Summary
Denne protokollen beskriver en blekkfri, etikettfri, substratuavhengig, høy gjennomstrømningscellemønstermetode basert på Magnetic Arkimedes-effekten.
Abstract
Cellemønster, som tillater presis kontroll av celleposisjonering, gir en unik fordel i studiet av celleadferd. I denne protokollen introduseres en cellemønsterstrategi basert på Magnetic-Archimedes (Mag-Arch) -effekten. Denne tilnærmingen muliggjør presis kontroll av celledistribusjon uten bruk av blekkmaterialer eller merkingspartikler. Ved å introdusere et paramagnetisk reagens for å forbedre den magnetiske følsomheten til cellekulturmediet, blir cellene frastøtt av magneter og ordner seg i et mønster komplementært til magnetsettene plassert under det mikrofluidiske substratet.
I denne artikkelen er detaljerte prosedyrer for cellemønster ved hjelp av Mag-Arch-basert strategi gitt. Metoder for mønster av enkeltcelletyper samt flere celletyper for samkultureksperimenter tilbys. I tillegg er omfattende instruksjoner for fremstilling av mikrofluidiske enheter som inneholder kanaler for cellemønster gitt. Å oppnå denne funksjonen ved hjelp av parallelle metoder er utfordrende, men kan gjøres på en forenklet og kostnadseffektiv måte. Bruk av Mag-Arch-basert cellemønster utstyrer forskere med et kraftig verktøy for in vitro-forskning .
Introduction
Cellemønster utvikler seg til en intuitiv og kraftig teknologi for in vitro-studier 1. Ved å manipulere celleposisjoner i kulturplater, gir den løsninger for en rekke eksperimenter, inkludert cellemigrasjon2, biomimetisk multicellulær samkultur3, organoidmontering4, biomaterialstudier5 og mer. I de fleste situasjoner foretrekkes en blekkfri, etikettfri metode for cellemønster fordi den gir enkel betjening og høy cellelevedyktighet for påfølgende undersøkelser.
Mag-Arch-effekten er et fysisk fenomen hvor diamagnetiske objekter i paramagnetiske væsker har en tendens til å bevege seg mot regioner med svake magnetfelt6. Levende celler er naturlig diamagnetiske, mens cellekulturmedier kan gjøres paramagnetiske ved å tilsette løselige paramagnetiske elementer, som gadopentetadagimeglumin (Gd-DTPA), som vanligvis brukes intravenøst i kjernemagnetisk resonansavbildning som kontrastmiddel7. Følgelig forventes celler å bli frastøtt av det omkringliggende paramagnetiske mediet og bevege seg mot regioner der magnetfeltene er svakere8. Et mønstret magnetfelt kan enkelt genereres ved hjelp av et sett med neodymmagneter. Ideelt sett er cellemønstre samlet i motsetning til magnetmønstrene. Teknisk sett er dette definert som en etikettfri metode fordi det eneste ekstra reagenset, Gd-DTPA, forblir i det ekstracellulære miljøet og ikke binder seg til celler. Dermed kan potensielle påvirkninger på påfølgende cellekultur lett unngås ved å erstatte kulturmediet. Sammenlignet med andre metoder 1,3,9,10, krever den Mag-Arch-baserte strategien ikke bioblekkkomponenter eller påføring av spesifikke partikler for å merke cellene positivt. Videre har det vist seg å fungere på flere substrater for celleadhesjon og er i stand til cellemønster med høy gjennomstrømning4.
Denne artikkelen presenterer en detaljert protokoll for cellemønster ved hjelp av Mag-Arch-basert metode, som dekker alt fra enhetsfabrikasjon til justering av cellemønsteret. I tillegg til mønstrene vi har demonstrert, kan brukerne enkelt lage forskjellige cellemønstre ved hjelp av magneter og Gd-DTPA-løsning. Videre er protokoller for montering av komplekse samkulturmønstre og manipulering av celler i lukkede mikrofluidiske chips også gitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Montering av magnetsettene
- Monter magnetsettene for stripemønstre.
- Velg flate rektangulære magneter, som vist i figur 1A. Dimensjonene til de rektangulære magnetene som brukes til denne demonstrasjonen er 1,5 mm × 10 mm × 35 mm (tykkelse × høyde × lengde) (se materialtabell). Tykkelsen på magneter bestemmer hullene mellom cellestripene.
- Skjær 2 mm tykke silikonplater (se Materialfortegnelse) i 2 mm × 8 mm × 30 mm rektangler. Forsikre deg om at de to sistnevnte dimensjonene på disse silikonplatene er litt mindre enn de rektangulære magnetene nevnt ovenfor for å optimalisere monteringen. Tykkelsen på silikonplatene bestemmer bredden på cellestripene.
- Monter de rektangulære magneter og silikonplater lag for lag, som illustrert i figur 1A. Hvert magnetsett består av 4 magneter og 3 silikonplater. Forsikre deg om at polene til hver tilstøtende magnet er motsatt, slik at magnetsettene automatisk kan justeres på grunn av den iboende attraktive kraften.
- Steriliser magneter før bruk.
MERK: Det anbefales å vaske magnetsettene med rent vann og deretter senke dem i 75% etanol i 10 minutter. De samlede dimensjonene til disse magnetsettene er 12 mm × 10 mm × 35 mm, designet for å passe til standard 6-brønns cellekulturplater.
- Sett sammen magnetsettene for punktmatrisemønstre
- Velg miniatyr sylindriske magneter, som vist i figur 1B. Dimensjonene til de sylindriske magneter som brukes til denne demonstrasjonen er Φ1, 5 mm × 10 mm (diameter × høyde), magnetisert i aksial retning.
- Monter de sylindriske magneter som angitt i figur 1B. Sørg for at hvert magnetsett består av 36 sylindriske magneter arrangert i et 6 × 6 rutenett. Sørg også for at polene til hver tilstøtende magnet er motsatte for å la magnetsettene justeres automatisk på grunn av den iboende attraktive kraften.
- Steriliser magnetene før bruk, følg samme fremgangsmåte som i trinn 1.1.4. De samlede dimensjonene til disse magnetsettene er 9 mm × 10 mm × 9 mm, designet for å passe til standard 6-brønns cellekulturplater.
2. Cellemønster på glassglass
- Forbered cellekulturenheten.
- Bruk 2 mm tykke silikonplater til å lage silikonformer. Bruk en puncher for å lage et rektangulært hull på 1 cm × 1 cm i platen. Trim silikonplaten rundt hullet for å lage en rund form (diameter = 25 mm) med hullet i midten, som vist i figur 1C.
- Rengjør silikonformene grundig ved hjelp av en ultralydrenser. Steriliser formene ved å vaske dem med rent vann i 10 minutter, etterfulgt av å erstatte vannet med 75% etanol i ytterligere 10 minutter. Tørk til slutt formene i en sterilisatorboks ved 65 °C i 60 minutter.
- Fest den steriliserte silikonformen til et Φ25 mm rundt glasscellelysbilde og trykk den forsiktig slik at silikonet fester seg til glasset, som vist i figur 1C. Den resulterende cellekulturanordningen vil ha en glassunderside og et 200 μL kulturhulrom. Dimensjonene til enheten er Φ25 mm × 2,15 mm, noe som gjør den egnet for standard 6-brønns cellekulturplater.
MERK: Cellekulturapparatet beskrevet ovenfor kan erstattes med andre petriskåler med undersiden tynnere enn 0,5 mm, for eksempel konfokalretter. - Plasser magnetsettene på en 6-brønnsplate. Ikke-magnetisk pinsett anbefales for enkel betjening.
MERK: Alle påfølgende trinn skal utføres under sterile forhold fra dette tidspunktet og fremover til observasjon av cellemønstre. - Plasser cellekulturenheten på toppen av magnetsettet i brønnen på 6-brønnplaten. Forsikre deg om at cellekulturenheten er plassert horisontalt, og at undersiden er i nær kontakt med magnetsettet.
- Forbered cellekulturmediet som inneholder Gd-DTPA
- Klargjør kommersielt tilgjengelig Gd-DTPA-injeksjon (se materialfortegnelse), vanligvis med en konsentrasjon på 500 mM. Fortynn injeksjonen ved å tilsette 30 μL Gd-DTPA injeksjon til 470 μL komplett cellekulturmedium for å oppnå en målkonsentrasjon på 30 mM.
MERK: Avhengig av lokale forskrifter og tilgjengelighet kan andre gadoliniumbaserte kontrastmidler (GBCA) med samme målkonsentrasjon gi lignende resultater11.
- Klargjør kommersielt tilgjengelig Gd-DTPA-injeksjon (se materialfortegnelse), vanligvis med en konsentrasjon på 500 mM. Fortynn injeksjonen ved å tilsette 30 μL Gd-DTPA injeksjon til 470 μL komplett cellekulturmedium for å oppnå en målkonsentrasjon på 30 mM.
- Opprett cellemønstrene.
- Høst celler for mønster. I denne demonstrasjonen ble humane navlestrengendotelceller (HUVEC, se materialtabell) brukt til mønster (figur 2). Sentrifuger cellene i 5 minutter ved 200 x g (ved romtemperatur) for å samle dem fra suspensjonen og resuspendere dem i det Gd-DTPA-holdige mediet. Tell celletettheten.
- Juster celletettheten til omtrent ~2 × 105 celler/ml med Gd-DTPA-holdig medium. Bland cellesuspensjonen forsiktig og tilsett 200 μL til hulrommet i hver cellekulturform for å skape en full væskeoverflate.
- Overfør forsiktig platen til en cellekulturinkubator og inkuber i 3-6 timer til cellene holder seg godt til substratet. Unngå å smelle inkubatordøren for å forhindre forstyrrelser i montering av cellemønstre. For celler med dårlige vedheftshastigheter er behandling over natten med GBCA generelt trygt12.
- Cellemønster anses som fullført når celler holder seg til bunnen av hulrommet i cellekulturenheten. Erstatt det Gd-DTPA-holdige mediet med komplett kulturmedium.
- Fjern cellekulturenheten fra magnetsettet. Man kan enten observere cellemønsteret umiddelbart eller overføre enheten til en ny kulturplate for videre dyrking.
3. Co-kultur mønstre av magnet sidelengs: fabrikasjon av den bevegelige malen
MERK: Følgende prosedyre presenteres for å dra nytte av Mag-Arch-basert cellemønster og utforske muligheten for flere applikasjoner.
- Forbered enheten for stripecellemønster etter trinn 1 og trinn 2. Reduser imidlertid celletettheten til 1 × 105 celler / ml og erstatt silikonplatene som skiller magneter med tynnere, noe som gjør hvert stripecellemønster tynnere.
MERK: Dette gir tilstrekkelig område for å legge flere celler i stripemønstre. Som referanse foreslår vi å bruke 1 mm silikonplater i stedet for 2 mm for å skille magneter. - Lag mønster over den første celletypen som illustrert i trinn 2.2-2.3. Dette trinnet krever også 3-6 timer for cellevedlegg.
MERK: For å skille forskjellige celletyper i kokultursystemet, kan brukerne merke celler med fluorescerende fargestoffer som DiI, DiD eller cellesporere (CMTPX, CMFDA, CMAC, etc.) før mønster. For eksempel, for DiI- og DiD-farging, tilsett 1 μL av stamløsningen (10 mM) (se materialtabell) per 1 ml FBS-fritt medium og bland godt for å oppnå en arbeidsløsning. Bytt ut kulturmediet med arbeidsløsningen for å dekke adherente celler. Etter inkubering i 30 minutter og vasking med PBS tre ganger, fortsett med cellehøsting. - Etter å ha mønstret den første typen celler, flytt cellekulturenheten 1 mm fra magnetene under til høyre, som illustrert i figur 3Aii.
- Vask forsiktig glasslysbildene med 200 μL PBS to ganger. Unngå å la lysbildene tørke.
- Mønstre den andre typen celler på samme måte som illustrert i trinn 2.2-2.3.
- Flytt cellekulturenheten 1 mm fra magnetene under til høyre, som illustrert i figur 3Aiii, og vask glasslysbildene med 200 μL PBS igjen. Mønstre den tredje celletypen på samme måte som illustrert i trinn 2.2-2.3.
- Etter mønster av alle typer celler, vask forsiktig glasslysbildene med 200 μL PBS to ganger og erstatt med komplett cellekulturmedium.
- Fjern cellekulturenheten fra magnetsettet. Man kan da observere cellemønsteret eller overføre enheten til en ny dyrkningsplate for videre dyrking.
4. Co-kultur mønstre ved å justere konsentrasjonen av Gd-DTPA
MERK: GBCA påvirker ikke celleadhesjon eller påfølgende vekst ved arbeidskonsentrasjoner signifikant (≤75 mM). I tillegg påvirkes cellemønstre av konsentrasjonen av Gd-DTPA: høyere konsentrasjoner resulterer i mindre / tynnere cellemønstre. Dermed er det mulig å skape kokultursystemer ved ganske enkelt å justere konsentrasjonen av Gd-DTPA. Dette eksemplet viser mønstre av konsentriske sirkulære matriser.
- Lag mønster av den første celletypen som illustrert i trinn 2.2-2.3 ved hjelp av sylindriske miniatyrmagneter fra trinn 1.2. Merk cellene med fluorescerende fargestoffer som DiI, DiD eller cellesporere (se trinn 3) før du høster dem for å skille forskjellige celletyper i samkultursystemet.
MERK: Man vil trenge en høyere konsentrasjon av Gd-DTPA (50 mM i stedet for 30 mM) og en lavere celletetthet, omtrent 1 × 105 celler / ml. - Etter å ha mønstret den første cellematrisen, vask forsiktig glasslysbildene med 200 μL PBS to ganger. Unngå å la lysbildene tørke.
- Lag mønster for den andre celletypen etter samme fremgangsmåte som før. Hold glasslysbildene relativt ubevegelige på magneter for å forhindre dislokasjon. Det anbefales å feste en silikonplate med en hul som passer magnetsettene til underoverflaten av glassglasset.
MERK: Her vil man trenge en lavere konsentrasjon av Gd-DTPA (20 mM i stedet for 30 mM) slik at de andre cellemønstrene forventes å være større enn de første, som illustrert i figur 3B. - Etter mønster av alle typer celler, vask forsiktig glasslysbildene med 200 μL PBS to ganger og erstatt mediet med komplett cellekulturmedium.
- Fjern cellekulturenheten fra magnetsettet. Man kan da observere cellemønsteret eller overføre enheten til en ny dyrkningsplate for videre dyrking.
5. Cellemønster i mikrofluidisk chip
MERK: Den Mag-Arch-baserte metoden har vist seg å fungere i lukkede smale kamre i vår tidligere studie8. Her er et eksempel på mønster prikkmatriser i en mikrofluidisk kanal.
- Fabrikasjon av mikrofluidbrikken
- Tilpass 40 mm × 75 mm × 20 mm polytetrafluoretylen (PTFE) former (se materialfortegnelse) som inneholder et rektangulært hulrom på 24 mm × 50 mm × 8 mm, som illustrert i figur 4A.
- Flat ut en 0,5 mm tykk silikonplate. Klipp silikonplatene i henhold til formen på væskekanalen, som har et rektangulært hulrom på 15 mm × 20 mm × 0,5 mm med trekantede bufferområder på både innløps- og utløpssidene, som illustrert i figur 4A, B.
- Tilpass 40 mm × 75 mm rektangulære glassplater. Rengjør glassplatene med luftplasma i 30 s.
- Umiddelbart etter rengjøring av luftplasma, dekk glassplatene med 0,5 ml av en kommersielt tilgjengelig anti-adhesjonsbuffer (se materialfortegnelse) og la dem lufttørke. Vask glassplatene en gang med etanol og la dem lufttørke.
- Fest en silikonplate klargjort i trinn 5.1.2 sikkert til midten av en glassplate, som illustrert i figur 4A.
- Klargjør prepolymer av polydimetylsiloksan (PDMS) i henhold til produsentens instruksjoner (se materialtabell). For hver PDMS-brikke veier du 10 g av basebestanddelen og 1 g av oppstrammende middel i et 50 ml sentrifugerør.
- Bland midlene grundig med en glassrørestang til små bobler er jevnt fordelt i kolloid. Blandingen tar 5-10 min, avhengig av kolloidvolumet. Sentrifuge kolloidprepolymeren i 1 min ved 500 x g (ved romtemperatur) for å eliminere bobler.
- Hell sakte ~ 10 ml av prepolymeren inn i hulrommet for å fylle PTFE-formen.
- Plasser formen forsiktig i en vakuumbeholder og hold den horisontal for å forhindre at prepolymeren strømmer bort.
- Fjern gjenværende luftbobler fra prepolymeren med en vakuumpumpe. Støvsugingen tar 120-180 min.
- Hell om nødvendig mer prepolymer for å fylle formhulen ytterligere. Vakuum i ytterligere 60 minutter.
- Dekk forsiktig PTFE-formen med glassplaten, med silikasiden mot hulrommet, som illustrert i figur 4Bi.
- Sørg for at alle bobler er eliminert. Overfør formen til en tørkeovn på 60 °C for at prepolymeren skal stivne over natten.
- Fjern formen fra ovnen. Etter avkjøling, demold det størknede PDMS-dekselet forsiktig. Lag et innløp og et utløp med en Φ1 mm nålestanser.
- Vask PDMS-dekselet og 24 mm × 50 mm dekselsklier i henhold til trinn 2.1.2.
MERK: Fortsett med følgende trinn under sterile forhold. - Fest et PDMS-deksel og et dekselglass for å lage en mikrofluidbrikke som inneholder en strømningskanal på omtrent ~ 500 μm i høyden. Undersiden skal bestå av et ~ 0,15 mm glassdeksel for å muliggjøre cellemønster med Mag-Arch-basert strategi.
- Monter kommersielt tilgjengelige sterile adaptere i både innløpet og utløpet til mikrovæskebrikken8.
- Forbered en 2% (w / v, oppløst i PBS) gelatinbeleggbuffer. Steriliser bufferen ved autoklavering.
- Injiser bufferen for gelatinbelegg inn i brikken via innløpsadapteren ved hjelp av en 1 ml sprøyte. Hvis bobler dukker opp, skyll dem ut med ekstra beleggbuffer.
- Plasser brikken i en 10 cm cellekulturfat. Tilsett 1 ml PBS rundt oppvaskbunnen for å unngå tørking. Overfør parabolen til en cellekulturinkubator. Belegget tar 30 min.
- Skyll ut beleggbufferen med 2 ml Gd-inneholdt medium (30 mM) via innløpet.
- Injiser forsiktig 1 ml cellesuspensjon inneholdende 30 ml Gd-DTPA med en 1 ml sprøyte.
- Mønsterceller som illustrert i trinn 2.2-2.3 ved hjelp av miniatyrsylindriske magneter fra trinn 1.2.
MERK: Det anbefales imidlertid å feste en silikonplate med en hul som passer magnetsettene til underoverflaten av glassglasset, som vist i figur 4Ci. - Etter mønster frisker du forsiktig opp det Gd-DTPA-holdige mediet med 1 ml komplett medium ved å skylle med en 1 ml sprøyte.
MERK: Prosessen med cellemønster i mikrofluidikk, fra trinn 5.7-5.9, tar omtrent 180 min, noe som ligner cellemønster på standard glasslysbilder. - Kvantifiser mønstrene under et mikroskop. Koble om nødvendig mikrofluidbrikken til en sirkulerende kulturanordning for videre dyrking.
MERK: Etter vår erfaring er celler i stand til å vokse i minst 72 timer når de støttes av en enkel mikropumpebasert enhet, som gir mikrofluidikken en kontinuerlig strøm av friskkulturmedium i en celleinkubator8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rektangulære (1,5 mm × 10 mm × 35 mm) og sylindriske (Φ1,5 m × 10 mm) magneter ble valgt for å lage cellemønstre som en demonstrasjon. Brukere har fleksibilitet til å endre størrelsen og formen på magneter eller sette dem sammen annerledes for å skape forskjellige cellemønstre. I figur 1A,B ble magnetene satt sammen, med de magnetiske polene avbildet i blått (sør) og rødt (nord) for klarhet. I denne konfigurasjonen tiltrekker magneter hverandre lateralt og justerer seg, som illustrert i figur 2. Figur 1C,D illustrerer strukturen til cellekulturenheten og cellemønsterprosedyren.
Figur 2 viser cellemønstre av monotypen. GFP-merkede HUVECs ble brukt til observasjon under et fluorescerende mikroskop. Cellene ble organisert i stripe og dot array mønstre ved hjelp av tilsvarende magnet sett. For HUVECs, som holder seg raskt til glassglass (innen 120-180 min), ble hele prosedyren fullført på 4 timer. Å følge protokollen resulterte i mønstre med veldefinerte kanter og høy ensartethet. For å bestemme levedyktigheten ble cellene behandlet med Gd-DTPA i 12 timer, noe som er mye lengre enn 3-6 timer i trinn 2. Imidlertid viste både levende/død farging og CCK8-analyse8 ingen signifikant reduksjon i cellelevedyktighet. En relativt høy konsentrasjon av Gd-DTPA (50 mM) induserte en statistisk forskjell, men bevarte likevel en leverate på 90,76 % ± 1,78 % (tilleggsfigur 1).
Ved å bygge på mono-type cellemønsterprotokollen ble det gitt eksempler på cellemønster av flere typer for potensielle samdyrkingsapplikasjoner. I dette scenariet ble HUVEC, A2780 eggstokkreftceller og glatte muskelceller (SMC) ansatt. For å skille mellom dem ble cellene merket med GFP, DiD og DiI før mønster. Ved å følge trinn 3 ble det generert et tredelt cellemønster av side-ved-side-striper (figur 3A). Omvendt ble trinn 4 brukt til å lage konsentriske punktmatriser ved å justere konsentrasjonen av Gd-DTPA (figur 3B). Det første laget av celler ble farget med DiI (rød) og mønstret med 50 mM Gd-DTPA, mens det andre laget av celler ble merket med GFP (grønn) og mønstret med 25 mM Gd-DTPA. Følgelig var punktstørrelsen på det første laget mindre, omgitt konsentrisk av det andre laget av prikkmønstrede celler. Ulike celletyper viste varierende tilknytnings- og spredningshastigheter, med HUVEC-er som festet seg og spredte seg raskt, A2780-er festet seg raskt, men spredte seg sakte, og SMC-er festet og spredte seg relativt sakte. Disse resultatene viste at ulike celletyper kunne danne cellemønstre i 3 timer og bli brukt i samkultureksperimenter.
Videre ble det demonstrert at cellemønster ved hjelp av et magnetfelt var kompatibelt med lukkede smale kulturenheter, for eksempel mikrofluidiske chips. Ved å følge trinn 5 ble mikrofluidiske chips fremstilt, og punktarrayer ble generert i dem (figur 4).
Figur 1: Oppsett og skjematisk diagram over mag-arch-basert cellemønster . (A) Montering av magnetsett for å lage stripecellemønstre. (B) Montering av magnetsett for generering av dot array-cellemønstre. (C) Oppsett av cellekulturenheten. (D) Trinnvis prosedyre for cellemønster. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Montering av enheter og mønster HUVECs i stripe og dot array mønstre. (A) Magnetsett begrenset i cellekulturenheter (i) og plassert i en cellekulturplate (ii). (B) og (C) Magnetsett og de tilsvarende cellemønstrene. Celler ble merket med grønt fluorescerende protein (GFP) for visualisering av cellemønsteret. Skala barer = 1,5 mm; innsatser = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Mønstre samkultursystemer med trinnvis strategi. (A) Samkultur mønstre ved hjelp av magnet sidelengs (i-iii). Celler ble merket med GFP (grønn), DiD (blå) og DiI (rød) for å skille forskjellige celletyper. Skalastenger = 1 mm. (B) Samkulturmønster oppnådd ved å justere Gd-DTPA-konsentrasjonen; (i) 50 mM, (ii) 20 mM. Skala barer = 1,5 mm; innsatser = 250 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Cellemønster i et mikrofluidisk kammer . (A) Skjematisk diagram over den mikrofluidiske formen. (B) Fabrikasjon av mikrofluidikk ved bruk av polydimetylsiloksan (PDMS) (i, ii). (C) Cellemønster i den mikrofluidiske enheten (i, ii) og et representativt resultat som viser dot array cellemønstre (iii). Cellene ble merket med grønt fluorescerende protein (GFP). Skala bar = 3 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Påvirkning av Gd-DTPA på cellelevedyktighet. HUVEC ble behandlet med varierende konsentrasjoner av Gd-DTPA i 12 timer og deretter utsatt for levende/død farging eller CCK-8-analyse. (A) Levende/død farging av HUVEC. Skalastenger = 200 μm. (B) Histogram som viser levende / døde fargeresultater. (C) Histogram som viser CCK-8-analyseresultater. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mag-Arch-basert cellemønster gir en brukervennlig løsning for de fleste biomedisinske laboratorier. Denne metoden utvikler seg parallelt med tegn uten blekk, etikettfri, substratuavhengig og muligheten for mønstermed høy gjennomstrømning 8,13. For mono-type cellemønster mønstrer det celler på en en-trinns måte. Prosedyren avsluttes ganske enkelt ved å forfriske kulturmedier.
Tidligere studier har brukt magnetiske partikler til å merke celler og tiltrekke dem med magneter for å danne presise mønstre14,15. Tilstedeværelsen av magnetiske partikler på celler reiste imidlertid bekymringer om potensielle effekter på celleadferd. Mag-Arch-basert cellemønster tar motsatt strategi ved å gjøre ekstracellulære væsker paramagnetiske, i stedet for celler. Denne strategien gjør det mye lettere å fjerne de ekstra paramagnetiske reagensene ved å oppdatere kulturmediet. Studier har generert cellulære sfærer og punktarrayer med Mag-Arch-basert cellemønster11,16. Sammenlignet med eksisterende Mag-Arch-baserte studier, kan metodene som presenteres av denne protokollen tilpasse formen på mønstre fritt. Videre presenterer protokollen strategier for å fabrikere samkultursystemer. Det har også vist seg å fungere inne i lukkede smale cellekulturkamre, som vi testet i mikrofluidikk.
I stedet for parallelle metoder, som krever profesjonelt bioprintingsutstyr17, tilpassede maler 18 eller overflatemodifisering av kompleks19, krever den Mag-Arch-baserte metoden bare to nødvendigheter: magneter og GBCA. Overflaten på magnetmønsteret bestemmer cellemønsteret omvendt. Flere mønstre av striper og prikkarrayer som grunnleggende ble demonstrert. Brukere kan generere mønstre i frihet med forskjellige former for magnetsett, som er rikelig kommersielt tilgjengelige. For å oppnå et ideelt resultat anbefales det å ta i bruk magneter som gir tilstrekkelig magnetisk kraft. I vår praksis vedtok vi N52 neodym-jern-bormagneter, hvis remanens var over 1430 mT og overflatemagnetisme var over 100 mT på poler. For GBCA ble Gd-DTPA vedtatt fordi den er stabil i fysiologiske forhold og billig tilgjengelig i de fleste land og områder. Andre GBCAer kan vedtas alternativt. Makrosykliske ikke-ioniske GBCAer, som gadobutrol og gadoteridol, kan være et bedre valg for lavere cytotoksisitet ved mønster av sårbare celler for langvarig behandling11,12.
Begrensningen av Mag-Arch-basert cellemønster ligger hovedsakelig i arbeidsområdet til magnetfeltet generert av magneter. Etter den inverse kvadratformelen reduseres magnetfeltet kraftig med avstand8. Som en konsekvens klarer ikke Mag-Arch-metoden å samle ideelle cellemønstre på generelle polystyrencellekulturfat eller plater, hvis bunner er tykkere enn 1 mm. Dermed må protokollen fungere på tynnere cellekulturoverflater, for eksempel glassglass eller konfokale cellekulturretter. Ved mønster inne i mikrofluidikk kreves det også at de nederste lysbildene av mikrofluidikk skal være tynnere enn 0,5 mm. For å etablere kokultursystemer kan metoden være tidkrevende, for hver ekstra celletype øker tiden med 3-6 timer for celletilknytning.
Samlet sett gir denne protokollen en forenklet måte for cellemønster, som kan replikeres i de fleste laboratorier uten noe spesielt utstyr. Brukere kan vedta det som et kraftig verktøy for å studere celleadferd, etterligne flercellede mikromiljøer eller teste celleaffiniteten til biomaterialer8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne studien støttes økonomisk av National Key R &D Program of China (2021YFA1101100), National Natural Science Foundation of China (32000971), Fundamental Research Funds for the Central Universities (nr. 2021FZZX001-42), og Starry Night Science Fund of Zhejiang University Shanghai Institute for Advanced Study (Grant nr. SN-ZJU-SIAS-004).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A2780 ovarian cancer cells | Procell | CL-0013 | |
| Cell culture medium (DMEM, high glucose) | Gibco | 11995040 | |
| Cover slides | Citotest Scientific | 80340-3610 | For fabricating microfluidics. Dimension: 24 mm × 50 mm |
| DiD | MedChemExpress (MCE) | HY-D1028 | For labeling cells with red fluorescence (Ex: 640 nm) |
| DiI | MedChemExpress (MCE) | HY-D0083 | For labeling cells with orange fluorescence (Ex: 550 nm) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochannel | BC-SE-FBS07 | |
| Gadopentetate dimeglumine (Gd-DTPA) | Beijing Beilu Pharmaceutical | H10860002 | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | V900863 | |
| Glass cell slides | Citotest Scientific | 80346-2510 | Diameter: 25 mm; thickness: 0.19-0.22 mm |
| Glass plates | PURESHI hardware store | For fabricating microfluidics. Dimension: 40 mm × 75 mm | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) | Servicebio | STCC12103G-1 | |
| Neodymium-iron-boron magnets (N52) | Lalaci | ||
| Non-toxic glass plate coating (Gel Slick Solution) | Lonza | 1049286 | For convenience of demolding when fabricating microfluidics |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Servicebio | G4200 | |
| Plasma cleaner | SANHOPTT | PT-2S | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | DOWSIL | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | For fabricating microfluidics |
| Polytetrafluoroethylene (PFTE) mold | PURESHI hardware store | Customized online, for fabricating microfluidics | |
| Silicon plate | PURESHI hardware store | ||
| Smooth Muscle Cells (SMC) | Procell | CL-0517 | |
| Ultrasonic cleaner | Sapeen | CSA-02 |
References
- Christian, J., et al. Control of cell adhesion using hydrogel patterning techniques for applications in traction force microscopy. J Vis Exp. 179, e63121 (2022).
- Abbas, Y., Turco, M. Y., Burton, G. J., Moffett, A. Investigation of human trophoblast invasion in vitro. Hum Reprod Update. 26 (4), 501-513 (2020).
- Park, M., et al. Modulation of heterotypic and homotypic cell-cell interactions via zwitterionic lipid masks. Adv Healthc Mater. 6 (15), 1700063 (2017).
- Ren, T., Chen, P., Gu, L., Ogut, M. G., Demirci, U. Soft ring-shaped cellu-robots with simultaneous locomotion in batches. Adv Mater. 32 (8), e1905713 (2020).
- Ren, T., Steiger, W., Chen, P., Ovsianikov, A., Demirci, U. Enhancing cell packing in buckyballs by acoustofluidic activation. Biofabrication. 12 (2), 025033 (2020).
- Ge, S., et al. Magnetic levitation in chemistry, materials science, and biochemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 59 (41), 17810-17855 (2020).
- Puluca, N., et al. Levitating cells to sort the fit and the fat. Adv Biosyst. 4 (6), e1900300 (2020).
- Ren, T., et al. Programing cell assembly via ink-free, label-free magneto-archimedes based strategy. ACS Nano. 17 (13), 12072-12086 (2023).
- Li, Y. C., et al. Programmable laser-assisted surface microfabrication on a poly(vinyl alcohol)-coated glass chip with self-changing cell adhesivity for heterotypic cell patterning. ACS Appl Mater Interfaces. 7 (40), 22322-22332 (2015).
- Chliara, M. A., Elezoglou, S., Zergioti, I. Bioprinting on organ-on-chip: Development and applications. Biosensors (Basel). 12 (12), 1135 (2022).
- Moncal, K. K., Yaman, S., Durmus, N. G. Levitational 3D bioassembly and density-based spatial coding of levitoids. Adv Funct Mater. 32 (50), 2204092 (2022).
- Parfenov, V. A., et al. Magnetic levitational bioassembly of 3D tissue construct in space. Sci Adv. 6 (29), eaba4174 (2020).
- Dell, A. C., Wagner, G., Own, J., Geibel, J. P. 3D bioprinting using hydrogels: Cell inks and tissue engineering applications. Pharmaceutics. 14 (12), 2596 (2022).
- Ino, K., Ito, A., Honda, H. Cell patterning using magnetite nanoparticles and magnetic force. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1309-1317 (2007).
- Okochi, M., Matsumura, T., Honda, H. Magnetic force-based cell patterning for evaluation of the effect of stromal fibroblasts on invasive capacity in 3d cultures. Biosens Bioelectron. 42, 300-307 (2013).
- Mishriki, S., et al. Rapid magnetic 3D printing of cellular structures with mcf-7 cell inks. Research (Wash D C). 2019, 9854593 (2019).
- Ozturk-Oncel, M. O., Leal-Martinez, B. H., Monteiro, R. F., Gomes, M. E., Domingues, R. M. A. A dive into the bath: Embedded 3D bioprinting of freeform in vitro models. Biomater Sci. 11, 5462-5473 (2023).
- Sahni, G., Yuan, J., Toh, Y. C. Stencil micropatterning of human pluripotent stem cells for probing spatial organization of differentiation fates. J Vis Exp. 112, e54097 (2016).
- Joddar, B., et al. Engineering approaches for cardiac organoid formation and their characterization. Transl Res. 250, 46-67 (2022).
