Summary
Questo protocollo descrive un metodo di patterning cellulare ad alto rendimento senza inchiostro, senza marcatura, indipendente dal substrato e basato sull'effetto Archimede magnetico.
Abstract
Il pattern cellulare, che consente un controllo preciso del posizionamento cellulare, presenta un vantaggio unico nello studio del comportamento cellulare. In questo protocollo, viene introdotta una strategia di pattern cellulare basata sull'effetto Magnetic-Archimede (Mag-Arch). Questo approccio consente un controllo preciso della distribuzione cellulare senza l'uso di materiali di inchiostro o particelle di marcatura. Introducendo un reagente paramagnetico per migliorare la suscettibilità magnetica del terreno di coltura cellulare, le cellule vengono respinte dai magneti e si dispongono in uno schema complementare ai set di magneti posizionati sotto il substrato microfluidico.
In questo articolo vengono fornite procedure dettagliate per il pattern delle celle utilizzando la strategia basata su Mag-Arch. Vengono offerti metodi per la modellizzazione di tipi di cellule singole e di più tipi di cellule per esperimenti di co-coltura. Inoltre, vengono fornite istruzioni complete per la fabbricazione di dispositivi microfluidici contenenti canali per il patterning cellulare. Ottenere questa funzionalità utilizzando metodi paralleli è impegnativo, ma può essere fatto in modo semplificato ed economico. L'impiego del pattern cellulare basato su Mag-Arch fornisce ai ricercatori un potente strumento per la ricerca in vitro .
Introduction
Il pattern cellulare si sta evolvendo in una tecnologia intuitiva e potente per gli studi in vitro 1. Manipolando le posizioni delle cellule nelle piastre di coltura, fornisce soluzioni per una varietà di esperimenti, tra cui la migrazione cellulare2, la co-coltura multicellulare biomimetica3, l'assemblaggio di organoidi4, gli studi sui biomateriali5 e altro ancora. Nella maggior parte delle situazioni, un metodo senza inchiostro e senza etichette è preferito per il patterning cellulare perché offre facilità d'uso e un'elevata vitalità cellulare per le indagini successive.
L'effetto Mag-Arch è un fenomeno fisico in cui gli oggetti diamagnetici nei liquidi paramagnetici tendono a muoversi verso regioni con campi magnetici deboli6. Le cellule viventi sono naturalmente diamagnetiche, mentre i terreni di coltura cellulare possono essere resi paramagnetici aggiungendo elementi paramagnetici solubili, come la dimeglina gadopentetata (Gd-DTPA), comunemente usata per via endovenosa nella risonanza magnetica nucleare come agente di contrasto7. Di conseguenza, ci si aspetta che le cellule vengano respinte dal mezzo paramagnetico circostante e si spostino verso regioni in cui i campi magneticisono più deboli. Un campo magnetico modellato può essere facilmente generato utilizzando una serie di magneti al neodimio. Idealmente, i modelli cellulari sono assemblati in opposizione ai modelli magnetici. Tecnicamente, questo è definito come un metodo label-free perché l'unico reagente aggiuntivo, Gd-DTPA, rimane nell'ambiente extracellulare e non si lega alle cellule. Pertanto, le potenziali influenze sulla successiva coltura cellulare possono essere facilmente evitate sostituendo il terreno di coltura. Rispetto ad altri metodi 1,3,9,10, la strategia basata su Mag-Arch non richiede componenti di bio-inchiostro o l'applicazione di particelle specifiche per etichettare positivamente le cellule. Inoltre, è stato dimostrato che funziona su più substrati per l'adesione cellulare ed è in grado di modellare le cellule ad alto rendimento4.
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per il pattern cellulare utilizzando il metodo basato su Mag-Arch, che copre tutto, dalla fabbricazione del dispositivo alla regolazione del pattern cellulare. Oltre ai modelli che abbiamo dimostrato, gli utenti possono facilmente creare vari modelli di celle utilizzando magneti e soluzioni Gd-DTPA. Inoltre, vengono forniti anche protocolli per l'assemblaggio di modelli complessi di co-coltura e la manipolazione di cellule in chip microfluidici chiusi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Assemblaggio dei set di magneti
- Assemblare i set di magneti per i modelli a strisce.
- Scegliete magneti rettangolari piatti, come illustrato nella Figura 1A. Le dimensioni dei magneti rettangolari utilizzati per questa dimostrazione sono 1,5 mm × 10 mm × 35 mm (spessore × altezza × lunghezza) (vedi Tabella dei materiali). Lo spessore dei magneti determina gli spazi tra le strisce cellulari.
- Tagliare lastre di silicone di 2 mm di spessore (vedi Tabella dei materiali) in rettangoli di 2 mm × 8 mm × 30 mm. Assicurarsi che le ultime due dimensioni di queste piastre in silicone siano leggermente più piccole di quelle dei magneti rettangolari sopra menzionati per ottimizzare l'assemblaggio. Lo spessore delle piastre in silicone determina la larghezza delle strisce cellulari.
- Assemblare i magneti rettangolari e le piastre in silicone strato per strato, come illustrato nella Figura 1A. Ogni set di magneti è composto da 4 magneti e 3 piastre in silicone. Assicurarsi che i poli di ciascun magnete adiacente siano opposti in modo che i set di magneti possano allinearsi automaticamente a causa della forza di attrazione intrinseca.
- Sterilizzare i magneti prima dell'uso.
NOTA: Si consiglia di lavare i set di magneti con acqua pura e poi immergerli in etanolo al 75% per 10 minuti. Le dimensioni complessive di questi set di magneti sono di 12 mm × 10 mm × 35 mm, progettati per adattarsi a piastre di coltura cellulare standard a 6 pozzetti.
- Assemblare i set di magneti per modelli a punti
- Scegliete magneti cilindrici miniaturizzati, come mostrato nella Figura 1B. Le dimensioni dei magneti cilindrici utilizzati per questa dimostrazione sono Φ1,5 mm × 10 mm (diametro × altezza), magnetizzati in direzione assiale.
- Assemblare i magneti cilindrici come indicato nella Figura 1B. Assicurarsi che ogni set di magneti sia composto da 36 magneti cilindrici disposti in una griglia 6 × 6. Inoltre, assicurati che i poli di ciascun magnete adiacente siano opposti per consentire ai set di magneti di allinearsi automaticamente a causa della forza attrattiva intrinseca.
- Sterilizzare i magneti prima dell'uso, seguendo la stessa procedura del punto 1.1.4. Le dimensioni complessive di questi set di magneti sono 9 mm × 10 mm × 9 mm, progettati per adattarsi a piastre di coltura cellulare standard a 6 pozzetti.
2. Pattern cellulare su vetrini
- Preparare il dispositivo per la coltura cellulare.
- Utilizzare piastre in silicone di 2 mm di spessore per creare stampi in silicone. Utilizzare un perforatore per creare un foro rettangolare di 1 cm × 1 cm nella piastra. Taglia la piastra in silicone attorno al foro per creare uno stampo rotondo (diametro = 25 mm) con il foro al centro, come illustrato nella Figura 1C.
- Pulire accuratamente gli stampi in silicone utilizzando un pulitore ad ultrasuoni. Sterilizzare gli stampi lavandoli con acqua pura per 10 min, quindi sostituire l'acqua con etanolo al 75% per altri 10 min. Infine, asciugare gli stampi in una scatola sterilizzatrice a 65 °C per 60 min.
- Fissare lo stampo in silicone sterilizzato a un vetrino rotondo da 25 mm e premerlo delicatamente in modo che il silicone aderisca al vetro, come mostrato nella Figura 1C. Il dispositivo di coltura cellulare risultante avrà una parte inferiore in vetro e una cavità di coltura da 200 μL. Le dimensioni del dispositivo sono Φ25 mm × 2,15 mm, il che lo rende adatto per piastre di coltura cellulare standard a 6 pozzetti.
NOTA: Il dispositivo per colture cellulari sopra descritto può essere sostituito con altre piastre di Petri con parti inferiori più sottili di 0,5 mm, come le piastre confocali. - Posizionare i set di magneti su una piastra a 6 pozzetti. Si consigliano pinzette non magnetiche per facilità d'uso.
NOTA: Tutte le fasi successive devono essere eseguite in condizioni sterili da questo punto in poi fino all'osservazione dei modelli cellulari. - Posizionare il dispositivo di coltura cellulare sopra il magnete inserito nel pozzetto della piastra a 6 pozzetti. Assicurarsi che il dispositivo di coltura cellulare sia posizionato orizzontalmente e che la parte inferiore sia a stretto contatto con il set di magneti.
- Preparare il terreno di coltura cellulare contenente Gd-DTPA
- Preparare l'iniezione di Gd-DTPA disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali), di solito con una concentrazione di 500 mM. Diluire l'iniezione aggiungendo 30 μL di Gd-DTPA iniettabile a 470 μL di terreno di coltura cellulare completo per ottenere una concentrazione target di 30 mM.
NOTA: A seconda delle normative locali e della disponibilità, altri agenti di contrasto a base di gadolinio (GBCA) con la stessa concentrazione target possono dare risultati simili11.
- Preparare l'iniezione di Gd-DTPA disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali), di solito con una concentrazione di 500 mM. Diluire l'iniezione aggiungendo 30 μL di Gd-DTPA iniettabile a 470 μL di terreno di coltura cellulare completo per ottenere una concentrazione target di 30 mM.
- Creare i modelli di celle.
- Raccogli le cellule per il patterning. In questa dimostrazione, le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC, vedi Tabella dei materiali) sono state utilizzate per il patterning (Figura 2). Centrifugare le cellule per 5 minuti a 200 x g (a temperatura ambiente) per raccoglierle dalla sospensione e risospenderle nel terreno contenente Gd-DTPA. Conta la densità delle celle.
- Regolare la densità cellulare a circa ~2 × 105 cellule/mL con terreno contenente Gd-DTPA. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare e aggiungere 200 μL alla cavità di ogni stampo per coltura cellulare per creare una superficie liquida piena di tesa.
- Trasferire con cautela la piastra in un incubatore per colture cellulari e incubare per 3-6 ore fino a quando le cellule aderiscono bene al substrato. Evitare di sbattere la porta dell'incubatrice per evitare interferenze con l'assemblaggio dei modelli cellulari. Per le cellule con scarsi tassi di adesione, il trattamento notturno con GBCA è generalmente sicuro12.
- Il pattern cellulare è considerato completo quando le cellule aderiscono al fondo della cavità del dispositivo di coltura cellulare. Sostituire il terreno contenente Gd-DTPA con un terreno di coltura completo.
- Rimuovere il dispositivo di coltura cellulare dal set di magneti. È possibile osservare immediatamente il modello cellulare o trasferire il dispositivo in una nuova piastra di coltura per un'ulteriore coltivazione.
3. Modellazione di co-coltura mediante magnete laterale: fabbricazione della dima mobile
NOTA: La seguente procedura viene presentata per sfruttare il modello di celle basato su Mag-Arch ed esplorare la possibilità di ulteriori applicazioni.
- Preparare il dispositivo per il pattern delle celle a strisce seguendo i passaggi 1 e 2. Tuttavia, riduci la densità delle celle a 1 × 105 cellule/mL e sostituisci le piastre di silicone che separano i magneti con altre più sottili, rendendo più sottile il modello di celle di ogni striscia.
NOTA: In questo modo si ottiene un'area sufficiente per la posa di più celle in motivi a strisce. Come riferimento, suggeriamo di utilizzare piastre in silicone da 1 mm invece di 2 mm per separare i magneti. - Ripeti il primo tipo di celle come illustrato nei passaggi 2.2-2.3. Anche questo passaggio richiede 3-6 ore per l'attacco della cella.
NOTA: Per distinguere i diversi tipi di cellule nel sistema di co-coltura, gli utenti possono etichettare le cellule con coloranti fluorescenti come DiI, DiD o tracker cellulari (CMTPX, CMFDA, CMAC, ecc.) prima del patterning. Ad esempio, per la colorazione DiI e DiD, aggiungere 1 μL della soluzione madre (10 mM) (vedere la tabella dei materiali) per 1 mL di terreno privo di FBS e mescolare bene per ottenere una soluzione di lavoro. Sostituire il terreno di coltura con la soluzione di lavoro per coprire le cellule aderenti. Dopo l'incubazione per 30 minuti e il lavaggio con PBS tre volte, procedere con la raccolta delle cellule. - Dopo aver modellato il primo tipo di cellule, spostare il dispositivo di coltura cellulare di 1 mm dai magneti sottostanti verso destra, come illustrato nella Figura 3Aii.
- Lavare delicatamente i vetrini con 200 μL di PBS due volte. Evitare di lasciare asciugare i vetrini.
- Modellare il secondo tipo di celle nello stesso modo illustrato nei passaggi 2.2-2.3.
- Spostare il dispositivo di coltura cellulare di 1 mm dai magneti sottostanti verso destra, come illustrato nella Figura 3Aiii, e lavare nuovamente i vetrini con 200 μL di PBS. Modellare il terzo tipo di celle nello stesso modo illustrato nei passaggi 2.2-2.3.
- Dopo aver modellato tutti i tipi di cellule, lavare delicatamente i vetrini con 200 μL di PBS due volte e sostituirli con un terreno di coltura cellulare completo.
- Rimuovere il dispositivo di coltura cellulare dal set di magneti. È quindi possibile osservare il modello cellulare o trasferire il dispositivo su una nuova piastra di coltura per un'ulteriore coltivazione.
4. Pattern di co-coltura regolando la concentrazione di Gd-DTPA
NOTA: I GBCA non influenzano in modo significativo l'adesione cellulare o la successiva crescita alle concentrazioni di lavoro (≤75 mM). Inoltre, i pattern cellulari sono influenzati dalla concentrazione di Gd-DTPA: concentrazioni più elevate si traducono in pattern cellulari più piccoli/sottili. Pertanto, è possibile creare sistemi di co-coltura semplicemente regolando la concentrazione di Gd-DTPA. In questo esempio viene illustrata la creazione di serie di matrici circolari concentriche.
- Modellare il primo tipo di celle come illustrato nei passaggi 2.2-2.3 utilizzando magneti cilindrici miniaturizzati dal punto 1.2. Etichettare le cellule con coloranti fluorescenti come DiI, DiD o tracker cellulari (vedere il passaggio 3) prima di raccoglierle per distinguere i diversi tipi di cellule nel sistema di co-coltura.
NOTA: Sarà necessaria una maggiore concentrazione di Gd-DTPA (50 mM invece di 30 mM) e una densità cellulare inferiore, circa 1 × 105 cellule/mL. - Dopo aver modellato il primo array di celle, lavare delicatamente i vetrini con 200 μL di PBS due volte. Evitare di lasciare asciugare i vetrini.
- Ripetete il secondo tipo di celle seguendo la stessa procedura di prima. Tenere i vetrini relativamente immobili sui magneti per evitare la dislocazione. Si consiglia di fissare una piastra in silicone con una cavità che si adatti ai set di magneti alla superficie inferiore del vetrino.
NOTA: In questo caso, sarà necessaria una concentrazione inferiore di Gd-DTPA (20 mM invece di 30 mM) in modo che i modelli della seconda cella siano più grandi del primo, come illustrato nella Figura 3B. - Dopo aver modellato tutti i tipi di cellule, lavare delicatamente i vetrini con 200 μL di PBS due volte e sostituire il terreno con un terreno di coltura cellulare completo.
- Rimuovere il dispositivo di coltura cellulare dal set di magneti. È quindi possibile osservare il modello cellulare o trasferire il dispositivo su una nuova piastra di coltura per un'ulteriore coltivazione.
5. Pattern cellulare in chip microfluidico
NOTA: Il metodo basato su Mag-Arch ha dimostrato di funzionare in camere strette chiuse nel nostro precedente studio8. Di seguito è riportato un esempio di creazione di serie di array di punti in un canale microfluidico.
- Fabbricazione del chip microfluido
- Personalizza stampi in politetrafluoroetilene (PTFE) da 40 mm × da 75 mm × da 20 mm (vedi Tabella dei materiali) contenenti una cavità rettangolare di 24 mm × 50 mm × 8 mm, come illustrato nella Figura 4A.
- Appiattire una piastra in silicone di 0,5 mm di spessore. Tagliare le piastre in silicone in base alla forma del canale del fluido, che ha una cavità rettangolare di 15 mm × 20 mm × 0,5 mm con aree tampone triangolari su entrambi i lati di ingresso e uscita, come illustrato nella Figura 4A,B.
- Personalizza lastre di vetro rettangolari da 40 mm × 75 mm. Pulire le lastre di vetro con plasma ad aria per 30 s.
- Subito dopo la pulizia al plasma ad aria, coprire le lastre di vetro con 0,5 mL di un tampone antiadesione disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali) e lasciarle asciugare all'aria. Lavare le lastre di vetro una volta con etanolo e lasciarle asciugare all'aria.
- Fissare saldamente una piastra in silicone preparata al punto 5.1.2 al centro di una lastra di vetro, come illustrato nella Figura 4A.
- Preparare il prepolimero di polidimetilsilossano (PDMS) secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali). Per ogni chip PDMS, pesare 10 g del costituente di base e 1 g dell'agente rassodante in una provetta da centrifuga da 50 mL.
- Mescolare accuratamente gli agenti con una bacchetta di vetro fino a quando le piccole bolle non sono distribuite uniformemente nel colloide. La miscelazione richiede 5-10 minuti, a seconda del volume colloidale. Centrifugare il prepolimero colloidale per 1 minuto a 500 x g (a temperatura ambiente) per eliminare le bolle.
- Versare lentamente ~10 mL di prepolimero nella cavità per riempire lo stampo in PTFE.
- Posizionare con cautela lo stampo in un serbatoio sottovuoto e tenerlo orizzontale per evitare che il prepolimero scorra via.
- Rimuovere le bolle d'aria residue dal prepolimero con una pompa a vuoto. L'aspirazione richiede 120-180 minuti.
- Se necessario, versare altro prepolimero per riempire ulteriormente la cavità dello stampo. Aspirare per altri 60 min.
- Coprire con cura lo stampo in PTFE con la lastra di vetro, con il lato in silice rivolto verso la cavità, come illustrato nella Figura 4Bi.
- Assicurarsi che tutte le bolle siano eliminate. Trasferire lo stampo in un forno di essiccazione a 60 °C affinché il prepolimero si solidifichi durante la notte.
- Togliete lo stampo dal forno. Dopo il raffreddamento, smontare con cura il coperchio PDMS solidificato. Creare un ingresso e un'uscita con una perforatrice ad ago da Φ1 mm.
- Lavare il coperchio PDMS e i vetrini da 24 mm × 50 mm secondo il punto 2.1.2.
NOTA: Procedere con i seguenti passaggi in condizioni sterili. - Collegare un coperchio PDMS e un vetrino di copertura per creare un chip microfluido contenente un canale di flusso di circa ~500 μm di altezza. Il lato inferiore dovrebbe essere costituito da un vetrino di copertura di ~0,15 mm per consentire il patterning delle celle con la strategia basata su Mag-Arch.
- Assemblare gli adattatori sterili disponibili in commercio sia all'ingresso che all'uscita del chip microfluido8.
- Preparare un tampone di rivestimento in gelatina al 2% (p/v, disciolto in PBS). Sterilizzare il tampone in autoclave.
- Iniettare il tampone di rivestimento in gelatina nel chip tramite l'adattatore di ingresso utilizzando una siringa da 1 ml. Se emergono bolle, sciacquarle con un tampone di rivestimento aggiuntivo.
- Mettere il chip in un piatto di coltura cellulare da 10 cm. Aggiungere 1 ml di PBS intorno al fondo del piatto per evitare che si secchi. Trasferire la capsula in un incubatore per colture cellulari. Il rivestimento dura 30 min.
- Sciacquare il tampone di rivestimento con 2 mL di terreno contenuto in Gd (30 mM) attraverso l'ingresso.
- Iniettare delicatamente 1 mL di sospensione cellulare contenente 30 mM di Gd-DTPA con una siringa da 1 mL.
- Modellare le celle come illustrato nei passaggi 2.2-2.3 utilizzando magneti cilindrici miniaturizzati dal punto 1.2.
NOTA: Tuttavia, si consiglia di fissare una piastra in silicone con una cavità che si adatti ai set di magneti alla superficie inferiore del vetrino, come mostrato nella Figura 4Ci. - Dopo il patterning, rinfrescare delicatamente il terreno contenuto in Gd-DTPA con 1 mL di terreno completo lavando con una siringa da 1 mL.
NOTA: Il processo di pattern cellulare in microfluidica, dai passaggi 5.7-5.9, richiede circa 180 minuti, che è simile al pattern cellulare su vetrini standard. - Quantificare i modelli al microscopio. Se necessario, collegare il chip del microfluido a un dispositivo di coltura circolante per un'ulteriore coltivazione.
NOTA: In base alla nostra esperienza, le cellule sono in grado di crescere per almeno 72 ore se supportate da un semplice dispositivo basato su micropompa, che fornisce alla microfluidica un flusso continuo di terreno di coltura fresco in un incubatore cellulare8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sono stati selezionati magneti rettangolari (1,5 mm × 10 mm × 35 mm) e cilindrici (Φ1,5 m × 10 mm) per creare modelli di celle come dimostrazione. Gli utenti hanno la flessibilità di modificare le dimensioni e la forma dei magneti o di assemblarli in modo diverso per creare diversi modelli di celle. Nella Figura 1A,B, i magneti sono stati assemblati, con i poli magnetici raffigurati in blu (sud) e rosso (nord) per chiarezza. In questa configurazione, i magneti si attraggono lateralmente e si allineano, come illustrato nella Figura 2. La Figura 1C,D illustra la struttura del dispositivo di coltura cellulare e la procedura di pattern cellulare.
Nella Figura 2 vengono visualizzati i modelli di celle monotipo. Gli HUVEC marcati con GFP sono stati utilizzati per l'osservazione al microscopio a fluorescenza. Le celle sono state organizzate in modelli a strisce e a matrice di punti utilizzando set di magneti corrispondenti. Per gli HUVEC, che aderiscono rapidamente ai vetrini (entro 120-180 minuti), l'intera procedura è stata completata in 4 ore. Seguendo il protocollo, si sono ottenuti modelli con bordi ben definiti e un'elevata uniformità. Per determinare la vitalità, le cellule sono state trattate con Gd-DTPA per 12 ore, che è molto più lungo di 3-6 ore nella fase 2. Tuttavia, sia la colorazione Vivo/Morto che il saggioCCK8 8 non hanno mostrato una diminuzione significativa della vitalità cellulare. Una concentrazione relativamente alta di Gd-DTPA (50 mM) ha indotto una differenza statistica, ma ha comunque conservato un tasso di vita del 90,76% ± dell'1,78% (Figura 1 supplementare).
Basandosi sul protocollo di pattern cellulare mono-tipo, sono stati forniti esempi di pattern cellulare multi-tipo per potenziali applicazioni di co-coltura. In questo scenario, sono state impiegate HUVEC, cellule di carcinoma ovarico A2780 e cellule muscolari lisce (SMC). Per distinguerle, le cellule sono state etichettate con GFP, DiD e DiI prima del patterning. Seguendo il passaggio 3, è stato generato un modello di celle tripartite di strisce affiancate (Figura 3A). Al contrario, il passaggio 4 è stato utilizzato per creare array di punti concentrici regolando la concentrazione di Gd-DTPA (Figura 3B). Il primo strato di cellule è stato colorato con DiI (rosso) e modellato con 50 mM Gd-DTPA, mentre il secondo strato di cellule è stato etichettato con GFP (verde) e modellato con 25 mM Gd-DTPA. Di conseguenza, la dimensione del punto del primo strato era più piccola, circondata concentricamente dal secondo strato di celle a punti. Diversi tipi di cellule hanno mostrato diversi tassi di adesione e diffusione, con HUVEC che si attaccano e si diffondono rapidamente, A2780 che si attaccano rapidamente ma si diffondono più lentamente e SMC che si attaccano e si diffondono relativamente lentamente. Questi risultati hanno dimostrato che vari tipi di cellule potrebbero formare modelli cellulari in 3 ore ed essere utilizzati in esperimenti di co-coltura.
Inoltre, è stato dimostrato che il patterning cellulare utilizzando un campo magnetico era compatibile con i dispositivi di coltura stretti chiusi, come i chip microfluidici. Seguendo la fase 5, sono stati fabbricati chip microfluidici e al loro interno sono stati generati array di punti (Figura 4).
Figura 1: Configurazione e diagramma schematico del pattern di celle basato su arco magnetico . (A) Assemblaggio di set di magneti per la creazione di modelli di celle a strisce. (B) Assemblaggio di set di magneti per la generazione di modelli di celle a matrice di punti. (C) Configurazione del dispositivo di coltura cellulare. (D) Procedura passo-passo per il pattern cellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Assemblaggio di dispositivi e creazione di modelli HUVEC in modelli a strisce e a matrice di punti. (A) Set di magneti confinati all'interno di dispositivi per colture cellulari (i) e collocati in una piastra per colture cellulari (ii). (B) e (C) Set di magneti e i corrispondenti modelli di celle. Le cellule sono state marcate con una proteina fluorescente verde (GFP) per la visualizzazione del modello cellulare. Barre graduate = 1,5 mm; inserti = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Modellizzazione dei sistemi di co-coltura con strategia passo-passo. (A) Patterning di co-coltura utilizzando il magnete lateralmente (i-iii). Le cellule sono state etichettate con GFP (verde), DiD (blu) e DiI (rosso) per distinguere i diversi tipi di cellule. Barre di scala = 1 mm. (B) Pattern di co-coltura ottenuto regolando la concentrazione di Gd-DTPA; (i) 50 mM, (ii) 20 mM. Barre graduate = 1,5 mm; inserti = 250 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Pattern cellulare in una camera microfluidica. (A) Diagramma schematico dello stampo microfluidico. (B) Fabbricazione di microfluidica utilizzando polidimetilsilossano (PDMS) (i,ii). (C) Pattern cellulare all'interno del dispositivo microfluidico (i,ii) e un risultato rappresentativo che mostra pattern cellulari a matrice di punti (iii). Le cellule sono state marcate con proteina fluorescente verde (GFP). Barra della scala = 3 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1: Influenza di Gd-DTPA sulla vitalità cellulare. Gli HUVEC sono stati trattati con concentrazioni variabili di Gd-DTPA per 12 ore e poi sottoposti a colorazione Vivo/Morto o al test CCK-8. (A) Colorazione Vivo/Morto degli HUVEC. Barre graduate = 200 μm. (B) Istogramma che rappresenta i risultati della colorazione Vivo/Morto. (C) Istogramma che mostra i risultati del test CCK-8. Fare clic qui per scaricare il file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il pattern cellulare basato su Mag-Arch fornisce una soluzione di facile utilizzo per la maggior parte dei laboratori biomedici. Questo metodo avanza parallelamente ai caratteri di senza inchiostro, senza etichetta, indipendente dal substrato e la capacità di patterning ad alta produttività 8,13. Per la creazione di modelli di celle di tipo singolo, crea una serie di celle in un unico passaggio. La procedura termina semplicemente rinfrescando i terreni di coltura.
Studi precedenti hanno utilizzato particelle magnetiche per etichettare le cellule e attirarle con magneti per formare modelli precisi14,15. Tuttavia, la presenza di particelle magnetiche sulle cellule ha sollevato preoccupazioni sui potenziali effetti sui comportamenti delle cellule. Il pattern cellulare basato su Mag-Arch adotta la strategia opposta, trasformando i liquidi extracellulari in paramagnetici, piuttosto che in cellule. Questa strategia rende molto più facile rimuovere i reagenti paramagnetici in eccesso rinfrescando il terreno di coltura. Gli studi hanno generato sfere cellulari e array di punti con pattern cellulare basato su Mag-Arch11,16. Rispetto agli studi esistenti basati su Mag-Arch, i metodi presentati da questo protocollo possono personalizzare liberamente la forma dei modelli. Inoltre, il protocollo presenta strategie per la fabbricazione di sistemi di co-coltura. È stato anche dimostrato che funziona all'interno di camere di coltura cellulare strette e chiuse, come abbiamo testato in microfluidica.
Piuttosto che metodi paralleli, che richiedono attrezzature professionali per il bioprinting17, modelli personalizzati 18 o modifiche della superficie del complesso19, il metodo basato su Mag-Arch richiede solo due necessità: magneti e GBCA. La superficie del modello magnetico determina il modello della cella in modo inverso. Sono stati dimostrati diversi modelli di strisce e matrici di punti come base. Gli utenti possono generare modelli a loro agio con diverse forme di set di magneti, che sono abbondantemente disponibili in commercio. Per ottenere un risultato ideale, si consiglia di adottare magneti che forniscano una forza magnetica sufficiente. Nella nostra pratica, abbiamo adottato magneti al neodimio-ferro-boro N52, la cui rimanenza era superiore a 1430 mT e il magnetismo superficiale era superiore a 100 mT sui poli. Per i GBCA, il Gd-DTPA è stato adottato perché è stabile in condizioni fisiologiche e disponibile a basso costo nella maggior parte dei paesi e delle aree. In alternativa, potrebbero essere adottati altri GBCA. I GBCA macrociclici non ionici, come il gadobutrolo e il gadoperidolo, potrebbero essere una scelta migliore per una minore citotossicità quando si modellano le cellule vulnerabili per il trattamento a lungo termine11,12.
Il limite del pattern cellulare basato su Mag-Arch risiede principalmente nell'area di lavoro del campo magnetico generato dai magneti. Seguendo la formula dell'inverso del quadrato, il campo magnetico diminuisce bruscamente con la distanza8. Di conseguenza, il metodo Mag-Arch non riesce ad assemblare modelli cellulari ideali su piastre o piastre di coltura cellulare in polistirene generico, il cui fondo è più spesso di 1 mm. Pertanto, il protocollo deve funzionare su superfici di coltura cellulare più sottili, come vetrini o piastre di coltura cellulare confocali. Quando si modella all'interno della microfluidica, è inoltre necessario che i vetrini inferiori della microfluidica siano più sottili di 0,5 mm. Per stabilire sistemi di co-coltura, il metodo potrebbe richiedere molto tempo, poiché ogni tipo di cellula aggiuntiva aumenta il tempo di 3-6 ore per l'attacco cellulare.
Nel complesso, questo protocollo fornisce un modo semplificato per il pattern cellulare, che potrebbe essere replicato nella maggior parte dei laboratori senza alcuna attrezzatura speciale. Gli utenti possono adottarlo come un potente strumento per studiare i comportamenti cellulari, imitare microambienti multicellulari o testare l'affinità cellulare dei biomateriali8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo studio è sostenuto finanziariamente dal National Key R&D Program of China (2021YFA1101100), dalla National Natural Science Foundation of China (32000971), dai Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. 2021FZZX001-42) e dallo Starry Night Science Fund of Zhejiang University Shanghai Institute for Advanced Study (Grant No. SN-ZJU-SIAS-004).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A2780 ovarian cancer cells | Procell | CL-0013 | |
| Cell culture medium (DMEM, high glucose) | Gibco | 11995040 | |
| Cover slides | Citotest Scientific | 80340-3610 | For fabricating microfluidics. Dimension: 24 mm × 50 mm |
| DiD | MedChemExpress (MCE) | HY-D1028 | For labeling cells with red fluorescence (Ex: 640 nm) |
| DiI | MedChemExpress (MCE) | HY-D0083 | For labeling cells with orange fluorescence (Ex: 550 nm) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochannel | BC-SE-FBS07 | |
| Gadopentetate dimeglumine (Gd-DTPA) | Beijing Beilu Pharmaceutical | H10860002 | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | V900863 | |
| Glass cell slides | Citotest Scientific | 80346-2510 | Diameter: 25 mm; thickness: 0.19-0.22 mm |
| Glass plates | PURESHI hardware store | For fabricating microfluidics. Dimension: 40 mm × 75 mm | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) | Servicebio | STCC12103G-1 | |
| Neodymium-iron-boron magnets (N52) | Lalaci | ||
| Non-toxic glass plate coating (Gel Slick Solution) | Lonza | 1049286 | For convenience of demolding when fabricating microfluidics |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Servicebio | G4200 | |
| Plasma cleaner | SANHOPTT | PT-2S | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | DOWSIL | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | For fabricating microfluidics |
| Polytetrafluoroethylene (PFTE) mold | PURESHI hardware store | Customized online, for fabricating microfluidics | |
| Silicon plate | PURESHI hardware store | ||
| Smooth Muscle Cells (SMC) | Procell | CL-0517 | |
| Ultrasonic cleaner | Sapeen | CSA-02 |
References
- Christian, J., et al. Control of cell adhesion using hydrogel patterning techniques for applications in traction force microscopy. J Vis Exp. 179, e63121 (2022).
- Abbas, Y., Turco, M. Y., Burton, G. J., Moffett, A. Investigation of human trophoblast invasion in vitro. Hum Reprod Update. 26 (4), 501-513 (2020).
- Park, M., et al. Modulation of heterotypic and homotypic cell-cell interactions via zwitterionic lipid masks. Adv Healthc Mater. 6 (15), 1700063 (2017).
- Ren, T., Chen, P., Gu, L., Ogut, M. G., Demirci, U. Soft ring-shaped cellu-robots with simultaneous locomotion in batches. Adv Mater. 32 (8), e1905713 (2020).
- Ren, T., Steiger, W., Chen, P., Ovsianikov, A., Demirci, U. Enhancing cell packing in buckyballs by acoustofluidic activation. Biofabrication. 12 (2), 025033 (2020).
- Ge, S., et al. Magnetic levitation in chemistry, materials science, and biochemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 59 (41), 17810-17855 (2020).
- Puluca, N., et al. Levitating cells to sort the fit and the fat. Adv Biosyst. 4 (6), e1900300 (2020).
- Ren, T., et al. Programing cell assembly via ink-free, label-free magneto-archimedes based strategy. ACS Nano. 17 (13), 12072-12086 (2023).
- Li, Y. C., et al. Programmable laser-assisted surface microfabrication on a poly(vinyl alcohol)-coated glass chip with self-changing cell adhesivity for heterotypic cell patterning. ACS Appl Mater Interfaces. 7 (40), 22322-22332 (2015).
- Chliara, M. A., Elezoglou, S., Zergioti, I. Bioprinting on organ-on-chip: Development and applications. Biosensors (Basel). 12 (12), 1135 (2022).
- Moncal, K. K., Yaman, S., Durmus, N. G. Levitational 3D bioassembly and density-based spatial coding of levitoids. Adv Funct Mater. 32 (50), 2204092 (2022).
- Parfenov, V. A., et al. Magnetic levitational bioassembly of 3D tissue construct in space. Sci Adv. 6 (29), eaba4174 (2020).
- Dell, A. C., Wagner, G., Own, J., Geibel, J. P. 3D bioprinting using hydrogels: Cell inks and tissue engineering applications. Pharmaceutics. 14 (12), 2596 (2022).
- Ino, K., Ito, A., Honda, H. Cell patterning using magnetite nanoparticles and magnetic force. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1309-1317 (2007).
- Okochi, M., Matsumura, T., Honda, H. Magnetic force-based cell patterning for evaluation of the effect of stromal fibroblasts on invasive capacity in 3d cultures. Biosens Bioelectron. 42, 300-307 (2013).
- Mishriki, S., et al. Rapid magnetic 3D printing of cellular structures with mcf-7 cell inks. Research (Wash D C). 2019, 9854593 (2019).
- Ozturk-Oncel, M. O., Leal-Martinez, B. H., Monteiro, R. F., Gomes, M. E., Domingues, R. M. A. A dive into the bath: Embedded 3D bioprinting of freeform in vitro models. Biomater Sci. 11, 5462-5473 (2023).
- Sahni, G., Yuan, J., Toh, Y. C. Stencil micropatterning of human pluripotent stem cells for probing spatial organization of differentiation fates. J Vis Exp. 112, e54097 (2016).
- Joddar, B., et al. Engineering approaches for cardiac organoid formation and their characterization. Transl Res. 250, 46-67 (2022).
