa do SHORT para amostras com uma variedade de áreas e espessuras. Espécimes com diferentes áreas e espessuras requerem um tempo de incubação variável em soluções de clareamento e anticorpos, resultando em comprimentos de tempo distintos para todo o pipeline SHORT. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 2: Anticorpos compatíveis com SHORT. A tabela lista todos os anticorpos que foram testados com o protocolo SHORT e mostraram coloração específica em amostras de cérebro humano de 400-500 μm de espessura. A coluna P/M denota anticorpos policlonais e monoclonais. Clique aqui para baixar esta tabela.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Imagens de alta resolução e reconstrução 3D de grandes áreas cerebrais humanas requerem secção mecânica do tecido seguida de clareamento óptico e imunomarcação de cortes únicos. O protocolo aqui apresentado descreve como o método de transformação tecidual SHORT pode ser usado para processamento rápido e simultâneo de múltiplas seções espessas do cérebro humano para reconstrução cerebral 3D com resolução subcelular com LSFM.
Ao contrário de outras abordagens, com o método SHORT as etapas de limpeza e multi-rotulagem não requerem equipamentos sofisticados e personalizados. Uma grande parte dos espécimes pode ser processada em conjunto, reduzindo o tempo de processamento de grandes blocos de tecido cerebral humano e minimizando a variabilidade técnica.
Os tratamentos de descoloração e desmascaramento de epítopos são cruciais quando se trabalha com tecidos humanos envelhecidos e fixados em formalina. O peróxido de hidrogênio e as soluções de recuperação de antígenos alcalinos também podem ser usados em combinação com outros métodos de clareamento, como o iDISCO 6,28, CLARITY, SWITCH e SHIELD24.
Para garantir a preservação da informação epitópica e alcançar uma limpeza uniforme da substância cinzenta e branca, é necessário transformar a amostra em um híbrido gel/tecido resistente ao calor e a reagentes químicos. O glutaraldeído foi selecionado por sua excelente capacidade de reticulação e sua capacidade de penetrar na laje de tecido em pH baixo (pH = 3). A concentração de glutaraldeído é um fator crítico na determinação da força e clareza do tecido. Uma maior concentração leva a uma melhor preservação da estrutura do tecido, mas também aumenta o tempo necessário para a limpeza. Essa escolha possibilita os resultados desejados em termos de preservação de epítopos e clareamento homogêneo. No caso da solução switch-off (protocolo passo 2.1), a concentração de glutaraldeído foi cuidadosamente escolhida e otimizada para encontrar um equilíbrio entre reticulação efetiva e clareamento rápido18,25. O SHORT é especificamente adaptado para trabalhar com fatias cerebrais humanas fixadas em formalina da área de Broca, hipocampo e córtex cortical 18,23,25. No entanto, ao trabalhar com outros modelos biológicos ou diferentes regiões cerebrais, algumas modificações podem ser necessárias devido a variações na composição da substância cinzenta e branca.
Uma tarefa crítica deste protocolo é também a otimização do tempo de incubação no clareamento (passo do protocolo 3.4) e das soluções de anticorpos (etapas do protocolo 4.8 e 4.10), principalmente relacionado ao tamanho do espécime e à composição biológica do tecido. Estimamos que 500 μm representam o limite de espessura do tecido para alcançar uma ótima transparência na substância branca e cinzenta e marcação uniforme em toda a profundidade do tecido para várias colorações de anticorpos (Tabela 2). Uma descrição detalhada desses processos pode ser encontrada em Pesce et al.18 e Scardigli et al.24. Diferentes áreas cerebrais podem ter uma composição diferente em lipídios e proteínas, e cérebros envelhecidos desenvolvem um alto conteúdo de pigmentos do tipo lipofuscina e neuromelanina que produzem um forte sinal de autofluorescência e alteram a difusão da sonda por todo o tecido. Como exemplo, uma fatia de 400 μm de espessura de 16 cm2 da área de Broca humana precisa de 7 dias de tratamento com a solução de limpeza para atingir um alto nível de delipidação. Para garantir coloração uniforme em toda a profundidade do tecido, é necessária incubação com soluções de anticorpos primários e secundários por 7 e 6 dias, respectivamente (Figura 3). Portanto, é necessária uma otimização fina para as etapas de limpeza e rotulagem antes da aplicação do protocolo de alto rendimento descrito aqui.
O SHORT permite armazenar amostras no suporte de imagem personalizado, uma vez que foi demonstrado que o sinal fluorescente é preservado por pelo menos um ano. Os pesquisadores podem, portanto, preparar todos os sanduíches com antecedência e armazená-los para a etapa de imagem que pode ser feita posteriormente. Notavelmente, a lâmina do microscópio, o espaçador e o vidro da tampa usados para preparar os sanduíches podem ser personalizados de acordo com o tamanho do espécime.
As amostras processadas com o protocolo SHORT aqui descrito foram analisadas utilizando-se um LSFM invertido sob medida18,23. Esta configuração é composta por dois braços equipados com objetivas 12x personalizadas com um colar de correção de índice de refração (RI). Cada objetiva atua como um braço de iluminação e detecção ao mesmo tempo, permitindo a aquisição simultânea de dois canais a uma velocidade volumétrica de 0,16 cm3/h. Como o porta-espécimes pode acomodar dois sanduíches por vez, somos capazes de obter imagens consecutivas de quatro canais em duas fatias em 10 h. Devido à toxicidade ligeira do vapor TDE para o sistema respiratório, para evitar a aberração esférica, o suporte da amostra é preenchido com glicerol a 91% v/v/solução de água que corresponde ao IR (1,46) da lamínula de quartzo e da solução de TDE. A solução de glicerol v/v/água a 91% deve ser trocada a cada 3 dias para evitar contaminação por poeira. Portanto, nosso LSFM permite a aquisição rápida de espécimes com baixo fotoclareamento com resolução isotrópica de 3,6 μm após pós-processamento 18,23,29. A grande quantidade de dados produzidos foi processada utilizando um pipeline definido para refatiamento e costura das pilhas de imagens utilizando um software auto-desenvolvido, ZetaStitcher (https://github.com/lens-biophotonics/ZetaStitcher)23,29.
Embora tenhamos usado o SHORT em combinação com microscopia de fluorescência de lâmina de luz, diferentes tipos de técnicas de imagem por fluorescência podem ser empregados para a aquisição, dependendo da disponibilidade do laboratório e das aplicações específicas. Por exemplo, a microscopia confocal25 ou a microscopia de dois fótons14 podem ser usadas para analisar espécimes eliminados. Esse tipo de análise é recomendado para amostras com volumes relativamente pequenos, pois são sistemas baseados em varredura e o tempo de aquisição de grandes áreas teciduais é muito longo30. Por obter imagens mais rápidas e desacoplar a resolução lateral e axial, a microscopia de fluorescência em folha de luz é o método preferido para obter imagens de grandes volumes de amostras clareadas 3,4,18,31,32,33.
Em resumo, descrevemos um protocolo rápido de alto rendimento para limpeza simultânea, comarcação homogênea e reconstrução volumétrica 3D de dezenas de cortes cerebrais humanos post-mortem. Combinando SHORT com imagens LSFM e análise computacional, é possível obter dados tridimensionais para um censo celular abrangente e análise proteômica do cérebro humano.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.
Acknowledgments
Agradecemos a Bruce Fischl, Massachusetts General Hospital, A.A. Martinos Center for Biomedical Imaging, Department of Radiology, por fornecer as amostras de cérebro humano analisadas neste estudo. Este projeto recebeu financiamento do Programa-Quadro de Investigação e Inovação Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo do acordo de subvenção n.º 654148 (Laserlab-Europe), do Programa-Quadro de Investigação e Inovação Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo do Acordo de Subvenção Específico n.º 785907 (Projeto Cérebro Humano SGA2) e n.º 945539 (Projeto Cérebro Humano SGA3), do Centro da Corporação Hospitalar Geral dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número de prémio U01 MH117023, e do Ministério da Educação italiano no âmbito do Nó Italiano Euro-Bioimaging (infraestrutura de investigação ESFRI). Finalmente, esta pesquisa foi realizada com a contribuição da "Fondazione CR Firenze". O conteúdo deste trabalho é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa, necessariamente, a opinião oficial do National Institutes of Health. A Figura 1 foi criada com BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2'-thiodiethanol | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
| Acetamide >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| Agarose High EEO | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
| Boric Acid | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
| Coverslips | LaserOptex | / | customized |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| Glutaraldehyde | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
| Glycine | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
| Hydrogen Peroxide 30% | Merck Life Science S.R.L. | ||
| Incubator ISS-4075 | Lab companion | / | |
| Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) | / | / | custom-made |
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| Microscope slides | Laborchimica | / | customized |
| Phospate buffer saline tablet | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | out of production |
| Potassium Hydrogen Phtalate | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| Sodium Azide | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
| Sodium Sulfite | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
| Spacers | Microlaser srl | customized | |
| Sputum Containers (dishes with screw lids) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| Tris Base | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
| Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
| Tubes | Sarstedt | 62 547254 | |
| Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| Water bath | Memmert | WNB 7-45 | |
| Antibodies and Dyes | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-NeuN Antibody | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | Dilution used, 1:100 |
| Anti-Parvalbumin antibody (PV) | Abcam | ab32895 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM) | Abcam | ab8069 | Dilution used, 1:200 |
| Calretinin Polyclonal antibody | ProteinTech | 12278_1_AP | Dilution used, 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | Dilution used, 1:100 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed | Abcam | ab175475 | Dilution used, 1:200 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | Dilution used, 1:200 |
| Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody | Abcam | ab194324 | Dilution used, 1:200 |
| Somatostatin Antibody YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | Dilution used, 1:200 |
| Vasoactive intestinal peptide (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | Dilution used, 1:200 |
References
- Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251 (2019).
- Richardson, D. S., et al.
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nature Protocols. 16 (6), 2732-2748 (2021).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 713-741 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6 (1), 18631 (2016).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Lee, H., Park, J. -H., Seo, I., Park, S. -H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14 (1), 48 (2014).
- Murray, E., et al. Simple, Scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Costantini, I., et al. Large-scale, cell-resolution volumetric mapping allows layer-specific investigation of human brain cytoarchitecture. Biomedical Optics Express. 12 (6), 3684 (2021).
- Lai, H. M., et al. Next generation histology methods for three-dimensional imaging of fresh and archival human brain tissues. Nature Communications. 9 (1), 1066 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812.e19 (2020).
- Costantini, I., et al. Autofluorescence enhancement for label-free imaging of myelinated fibers in mammalian brains. Scientific Reports. 11 (1), 8038 (2021).
- Pesce, L., et al. 3D molecular phenotyping of cleared human brain tissues with light-sheet fluorescence microscopy. Communications Biology. 5 (1), 447 (2022).
- Schueth, A., et al. Efficient 3D light-sheet imaging of very large-scale optically cleared human brain and prostate tissue samples. Communications Biology. 6 (1), 170 (2023).
- Morawski, M., et al. Developing 3D microscopy with CLARITY on human brain tissue: Towards a tool for informing and validating MRI-based histology. NeuroImage. 182, 417-428 (2018).
- Park, J., et al. Integrated platform for multi-scale molecular imaging and phenotyping of the human brain. bioRxiv. , (2022).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Costantini, I., et al. A cellular resolution atlas of Broca's area. Science Advances. (9), eadg3844 (2023).
- Scardigli, M., et al. Comparison of different tissue clearing methods for three-dimensional reconstruction of human brain cellular anatomy using advanced imaging techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 752234 (2021).
- Pesce, L., et al. Exploring the human cerebral cortex using confocal microscopy. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 168, 3-9 (2022).
- Keller, P. J., Dodt, H. -U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173.e12 (2017).
- Sorelli, M., et al. Fiber enhancement and 3D orientation analysis in label-free two-photon fluorescence microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 4160 (2023).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369 (2021).
- Costantini, I., et al. Editorial: The human brain multiscale imaging challenge. Frontiers in Neuroanatomy. (16), 1060405 (2022).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5 (1), 9808 (2015).
