Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine tintenfreie, markierungsfreie, substratunabhängige Hochdurchsatz-Zellstrukturierungsmethode, die auf dem magnetischen Archimedes-Effekt basiert.
Abstract
Die Zellstrukturierung, die eine präzise Kontrolle der Zellpositionierung ermöglicht, stellt einen einzigartigen Vorteil bei der Untersuchung des Zellverhaltens dar. In diesem Protokoll wird eine Zellstrukturierungsstrategie eingeführt, die auf dem Magnetic-Archimedes-Effekt (Mag-Arch) basiert. Dieser Ansatz ermöglicht eine präzise Steuerung der Zellverteilung ohne den Einsatz von Tintenmaterialien oder Markierungspartikeln. Durch das Einbringen eines paramagnetischen Reagenzes zur Verbesserung der magnetischen Suszeptibilität des Zellkulturmediums werden die Zellen von Magneten abgestoßen und ordnen sich in einem Muster an, das komplementär zu den Magnetsätzen ist, die unter dem mikrofluidischen Substrat positioniert sind.
In diesem Artikel werden detaillierte Verfahren für die Zellstrukturierung mit der Mag-Arch-basierten Strategie vorgestellt. Es werden Methoden zur Strukturierung von Einzelzelltypen sowie von Mehrfachzelltypen für Co-Kulturexperimente angeboten. Darüber hinaus werden umfassende Anweisungen für die Herstellung von mikrofluidischen Geräten bereitgestellt, die Kanäle für die Zellstrukturierung enthalten. Das Erreichen dieser Funktion mit parallelen Methoden ist eine Herausforderung, kann aber auf vereinfachte und kostengünstige Weise durchgeführt werden. Durch den Einsatz von Mag-Arch-basierter Zellstrukturierung erhalten Forscher ein leistungsstarkes Werkzeug für die In-vitro-Forschung .
Introduction
Die Zellstrukturierung entwickelt sich zu einer intuitiven und leistungsstarken Technologie für In-vitro-Studien 1. Durch die Manipulation von Zellpositionen in Kulturplatten bietet es Lösungen für eine Vielzahl von Experimenten, darunter Zellmigration2, biomimetische multizelluläre Co-Kultur3, Organoid-Assemblierung4, Biomaterialstudien5 und mehr. In den meisten Fällen wird eine tinten- und markierungsfreie Methode für die Zellstrukturierung bevorzugt, da sie eine einfache Bedienung und eine hohe Zellviabilität für nachfolgende Untersuchungen bietet.
Der Mag-Arch-Effekt ist ein physikalisches Phänomen, bei dem diamagnetische Objekte in paramagnetischen Flüssigkeiten dazu neigen, sich in Bereiche mit schwachen Magnetfeldern zu bewegen6. Lebende Zellen sind von Natur aus diamagnetisch, während Zellkulturmedien paramagnetisch gemacht werden können, indem lösliche paramagnetische Elemente hinzugefügt werden, wie z. B. Gadopentetat-Dimeglumin (Gd-DTPA), das üblicherweise intravenös in der Kernspintomographie als Kontrastmittel verwendet wird7. Folglich wird erwartet, dass Zellen vom umgebenden paramagnetischen Medium abgestoßen werden und sich in Regionen bewegen, in denen die Magnetfelder schwächer sind8. Ein strukturiertes Magnetfeld kann leicht mit einem Satz Neodym-Magnete erzeugt werden. Im Idealfall werden die Zellmuster entgegengesetzt zu den Magnetmustern aufgebaut. Technisch gesehen handelt es sich um eine markierungsfreie Methode, da das einzige zusätzliche Reagenz, Gd-DTPA, in der extrazellulären Umgebung verbleibt und nicht an Zellen bindet. So können potentielle Einflüsse auf die nachfolgende Zellkultur durch den Austausch des Nährmediums leicht vermieden werden. Im Vergleich zu anderen Methoden 1,3,9,10 erfordert die Mag-Arch-basierte Strategie keine Biotintenkomponenten oder die Anwendung spezifischer Partikel, um die Zellen positiv zu markieren. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass es auf mehreren Substraten für die Zelladhäsion funktioniert und in der Lage ist, Zellmuster mit hohem Durchsatzzu erzeugen 4.
In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll für die Zellstrukturierung mit der Mag-Arch-basierten Methode vorgestellt, das alles von der Herstellung des Geräts bis zur Anpassung des Zellmusters abdeckt. Zusätzlich zu den Mustern, die wir demonstriert haben, können Benutzer mit Magneten und der Gd-DTPA-Lösung problemlos verschiedene Zellmuster erstellen. Darüber hinaus werden Protokolle für die Assemblierung komplexer Co-Kulturmuster und die Manipulation von Zellen in geschlossenen Mikrofluidik-Chips bereitgestellt.
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Protocol
1. Zusammenbau der Magnetsets
- Montieren Sie die Magnet-Sets für Streifenmuster.
- Wählen Sie flache rechteckige Magnete, wie in Abbildung 1A dargestellt. Die Abmessungen der für diese Demonstration verwendeten Rechteckmagnete betragen 1,5 mm × 10 mm × 35 mm (Dicke × Höhe × Länge) (siehe Materialtabelle). Die Dicke der Magnete bestimmt die Lücken zwischen den Zellstreifen.
- 2 mm dicke Silikonplatten (siehe Materialtabelle) in 2 mm × 8 mm × 30 mm Rechtecke schneiden. Achten Sie darauf, dass die letzten beiden Abmessungen dieser Silikonplatten etwas kleiner sind als die der oben genannten rechteckigen Magnete, um die Montage zu optimieren. Die Dicke der Silikonplatten bestimmt die Breite der Zellstreifen.
- Montieren Sie die rechteckigen Magnete und die Silikonplatten Schicht für Schicht, wie in Abbildung 1A dargestellt. Jedes Magnetset besteht aus 4 Magneten und 3 Silikonplatten. Stellen Sie sicher, dass die Pole jedes benachbarten Magneten entgegengesetzt sind, damit sich die Magnetsätze aufgrund der intrinsischen Anziehungskraft automatisch ausrichten können.
- Sterilisieren Sie die Magnete vor dem Gebrauch.
HINWEIS: Es wird empfohlen, die Magnetsets mit reinem Wasser zu waschen und dann 10 Minuten lang in 75%iges Ethanol zu tauchen. Die Gesamtabmessungen dieser Magnetsets betragen 12 mm × 10 mm × 35 mm und sind für Standard-6-Well-Zellkulturplatten ausgelegt.
- Zusammenstellen der Magnet-Sets für Punkt-Array-Muster
- Wählen Sie zylindrische Miniaturmagnete, wie in Abbildung 1B dargestellt. Die Abmessungen der für diese Demonstration verwendeten zylindrischen Magnete betragen Φ1,5 mm × 10 mm (Durchmesser × Höhe), die in axialer Richtung magnetisiert sind.
- Montieren Sie die zylindrischen Magnete wie in Abbildung 1B gezeigt. Stellen Sie sicher, dass jedes Magnetset aus 36 zylindrischen Magneten besteht, die in einem 6×6-Raster angeordnet sind. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Pole jedes benachbarten Magneten entgegengesetzt sind, damit sich die Magnetsätze aufgrund der intrinsischen Anziehungskraft automatisch ausrichten können.
- Sterilisieren Sie die Magnete vor dem Gebrauch nach dem gleichen Verfahren wie in Schritt 1.1.4. Die Gesamtabmessungen dieser Magnetsets betragen 9 mm × 10 mm × 9 mm und sind für Standard-6-Well-Zellkulturplatten ausgelegt.
2. Zellstrukturierung auf Objektträgern
- Bereiten Sie das Zellkulturgerät vor.
- Verwenden Sie 2 mm dicke Silikonplatten, um Silikonformen herzustellen. Verwende einen Stanzer, um ein 1 cm × 1 cm großes rechteckiges Loch in die Platte zu bohren. Schneiden Sie die Silikonplatte um das Loch herum, um eine runde Form (Durchmesser = 25 mm) mit dem Loch in der Mitte herzustellen, wie in Abbildung 1C dargestellt.
- Reinigen Sie die Silikonformen gründlich mit einem Ultraschallreiniger. Sterilisieren Sie die Formen, indem Sie sie 10 Minuten lang mit reinem Wasser waschen und anschließend das Wasser für weitere 10 Minuten durch 75%iges Ethanol ersetzen. Zum Schluss trocknen Sie die Formen in einer Sterilisatorbox bei 65 °C für 60 min.
- Befestigen Sie die sterilisierte Silikonform an einem runden Glaszellenträger mit einem Durchmesser von 25 mm und drücken Sie ihn vorsichtig an, damit das Silikon am Glas haftet, wie in Abbildung 1C gezeigt. Das resultierende Zellkulturgerät wird eine Glasunterseite und einen 200 μL Kulturhohlraum haben. Die Abmessungen des Geräts betragen Φ25 mm × 2,15 mm, wodurch es für Standard-6-Well-Zellkulturplatten geeignet ist.
HINWEIS: Das oben beschriebene Zellkulturgerät kann durch andere Petrischalen mit Unterseiten ersetzt werden, die dünner als 0,5 mm sind, wie z. B. konfokale Schalen. - Platzieren Sie die Magnetsets auf einer 6-Well-Platte. Nichtmagnetische Pinzetten werden empfohlen, um die Bedienung zu erleichtern.
HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte sollten von diesem Zeitpunkt an bis zur Beobachtung der Zellmuster unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. - Positionieren Sie das Zellkulturgerät auf dem Magneten in der Vertiefung der 6-Well-Platte. Stellen Sie sicher, dass das Zellkulturgerät waagerecht aufgestellt ist und die Unterseite in engem Kontakt mit dem Magnetset steht.
- Bereiten Sie das Gd-DTPA-haltige Zellkulturmedium vor
- Herstellen einer handelsüblichen Gd-DTPA-Injektion (siehe Materialtabelle), in der Regel mit einer Konzentration von 500 mM. Verdünnen Sie die Injektion, indem Sie 30 μl Gd-DTPA-Injektion zu 470 μl vollständigem Zellkulturmedium hinzufügen, um eine Zielkonzentration von 30 mM zu erreichen.
HINWEIS: Abhängig von den örtlichen Vorschriften und der Verfügbarkeit können andere gadoliniumbasierte Kontrastmittel (GBCAs) mit der gleichen Zielkonzentration zu ähnlichen Ergebnissen führen11.
- Herstellen einer handelsüblichen Gd-DTPA-Injektion (siehe Materialtabelle), in der Regel mit einer Konzentration von 500 mM. Verdünnen Sie die Injektion, indem Sie 30 μl Gd-DTPA-Injektion zu 470 μl vollständigem Zellkulturmedium hinzufügen, um eine Zielkonzentration von 30 mM zu erreichen.
- Erstellen Sie die Zellenmuster.
- Ernten Sie Zellen für die Musterung. In dieser Demonstration wurden humane Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs, siehe Materialtabelle) für die Musterung verwendet (Abbildung 2). Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 Minuten bei 200 x g (bei Raumtemperatur), um sie aus der Suspension zu sammeln, und resuspendieren Sie sie in dem Gd-DTPA-haltigen Medium. Zählen Sie die Zelldichte.
- Stellen Sie die Zelldichte auf ca. ~2 ×10 5 Zellen/ml mit Gd-DTPA-haltigem Medium ein. Mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig und geben Sie 200 μl in den Hohlraum jeder Zellkulturform, um eine randvolle flüssige Oberfläche zu schaffen.
- Die Platte vorsichtig in einen Zellkultur-Inkubator überführen und 3-6 h inkubieren, bis die Zellen gut am Substrat haften. Vermeiden Sie es, die Tür des Inkubators zuzuschlagen, um Interferenzen mit dem Zusammenbau von Zellmustern zu vermeiden. Bei Zellen mit schlechten Adhäsionsraten ist die Behandlung über Nacht mit GBCAs im Allgemeinen sicher12.
- Die Zellstrukturierung gilt als abgeschlossen, wenn die Zellen am Boden des Hohlraums des Zellkulturgeräts haften. Ersetzen Sie das Gd-DTPA-haltige Medium durch ein vollständiges Nährmedium.
- Nehmen Sie das Zellkulturgerät aus dem Magnetset. Man kann das Zellmuster entweder sofort beobachten oder das Gerät zur weiteren Kultivierung in eine neue Kulturplatte übertragen.
3. Co-Kultur-Musterung durch seitlichen Magneten: Herstellung der beweglichen Schablone
HINWEIS: Das folgende Verfahren wird vorgestellt, um die Vorteile der Mag-Arch-basierten Zellstrukturierung zu nutzen und die Möglichkeit weiterer Anwendungen zu untersuchen.
- Bereiten Sie das Gerät gemäß Schritt 1 und Schritt 2 für die Musterung von Streifenzellen vor. Reduzieren Sie jedoch die Zelldichte auf 1 × 105 Zellen/ml und ersetzen Sie die Silikonplatten, die die Magnete trennen, durch dünnere, wodurch jedes Streifenzellmuster dünner wird.
HINWEIS: Dies bietet ausreichend Fläche, um mehrere Zellen in Streifenmustern zu verlegen. Als Referenz empfehlen wir, 1 mm Silikonplatten anstelle von 2 mm zu verwenden, um die Magnete zu trennen. - Erstellen Sie ein Muster für den ersten Zelltyp, wie in den Schritten 2.2 bis 2.3 dargestellt. Auch dieser Schritt benötigt 3-6 h für die Zellanhaftung.
HINWEIS: Um verschiedene Zelltypen im Co-Kultursystem zu unterscheiden, können Benutzer Zellen vor der Strukturierung mit Fluoreszenzfarbstoffen wie DiI, DiD oder Zelltrackern (CMTPX, CMFDA, CMMAC usw.) markieren. Für die DiI- und DiD-Färbung fügen Sie beispielsweise 1 μl der Stammlösung (10 mM) (siehe Materialtabelle) pro 1 ml FBS-freies Medium hinzu und mischen Sie es gut, um eine Arbeitslösung zu erhalten. Ersetzen Sie das Nährmedium durch die Arbeitslösung, um adhärente Zellen zu bedecken. Nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten und dreimaligem Waschen mit PBS fahren Sie mit der Zellernte fort. - Nachdem Sie den ersten Zelltyp strukturiert haben, bewegen Sie das Zellkulturgerät 1 mm von den Magneten unten nach rechts, wie in Abbildung 3Aii dargestellt.
- Waschen Sie die Objektträger vorsichtig zweimal mit 200 μl PBS. Vermeiden Sie es, die Objektträger trocknen zu lassen.
- Mustern Sie den zweiten Zelltyp auf die gleiche Weise wie in den Schritten 2.2 bis 2.3 dargestellt.
- Bewegen Sie das Zellkulturgerät 1 mm von den Magneten unten nach rechts, wie in Abbildung 3Aiii dargestellt, und waschen Sie die Objektträger erneut mit 200 μl PBS. Mustern Sie den dritten Zelltyp auf die gleiche Weise wie in den Schritten 2.2 bis 2.3 dargestellt.
- Nachdem Sie alle Arten von Zellen strukturiert haben, waschen Sie die Objektträger vorsichtig zweimal mit 200 μl PBS und ersetzen Sie sie durch ein vollständiges Zellkulturmedium.
- Nehmen Sie das Zellkulturgerät aus dem Magnetset. Man kann dann das Zellmuster beobachten oder das Gerät zur weiteren Kultivierung auf eine neue Kulturplatte übertragen.
4. Co-Kultur-Patterning durch Anpassung der Gd-DTPA-Konzentration
HINWEIS: GBCAs haben keinen signifikanten Einfluss auf die Zelladhäsion oder das anschließende Wachstum bei Arbeitskonzentrationen (≤75 mM). Zusätzlich werden die Zellmuster durch die Konzentration von Gd-DTPA beeinflusst: Höhere Konzentrationen führen zu kleineren/dünneren Zellmustern. So ist es möglich, Co-Kultursysteme zu schaffen, indem einfach die Konzentration von Gd-DTPA angepasst wird. In diesem Beispiel wird die Strukturierung konzentrischer kreisförmiger Arrays veranschaulicht.
- Strukturieren Sie den ersten Zelltyp, wie in den Schritten 2.2-2.3 dargestellt, mit zylindrischen Miniaturmagneten aus Schritt 1.2. Markieren Sie die Zellen vor der Ernte mit Fluoreszenzfarbstoffen wie DiI, DiD oder Zelltrackern (siehe Schritt 3), um verschiedene Zelltypen im Co-Kultursystem zu unterscheiden.
HINWEIS: Man benötigt eine höhere Konzentration von Gd-DTPA (50 mM statt 30 mM) und eine geringere Zelldichte, etwa 1 × 105 Zellen/ml. - Nachdem Sie das erste Zellarray strukturiert haben, waschen Sie die Objektträger vorsichtig zweimal mit 200 μl PBS. Vermeiden Sie es, die Objektträger trocknen zu lassen.
- Mustern Sie den zweiten Zelltyp nach dem gleichen Verfahren wie zuvor. Halten Sie die Objektträger relativ bewegungslos auf den Magneten, um ein Verrutschen zu vermeiden. Es wird empfohlen, eine Silikonplatte mit einem Hohlraum, der zu den Magnetsets passt, an der Unterseite des Objektträgers anzubringen.
HINWEIS: Hier wird eine niedrigere Konzentration von Gd-DTPA (20 mM statt 30 mM) benötigt, so dass erwartet wird, dass die zweiten Zellmuster größer sind als die ersten, wie in Abbildung 3B dargestellt. - Nachdem Sie alle Zelltypen strukturiert haben, waschen Sie die Objektträger vorsichtig zweimal mit 200 μl PBS und ersetzen Sie das Medium durch ein vollständiges Zellkulturmedium.
- Nehmen Sie das Zellkulturgerät aus dem Magnetset. Man kann dann das Zellmuster beobachten oder das Gerät zur weiteren Kultivierung auf eine neue Kulturplatte übertragen.
5. Zellstrukturierung in einem mikrofluidischen Chip
HINWEIS: Die Mag-Arch-basierte Methode hat in unserer vorherigen Studie8 gezeigt, dass sie in geschlossenen engen Kammern funktioniert. Hier ist ein Beispiel für die Strukturierung von Punktarrays in einem mikrofluidischen Kanal.
- Herstellung des Mikrofluid-Chips
- Passen Sie Formen aus Polytetrafluorethylen (PTFE) mit einem Durchmesser von 40 mm × 75 mm × 20 mm (siehe Materialtabelle) mit einem rechteckigen Hohlraum von 24 mm × 50 mm × 8 mm an, wie in Abbildung 4A dargestellt.
- Eine 0,5 mm dicke Silikonplatte flach drücken. Schneiden Sie die Silikonplatten entsprechend der Form des Flüssigkeitskanals zu, der einen rechteckigen Hohlraum von 15 mm × 20 mm × 0,5 mm mit dreieckigen Pufferbereichen sowohl auf der Einlass- als auch auf der Auslassseite hat, wie in Abbildung 4A,B dargestellt.
- Passen Sie 40 mm × 75 mm rechteckige Glasplatten an. Reinigen Sie die Glasplatten 30 s lang mit Luftplasma.
- Unmittelbar nach der Luftplasmareinigung die Glasplatten mit 0,5 mL eines handelsüblichen Antihaftpuffers (siehe Materialtabelle) abdecken und an der Luft trocknen lassen. Waschen Sie die Glasplatten einmal mit Ethanol und lassen Sie sie an der Luft trocknen.
- Eine in Schritt 5.1.2 vorbereitete Silikonplatte wird sicher an der Mitte einer Glasplatte befestigt, wie in Abbildung 4A dargestellt.
- Polydimethylsiloxan (PDMS)-Prepolymer gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereiten (siehe Materialtabelle). Für jeden PDMS-Chip werden 10 g des Basisbestandteils und 1 g des Festigungsmittels in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen eingewogen.
- Mischen Sie die Mittel gründlich mit einem Glasrührstab, bis kleine Bläschen gleichmäßig im Kolloid verteilt sind. Das Mischen dauert je nach Kolloidvolumen 5-10 min. Zentrifugieren Sie das Kolloid-Prepolymer 1 Minute lang bei 500 x g (bei Raumtemperatur), um Blasen zu entfernen.
- Gießen Sie langsam ~10 ml des Prepolymers in den Hohlraum, um die PTFE-Form zu füllen.
- Stellen Sie die Form vorsichtig in ein Vakuumreservoir und halten Sie es waagerecht, um zu verhindern, dass das Prepolymer abfließt.
- Restluftblasen mit einer Vakuumpumpe aus dem Prepolymer entfernen. Das Staubsaugen dauert 120-180 min.
- Gießen Sie bei Bedarf mehr Prepolymer ein, um den Formhohlraum weiter zu füllen. Weitere 60 Min. vakuumieren.
- Decken Sie die PTFE-Form vorsichtig mit der Glasplatte ab, wobei die Silica-Seite zum Hohlraum zeigt, wie in Abbildung 4Bi dargestellt.
- Stellen Sie sicher, dass alle Blasen beseitigt sind. Die Form in einen 60 °C heißen Trockenschrank geben, damit das Prepolymer über Nacht erstarrt.
- Die Form aus dem Ofen nehmen. Nach dem Abkühlen die erstarrte PDMS-Abdeckung vorsichtig abformen. Erstellen Sie einen Einlass und einen Auslass mit einem Nadellocher von Φ1 mm.
- Waschen Sie die PDMS-Abdeckung und die 24-mm- × 50-mm-Folien gemäß Schritt 2.1.2.
HINWEIS: Fahren Sie mit den folgenden Schritten unter sterilen Bedingungen fort. - Bringen Sie eine PDMS-Abdeckung und einen Abdeckschieber an, um einen Mikrofluid-Chip mit einem Strömungskanal von ca. ~500 μm Höhe zu erstellen. Die Unterseite sollte aus einem ~0,15 mm großen Glasabdeckobjektträger bestehen, um die Zellstrukturierung mit der Mag-Arch-basierten Strategie zu ermöglichen.
- Montieren Sie handelsübliche sterile Adapter sowohl in den Einlass als auch in den Auslass des Mikrofluid-Chips8.
- Bereiten Sie einen 2%igen Gelatinebeschichtungspuffer (w/v, gelöst in PBS) vor. Sterilisieren Sie den Puffer durch Autoklavieren.
- Injizieren Sie den Gelatinebeschichtungspuffer über den Einlassadapter mit einer 1-ml-Spritze in den Chip. Wenn Blasen entstehen, spülen Sie sie mit einem zusätzlichen Beschichtungspuffer aus.
- Legen Sie den Chip in eine 10 cm große Zellkulturschale. Geben Sie 1 ml PBS um den Boden der Schale herum, um ein Austrocknen zu vermeiden. Bringen Sie die Schale in einen Zellkultur-Inkubator. Die Beschichtung dauert 30 min.
- Spülen Sie den Beschichtungspuffer mit 2 mL Gd-haltigem Medium (30 mM) über den Einlass aus.
- Injizieren Sie vorsichtig 1 ml Zellsuspension mit 30 mM Gd-DTPA mit einer 1-ml-Spritze.
- Musterzellen wie in den Schritten 2.2-2.3 dargestellt unter Verwendung von zylindrischen Miniaturmagneten aus Schritt 1.2.
HINWEIS: Es wird jedoch empfohlen, eine Silikonplatte mit einem Hohlraum anzubringen, der die Magnetsätze an der Unterseite des Glasobjektträgers anbringt, wie in Abbildung 4Ci gezeigt. - Nach der Strukturierung wird das Gd-DTPA-haltige Medium vorsichtig mit 1 ml vollständigem Medium durch Spülen mit einer 1-ml-Spritze aufgefrischt.
HINWEIS: Der Prozess der Zellstrukturierung in der Mikrofluidik aus den Schritten 5.7-5.9 dauert etwa 180 Minuten, was der Zellstrukturierung auf Standard-Glasobjektträgern ähnelt. - Quantifizieren Sie die Muster unter dem Mikroskop. Schließen Sie den Mikrofluid-Chip bei Bedarf an ein zirkulierendes Kulturgerät für die weitere Kultivierung an.
ANMERKUNG: Unserer Erfahrung nach sind Zellen in der Lage, mindestens 72 Stunden lang zu wachsen, wenn sie von einem einfachen Mikropumpen-basierten Gerät unterstützt werden, das die Mikrofluidik mit einem kontinuierlichen Fluss von frischem Kulturmedium in einem Zellinkubator8 versorgt.
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Representative Results
Zur Demonstration wurden rechteckige (1,5 mm × 10 mm × 35 mm) und zylindrische (Φ1,5 m × 10 mm) Magnete ausgewählt, um Zellmuster zu erzeugen. Benutzer haben die Flexibilität, die Größe und Form von Magneten zu ändern oder sie anders zusammenzusetzen, um verschiedene Zellmuster zu erstellen. In Abbildung 1A,B wurden die Magnete zusammengebaut, wobei die magnetischen Pole der Übersichtlichkeit halber blau (Süden) und rot (Norden) dargestellt sind. In dieser Konfiguration ziehen sich die Magnete seitlich an und richten sich aus, wie in Abbildung 2 dargestellt. 1C,D veranschaulicht den Aufbau der Zellkulturvorrichtung und das Zellstrukturierungsverfahren.
Abbildung 2 zeigt monotypisierte Zellmuster. GFP-markierte HUVECs wurden für die Beobachtung unter dem Fluoreszenzmikroskop verwendet. Die Zellen wurden mit Hilfe entsprechender Magnetsätze in Streifen- und Punkt-Array-Mustern organisiert. Bei HUVECs, die schnell auf Objektträgern haften (innerhalb von 120-180 min), war die gesamte Prozedur in 4 h abgeschlossen. Die Befolgung des Protokolls führte zu Mustern mit klar definierten Kanten und hoher Gleichmäßigkeit. Um die Viabilität zu bestimmen, wurden die Zellen 12 h lang mit Gd-DTPA behandelt, was deutlich länger ist als 3-6 h in Schritt 2. Sowohl die Lebend/Tot-Färbung als auch der CCK8-Assay8 zeigten jedoch keine signifikante Abnahme der Zelllebensfähigkeit. Eine relativ hohe Konzentration von Gd-DTPA (50 mM) induzierte einen statistischen Unterschied, behielt aber immer noch eine Lebensrate von 90,76 % ± 1,78 % (Ergänzende Abbildung 1).
Aufbauend auf dem Monotyp-Zellstrukturierungsprotokoll wurden Multityp-Zellmusterungsbeispiele für potenzielle Co-Kultivierungsanwendungen bereitgestellt. In diesem Szenario wurden HUVECs, A2780-Ovarialkarzinomzellen und glatte Muskelzellen (SMCs) verwendet. Zur Unterscheidung wurden die Zellen vor der Musterung mit GFP, DiD und DiI markiert. Durch Befolgen von Schritt 3 wurde ein dreiteiliges Zellmuster von nebeneinander liegenden Streifen erzeugt (Abbildung 3A). Umgekehrt wurde Schritt 4 verwendet, um konzentrische Punktarrays zu erzeugen, indem die Konzentration von Gd-DTPA angepasst wurde (Abbildung 3B). Die erste Zellschicht wurde mit DiI (rot) gefärbt und mit 50 mM Gd-DTPA gemustert, während die zweite Zellschicht mit GFP (grün) markiert und mit 25 mM Gd-DTPA gemustert wurde. Folglich war die Punktgröße der ersten Schicht kleiner und konzentrisch von der zweiten Schicht punktförmiger Zellen umgeben. Verschiedene Zelltypen wiesen unterschiedliche Anheftungs- und Ausbreitungsraten auf, wobei HUVECs sich schnell anhefteten und ausbreiteten, A2780 sich schnell, aber langsamer ausbreiteten, und SMCs relativ langsam andockten und sich ausbreiteten. Diese Ergebnisse zeigten, dass verschiedene Zelltypen in 3 h Zellmuster bilden und in Co-Kultur-Experimenten verwendet werden können.
Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Zellstrukturierung unter Verwendung eines Magnetfeldes mit geschlossenen Schmalkulturgeräten, wie z.B. Mikrofluidik-Chips, kompatibel ist. Im folgenden Schritt 5 wurden mikrofluidische Chips hergestellt und in ihnen Punktarrays erzeugt (Abbildung 4).
Abbildung 1: Aufbau und schematische Darstellung der Magnetbogen-basierten Zellstrukturierung . (A) Zusammenstellung von Magnetsätzen zur Erzeugung von Streifenzellmustern. (B) Zusammenstellung von Magnetsätzen zur Erzeugung von Punkt-Array-Zellmustern. (C) Einrichtung des Zellkulturgeräts. (D) Schritt-für-Schritt-Verfahren für die Zellstrukturierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Zusammenbau von Bauelementen und Strukturierung von HUVECs in Streifen- und Punktarray-Mustern . (A) Magnetsätze, die in Zellkulturgeräten (i) eingeschlossen und in einer Zellkulturplatte (ii) platziert sind. (B) und (C) Magnetsätze und die entsprechenden Zellmuster. Die Zellen wurden mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) markiert, um das Zellmuster zu visualisieren. Maßstabsbalken = 1,5 mm; Einschübe = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Strukturierung von Co-Kultursystemen mit Schritt-für-Schritt-Strategie. (A) Co-Kultur-Strukturierung unter Verwendung von Magneten seitlich (i-iii). Die Zellen wurden mit GFP (grün), DiD (blau) und DiI (rot) markiert, um verschiedene Zelltypen zu unterscheiden. Maßstabsbalken = 1 mm. (B) Co-Kultur-Musterbildung durch Anpassung der Gd-DTPA-Konzentration; i) 50 mM, ii) 20 mM. Maßstabsbalken = 1,5 mm; Einsätze = 250 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Zellstrukturierung in einer mikrofluidischen Kammer. (A) Schematische Darstellung der mikrofluidischen Form. (B) Herstellung von Mikrofluidik unter Verwendung von Polydimethylsiloxan (PDMS) (i,ii). (C) Zellstrukturierung innerhalb des mikrofluidischen Geräts (i,ii) und ein repräsentatives Ergebnis mit Punkt-Array-Zellmustern (iii). Die Zellen wurden mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) markiert. Maßstabsleiste = 3 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Einfluss von Gd-DTPA auf die Zellviabilität. HUVECs wurden 12 h lang mit unterschiedlichen Konzentrationen von Gd-DTPA behandelt und dann einer Lebend/Tot-Färbung oder einem CCK-8-Assay unterzogen. (A) Lebend-/Totfärbung von HUVECs. Maßstabsbalken = 200 μm. (B) Histogramm mit Live/Dead-Färbeergebnissen. (C) Histogramm mit CCK-8-Analyseergebnissen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die Mag-Arch-basierte Zellstrukturierung bietet eine benutzerfreundliche Lösung für die meisten biomedizinischen Labore. Dieses Verfahren entwickelt sich parallel zu den Zeichen tintenfrei, markierungsfrei, substratunabhängig und der Fähigkeit zur Strukturierung mit hohem Durchsatz 8,13. Bei der Strukturierung von Monotyp-Zellen werden Zellen in einem Schritt strukturiert. Das Verfahren endet einfach durch das Auffrischen von Nährmedien.
Frühere Studien haben Magnetpartikel verwendet, um Zellen zu markieren und sie mit Magneten anzuziehen, um präzise Muster zu bilden14,15. Das Vorhandensein von magnetischen Partikeln auf Zellen gab jedoch Anlass zu Bedenken hinsichtlich möglicher Auswirkungen auf das Zellverhalten. Die Mag-Arch-basierte Zellstrukturierung verfolgt die entgegengesetzte Strategie, indem extrazelluläre Flüssigkeiten paramagnetisch und nicht Zellen werden. Diese Strategie macht es viel einfacher, die zusätzlichen paramagnetischen Reagenzien zu entfernen, indem das Nährmedium aufgefrischt wird. Studien haben zelluläre Sphären und Punkt-Arrays mit Mag-Arch-basierter Zellmusterung erzeugt11,16. Im Vergleich zu bestehenden Mag-Arch-basierten Studien können die von diesem Protokoll vorgestellten Methoden die Form von Mustern frei anpassen. Darüber hinaus stellt das Protokoll Strategien für die Herstellung von Co-Kultursystemen vor. Es hat sich auch gezeigt, dass es in geschlossenen engen Zellkulturkammern funktioniert, wie wir in der Mikrofluidik getestet haben.
Im Gegensatz zu parallelen Methoden, die professionelle Bioprinting-Geräte17, kundenspezifische Schablonen 18 oder Oberflächenmodifikationen des Komplexes19 erfordern, erfordert die Mag-Arch-basierte Methode nur zwei Notwendigkeiten: Magnete und GBCAs. Die Oberfläche des Magnetmusters bestimmt das Zellmuster umgekehrt. Es wurden verschiedene Muster von Streifen und Punktanordnungen als Basic demonstriert. Benutzer können Muster nach Belieben mit verschiedenen Formen von Magnetsätzen erzeugen, die im Handel reichlich erhältlich sind. Um ein ideales Ergebnis zu erzielen, empfiehlt es sich, Magnete zu verwenden, die eine ausreichende Magnetkraft liefern. In unserer Praxis haben wir N52-Neodym-Eisen-Bor-Magnete verwendet, deren Remanenz über 1430 mT und der Oberflächenmagnetismus über 100 mT an Polen betrug. Für GBCAs wurde Gd-DTPA eingeführt, weil es unter physiologischen Bedingungen stabil und in den meisten Ländern und Gebieten kostengünstig erhältlich ist. Andere GBCAs könnten alternativ übernommen werden. Makrozyklische nichtionische GBCAs wie Gadobutrol und Gadoteridol könnten eine bessere Wahl für eine geringere Zytotoxizität sein, wenn sie anfällige Zellen für eine Langzeitbehandlung strukturieren11,12.
Die Einschränkung der Mag-Arch-basierten Zellstrukturierung liegt hauptsächlich im Arbeitsbereich des von Magneten erzeugten Magnetfeldes. Nach der umgekehrten quadratischen Formel nimmt das Magnetfeld mit dem Abstand8 stark ab. Infolgedessen gelingt es der Mag-Arch-Methode nicht, ideale Zellmuster auf allgemeinen Polystyrol-Zellkulturschalen oder -platten zusammenzustellen, deren Boden dicker als 1 mm ist. Daher muss das Protokoll auf dünneren Zellkulturoberflächen wie Glasobjektträgern oder konfokalen Zellkulturschalen funktionieren. Bei der Strukturierung innerhalb der Mikrofluidik ist es außerdem erforderlich, dass die unteren Objektträger der Mikrofluidik dünner als 0,5 mm sind. Für die Etablierung von Co-Kultursystemen kann die Methode zeitaufwändig sein, denn jeder zusätzliche Zelltyp erhöht die Zeit für die Zellanhaftung um 3-6 h.
Insgesamt bietet dieses Protokoll eine vereinfachte Möglichkeit zur Zellstrukturierung, die in den meisten Labors ohne spezielle Ausrüstung repliziert werden kann. Anwender können es als leistungsstarkes Werkzeug zur Untersuchung des Zellverhaltens, zur Nachahmung multizellulärer Mikroumgebungen oder zum Testen der Zellaffinität von Biomaterialien einsetzen8.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Studie wird finanziell unterstützt durch das National Key R&D Program of China (2021YFA1101100), die National Natural Science Foundation of China (32000971), die Fundamental Research Funds for the Central Universities (Nr. 2021FZZX001-42) und den Starry Night Science Fund des Shanghai Institute for Advanced Study der Zhejiang University (Grant No. SN-ZJU-SIAS-004).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A2780 ovarian cancer cells | Procell | CL-0013 | |
| Cell culture medium (DMEM, high glucose) | Gibco | 11995040 | |
| Cover slides | Citotest Scientific | 80340-3610 | For fabricating microfluidics. Dimension: 24 mm × 50 mm |
| DiD | MedChemExpress (MCE) | HY-D1028 | For labeling cells with red fluorescence (Ex: 640 nm) |
| DiI | MedChemExpress (MCE) | HY-D0083 | For labeling cells with orange fluorescence (Ex: 550 nm) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochannel | BC-SE-FBS07 | |
| Gadopentetate dimeglumine (Gd-DTPA) | Beijing Beilu Pharmaceutical | H10860002 | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | V900863 | |
| Glass cell slides | Citotest Scientific | 80346-2510 | Diameter: 25 mm; thickness: 0.19-0.22 mm |
| Glass plates | PURESHI hardware store | For fabricating microfluidics. Dimension: 40 mm × 75 mm | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) | Servicebio | STCC12103G-1 | |
| Neodymium-iron-boron magnets (N52) | Lalaci | ||
| Non-toxic glass plate coating (Gel Slick Solution) | Lonza | 1049286 | For convenience of demolding when fabricating microfluidics |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Servicebio | G4200 | |
| Plasma cleaner | SANHOPTT | PT-2S | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | DOWSIL | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | For fabricating microfluidics |
| Polytetrafluoroethylene (PFTE) mold | PURESHI hardware store | Customized online, for fabricating microfluidics | |
| Silicon plate | PURESHI hardware store | ||
| Smooth Muscle Cells (SMC) | Procell | CL-0517 | |
| Ultrasonic cleaner | Sapeen | CSA-02 |
References
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