Summary
Mevcut protokol, (SWITCH - H2O2 - Antijen Reterival - 2,2'-tiyodietanol [TDE]) KISA doku transformasyon tekniğini rutin olarak yüksek verimli bir protokolde ışık tabakası floresan mikroskobu görüntüleme ile birleştirerek onlarca postmortem insan beyni kesitinin hızlı ve eşzamanlı optik temizleme, çok yönlü etiketleme ve 3D hacimsel rekonstrüksiyonu için adım adım bir prosedür sağlar.
Abstract
Son on yılda ortaya çıkan çok sayıda temizleme tekniğine rağmen, ölüm sonrası insan beyinlerinin işlenmesi, mikrometre çözünürlüğünde görüntülemeyi özellikle zorlaştıran boyutları ve karmaşıklığı nedeniyle zorlu bir görev olmaya devam ediyor. Bu makale, ışık tabakası floresan mikroskobu (LSFM) ile numunelerin temizlenmesini, etiketlenmesini ve sıralı görüntülenmesini sağlayan SHORT (S WITCH - H2O2 - Antijen Retrivansı - 2,2'-tiyodietanol [TDE]) doku transformasyon protokolü ile onlarca kesiti aynı anda işleyerek insan beyninin hacimsel bölümlerinin rekonstrüksiyonunu gerçekleştirmek için bir protokol sunmaktadır. SHORT, hem beyaz hem de gri maddede farklı nöronal alt popülasyonların tanımlanmasını sağlayarak, çeşitli nöronal belirteçlerle hızlı doku temizliği ve kalın dilimlerin homojen çoklu etiketlenmesini sağlar. Temizlendikten sonra, dilimler hızlı bir 3D rekonstrüksiyon için LSFM aracılığıyla mikrometre çözünürlüğünde ve aynı anda birden fazla kanalda görüntülenir. SHORT'u rutin olarak yüksek verimli bir protokol içinde LSFM analizi ile birleştirerek, kısa sürede yüksek çözünürlükte büyük hacimsel alanların 3D sitomimari rekonstrüksiyonunu elde etmek ve böylece insan beyninin kapsamlı yapısal karakterizasyonunu sağlamak mümkündür.
Introduction
İnsan beyninin büyük hacimlerinin 3D moleküler organizasyonunu ve sitomimarisini analiz etmek, kapsamlı işlem süresine sahip protokoller aracılığıyla elde edilen örneklerin optik şeffaflığını gerektirir. Dokulardaki kırılma indisindeki (RI) heterojenliği en aza indirmek, böylece ışık saçılımını azaltmak ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme için ışık penetrasyon derinliğini artırmak için optik temizleme teknikleri geliştirilmiştir 1,2,3,4,5. Temizleme ve derin doku etiketleme yöntemlerindeki mevcut gelişmeler, en son mikroskopi tekniklerinden yararlanarak bozulmamış kemirgen organlarının ve embriyoların hacimsel olarak görüntülenmesine izin verir6,7,8,9,10,11,12.
Bununla birlikte, ölüm sonrası insan beyninin geniş alanlarının hacimsel 3D rekonstrüksiyonu, model organizmalarla karşılaştırıldığında hala zorlu bir görevi temsil ediyor. Karmaşık biyolojik bileşim ve değişken postmortem fiksasyon ve saklama koşulları, doku temizleme etkinliğini, antikor penetrasyon derinliğini ve epitop tanıma 13,14,15,16,17,18,19'u tehlikeye atabilir. Ayrıca, büyük insan beyni alanlarının verimli bir şekilde temizlenmesi ve tek tip etiketlenmesi elde etmek için mekanik doku kesitleri ve ardından her dilimin temizlenmesi ve etiketlenmesi hala gereklidir, bu da model organizmalara kıyasla uzun işlem sürelerine ve sofistike özel ekipman ihtiyacına neden olur 15,20,21,22.
SWITCH - H2O2 - antijen Retrieval -TDE (KISA) doku dönüşüm tekniği, insan beyninin büyük hacimlerini analiz etmek için özel olarak geliştirilmiştir18,23. Bu yöntem, epitop restorasyonu ile birlikte doku otofloresansını azaltmak için SWITCH protokolü11'in doku yapısal korumasını ve yüksek konsantrasyonlarda peroksit hidrojeni kullanır. SHORT, farklı nöronal alt tipler, glial hücreler, damar sistemi ve miyelinli lifler için belirteçlerle insan beyni dilimlerinin düzgün boyanmasına izin verir18,24. Sonuçları hem düşük hem de yüksek yoğunluklu proteinlerin analizi ile uyumludur. Ortaya çıkan yüksek şeffaflık seviyeleri ve tek tip etiketleme, floresan mikroskobu ile kalın dilimlerin hacimsel olarak yeniden yapılandırılmasını sağlar, özellikle hızlı elde etme için ışık tabakası aparatı kullanılabilir 18,24,25,26,27.
Bu çalışmada, KISA doku dönüşüm tekniğinin, formalinle sabitlenmiş onlarca insan beyni bölümünün aynı anda temizlenmesi ve çok yönlü etiketlenmesi için nasıl kullanılabileceğini açıklıyoruz. Dört farklı floresan işaretleyici birlikte kullanılabilir ve bu da farklı hücresel alt popülasyonların tanımlanmasına yol açar. Temizledikten sonra, floresan mikroskobu ile yüksek çözünürlüklü hacimsel görüntüleme yapılabilir. Burada, numunenin hızlı optik kesitini ve paralel olarak birden fazla kanalın hızlı bir şekilde alınmasını sağlayan özel yapım ters çevrilmiş bir LSFM 18,24,25,26,27 kullandık. Bu rutin olarak yüksek verimli protokolle, tüm Broca alanının haritalanmasında gösterildiği gibi, insan beyninin geniş alanlarının hücre altı çözünürlüğü ile kapsamlı bir hücresel ve yapısal karakterizasyon elde etmek mümkündür23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Formalinle sabitlenmiş insan doku örnekleri, Massachusetts General Hospital (MGH) Otopsi Servisi (Boston, ABD) Nöropatoloji Bölümü tarafından sağlandı. Ortaklar Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi'nden IRB onaylı doku toplama protokollerini takiben ölümden önce sağlıklı katılımcılardan yazılı onay alındı (PIBC, protokol 2003P001937). Yetki belgeleri, Boston, MA, Amerika Birleşik Devletleri'ndeki MGH Otopsi Hizmetlerinde saklanır ve talep üzerine temin edilebilir.
1. Agaroz gömme ve numune kesme
- Bir beherde 1x fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) içinde% 4 w / v agaroz çözeltisi hazırlayın ve doku bloğunu içine gömün. Oda sıcaklığına (RT) ulaşana kadar bekleyin ve ardından 4 °C'de 24 saat saklayın.
- Yüksek hassasiyetli kesitler elde etmek için numuneyi vibratomun numune diskine yapıştırın ve tepsiyi soğuk 1x PBS (pH 7.4) ile doldurun. Dilimlenecek doku tipine göre frekans, genlik ve hız gibi vibratom parametrelerini ayarlayın (kullanılan değerler: frekans = 5 (50 Hz); genlik = 0.4; hız = 3 (0.15 mm/s).
NOT: Numune hacmine bağlı olarak farklı vibratomlar kullanılmalıdır. Maksimum hacmi 70 x 40 x 15 mm olan numuneler için bir vibratom (örneğin, Leica VT1000 S) kullanılabilir; daha büyük numuneler için bir sıkıştırma (örneğin, VF-900-0Z Mikrotom18) veya özel yapım bir aparat21 kullanmak mümkündür. Burada 400 μm veya 500 μm kalınlığında kesilmiş dilimler sunuyoruz. - Kestikten sonra, tüm dilimleri %0,01 w/v Sodyum Azid (NaN3) ile 1x PBS (pH 7.4) içeren bir koruyucu solüsyona koyun ve 4 °C'de saklayın.
NOT: Gömmeden önce, agaroz çözeltisi 37 °C'ye ulaşana kadar bekleyin. Daha yüksek bir sıcaklık numuneye zarar verebilir. Uzun süreli fiksasyon, antijenlere zarar vererek ve doku otofloresansını artırarak etiketleme prosedürüne müdahale edebileceğinden, numunelerin PFA'da 48 saatten fazla bırakılmaması önerilir. İnsan dokularının uzun süreli depolanması için, mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için NaN3'lü PBS kullanılır. NaN3'ün toksisitesi nedeniyle, koruyucu çözeltiyi kimyasal bir başlık altında hazırlayın.
2. Doku fiksasyonu
NOT: Aşağıdaki protokolde kullanılan tüm solüsyonlar, aynı doku bloğunun tüm dilimlerini işlemek ve teknik değişkenliği en aza indirmek ve bireysel adımlar için süreyi azaltmak için yeterli olan büyük hacimlerde hazırlanmıştır.
- %50 v/v 1x PBS pH 3, %25 v/v 0,1 M hidroklorik asit (HCl), %25 v/v 0,1 M potasyum hidrojen ftalat (KHP) ve taze %4 v/v glutaraldehit içeren kapatma solüsyonunu hazırlayın. Tüm numuneleri vidalı kapaklı (70 x 23 mm) tabaklara yerleştirin ve alüminyum folyo ile ışıktan koruyarak 1 gün boyunca 4 °C'de hafifçe çalkalayarak Kapatma solüsyonu ile inkübe edin.
- Açma solüsyonunu 1x PBS (pH 7.4) ve taze %1 v/v glutaraldehit ile hazırlayın. Tüm numuneleri yeni kaplara yerleştirin ve 1 gün boyunca 4 °C'de hafifçe çalkalayarak Switch-on solüsyonu ile inkübe edin ve alüminyum folyo ile ışıktan koruyun.
NOT: Gluteraldehitin yüksek toksisitesi ve ışık hassasiyeti nedeniyle, hem Kapatma hem de Açma çözeltileri her zaman taze olarak hazırlanmalı ve kimyasal kaputun altında buz üzerinde tutulmalıdır. Çanağı her zaman her çözeltiden 20 mL ile doldurun ve parafilm ile kapatın.
3. Devre dışı bırakma ve temizleme
NOT: Numunelerdeki reaktif glutaraldehit, 1x PBS pH 7.4, %4 w/v asetamid, %4 w/v glisin, pH 9.0'dan oluşan bir inaktivasyon solüsyonu ile inkübe edilerek inaktive edilmelidir. Çözelti 4 °C'de 3 aya kadar saklanabilir. Lipitleri uzaklaştırmak ve dokuyu şeffaf hale getirmek için 200 mM sodyum dodesil sülfat (SDS), 20 mM sodyum sülfit (Na2S3) ve 20 mM borik asit (H3BO3), pH 9.0'dan oluşan temizleme solüsyonunu kullanıyoruz. SDS 4 °C'de çökeldiği için çözelti RT'de saklanmalıdır. Aşağıdaki tüm adımlar çözelti ile doldurulmuş tüplerde yapılacaktır.
- Numuneleri bulaşıklardan tüplere taşıyın ve RT'de 1x PBS pH 7.4 ile 3 x 2 saat boyunca hafifçe çalkalayarak yıkayın.
NOT: Adım 3.1 için, glutaraldehit toksisitesi nedeniyle kimyasal başlık altında çalışmak gerekir. Asetamid ve borik asit de toksik reaktiflerdir ve kimyasal bir başlık altında ele alınmaları gerekir. Tüpü her zaman her çözeltiden 50 mL ile doldurun. - Numuneleri inaktivasyon solüsyonu içinde 37 °C'de bir su banyosunda gece boyunca inkübe edin (o/n).
- RT'de 1x PBS pH 7.4'te 3 x 2 saat boyunca hafifçe çalkalayarak yıkayın.
- Numuneleri temizleme solüsyonunda 55 °C'de bir su banyosunda 3-7 gün inkübe edin. Çözeltiyi her 2 günde bir değiştirin (Tablo 1).
4. İmmün etiketleme
NOT: Etiketleme adımından önce, 10 mM Tris bazı, 1 mM EDTA ve %0.05 v/v Tween 20, pH 9'dan oluşan bir antijen alma solüsyonu ile artık SDS'nin çıkarılması, otofloresansı azaltmak ve epitopların maskesini kaldırmak gerekir. Çözeltinin pH'ı 9, verimli bir geri alma işlemi için optimize edilmiştir; Tris bazı, stabil bir pH ortamını korumak için bir tamponlama maddesi görevi görür; Bir kenetleme ajanı olan EDTA, antijenin erişilebilirliğini arttırır. Noniyonik deterjan Tween 20, dokunun geçirgenliğini artırmaya yardımcı olur. Bu çözelti 4 °C'de saklanabilir. Antijen alma aşaması ile birleştirilen hidrojen peroksitin, spesifik olmayan arka plan sinyalinden (lipofuscin gibi) sorumlu endojen floroforları parçalayarak ve/veya modifiye ederek otofloresan sinyalini azaltmada sinerjik bir etkiye sahip olduğuna dikkat etmek önemlidir.
- %0,1 v/v Triton X-100 (PBST) ile 1x PBS hazırlayın, önceden 37 °C'ye ısıtın ve numuneleri inkübatörde 37 °C'de hafifçe çalkalayarak gün boyunca 3 x 3 saat yıkayın. Son yıkamayı o / n'ye bırakın.
NOT: PBST stok çözeltisini 4 °C'de saklayın. SDS'nin dokudan uzaklaştırılması çok önemlidir, çünkü düşük sıcaklıklarda sonraki edinim süreçlerine müdahale edebilecek çözünmez çökeltiler oluşturabilir. - Ertesi gün, her numuneye 10 mL %30 v/v hidrojen peroksit (H2O2) ekleyin ve RT'de 45 dakika hafifçe çalkalayarak bırakın.
- RT'de hafifçe çalkalayarak 1x PBS (pH 7.4) ile 3 x 10 dakika yıkayın.
- Antijen alma solüsyonunu bir su banyosunda 95 °C'de önceden ısıtın; numuneleri ısıtılmış çözeltiye aktarın ve 95 °C'de 10 dakika bekletin.
- Numunelerin hafifçe çalkalayarak 40 dakika RT'ye soğumasını bekleyin.
- 3 x 5 dakika deiyonize su ile hafifçe çalkalayarak yıkayın.
- Numuneleri PBS'de 4 °C'de 15 dakika dengeleyin.
- % 0.01 w / v NaN3 içeren PBST'den yapılmış taze antikor çözeltisi hazırlayın (adım 1.3 için NOT'a bakın) ve birincil antikorları ekleyin. Numuneleri, vidalı kapaklı kaplarda çözelti ile 37 ° C'de n gün (1-7) boyunca bir inkübatörde hafifçe çalkalayarak ve ışıktan koruyarak inkübe edin (Tablo 2).
NOT: Kuluçka süresi boyuta ve kalınlığa bağlıdır (Tablo 1 ve Tablo 2). - N gün sonra, numuneleri tüplere taşıyın ve inkübatörde hafifçe çalkalayarak 37 ° C'de önceden ısıtılmış PBST ile 3 x 2 saat yıkayın.
- PBST'ye %0.01 w/vNaN3 ile ikincil antikorlar ekleyin ve numuneleri vidalı kapaklı yeni kaplarda 37 °C'de n gün (1-6) boyunca bir inkübatörde hafifçe çalkalayarak ve ışıktan koruyarak inkübe edin (Tablo 1 ve Tablo 2).
- N gün sonra, numuneleri tüplere aktarın ve gün boyunca 3 x 3 saat önceden ısıtılmış PBST ile 37 °C'de hafifçe çalkalanan bir inkübatörde yıkayın. Son yıkamayı o / n'ye bırakın.
NOT: Triton X-100 ve Tween 20 viskoz olduğundan, ucun dolması için yavaşça pipetleyin. Tüpü her zaman her çözeltiden 50 mL ile doldurun. Her numune için 10 mL antikor solüsyonu kullanın ve solüsyonun buharlaşmasını önlemek için kabı parafilm ile kapatın. Antikor çözeltileri NaN 3 içerdiğinden, 4 ° C'de saklanabilir ve 2 hafta içinde yeni örnekleri etiketlemek için yeniden kullanılabilir.
5. Kırılma indisi eşleştirme
NOT: Yüksek düzeyde şeffaflık elde etmek için, doku kırılma indisini homojenize etmek gerekir. Burada 1x PBS'de seyreltilmiş 2,2'-tiyodietanol (TDE) kullanıyoruz. TDE çözümleri RT'de depolanmalıdır.
- Numuneleri yeni tabaklara aktarın, %30 v/v TDE ekleyin ve RT'de hafifçe çalkalayarak 4 saat bekletin.
- %30 v/v TDE çözeltisini çıkarın, numunelere %68 v/v TDE ekleyin ve RT'de hafifçe çalkalayın.
NOT: TDE viskoz olduğundan, ucun dolmasını sağlamak için yavaşça pipetleyin. TDE buharının veya sisinin solunması solunum sistemini tahriş edebilir. Bu nedenle, maruziyeti en aza indirmek için iyi havalandırılan bir alanda çalışmanız veya çeker ocak kullanmanız önerilir. Her numune için 10 mL TDE solüsyonu kullanın.
6. Örnek montaj
NOT: Numune montajını ve LSFM görüntü alımını kolaylaştırmak için, üç parçadan oluşan ısmarlama, sızdırmaz bir numune tutucu ("sandviç" olarak adlandırılır) kullanıyoruz: bir mikroskop lam, bir ara parça ve bir lamel .
- Çelik ara parçayı (56 x 56 x 0.5 mm3) mikroskop lamının (60 x 60 x 1 mm3) üzerine yerleştirin ve numuneyi mikroskopi lamına yerleştirin.
- Kuvars lamel (60 x 60 x 0,5 mm3) dikkatlice yerleştirin, her şeyi bir araya getirin ve 1:1 oranında iki bileşenli bir silikon yapıştırıcı hazırlayın. Kırılma indisini eşleştirmek ve edinme işlemi sırasında optik sapmayı azaltmak için bir kuvars lamel kullanın.
- 1 mL'lik bir şırınga kullanarak, ara parça ile lamel arasındaki boşluğu iki bileşenli bir silikon yapıştırıcı ile doldurun ve 10 dakika kurumasını bekleyin.
- Klipsleri çıkarın ve tüm sandviçi %68 v/v TDE ile yavaşça doldurmak için küçük bir iğne kullanın.
- Taze tutkal yapın ve sandviçi kapatın.
NOT: TDE yanlışlıkla adım 6.1'de ara parçaya ulaşırsa, yapıştırıcı sertleşmez. Adım 6.2'de hava kabarcığı oluşmadığından emin olun.
7. Sıyırma
NOT: SHORT'un yapısal koruması ve gelişmiş epitop erişilebilirliği, antikorları çıkararak ve numuneleri diğer belirteçlerle yeniden boyayarak dilimlerin çok yönlü etiketlenmesine izin verir.
- Sandviçi bir bıçakla açın, numuneleri %30 v/v TDE ile doldurulmuş vidalı kapaklı yeni kaplara koyun ve 3 saat bekletin.
- Numuneleri tüplere aktarın, RT'de 1x PBS'de (pH 7.4) 3 x 2 saat hafifçe çalkalayarak yıkayın ve son yıkamayı o / n bırakın.
- Numuneleri 4 saat boyunca 80 ° C'de bir su banyosunda temizleme çözeltisine yerleştirin.
- 1x PBST'de (pH 7.4) 37 °C'de 3 x 2 saat hafifçe çalkalayarak yıkayın ve son yıkamayı o/n bırakın. Artık numune, 4.8 adımından başlayarak tekrar etiketlenmeye hazırdır.
NOT: Tüpü her zaman her çözeltiden 50 mL ile doldurun. Her numune için 10 mL TDE çözeltisi kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan protokol, SHORT yöntemi kullanılarak kalınlıkları 100 μm ila 500 μm arasında değişen birden fazla dilimin aynı anda işlenmesini sağlar. Bu yaklaşım, tüm prosedür için genel işlem süresini önemli ölçüde azaltır. Bu çalışmada, birden fazla ölüm sonrası insan beyni kalın kesitini aynı anda işlemek için tüm boru hattının kapsamlı bir tanımını (Şekil 1) sunuyoruz ve protokolü aynı anda 24 dilim üzerinde gösteriyoruz (Şekil 2A). Temizleme ve birlikte etiketleme süresi, görüntüleme ve görüntüleme sonrası işlemler hariç, numunelerin boyutu ve kalınlığı dikkate alınarak 11 ila 30 gün arasında değişmektedir (Tablo 1). TDE'de delipidasyon ve kırılma indisi eşleşmesini takiben, hem gri hem de beyaz cevherde tüm doku dilimlerinin optimal ve homojen şeffaflığı elde edilir (Şekil 2B).
Görüntü alımı, konfokal25 ve iki foton mikroskobu14 dahil olmak üzere farklı gelişmiş floresan mikroskopları ile gerçekleştirilebilir. Burada, floroforla konjuge antikorlarla etiketlenmiş dört farklı biyolojik özellik elde edebilen dört uyarma lazer çizgisiyle donatılmış, dört uyarma lazer çizgisiyle donatılmış, özel yapım bir ters çevrilmiş LSFM18,23 kullandık: 405 nm, 488 nm, 561 nm ve 638 nm. Şekil 3A, internöronların iki farklı alt popülasyonunu ve nükleer belirteç DAPI'yi etiketleyen bir pan-nöronal belirteç, Somatostatin (SST) ve Calretinin (CR) için birlikte etiketlenmiş bir insan Broca bölgesinden 400 μm kalınlığındaki bir dilimin temsili görüntülerini göstermektedir (Şekil 3A, B). 400 μm kalınlığındaki levhada, Z boyunca küresel floresansın yüzeyle sınırlı olmadığını, ancak sinyal yoğunluğunun ortada biraz azalmasına rağmen, doku derinliği boyunca neredeyse tekdüze olduğunu gözlemledik (Şekil 3C).
İnsan beyin dokusunun daha kapsamlı bir hücresel karakterizasyonunu elde etmek için, antikorları sıyırarak ve numuneyi SHORT orijinal makalesinde gösterildiği gibi yeniden etiketleyerek aynı numunelerin çok yönlü etiketlemesini gerçekleştirmek mümkündür. Şekil 4 (Pesce ve ark.18'den uyarlanmıştır), art arda üç immün boyama turunda SHORT ile işlenen 500 μm kalınlığındaki bir doku dilimi üzerinde yedi farklı antikorun potansiyel uygulamasını göstermektedir. Kullanılan antikorlar arasında inhibitör nöronal belirteçler olarak NeuN, SST, CR, Parvalbumin (PV) ve vazoaktif bağırsak peptidi (VIP), glial hücreler için glial fibriler asidik protein (GFAP) ve vaskülatür için vimentin (VIM) bulunur (Tablo 2). Sonuçlar, SHORT'un çeşitli sıyırma prosedürleri boyunca doku bilgilerini koruma, otofloresan sinyallerini etkili bir şekilde azaltma ve verimli numune temizleme sağlama konusundaki olağanüstü yeteneğini göstermektedir.
Şekil 1: SHORT'un zaman çizelgesi. Numuneleri SHORT protokolü ile işlemek için gerekli adımları temsil eden şema. Her adımda, onlarca insan beyni dokusu levhası birlikte işlenir. Agaroz içine gömüldükten ve dilimlendikten sonra, numuneler her biri 1 gün boyunca Açma ve Kapatma solüsyonlarına yerleştirilir; İnaktivasyon adımları gece boyunca gerçekleştirilirken, temizleme çözeltisinde inkübasyon yoluyla delipidasyon 3-7 gün gerektirir. Daha sonra, numuneler sırasıyla maksimum 7 ve 6 gün boyunca birincil ve ikincil antikor çözeltileri ile inkübe edilir. Kırılma indisi eşleştirmesinden sonra numuneler, LSFM görüntüleme ve saklama için numune tutucuya (sandviç) monte edilir. Sandviç montajından sonra herhangi bir zamanda, farklı işaretleyicilerin tespiti için numuneler sıyrılabilir ve yeniden etiketlenebilir. Kısaltmalar: TDE = 2,2'-tiyodietanol; KISA = SCADI - H2O2 - Antijen Reterivası -TDE; o/n = bir gecede; RI = kırılma indisi; LSFM = ışık tabakası floresan mikroskobu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bir Broca bölgesinin bloğundan insan beyni dilimleri aynı anda işlenir. (A) KISA yöntemle işlenmeden önce PBS'de Broca'nın 4 x 4 x 0.04cm3 alanından yirmi dört ardışık dilim. (B) KISA işlemden sonra gösterilen A'daki aynı örnekler. Ölçek çubuğu = 1 cm. Kısaltmalar: TDE = 2,2'-tiyodietanol; KISA = SCADI - H2O2 - Antijen Reterivası -TDE; PBS = fosfat tamponlu salin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Dört farklı işaretleyici ile etiketlenmiş netleştirilmiş bir dilimin temsili LSFM görüntüleri. (A) NeuN, Somatostatin, Calretinin ve nükleer belirteç DAPI için etiketlenmiş KISA işlenmiş bir Broca alanı diliminin mezoskopik rekonstrüksiyonunu gösteren maksimum yoğunluk projeksiyon görüntüleri (3.3 x 3.3 x 3.3μm3 çözünürlük). Sağ tarafta, birleştirilmiş görüntü (NeuN-SST-CR-DAPI) gösterilir. Ölçek çubuğu = 0,5 cm. (B) A'da birleştirilen görüntünün büyütülmüş eki. Ölçek çubuğu = 100 μm. (C) (B)'den yüksek çözünürlüklü (0,55 x 0,55 x 3,3 μm) yz görüntüler. Ölçek çubuğu = 100 μm. Kısaltmalar: TDE = 2,2'-tiyodietanol; KISA = SCADI - H2O2 - Antijen Reterivası -TDE; LSFM = ışık tabakası floresan mikroskobu; NeuN = Nöronal Nükleer antijen; SST = somatostatin; CR = kalretinin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: KISA işlenmiş dilimlerde çok yuvarlak boyamanın temsili LSFM görüntüleri. (A) Bir insan beyni diliminin ön temizlemesinin (PBS'de) ve kırılma indisi eşleşmesi ile çok turlu etiketlemeden sonra (% 68 TDE) görüntüleri. Ölçek çubuğu = 1 cm. (B) Birbirini takip eden üç çoklu tur sırasında elde edilen çeşitli kanalların birleştirilmesi. Görüntü, Vazoaktif Bağırsak Peptit, Somatostatin, Parvalbümin, Calretinin, Nöronal Nükleer antijen, Glial Fibriler Asidik Protein ve Vimentin ile etiketlenmiş hem beyaz hem de gri maddeyi göstermektedir. Yüksek çözünürlüklü (0,55 x 0,55 x 3,3 μm çözünürlük), tek kanallı görüntüler görüntünün sağında ve altında gösterilir. GFAP hariç tüm görüntüler için ölçek çubuğu = 100 μm (ölçek çubuğu 10 = μm). (C) Üç ardışık immün boyama turunda kullanılan yedi farklı antikordan gelen sinyali gösteren 500 μm kalınlığındaki dilimin maksimum yoğunluk projeksiyon görüntüleri. 1. Tur: PV-SST-VIP; 2. tur: CR-SST-NeuN; 3. Tur: VIM-SST-GFAP. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakam Pesce ve ark.18'den değiştirilmiştir. Kısaltmalar: TDE = 2,2'-tiyodietanol; KISA = SCADI - H2O2 - Antijen Reterivası -TDE; LSFM = ışık tabakası floresan mikroskobu; NeuN = Nöronal Nükleer antijen; SST = somatostatin; CR = kalretinin; PV = parvalbümin; GFAP = glial fibriler asidik protein; VIM = vimentin; VIP = vazoaktif bağırsak peptidi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Çeşitli alan ve kalınlığa sahip numuneler için SHORT'un temsili zaman uzunluğu. Farklı alanlara ve kalınlıklara sahip numuneler, temizleme ve antikor çözeltilerinde değişken bir inkübasyon süresi gerektirir, bu da tüm SHORT boru hattı için farklı zaman uzunlukları ile sonuçlanır. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 2: SHORT ile uyumlu antikorlar. Tablo, SHORT protokolü ile test edilen ve 400-500 μm kalınlığındaki insan beyni örneklerinde spesifik lekelenme gösteren tüm antikorları listeler. P/M sütunu poliklonal ve monoklonal antikorları gösterir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Büyük insan beyni alanlarının yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve 3D rekonstrüksiyonu, mekanik doku kesiti ve ardından tek dilimlerin optik olarak temizlenmesi ve immüno-etiketlenmesini gerektirir. Burada sunulan protokol, KISA doku transformasyon yönteminin, LSFM ile hücre altı çözünürlüğe sahip 3D beyin rekonstrüksiyonu için çoklu insan beyninin kalın kesitlerinin hızlı ve eşzamanlı işlenmesi için nasıl kullanılabileceğini açıklamaktadır.
Diğer yaklaşımlardan farklı olarak, SHORT yönteminde temizleme ve çoklu etiketleme adımları, gelişmiş özelleştirilmiş ekipman gerektirmez. Numunelerin büyük bir kısmı tamamen işlenebilir, bu da büyük insan beyin dokusu bloklarının işlem süresini azaltır ve teknik değişkenliği en aza indirir.
Renk giderme ve epitop maskeleme tedavileri, yaşlanmış, formalinle sabitlenmiş insan dokularıyla çalışırken çok önemlidir. Hidrojen peroksit ve alkali antijen geri alma çözeltileri, iDISCO 6,28, CLARITY, SWITCH ve SHIELD24 gibi diğer temizleme yöntemleriyle birlikte de kullanılabilir.
Epitopal bilginin korunmasını sağlamak ve hem gri hem de beyaz cevherin düzgün bir şekilde temizlenmesini sağlamak için, numuneyi ısıya ve kimyasal reaktiflere dirençli bir jel/doku hibritine dönüştürmek gerekir. Glutaraldehit, mükemmel çapraz bağlanma kabiliyeti ve düşük pH'ta (pH = 3) doku levhasına nüfuz etme kabiliyeti nedeniyle seçilmiştir. Gluteraldehit konsantrasyonu, dokunun gücünü ve berraklığını belirlemede kritik bir faktördür. Daha yüksek bir konsantrasyon, doku yapısının daha iyi korunmasına yol açar, ancak aynı zamanda temizleme için gereken süreyi de artırır. Bu seçim, epitopun korunması ve homojen temizleme açısından istenen sonuçları sağlar. Kapatma çözümü durumunda (protokol adımı 2.1), glutaraldehit konsantrasyonu, etkili çapraz bağlama ile hızlı temizleme18,25 arasında bir denge sağlamak için dikkatlice seçilmiş ve optimize edilmiştir. SHORT, Broca bölgesi, hipokampus ve kortikal korteks 18,23,25'ten formalinle sabitlenmiş insan beyni dilimleriyle çalışmak için özel olarak tasarlanmıştır. Bununla birlikte, diğer biyolojik modellerle veya farklı beyin bölgeleriyle çalışırken, gri ve beyaz madde bileşimindeki farklılıklar nedeniyle bazı değişiklikler gerekli olabilir.
Bu protokolün kritik bir görevi, esas olarak numune boyutu ve doku biyolojik bileşimi ile ilgili olan temizlemede (protokol adımı 3.4) ve antikor çözeltilerinde (protokol adımları 4.8 ve 4.10) inkübasyon süresinin optimizasyonudur. 500 μm'nin hem beyaz hem de gri maddede optimal şeffaflık elde etmek için doku kalınlığı sınırını ve çeşitli antikor boyaması için doku derinliği boyunca tek tip etiketlemeyi temsil ettiğini tahmin ettik (Tablo 2). Bu süreçlerin ayrıntılı bir açıklaması Pesce ve ark.18 ve Scardigli ve ark.24'te bulunabilir. Farklı beyin bölgeleri, lipitlerde ve proteinlerde farklı bir bileşime sahip olabilir ve yaşlı beyinler, güçlü bir otofloresan sinyali üreten ve doku boyunca prob difüzyonunu değiştiren yüksek miktarda lipofusin tipi pigment ve nöromelanin geliştirir. Örnek olarak, insan Broca bölgesinden 400 μm kalınlığında 16cm2'lik bir dilimin, yüksek bir delipidasyon seviyesine ulaşması için temizleme solüsyonu ile 7 günlük tedaviye ihtiyacı vardır. Doku derinliği boyunca homojen boyama sağlamak için, sırasıyla 7 ve 6 gün boyunca primer ve sekonder antikor solüsyonları ile inkübasyon gerektirir (Şekil 3). Bu nedenle, burada açıklanan yüksek verimli protokolün uygulanmasından önce temizleme ve etiketleme adımları için hassas bir optimizasyon gereklidir.
SHORT, floresan sinyalin en az bir yıl korunduğu kanıtlandığı için numunelerin özel yapım görüntüleme tutucusunda saklanmasını sağlar. Bu nedenle araştırmacılar tüm sandviçleri önceden hazırlayabilir ve daha sonra yapılabilecek görüntüleme adımı için saklayabilirler. Özellikle, sandviçleri hazırlamak için kullanılan mikroskop lamı, ara parça ve kapak camı, numunenin boyutuna göre özelleştirilebilir.
Burada tarif edilen SHORT protokolü ile işlenen numuneler, özel yapım ters çevrilmiş LSFM18,23 kullanılarak analiz edildi. Bu kurulum, kırılma indisi (RI) düzeltme bileziğine sahip 12x özel yapım objektiflerle donatılmış iki koldan oluşur. Her objektif aynı anda bir aydınlatma ve algılama kolu görevi görerek 0,16 cm3/s hacimsel hızda iki kanalın aynı anda alınmasına izin verir. Numune tutucu aynı anda iki sandviçi barındırabildiğinden, 10 saatte iki dilim halinde dört kanalı art arda görüntüleyebiliyoruz. Solunum sistemi için TDE buharının hafif toksisitesi nedeniyle, küresel sapmayı önlemek için, numune tutucu hem kuvars lamel hem de TDE çözeltisinin RI (1.46) ile eşleşen %91 v/v gliserol/su çözeltisi ile doldurulur. Toz kontaminasyonunu önlemek için %91 v/v gliserol/su çözeltisi her 3 günde bir değiştirilmelidir. Bu nedenle, LSFM'miz,son işlemden sonra 3,6 μm'lik izotropik çözünürlükte düşük fotoağartma ile numunelerin hızlı bir şekilde alınmasını sağlar 18,23,29. Üretilen büyük miktarda veri, kendi geliştirdiği bir yazılım olan ZetaStitcher (https://github.com/lens-biophotonics/ZetaStitcher)23,29 kullanılarak görüntü yığınlarının yeniden dilimlenmesi ve birleştirilmesi için tanımlanmış bir boru hattı kullanılarak işlendi.
SHORT'u ışık tabakası floresan mikroskobu ile birlikte kullanmamıza rağmen, laboratuvarın mevcudiyetine ve özel uygulamalara bağlı olarak elde etmek için farklı floresan görüntüleme teknikleri kullanılabilir. Örneğin, temizlenmiş örnekleri analiz etmek için konfokal mikroskopi25 veya iki foton mikroskobu14 kullanılabilir. Bu tür analizler, tarama tabanlı sistemler oldukları ve geniş doku alanları için alım süresi çok uzun olduğu için nispeten küçük hacimli numuneler için önerilir30. Daha hızlı görüntüleme elde ederek ve yanal ve eksenel çözünürlüğü ayırarak, ışık tabakası floresan mikroskobu, büyük hacimlerde temizlenmiş numunelerin görüntülenmesi için tercih edilen yöntemdir 3,4,18,31,32,33.
Özetle, düzinelerce ölüm sonrası insan beyni bölümünün eşzamanlı temizleme, homojen ortak etiketleme ve 3D hacimsel rekonstrüksiyonu için hızlı bir yüksek verimli protokol tanımladık. SHORT'u LSFM görüntüleme ve hesaplamalı analiz ile birleştirerek, kapsamlı bir hücre sayımı ve insan beyninin proteomik analizi için üç boyutlu veriler elde etmek mümkündür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yürütüldüğünü beyan ederler.
Acknowledgments
Massachusetts General Hospital, AA Martinos Biyomedikal Görüntüleme Merkezi, Radyoloji Bölümü'nden Bruce Fischl'e bu çalışmada analiz edilen insan beyni örneklerini sağladığı için teşekkür ederiz. Bu proje, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 Araştırma ve İnovasyon Çerçeve Programı'ndan 654148 No'lu hibe sözleşmesi (Laserlab-Europe), Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 Araştırma ve İnovasyon Çerçeve Programı'ndan 785907 No'lu (İnsan Beyni Projesi SGA2) ve 945539 No'lu (İnsan Beyni Projesi SGA3) Özel Hibe Sözleşmesi kapsamında, Ulusal Sağlık Enstitüleri Genel Hastane Şirketi Merkezi'nden U01 MH117023 ödül numarası altında, ve Euro-Bioimaging Italian Node (ESFRI araştırma altyapısı) çerçevesinde İtalya Eğitim Bakanlığı'ndan. Son olarak, bu araştırma "Fondazione CR Firenze"nin katkılarıyla gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmanın içeriği yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmeyebilir. Şekil 1 BioRender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2'-thiodiethanol | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
| Acetamide >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| Agarose High EEO | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
| Boric Acid | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
| Coverslips | LaserOptex | / | customized |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| Glutaraldehyde | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
| Glycine | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
| Hydrogen Peroxide 30% | Merck Life Science S.R.L. | ||
| Incubator ISS-4075 | Lab companion | / | |
| Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) | / | / | custom-made |
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| Microscope slides | Laborchimica | / | customized |
| Phospate buffer saline tablet | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | out of production |
| Potassium Hydrogen Phtalate | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| Sodium Azide | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
| Sodium Sulfite | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
| Spacers | Microlaser srl | customized | |
| Sputum Containers (dishes with screw lids) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| Tris Base | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
| Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
| Tubes | Sarstedt | 62 547254 | |
| Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| Water bath | Memmert | WNB 7-45 | |
| Antibodies and Dyes | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-NeuN Antibody | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | Dilution used, 1:100 |
| Anti-Parvalbumin antibody (PV) | Abcam | ab32895 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM) | Abcam | ab8069 | Dilution used, 1:200 |
| Calretinin Polyclonal antibody | ProteinTech | 12278_1_AP | Dilution used, 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | Dilution used, 1:100 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed | Abcam | ab175475 | Dilution used, 1:200 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | Dilution used, 1:200 |
| Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody | Abcam | ab194324 | Dilution used, 1:200 |
| Somatostatin Antibody YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | Dilution used, 1:200 |
| Vasoactive intestinal peptide (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | Dilution used, 1:200 |
References
- Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251 (2019).
- Richardson, D. S., et al.
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nature Protocols. 16 (6), 2732-2748 (2021).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 713-741 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6 (1), 18631 (2016).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Lee, H., Park, J. -H., Seo, I., Park, S. -H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14 (1), 48 (2014).
- Murray, E., et al. Simple, Scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Costantini, I., et al. Large-scale, cell-resolution volumetric mapping allows layer-specific investigation of human brain cytoarchitecture. Biomedical Optics Express. 12 (6), 3684 (2021).
- Lai, H. M., et al. Next generation histology methods for three-dimensional imaging of fresh and archival human brain tissues. Nature Communications. 9 (1), 1066 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812.e19 (2020).
- Costantini, I., et al. Autofluorescence enhancement for label-free imaging of myelinated fibers in mammalian brains. Scientific Reports. 11 (1), 8038 (2021).
- Pesce, L., et al. 3D molecular phenotyping of cleared human brain tissues with light-sheet fluorescence microscopy. Communications Biology. 5 (1), 447 (2022).
- Schueth, A., et al. Efficient 3D light-sheet imaging of very large-scale optically cleared human brain and prostate tissue samples. Communications Biology. 6 (1), 170 (2023).
- Morawski, M., et al. Developing 3D microscopy with CLARITY on human brain tissue: Towards a tool for informing and validating MRI-based histology. NeuroImage. 182, 417-428 (2018).
- Park, J., et al. Integrated platform for multi-scale molecular imaging and phenotyping of the human brain. bioRxiv. , (2022).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Costantini, I., et al. A cellular resolution atlas of Broca's area. Science Advances. (9), eadg3844 (2023).
- Scardigli, M., et al. Comparison of different tissue clearing methods for three-dimensional reconstruction of human brain cellular anatomy using advanced imaging techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 752234 (2021).
- Pesce, L., et al. Exploring the human cerebral cortex using confocal microscopy. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 168, 3-9 (2022).
- Keller, P. J., Dodt, H. -U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173.e12 (2017).
- Sorelli, M., et al. Fiber enhancement and 3D orientation analysis in label-free two-photon fluorescence microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 4160 (2023).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369 (2021).
- Costantini, I., et al. Editorial: The human brain multiscale imaging challenge. Frontiers in Neuroanatomy. (16), 1060405 (2022).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5 (1), 9808 (2015).
