Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة نقش خلية خالية من الحبر وخالية من الملصقات ومستقلة عن الركيزة وعالية الإنتاجية تعتمد على تأثير أرخميدس المغناطيسي.
Abstract
يقدم نمط الخلية ، الذي يسمح بالتحكم الدقيق في موضع الخلية ، ميزة فريدة في دراسة سلوك الخلية. في هذا البروتوكول ، يتم تقديم استراتيجية نمطية للخلايا تعتمد على تأثير أرخميدس المغناطيسي (Mag-Arch). يتيح هذا النهج التحكم الدقيق في توزيع الخلايا دون استخدام مواد الحبر أو جزيئات وضع العلامات. من خلال إدخال كاشف مغناطيسي لتعزيز الحساسية المغناطيسية لوسط زراعة الخلية ، يتم صد الخلايا بواسطة المغناطيس وترتيب نفسها في نمط مكمل لمجموعات المغناطيس الموضوعة أسفل ركيزة الموائع الدقيقة.
في هذه المقالة ، يتم توفير إجراءات مفصلة لأنماط الخلايا باستخدام الإستراتيجية المستندة إلى Mag-Arch. يتم تقديم طرق لتصميم أنواع الخلايا المفردة وكذلك أنواع الخلايا المتعددة لتجارب الثقافة المشتركة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير تعليمات شاملة لتصنيع أجهزة الموائع الدقيقة التي تحتوي على قنوات لنمط الخلايا. يعد تحقيق هذه الميزة باستخدام طرق متوازية أمرا صعبا ولكن يمكن القيام به بطريقة مبسطة وفعالة من حيث التكلفة. إن استخدام أنماط الخلايا القائمة على Mag-Arch يزود الباحثين بأداة قوية للبحث في المختبر .
Introduction
يتطور نمط الخلية إلى تقنية بديهية وقوية للدراسات في المختبر 1. من خلال معالجة مواقع الخلايا في لوحات الاستزراع ، فإنه يوفر حلولا لمجموعة متنوعة من التجارب ، بما في ذلك هجرة الخلايا2 ، والزراعة المشتركة متعددة الخلاياللمحاكاة الحيوية 3 ، والتجميع العضوي4 ، ودراسات المواد الحيوية5 ، والمزيد. في معظم الحالات ، يفضل استخدام طريقة خالية من الحبر وخالية من الملصقات لنقش الخلية لأنها توفر سهولة التشغيل وقابلية عالية للخلية للتحقيقات اللاحقة.
تأثير Mag-Arch هو ظاهرة فيزيائية حيث تميل الأجسام المغناطيسية في السوائل البارامغناطيسية إلى التحرك نحو المناطق ذات المجالات المغناطيسيةالضعيفة 6. الخلايا الحية مغناطيسية بشكل طبيعي ، في حين يمكن جعل وسائط زراعة الخلايا بارامغناطيسية عن طريق إضافة عناصر بارامغناطيسية قابلة للذوبان ، مثل جادوبنتيتات ديميجلومين (Gd-DTPA) ، التي يشيع استخدامها عن طريق الوريد في التصوير بالرنين المغناطيسي النووي كعامل تباين7. وبالتالي ، من المتوقع أن يتم صد الخلايا بواسطة الوسط المغنطيسي المحيط وتتحرك نحو المناطق التي تكون فيها المجالات المغناطيسية أضعف8. يمكن توليد مجال مغناطيسي منقوش بسهولة باستخدام مجموعة من مغناطيسات النيوديميوم. من الناحية المثالية ، يتم تجميع أنماط الخلايا في معارضة أنماط المغناطيس. من الناحية الفنية ، يتم تعريف هذا على أنه طريقة خالية من الملصقات لأن الكاشف الإضافي الوحيد ، Gd-DTPA ، يبقى في البيئة خارج الخلية ولا يرتبط بالخلايا. وبالتالي ، يمكن بسهولة تجنب التأثيرات المحتملة على زراعة الخلايا اللاحقة عن طريق استبدال وسط الثقافة. بالمقارنة مع الطرق الأخرى1،3،9،10 ، لا تتطلب الإستراتيجية القائمة على Mag-Arch مكونات الحبر الحيوي أو تطبيق جزيئات معينة لتسمية الخلايا بشكل إيجابي. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أنه يعمل على ركائز متعددة لالتصاق الخلايا وهو قادر على نقش الخلايا عالية الإنتاجية4.
تقدم هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لنمط الخلية باستخدام الطريقة المستندة إلى Mag-Arch ، والتي تغطي كل شيء من تصنيع الجهاز إلى ضبط نمط الخلية. بالإضافة إلى الأنماط التي أظهرناها ، يمكن للمستخدمين بسهولة إنشاء أنماط خلايا مختلفة باستخدام المغناطيس وحل Gd-DTPA. علاوة على ذلك ، يتم أيضا توفير بروتوكولات لتجميع أنماط الاستزراع المشترك المعقدة ومعالجة الخلايا في رقائق الموائع الدقيقة المغلقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تجميع مجموعات المغناطيس
- قم بتجميع مجموعات المغناطيس لأنماط الشريط.
- اختر مغناطيسا مستطيلا مسطحا ، كما هو موضح في الشكل 1 أ. أبعاد المغناطيسات المستطيلة المستخدمة في هذا العرض التوضيحي هي 1.5 مم × 10 مم × 35 مم (سمك × ارتفاع × طول) (انظر جدول المواد). يحدد سمك المغناطيس الفجوات بين خطوط الخلية.
- قطع ألواح السيليكون بسمك 2 مم (انظر جدول المواد) إلى مستطيلات 2 مم × 8 مم × 30 مم. تأكد من أن البعدين الأخيرين لألواح السيليكون هذه أصغر قليلا من أبعاد المغناطيس المستطيل المذكور أعلاه لتحسين التجميع. يحدد سمك ألواح السيليكون عرض خطوط الخلية.
- قم بتجميع المغناطيس المستطيل وألواح السيليكون طبقة تلو الأخرى ، كما هو موضح في الشكل 1 أ. تتكون كل مجموعة مغناطيس من 4 مغناطيسات و 3 ألواح سيليكون. تأكد من أن أقطاب كل مغناطيس مجاور متقابلة بحيث يمكن محاذاة مجموعات المغناطيس تلقائيا بسبب قوة الجذب الجوهرية.
- تعقيم المغناطيس قبل الاستخدام.
ملاحظة: يوصى بغسل مجموعات المغناطيس بالماء النقي ثم غمرها في 75٪ من الإيثانول لمدة 10 دقائق. الأبعاد الكلية لمجموعات المغناطيس هذه هي 12 مم × 10 مم × 35 مم ، مصممة لتناسب ألواح زراعة الخلايا القياسية المكونة من 6 آبار.
- تجميع مجموعات المغناطيس لأنماط الصفيف النقطي
- اختر مغناطيسات أسطوانية مصغرة ، كما هو موضح في الشكل 1 ب. أبعاد المغناطيس الأسطواني المستخدم في هذا العرض التوضيحي هي Φ1.5 مم × 10 مم (القطر × الارتفاع) ، ممغنطة في الاتجاه المحوري.
- قم بتجميع المغناطيسات الأسطوانية كما هو موضح في الشكل 1 ب. تأكد من أن كل مجموعة مغناطيسية تتكون من 36 مغناطيسا أسطوانيا مرتبة في شبكة 6 × 6. تأكد أيضا من أن أقطاب كل مغناطيس مجاور متقابلة للسماح لمجموعات المغناطيس بالمحاذاة تلقائيا بسبب قوة الجذب الجوهرية.
- تعقيم المغناطيس قبل الاستخدام ، باتباع نفس الإجراء كما في الخطوة 1.1.4. الأبعاد الكلية لمجموعات المغناطيس هذه هي 9 مم × 10 مم × 9 مم ، مصممة لتناسب ألواح زراعة الخلايا القياسية المكونة من 6 آبار.
2. نقش الخلية على الشرائح الزجاجية
- تحضير جهاز زراعة الخلايا.
- استخدم ألواح سيليكون بسمك 2 مم لإنشاء قوالب سيليكون. استخدم أداة ثقب لإنشاء ثقب مستطيل 1 سم × 1 سم في اللوحة. قم بقص صفيحة السيليكون حول الفتحة لصياغة قالب دائري (القطر = 25 مم) مع وجود الفتحة في المركز ، كما هو موضح في الشكل 1C.
- قم بتنظيف قوالب السيليكون جيدا باستخدام منظف بالموجات فوق الصوتية. تعقيم القوالب عن طريق غسلها بالماء النقي لمدة 10 دقائق ، تليها استبدال الماء ب 75٪ إيثانول لمدة 10 دقائق أخرى. أخيرا ، جفف القوالب في صندوق التعقيم على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
- قم بتوصيل قالب السيليكون المعقم بشريحة خلية زجاجية مستديرة Φ25 مم واضغط عليها برفق حتى يلتصق السيليكون بالزجاج ، كما هو موضح في الشكل 1C. سيكون لجهاز زراعة الخلايا الناتج جانب سفلي زجاجي وتجويف ثقافة 200 ميكرولتر. أبعاد الجهاز هي Φ25 مم × 2.15 مم ، مما يجعله مناسبا لألواح زراعة الخلايا القياسية المكونة من 6 آبار.
ملاحظة: يمكن استبدال جهاز زراعة الخلايا الموصوف أعلاه بأطباق بتري أخرى ذات جوانب سفلية أرق من 0.5 مم ، مثل الأطباق متحدة البؤر. - ضع مجموعات المغناطيس على لوحة من 6 آبار. يوصى باستخدام ملاقط غير مغناطيسية لسهولة التشغيل.
ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في ظل ظروف معقمة من هذه النقطة فصاعدا حتى ملاحظة أنماط الخلايا. - ضع جهاز زراعة الخلايا أعلى المغناطيس الموجود في بئر اللوحة المكونة من 6 آبار. تأكد من وضع جهاز زراعة الخلايا أفقيا ، وأن الجانب السفلي على اتصال وثيق بمجموعة المغناطيس.
- تحضير وسط زراعة الخلايا الذي يحتوي على Gd-DTPA
- تحضير حقن Gd-DTPA المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) ، عادة بتركيز 500 مللي مول. قم بتخفيف الحقن بإضافة 30 ميكرولتر من حقن Gd-DTPA إلى 470 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الكامل لتحقيق تركيز مستهدف يبلغ 30 مللي مول.
ملاحظة: اعتمادا على اللوائح المحلية والتوافر ، قد تسفر عوامل التباين الأخرى القائمة على الجادولينيوم (GBCAs) بنفس التركيز المستهدف عن نتائج مماثلة11.
- تحضير حقن Gd-DTPA المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) ، عادة بتركيز 500 مللي مول. قم بتخفيف الحقن بإضافة 30 ميكرولتر من حقن Gd-DTPA إلى 470 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الكامل لتحقيق تركيز مستهدف يبلغ 30 مللي مول.
- إنشاء أنماط الخلايا.
- خلايا الحصاد للزخرفة. في هذا العرض التوضيحي ، تم استخدام الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs ، انظر جدول المواد) للنقش (الشكل 2). أجهزة الطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق عند 200 × جم (في درجة حرارة الغرفة) لجمعها من التعليق وإعادة تعليقها في الوسط المحتوي على Gd-DTPA. عد كثافة الخلية.
- اضبط كثافة الخلية على ~ 2 × 105 خلايا / مل تقريبا باستخدام وسيط يحتوي على Gd-DTPA. امزج تعليق الخلية برفق وأضف 200 ميكرولتر إلى تجويف كل قالب زراعة خلية لإنشاء سطح سائل ممتلئ الحافة.
- نقل بعناية لوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية واحتضان لمدة 3-6 ساعات حتى تلتصق الخلايا جيدا الركيزة. تجنب إغلاق باب الحاضنة لمنع التداخل مع تجميع أنماط الخلايا. بالنسبة للخلايا ذات معدلات الالتصاق الضعيفة ، فإن العلاج الليلي باستخدام GBCAs آمن بشكل عام12.
- يعتبر نقش الخلية مكتملا عندما تلتصق الخلايا بالجزء السفلي من تجويف جهاز زراعة الخلايا. استبدل الوسط المحتوي على Gd-DTPA بوسط استزراع كامل.
- قم بإزالة جهاز زراعة الخلايا من مجموعة المغناطيس. يمكن للمرء إما مراقبة نمط الخلية على الفور أو نقل الجهاز إلى لوحة استزراع جديدة لمزيد من الزراعة.
3. زخرفة الثقافة المشتركة بواسطة المغناطيس الجانبي: تصنيع القالب المتحرك
ملاحظة: يتم تقديم الإجراء التالي للاستفادة من نمط الخلية القائم على Mag-Arch واستكشاف إمكانية المزيد من التطبيقات.
- قم بإعداد الجهاز لنقش الخلايا الشريطية باتباع الخطوتين 1 و 2. ومع ذلك ، قم بتقليل كثافة الخلية إلى 1 × 105 خلايا / مل واستبدل ألواح السيليكون التي تفصل المغناطيس بأخرى أرق ، مما يجعل كل نمط خلية شريطي أرق.
ملاحظة: يوفر هذا مساحة كافية لوضع خلايا متعددة في أنماط شريطية. كمرجع ، نقترح استخدام ألواح سيليكون 1 مم بدلا من 2 مم لفصل المغناطيس. - صمم النوع الأول من الخلايا كما هو موضح في الخطوات 2.2-2.3. تتطلب هذه الخطوة أيضا 3-6 ساعات لمرفق الخلية.
ملاحظة: للتمييز بين أنواع الخلايا المختلفة في نظام الاستزراع المشترك ، يمكن للمستخدمين تسمية الخلايا بأصباغ الفلورسنت مثل DiI أو DiD أو أجهزة تتبع الخلايا (CMTPX ، CMFDA ، CMAC ، إلخ) قبل النقش. على سبيل المثال ، بالنسبة لتلطيخ DiI و DiD ، أضف 1 ميكرولتر من محلول المخزون (10 mM) (انظر جدول المواد) لكل 1 مل من الوسط الخالي من FBS واخلطه جيدا للحصول على حل عملي. استبدل وسط الاستزراع بمحلول العمل لتغطية الخلايا الملتصقة. بعد الحضانة لمدة 30 دقيقة والغسيل باستخدام برنامج تلفزيوني ثلاث مرات ، تابع حصاد الخلايا. - بعد تصميم النوع الأول من الخلايا ، حرك جهاز زراعة الخلية 1 مم من المغناطيس أدناه إلى اليمين ، كما هو موضح في الشكل 3Aii.
- اغسل الشرائح الزجاجية برفق باستخدام 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مرتين. تجنب ترك الشرائح تجف.
- صمم النوع الثاني من الخلايا بنفس الطريقة الموضحة في الخطوات 2.2-2.3.
- حرك جهاز زراعة الخلايا 1 مم من المغناطيس أدناه إلى اليمين ، كما هو موضح في الشكل 3Aiii ، واغسل الشرائح الزجاجية ب 200 ميكرولتر من PBS مرة أخرى. صمم النوع الثالث من الخلايا بنفس الطريقة الموضحة في الخطوات 2.2-2.3.
- بعد نقش جميع أنواع الخلايا ، اغسل الشرائح الزجاجية برفق باستخدام 200 ميكرولتر من PBS مرتين واستبدلها بوسط زراعة الخلايا الكامل.
- قم بإزالة جهاز زراعة الخلايا من مجموعة المغناطيس. يمكن للمرء بعد ذلك مراقبة نمط الخلية أو نقل الجهاز إلى لوحة استزراع جديدة لمزيد من الزراعة.
4. نمط الثقافة المشتركة عن طريق ضبط تركيز Gd-DTPA
ملاحظة: لا تؤثر GBCAs بشكل كبير على التصاق الخلايا أو النمو اللاحق بتركيزات العمل (≤75 مللي مول). بالإضافة إلى ذلك ، تتأثر أنماط الخلايا بتركيز Gd-DTPA: تؤدي التركيزات الأعلى إلى أنماط خلايا أصغر / أرق. وبالتالي ، من الممكن إنشاء أنظمة ثقافة مشتركة ببساطة عن طريق ضبط تركيز Gd-DTPA. يوضح هذا المثال تصميم صفائف دائرية متحدة المركز.
- صمم النوع الأول من الخلايا كما هو موضح في الخطوات 2.2-2.3 باستخدام مغناطيسات أسطوانية مصغرة من الخطوة 1.2. قم بتسمية الخلايا بأصباغ الفلورسنت مثل DiI أو DiD أو أجهزة تتبع الخلايا (انظر الخطوة 3) قبل حصادها لتمييز أنواع الخلايا المختلفة في نظام الاستزراع المشترك.
ملاحظة: سيحتاج المرء إلى تركيز أعلى من Gd-DTPA (50 mM بدلا من 30 mM) وكثافة خلية أقل ، حوالي 1 × 105 خلايا / مل. - بعد تصميم مجموعة الخلايا الأولى ، اغسل الشرائح الزجاجية برفق باستخدام 200 ميكرولتر من PBS مرتين. تجنب ترك الشرائح حتى تجف.
- نمط النوع الثاني من الخلايا باتباع نفس الإجراء كما كان من قبل. حافظ على الشرائح الزجاجية بلا حراك نسبيا على المغناطيس لمنع الخلع. يوصى بتوصيل صفيحة سيليكون بتجويف يناسب مجموعات المغناطيس بالسطح السفلي للشريحة الزجاجية.
ملاحظة: هنا ، سيحتاج المرء إلى تركيز أقل من Gd-DTPA (20 mM بدلا من 30 mM) بحيث يتوقع أن تكون أنماط الخلايا الثانية أكبر من الأولى ، كما هو موضح في الشكل 3B. - بعد نقش جميع أنواع الخلايا ، اغسل الشرائح الزجاجية برفق باستخدام 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مرتين واستبدل الوسط بوسط زراعة الخلايا الكامل.
- قم بإزالة جهاز زراعة الخلايا من مجموعة المغناطيس. يمكن للمرء بعد ذلك مراقبة نمط الخلية أو نقل الجهاز إلى لوحة استزراع جديدة لمزيد من الزراعة.
5. نمط الخلية في رقاقة الموائع الدقيقة
ملاحظة: تم إثبات أن الطريقة القائمة على Mag-Arch تعمل في غرف ضيقة مغلقة في دراستنا السابقة8. فيما يلي مثال على مصفوفات نقطية في قناة الموائع الدقيقة.
- تصنيع رقاقة الموائع الدقيقة
- قم بتخصيص قوالب Polytetrafluoroethylene (PTFE) مقاس 40 مم × 75 مم × 20 مم (انظر جدول المواد) تحتوي على تجويف مستطيل 24 مم × 50 مم × 8 مم ، كما هو موضح في الشكل 4 أ.
- قم بتسطيح صفيحة سيليكون بسمك 0.5 مم. قم بقص ألواح السيليكون وفقا لشكل قناة السائل ، التي لها تجويف مستطيل يبلغ 15 مم × 20 مم × 0.5 مم مع مناطق عازلة مثلثة على جانبي المدخل والمخرج ، كما هو موضح في الشكل 4 أ ، ب.
- تخصيص ألواح زجاجية مستطيلة 40 مم × 75 مم. تنظيف الألواح الزجاجية مع البلازما الهوائية لمدة 30 ثانية.
- مباشرة بعد تنظيف بلازما الهواء ، قم بتغطية الألواح الزجاجية ب 0.5 مل من المخزن المؤقت المضاد للالتصاق المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) واتركها تجف في الهواء. اغسل الألواح الزجاجية مرة واحدة بالإيثانول واتركها تجف في الهواء.
- قم بتوصيل صفيحة سيليكون محضرة في الخطوة 5.1.2 بإحكام في منتصف لوحة زجاجية ، كما هو موضح في الشكل 4 أ.
- تحضير بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان (PDMS) البوليمر المسبق وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (انظر جدول المواد). لكل شريحة PDMS ، قم بوزن 10 جم من المكون الأساسي و 1 جم من عامل الثبات في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
- امزج العوامل جيدا بقضيب تحريك زجاجي حتى يتم توزيع الفقاعات الصغيرة بشكل موحد في الغروانية. يستغرق الخلط من 5 إلى 10 دقائق ، اعتمادا على حجم الغروانية. أجهزة الطرد المركزي البوليمر الغرواني لمدة 1 دقيقة عند 500 × جم (في درجة حرارة الغرفة) للقضاء على الفقاعات.
- صب ببطء ~ 10 مل من البوليمر المسبق في التجويف لملء قالب PTFE.
- ضع القالب بعناية في خزان مفرغ من الهواء واحتفظ به أفقيا لمنع البوليمر المسبق من التدفق بعيدا.
- قم بإزالة فقاعات الهواء المتبقية من البوليمر المسبق باستخدام مضخة تفريغ. يستغرق التنظيف بالمكنسة الكهربائية 120-180 دقيقة.
- إذا لزم الأمر ، صب المزيد من البوليمر المسبق لملء تجويف القالب. نظف بالمكنسة الكهربائية لمدة 60 دقيقة أخرى.
- قم بتغطية قالب PTFE بعناية باللوحة الزجاجية ، بحيث يواجه جانب السيليكا التجويف ، كما هو موضح في الشكل 4Bi.
- تأكد من التخلص من جميع الفقاعات. انقل القالب إلى فرن تجفيف بدرجة حرارة 60 درجة مئوية حتى يتجمد البوليمر الأولي طوال الليل.
- أخرج القالب من الفرن. بعد التبريد ، قم بإزالة غطاء PDMS المتصلب بعناية. قم بإنشاء مدخل ومخرج باستخدام أداة ثقب إبرة Φ1 مم.
- اغسل غطاء PDMS وشرائح الغطاء مقاس 24 مم × 50 مم وفقا للخطوة 2.1.2.
ملاحظة: تابع الخطوات التالية في ظل ظروف معقمة. - قم بتوصيل غطاء PDMS وشريحة غطاء لإنشاء شريحة ميكروفلويد تحتوي على قناة تدفق يبلغ ارتفاعها ~ 500 ميكرومتر تقريبا. يجب أن يتكون الجانب السفلي من شريحة غطاء زجاجي ~ 0.15 مم لتمكين نقش الخلية باستخدام الإستراتيجية القائمة على Mag-Arch.
- قم بتجميع المحولات المعقمة المتاحة تجاريا في كل من مدخل ومخرج شريحة الموائع الدقيقة8.
- تحضير 2٪ (وزن / فولت ، مذاب في PBS) عازلة طلاء الجيلاتين. تعقيم المخزن المؤقت عن طريق التعقيم.
- قم بحقن المخزن المؤقت لطلاء الجيلاتين في الشريحة عبر محول المدخل باستخدام حقنة سعة 1 مل. إذا ظهرت فقاعات ، فقم بطردها بمخزن إضافي للطلاء.
- ضع الشريحة في طبق زراعة الخلايا 10 سم. أضف 1 مل من PBS حول قاع الطبق لتجنب التجفيف. نقل الطبق إلى حاضنة ثقافة الخلية. يستغرق الطلاء 30 دقيقة.
- اغسل المخزن المؤقت للطلاء ب 2 مل من الوسط المحتوي على Gd (30 مللي مول) عبر المدخل.
- حقن بلطف 1 مل من معلق الخلية التي تحتوي على 30 mM Gd-DTPA مع حقنة 1 مل.
- خلايا النمط كما هو موضح في الخطوات 2.2-2.3 باستخدام مغناطيسات أسطوانية مصغرة من الخطوة 1.2.
ملاحظة: ومع ذلك ، يوصى بتوصيل صفيحة سيليكون بتجويف يناسب مجموعات المغناطيس بالسطح السفلي للشريحة الزجاجية ، كما هو موضح في الشكل 4Ci. - بعد النقش ، قم بتحديث الوسط المحتوي على Gd-DTPA برفق باستخدام 1 مل من الوسط الكامل عن طريق التنظيف باستخدام حقنة سعة 1 مل.
ملاحظة: تستغرق عملية نقش الخلايا في الموائع الدقيقة ، من الخطوات 5.7-5.9 ، حوالي 180 دقيقة ، وهو ما يشبه نقش الخلية على الشرائح الزجاجية القياسية. - تحديد الأنماط تحت المجهر. إذا لزم الأمر ، قم بتوصيل رقاقة الموائع الدقيقة بجهاز استزراع دائري لمزيد من الزراعة.
ملاحظة: في تجربتنا ، تكون الخلايا قادرة على النمو لمدة 72 ساعة على الأقل عندما تكون مدعومة بجهاز بسيط قائم على micropump ، والذي يوفر للموائع الدقيقة تدفقا مستمرا لوسط استزراع جديد في حاضنة الخلايا8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم اختيار مغناطيس مستطيل (1.5 مم × 10 مم × 35 مم) وأسطواني (Φ1.5 م × 10 مم) لإنشاء أنماط خلايا كعرض توضيحي. يتمتع المستخدمون بالمرونة لتعديل حجم وشكل المغناطيس أو تجميعها بشكل مختلف لإنشاء أنماط خلايا متنوعة. في الشكل 1 أ ، ب ، تم تجميع المغناطيس ، مع تصوير الأقطاب المغناطيسية باللون الأزرق (جنوبا) وأحمر (شمالا) من أجل الوضوح. في هذا التكوين ، تجذب المغناطيسات بعضها البعض أفقيا ومحاذاة نفسها ، كما هو موضح في الشكل 2. يوضح الشكل 1C ، D بنية جهاز زراعة الخلايا وإجراء نقش الخلية.
يعرض الشكل 2 أنماط الخلايا أحادية النوع. تم استخدام HUVECs الموسومة ب GFP للمراقبة تحت المجهر الفلوري. تم تنظيم الخلايا في أنماط صفيف شريطية ونقطية باستخدام مجموعات المغناطيس المقابلة. بالنسبة ل HUVECs ، التي تلتصق بسرعة بالشرائح الزجاجية (في غضون 120-180 دقيقة) ، تم الانتهاء من الإجراء بأكمله في 4 ساعات. أدى اتباع البروتوكول إلى أنماط ذات حواف محددة جيدا وتوحيد عالي. لتحديد الجدوى ، تمت معالجة الخلايا باستخدام Gd-DTPA لمدة 12 ساعة ، وهي أطول بكثير من 3-6 ساعات في الخطوة 2. ومع ذلك ، لم يظهر كل من التلوين الحي / الميت ومقايسة CCK88 أي انخفاض كبير في صلاحية الخلية. أدى التركيز العالي نسبيا ل Gd-DTPA (50 mM) إلى حدوث فرق إحصائي ، لكنه لا يزال يحافظ على معدل معيشة يبلغ 90.76٪ ± 1.78٪ (الشكل التكميلي 1).
واستنادا إلى بروتوكول نمط الخلية من النوع الأحادي، قدمت أمثلة على أنماط الخلايا المتعددة الأنواع لتطبيقات الاستزراع المشترك المحتملة. في هذا السيناريو ، تم استخدام HUVECs وخلايا سرطان المبيض A2780 وخلايا العضلات الملساء (SMCs). للتمييز بينهما ، تم تمييز الخلايا ب GFP و DiD و DiI قبل النقش. باتباع الخطوة 3 ، تم إنشاء نمط خلية ثلاثية من الخطوط جنبا إلى جنب (الشكل 3 أ). على العكس من ذلك ، تم استخدام الخطوة 4 لإنشاء صفائف نقطية متحدة المركز عن طريق ضبط تركيز Gd-DTPA (الشكل 3B). كانت الطبقة الأولى من الخلايا ملطخة ب DiI (أحمر) ومنقوشة ب 50 mM Gd-DTPA ، بينما تم تمييز الطبقة الثانية من الخلايا ب GFP (أخضر) ومنقوشة ب 25 mM Gd-DTPA. وبالتالي ، كان حجم النقطة للطبقة الأولى أصغر ، محاطا بشكل مركز بالطبقة الثانية من الخلايا ذات النمط النقطي. أظهرت أنواع الخلايا المختلفة معدلات ارتباط وانتشار متفاوتة ، حيث تلتصق HUVECs وتنتشر بسرعة ، وترتبط A2780s بسرعة ولكنها تنتشر ببطء أكثر ، وترتبط SMCs وتنتشر ببطء نسبيا. أظهرت هذه النتائج أن أنواع الخلايا المختلفة يمكن أن تشكل أنماط الخلايا في 3 ساعات ويمكن استخدامها في تجارب الاستزراع المشترك.
علاوة على ذلك ، ثبت أن نمط الخلية باستخدام مجال مغناطيسي كان متوافقا مع أجهزة الاستزراع الضيقة المغلقة ، مثل رقائق الموائع الدقيقة. باتباع الخطوة 5 ، تم تصنيع رقائق الموائع الدقيقة ، وتم إنشاء صفائف نقطية داخلها (الشكل 4).
الشكل 1: الإعداد والرسم التخطيطي لأنماط الخلايا القائمة على قوس ماج . (أ) تجميع مجموعات مغناطيسية لإنشاء أنماط خلايا شريطية . (ب) تجميع مجموعات مغناطيسية لتوليد أنماط خلايا صفيف نقطي. ج: إعداد جهاز زراعة الخلايا. د: إجراء خطوة بخطوة لنقش الخلايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تجميع الأجهزة ونقش HUVECs في أنماط صفيف شريطية ونقطية. (أ) مجموعات مغناطيسية محصورة داخل أجهزة زراعة الخلايا (i) وموضوعة في صفيحة زراعة الخلايا (ii). (ب) و(ج) مجموعات المغناطيس وأنماط الخلايا المناظرة. تم تمييز الخلايا ببروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) لتصور نمط الخلية. قضبان المقياس = 1.5 مم ؛ أقحم = 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تصميم أنظمة الاستزراع المشترك بإستراتيجية خطوة بخطوة. (أ) الزخرفة المشتركة باستخدام المغناطيس الجانبي (i-iii). تم تمييز الخلايا ب GFP (أخضر) و DiD (أزرق) و DiI (أحمر) لتمييز أنواع الخلايا المختلفة. قضبان المقياس = 1 مم. (ب) تم تحقيق نمط الاستزراع المشترك عن طريق ضبط تركيز Gd-DTPA ؛ (ط) 50 ملي مول، (ب) 20 ملي مول. قضبان المقياس = 1.5 مم ؛ أقحم = 250 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: نمط الخلية في حجرة الموائع الدقيقة. أ: رسم تخطيطي لقالب الموائع الدقيقة. (ب) تصنيع الموائع الدقيقة باستخدام بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS) (i,ii). (C) نمط الخلية داخل جهاز الموائع الدقيقة (i ، ii) والنتيجة التمثيلية التي توضح أنماط خلايا الصفيف النقطي (iii). تم تصنيف الخلايا ببروتين الفلورسنت الأخضر (GFP). شريط المقياس = 3 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل التكميلي 1: تأثير Gd-DTPA على صلاحية الخلية. وعولجت مركبات HUVECs بتركيزات متفاوتة من Gd-DTPA لمدة 12 ساعة ثم خضعت للتلطيخ الحي / الميت أو مقايسة CCK-8. (أ) تلطيخ الأحياء / الميتين لمركبات HUVEC. قضبان المقياس = 200 ميكرومتر. (ب) الرسم البياني الذي يصور نتائج تلطيخ الأحياء / الميتين. (ج) مدرج تكراري يوضح نتائج فحص CCK-8. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر نمط الخلايا القائم على Mag-Arch حلا سهل الاستخدام لمعظم المختبرات الطبية الحيوية. تتقدم هذه الطريقة بالتوازي مع أحرف خالية من الحبر ، وخالية من الملصقات ، ومستقلة عن الركيزة ، والقدرة على الزخرفة عالية الإنتاجية 8,13. بالنسبة لنقش الخلايا من النوع الأحادي ، فإنه يصمم الخلايا بطريقة خطوة واحدة. ينتهي الإجراء ببساطة عن طريق تحديث وسائط الثقافة.
استخدمت الدراسات السابقة الجسيمات المغناطيسية لتسمية الخلايا وجذبها بالمغناطيس لتشكيل أنماط دقيقة14,15. ومع ذلك ، أثار وجود جزيئات مغناطيسية على الخلايا مخاوف بشأن الآثار المحتملة على سلوكيات الخلية. تتخذ أنماط الخلايا القائمة على Mag-Arch استراتيجية معاكسة عن طريق تحويل السوائل خارج الخلية إلى بارامغناطيسية ، بدلا من الخلايا. هذه الاستراتيجية تجعل من الأسهل بكثير إزالة الكواشف المغناطيسية الإضافية عن طريق تحديث وسط الاستزراع. ولدت الدراسات مجالات خلوية ومصفوفات نقطية مع نمط الخلايا القائم على Mag-Arch11,16. بالمقارنة مع الدراسات القائمة على Mag-Arch الحالية ، يمكن للطرق التي يقدمها هذا البروتوكول تخصيص شكل الأنماط بحرية. علاوة على ذلك ، يقدم البروتوكول استراتيجيات لتصنيع أنظمة الثقافة المشتركة. كما ثبت أنه يعمل داخل غرف زراعة الخلايا الضيقة المغلقة ، كما اختبرنا في الموائع الدقيقة.
بدلا من الطرق المتوازية ، التي تتطلب معدات طباعة حيوية احترافية17 ، أو قوالب مخصصة18 ، أو تعديل سطحمعقد 19 ، تتطلب الطريقة المستندة إلى Mag-Arch ضرورتين فقط: المغناطيس و GBCAs. يحدد سطح نمط المغناطيس نمط الخلية بشكل عكسي. تم عرض عدة أنماط من الخطوط والمصفوفات النقطية الأساسية. يمكن للمستخدمين إنشاء أنماط بحرية بأشكال مختلفة من مجموعات المغناطيس ، والتي تتوفر تجاريا بكثرة. لتحقيق نتيجة مثالية ، يوصى باعتماد مغناطيس يوفر قوة مغناطيسية كافية. في ممارستنا ، اعتمدنا مغناطيس النيوديميوم والحديد والبورون N52 ، الذي كان رياحته أكثر من 1430 mT وكانت المغناطيسية السطحية أكثر من 100 mT على القطبين. بالنسبة ل GBCAs ، تم اعتماد Gd-DTPA لأنه مستقر في الظروف الفسيولوجية ومتاح بثمن بخس في معظم البلدان والمناطق. ويمكن اعتماد GBCAs أخرى بدلا من ذلك. يمكن أن تكون GBCAs غير الأيونية الحلقية الكبيرة ، مثل gadobutrol و gadoteridol ، خيارا أفضل لانخفاض السمية الخلوية عند تصميم الخلايا الضعيفة للعلاج طويل الأمد11,12.
يكمن الحد من أنماط الخلايا القائمة على Mag-Arch بشكل أساسي في منطقة عمل المجال المغناطيسي الناتج عن المغناطيس. باتباع صيغة التربيع العكسي ، ينخفض المجال المغناطيسي بشكل حاد مع المسافة8. نتيجة لذلك ، فشلت طريقة Mag-Arch في تجميع أنماط الخلايا المثالية على أطباق أو ألواح زراعة خلايا البوليسترين العامة ، والتي تكون قيعانها أكثر سمكا من 1 مم. وبالتالي ، يجب أن يعمل البروتوكول على أسطح زراعة الخلايا الرقيقة ، مثل الشرائح الزجاجية أو أطباق زراعة الخلايا متحدة البؤر. عند النقش داخل الموائع الدقيقة ، من الضروري أيضا أن تكون الشرائح السفلية من الموائع الدقيقة أرق من 0.5 مم. لإنشاء أنظمة الاستزراع المشترك ، قد تستغرق الطريقة وقتا طويلا ، لأن كل نوع خلية إضافي يزيد من الوقت بمقدار 3-6 ساعات لربط الخلية.
بشكل عام ، يوفر هذا البروتوكول طريقة مبسطة لأنماط الخلايا ، والتي يمكن تكرارها في معظم المختبرات دون أي معدات خاصة. يمكن للمستخدمين اعتماده كأداة قوية لدراسة سلوكيات الخلية ، أو محاكاة البيئات الدقيقة متعددة الخلايا ، أو اختبار تقارب الخلية للمواد الحيوية8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
يتم دعم هذه الدراسة ماليا من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2021YFA1101100) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32000971) ، وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (رقم 2021FZZX001-42) ، وصندوق العلوم الليلي المرصع بالنجوم التابع لمعهد شنغهاي للدراسات المتقدمة بجامعة تشجيانغ (رقم المنحة. SN-ZJU-SIAS-004).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A2780 ovarian cancer cells | Procell | CL-0013 | |
| Cell culture medium (DMEM, high glucose) | Gibco | 11995040 | |
| Cover slides | Citotest Scientific | 80340-3610 | For fabricating microfluidics. Dimension: 24 mm × 50 mm |
| DiD | MedChemExpress (MCE) | HY-D1028 | For labeling cells with red fluorescence (Ex: 640 nm) |
| DiI | MedChemExpress (MCE) | HY-D0083 | For labeling cells with orange fluorescence (Ex: 550 nm) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochannel | BC-SE-FBS07 | |
| Gadopentetate dimeglumine (Gd-DTPA) | Beijing Beilu Pharmaceutical | H10860002 | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | V900863 | |
| Glass cell slides | Citotest Scientific | 80346-2510 | Diameter: 25 mm; thickness: 0.19-0.22 mm |
| Glass plates | PURESHI hardware store | For fabricating microfluidics. Dimension: 40 mm × 75 mm | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) | Servicebio | STCC12103G-1 | |
| Neodymium-iron-boron magnets (N52) | Lalaci | ||
| Non-toxic glass plate coating (Gel Slick Solution) | Lonza | 1049286 | For convenience of demolding when fabricating microfluidics |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Servicebio | G4200 | |
| Plasma cleaner | SANHOPTT | PT-2S | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | DOWSIL | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | For fabricating microfluidics |
| Polytetrafluoroethylene (PFTE) mold | PURESHI hardware store | Customized online, for fabricating microfluidics | |
| Silicon plate | PURESHI hardware store | ||
| Smooth Muscle Cells (SMC) | Procell | CL-0517 | |
| Ultrasonic cleaner | Sapeen | CSA-02 |
References
- Christian, J., et al. Control of cell adhesion using hydrogel patterning techniques for applications in traction force microscopy. J Vis Exp. 179, e63121 (2022).
- Abbas, Y., Turco, M. Y., Burton, G. J., Moffett, A. Investigation of human trophoblast invasion in vitro. Hum Reprod Update. 26 (4), 501-513 (2020).
- Park, M., et al. Modulation of heterotypic and homotypic cell-cell interactions via zwitterionic lipid masks. Adv Healthc Mater. 6 (15), 1700063 (2017).
- Ren, T., Chen, P., Gu, L., Ogut, M. G., Demirci, U. Soft ring-shaped cellu-robots with simultaneous locomotion in batches. Adv Mater. 32 (8), e1905713 (2020).
- Ren, T., Steiger, W., Chen, P., Ovsianikov, A., Demirci, U. Enhancing cell packing in buckyballs by acoustofluidic activation. Biofabrication. 12 (2), 025033 (2020).
- Ge, S., et al. Magnetic levitation in chemistry, materials science, and biochemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 59 (41), 17810-17855 (2020).
- Puluca, N., et al. Levitating cells to sort the fit and the fat. Adv Biosyst. 4 (6), e1900300 (2020).
- Ren, T., et al. Programing cell assembly via ink-free, label-free magneto-archimedes based strategy. ACS Nano. 17 (13), 12072-12086 (2023).
- Li, Y. C., et al. Programmable laser-assisted surface microfabrication on a poly(vinyl alcohol)-coated glass chip with self-changing cell adhesivity for heterotypic cell patterning. ACS Appl Mater Interfaces. 7 (40), 22322-22332 (2015).
- Chliara, M. A., Elezoglou, S., Zergioti, I. Bioprinting on organ-on-chip: Development and applications. Biosensors (Basel). 12 (12), 1135 (2022).
- Moncal, K. K., Yaman, S., Durmus, N. G. Levitational 3D bioassembly and density-based spatial coding of levitoids. Adv Funct Mater. 32 (50), 2204092 (2022).
- Parfenov, V. A., et al. Magnetic levitational bioassembly of 3D tissue construct in space. Sci Adv. 6 (29), eaba4174 (2020).
- Dell, A. C., Wagner, G., Own, J., Geibel, J. P. 3D bioprinting using hydrogels: Cell inks and tissue engineering applications. Pharmaceutics. 14 (12), 2596 (2022).
- Ino, K., Ito, A., Honda, H. Cell patterning using magnetite nanoparticles and magnetic force. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1309-1317 (2007).
- Okochi, M., Matsumura, T., Honda, H. Magnetic force-based cell patterning for evaluation of the effect of stromal fibroblasts on invasive capacity in 3d cultures. Biosens Bioelectron. 42, 300-307 (2013).
- Mishriki, S., et al. Rapid magnetic 3D printing of cellular structures with mcf-7 cell inks. Research (Wash D C). 2019, 9854593 (2019).
- Ozturk-Oncel, M. O., Leal-Martinez, B. H., Monteiro, R. F., Gomes, M. E., Domingues, R. M. A. A dive into the bath: Embedded 3D bioprinting of freeform in vitro models. Biomater Sci. 11, 5462-5473 (2023).
- Sahni, G., Yuan, J., Toh, Y. C. Stencil micropatterning of human pluripotent stem cells for probing spatial organization of differentiation fates. J Vis Exp. 112, e54097 (2016).
- Joddar, B., et al. Engineering approaches for cardiac organoid formation and their characterization. Transl Res. 250, 46-67 (2022).
