Summary
이 프로토콜은 자기 아르키메데스 효과(Magnetic Archimedes effect)를 기반으로 하는 잉크가 없고, 라벨이 없고, 기판에 독립적이며, 처리량이 많은 세포 패터닝 방법을 설명합니다.
Abstract
세포 포지셔닝을 정밀하게 제어할 수 있는 세포 패터닝은 세포 거동 연구에서 고유한 이점을 제공합니다. 이 프로토콜에서는 마그네틱-아르키메데스(Mag-Arch) 효과를 기반으로 하는 세포 패터닝 전략이 도입됩니다. 이 접근 방식을 사용하면 잉크 재료나 라벨링 입자를 사용하지 않고도 세포 분포를 정밀하게 제어할 수 있습니다. 세포 배양 배지의 자화율을 향상시키기 위해 상자성 시약을 도입함으로써 세포는 자석에 의해 반발되고 미세유체 기질 아래에 위치한 자석 세트를 보완하는 패턴으로 배열됩니다.
이 기사에서는 Mag-Arch 기반 전략을 사용한 세포 패터닝에 대한 자세한 절차를 제공합니다. 단일 세포 유형을 패터닝하는 방법과 공동 배양 실험을 위한 여러 세포 유형이 제공됩니다. 또한 세포 패터닝을 위한 채널을 포함하는 미세유체 장치를 제조하기 위한 포괄적인 지침이 제공됩니다. 병렬 방법을 사용하여 이 기능을 달성하는 것은 어렵지만 간단하고 비용 효율적인 방식으로 수행할 수 있습니다. Mag-Arch 기반 세포 패터닝을 사용하면 연구자들에게 체외 연구를 위한 강력한 도구를 제공할 수 있습니다.
Introduction
세포 패터닝은 체외 연구를 위한 직관적이고 강력한 기술로 진화하고 있습니다1. 배양 플레이트에서 세포 위치를 조작함으로써 세포 이동2, 생체 모방 다세포 공동 배양3, 오가노이드 조립4, 생체 재료 연구5 등을 포함한 다양한 실험을 위한 솔루션을 제공합니다. 대부분의 경우, 잉크가 없고 표지가 없는 분석법은 후속 조사를 위한 작동이 간편하고 세포 생존율이 높기 때문에 세포 패터닝에 선호됩니다.
Mag-Arch 효과는 상자성 액체의 반자성 물체가 자기장이 약한 영역으로 이동하는 경향이 있는 물리적 현상입니다 6. 살아있는 세포는 자연적으로 반자성인 반면, 세포 배양 배지는 조영제로 핵 자기 공명 영상에서 정맥 주사로 일반적으로 사용되는 가도펜테테이트 디메글루민(Gd-DTPA)과 같은 수용성 상자성 요소를 첨가하여 상자성을 만들 수 있다7. 결과적으로, 세포는 주변의 상자성 매질에 의해 반발되어 자기장이 약한 영역으로 이동할 것으로 예상된다8. 패턴화된 자기장은 네오디뮴 자석 세트를 사용하여 쉽게 생성할 수 있습니다. 이상적으로, 셀 패턴은 자석 패턴과 반대로 조립됩니다. 기술적으로, 이것은 유일한 추가 시약인 Gd-DTPA가 세포외 환경에 남아 있고 세포에 결합하지 않기 때문에 표지가 없는 방법으로 정의됩니다. 따라서, 후속 세포 배양에 대한 잠재적인 영향은 배양 배지를 교체함으로써 쉽게 피할 수 있습니다. 다른 방법 1,3,9,10과 비교하여, Mag-Arch 기반 전략은 세포를 긍정적으로 표지하기 위해 바이오 잉크 성분 또는 특정 입자의 적용이 필요하지 않습니다. 또한, 세포 접착을 위해 여러 기질에서 작동하는 것으로 나타났으며 고처리량 세포 패터닝이 가능합니다4.
이 기사에서는 Mag-Arch 기반 방법을 사용한 셀 패터닝에 대한 자세한 프로토콜을 제시하며, 장치 제조에서 셀 패턴 조정에 이르기까지 모든 것을 다룹니다. 우리가 시연한 패턴 외에도 사용자는 자석과 Gd-DTPA 솔루션을 사용하여 다양한 셀 패턴을 쉽게 만들 수 있습니다. 또한 복잡한 공동 배양 패턴을 조립하고 밀폐된 미세유체 칩에서 세포를 조작하기 위한 프로토콜도 제공됩니다.
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Protocol
1. 자석 세트 조립
- 스트립 패턴용 자석 세트를 조립합니다.
- 그림 1A와 같이 평평한 직사각형 자석을 선택하십시오. 이 데모에 사용된 직사각형 자석의 치수는 1.5mm × 10mm × 35mm(두께 × 높이 × 길이)입니다(재료 표 참조). 자석의 두께는 셀 줄무늬 사이의 간격을 결정합니다.
- 2mm 두께의 실리콘 판( 재료 표 참조)을 2mm × 8mm × 30mm 직사각형으로 자릅니다. 이 실리콘 판의 후자의 두 치수가 위에서 언급한 직사각형 자석의 치수보다 약간 작은지 확인하여 조립을 최적화하십시오. 실리콘 판의 두께는 셀 스트라이프의 너비를 결정합니다.
- 그림 1A와 같이 직사각형 자석과 실리콘 판을 층별로 조립합니다. 각 자석 세트는 4개의 자석과 3개의 실리콘 판으로 구성됩니다. 인접한 각 자석의 극이 반대인지 확인하여 고유한 인력으로 인해 자석 세트가 자동으로 정렬될 수 있도록 합니다.
- 사용하기 전에 자석을 소독하십시오.
알림: 자석 세트를 순수한 물로 씻은 다음 75% 에탄올에 10분 동안 담그는 것이 좋습니다. 이 자석 세트의 전체 치수는 12mm × 10mm × 35mm이며 표준 6웰 세포 배양 플레이트에 맞도록 설계되었습니다.
- 도트 어레이 패턴을 위한 자석 세트 조립
- 그림 1B와 같이 소형 원통형 자석을 선택하십시오. 이 데모에 사용된 원통형 자석의 치수는 Φ1.5mm × 10mm(직경 × 높이)이며 축 방향으로 자화됩니다.
- 그림 1B와 같이 원통형 자석을 조립합니다. 각 자석 세트가 36 × 6 그리드에 배열된 6개의 원통형 자석으로 구성되어 있는지 확인하십시오. 또한 각 인접 자석의 극이 반대인지 확인하여 고유 인력으로 인해 자석 세트가 자동으로 정렬될 수 있도록 합니다.
- 1.1.4단계와 동일한 절차에 따라 사용하기 전에 자석을 소독하십시오. 이 자석 세트의 전체 치수는 9mm × 10mm × 9mm이며 표준 6웰 세포 배양 플레이트에 맞도록 설계되었습니다.
2. 유리 슬라이드의 셀 패터닝
- 세포 배양 장치를 준비합니다.
- 2mm 두께의 실리콘 플레이트를 사용하여 실리콘 몰드를 만듭니다. 펀처를 사용하여 플레이트에 1cm × 1cm 직사각형 구멍을 만듭니다. 그림 25C와 같이 구멍 주위의 실리콘 플레이트를 다듬어 구멍이 중앙에 있는 원형 몰드(직경 = 1mm)를 만듭니다.
- 초음파 세척기를 사용하여 실리콘 몰드를 철저히 청소하십시오. 곰팡이를 순수한 물로 10분 동안 세척한 다음 물을 75% 에탄올로 교체하여 10분 더 살균합니다. 마지막으로 65°C의 멸균 상자에서 60분 동안 금형을 건조합니다.
- 멸균된 실리콘 몰드를 Φ25mm 원형 유리 셀 슬라이드에 부착하고 그림 1C와 같이 실리콘이 유리에 부착되도록 부드럽게 누릅니다. 생성된 세포 배양 장치에는 유리 밑면과 200μL 배양 캐비티가 있습니다. 장치의 크기는 Φ25mm × 2.15mm로 표준 6웰 세포 배양 플레이트에 적합합니다.
알림: 위에서 설명한 세포 배양 장치는 컨포칼 접시와 같이 밑면이 0.5mm보다 얇은 다른 페트리 접시로 교체할 수 있습니다. - 자석 세트를 6웰 플레이트에 놓습니다. 간편한 작동을 위해 비자성 핀셋을 사용하는 것이 좋습니다.
알림: 모든 후속 단계는 이 시점부터 세포 패턴이 관찰될 때까지 멸균 조건에서 수행해야 합니다. - 세포 배양 장치를 6웰 플레이트의 웰에 있는 자석 세트 위에 놓습니다. 세포 배양 장치가 수평으로 배치되고 밑면이 자석 세트와 밀착되어 있는지 확인하십시오.
- Gd-DTPA를 함유하는 세포 배양 배지를 준비합니다
- 일반적으로 500mM의 농도로 시판되는 Gd-DTPA 주입제( 재료 표 참조)를 준비합니다. 30mM의 목표 농도를 달성하기 위해 470μL의 완전한 세포 배양 배지에 30μL의 Gd-DTPA 주입을 추가하여 주입을 희석합니다.
참고: 현지 규정 및 가용성에 따라 동일한 목표 농도를 가진 다른 가돌리늄 기반 조영제(GBCA)도 유사한 결과를 얻을 수 있습니다11.
- 일반적으로 500mM의 농도로 시판되는 Gd-DTPA 주입제( 재료 표 참조)를 준비합니다. 30mM의 목표 농도를 달성하기 위해 470μL의 완전한 세포 배양 배지에 30μL의 Gd-DTPA 주입을 추가하여 주입을 희석합니다.
- 셀 패턴을 만듭니다.
- 패터닝을 위해 세포를 수확합니다. 이 시연에서는 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC, 재료 표 참조)를 패터닝에 사용했습니다(그림 2). 세포를 200 x g (실온에서)에서 5분 동안 원심분리하여 현탁액으로부터 세포를 수집하고 Gd-DTPA 함유 배지에 재현탁시킵니다. 셀 밀도를 계산합니다.
- Gd-DTPA 함유 배지를 사용하여 세포 밀도를 약 ~2 × 105 cells/mL로 조정합니다. 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하고 각 세포 배양 몰드의 공동에 200μL를 추가하여 가장자리가 가득 찬 액체 표면을 만듭니다.
- 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 조심스럽게 옮기고 세포가 기질에 잘 부착될 때까지 3-6시간 동안 배양합니다. 세포 패턴의 조립에 대한 간섭을 방지하기 위해 인큐베이터 도어를 쾅 닫지 마십시오. 접착률이 좋지 않은 세포의 경우, GBCA로 하룻밤 동안 치료하는 것이 일반적으로 안전하다12.
- 세포 패터닝은 세포가 세포 배양 장치의 캐비티 바닥에 부착될 때 완료된 것으로 간주됩니다. Gd-DTPA 함유 배지를 완전한 배양 배지로 교체합니다.
- 자석 세트에서 세포 배양 장치를 제거합니다. 세포 패턴을 즉시 관찰하거나 추가 배양을 위해 장치를 새로운 배양 플레이트로 옮길 수 있습니다.
3. 자석 옆길에 의한 공동 문화 패터닝: 움직이는 템플릿 제작
참고: 다음 절차는 Mag-Arch 기반 셀 패터닝을 활용하고 더 많은 응용 프로그램의 가능성을 탐색하기 위해 제시됩니다.
- 1단계와 2단계에 따라 스트라이프 셀 패터닝을 위해 장치를 준비합니다. 그러나 세포 밀도를 1 × 105 cells/mL로 줄이고 자석을 분리하는 실리콘 판을 더 얇은 판으로 교체하여 각 줄무늬 세포 패턴을 더 얇게 만듭니다.
참고: 이것은 스트라이프 패턴으로 여러 셀을 놓을 수 있는 충분한 공간을 제공합니다. 참고로 1mm 대신 2mm 실리콘 플레이트를 사용하여 자석을 분리하는 것이 좋습니다. - 2.2-2.3단계에 설명된 대로 첫 번째 유형의 셀을 패턴화합니다. 이 단계는 또한 세포 부착을 위해 3-6시간이 필요합니다.
참고: 공동 배양 시스템에서 다양한 세포 유형을 구별하기 위해 사용자는 패터닝 전에 DiI, DiD 또는 세포 추적기(CMTPX, CMFDA, CMAC 등)와 같은 형광 염료로 세포를 라벨링할 수 있습니다. 예를 들어, DiI 및 DiD 염색의 경우 FBS가 없는 배지 1mL당 원액(10mM)( 재료 표 참조) 1μL를 추가하고 잘 혼합하여 작업 용액을 얻습니다. 배양 배지를 부착 세포를 덮을 수 있는 작업 용액으로 교체합니다. 30분 동안 배양하고 PBS로 3회 세척한 후 세포 채취를 진행합니다. - 첫 번째 유형의 세포를 패터닝한 후 그림 1Aii와 같이 세포 배양 장치를 아래 자석에서 오른쪽으로 3mm 이동합니다.
- 유리 슬라이드를 200μL의 PBS로 두 번 부드럽게 세척합니다. 슬라이드를 건조시키지 마십시오.
- 2.2-2.3단계에 설명된 것과 동일한 방식으로 두 번째 유형의 셀을 패턴화합니다.
- 그림 3Aiii와 같이 세포 배양 장치를 아래 자석에서 오른쪽으로 1mm 이동하고 유리 슬라이드를 200μL의 PBS로 다시 세척합니다. 2.2-2.3단계에서 설명한 것과 동일한 방식으로 세 번째 유형의 셀을 패턴화합니다.
- 모든 유형의 세포를 패터닝한 후 유리 슬라이드를 200μL의 PBS로 두 번 부드럽게 세척하고 완전한 세포 배양 배지로 교체합니다.
- 자석 세트에서 세포 배양 장치를 제거합니다. 그런 다음 세포 패턴을 관찰하거나 추가 배양을 위해 장치를 새 배양 플레이트로 옮길 수 있습니다.
4. Gd-DTPA의 농도 조절을 통한 공동 배양 패터닝
참고: GBCA는 작업 농도(≤75mM)에서 세포 접착 또는 후속 성장에 큰 영향을 미치지 않습니다. 또한, 세포 패턴은 Gd-DTPA의 농도에 의해 영향을 받으며, 농도가 높을수록 세포 패턴이 더 작아지거나 얇아집니다. 따라서 Gd-DTPA의 농도를 조절하는 것만으로 공동 배양 시스템을 만들 수 있습니다. 이 예제에서는 동심 원형 배열을 패터닝하는 방법을 보여줍니다.
- 2.2단계의 소형 원통형 자석을 사용하여 2.3-1.2단계에 설명된 대로 첫 번째 유형의 세포를 패턴화합니다. 세포를 수확하기 전에 DiI, DiD 또는 세포 추적기(3단계 참조)와 같은 형광 염료로 세포를 라벨링하여 공동 배양 시스템에서 다양한 세포 유형을 구별합니다.
참고: 더 높은 농도의 Gd-DTPA(30mM 대신 50mM)와 더 낮은 세포 밀도(약 1 × 105 cells/mL)가 필요합니다. - 첫 번째 셀 어레이를 패터닝한 후 유리 슬라이드를 200μL의 PBS로 두 번 부드럽게 세척합니다. 슬라이드가 마르지 않도록 하십시오.
- 이전과 동일한 절차에 따라 두 번째 유형의 셀을 패턴화합니다. 탈구를 방지하기 위해 유리 슬라이드를 자석에서 상대적으로 움직이지 않도록 유지하십시오. 유리 슬라이드의 밑면에 자석 세트를 맞는 속이 빈 실리콘 플레이트를 부착하는 것이 좋습니다.
참고: 여기서는 그림 3B와 같이 두 번째 세포 패턴이 첫 번째 세포 패턴보다 클 것으로 예상되도록 더 낮은 농도의 Gd-DTPA(30mM 대신 20mM)가 필요합니다. - 모든 유형의 세포를 패터닝한 후 유리 슬라이드를 200μL의 PBS로 두 번 부드럽게 세척하고 배지를 완전한 세포 배양 배지로 교체합니다.
- 자석 세트에서 세포 배양 장치를 제거합니다. 그런 다음 세포 패턴을 관찰하거나 추가 배양을 위해 장치를 새 배양 플레이트로 옮길 수 있습니다.
5. microfluidic 칩에 있는 세포 패터닝
참고: Mag-Arch 기반 방법은 이전 연구8에서 밀폐된 좁은 챔버에서 작동하는 것으로 입증되었습니다. 다음은 미세유체 채널에서 도트 어레이를 패터닝하는 예입니다.
- 미세유체 칩 제작
- 그림 4A와 같이 24mm ×× 50mm × 8mm의 직사각형 캐비티를 포함하는 40mm × 75mm 20mm 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 금형(재료 표 참조)을 사용자 정의하십시오.
- 0.5mm 두께의 실리콘 판을 평평하게 만듭니다. 그림 4A,B와 같이 입구와 출구 양쪽에 삼각형 완충 영역이 있는 15mm × 20mm × 0.5mm의 직사각형 캐비티가 있는 유체 채널의 모양에 따라 실리콘 플레이트를 자릅니다.
- 40mm × 75mm 직사각형 유리판을 사용자 정의할 수 있습니다. 공기 플라즈마로 유리판을 30초 동안 청소합니다.
- 공기 플라즈마 세척 직후 유리판을 시중에서 판매되는 접착 방지 완충액 0.5mL( 재료 표 참조)로 덮고 자연 건조시킵니다. 유리판을 에탄올로 한 번 씻고 자연 건조시킵니다.
- 그림 5.1.2A와 같이 4단계에서 준비한 실리콘 판을 유리판 중앙에 단단히 부착합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 폴리디메틸실록산(PDMS) 프리폴리머를 준비합니다( 재료 표 참조). 각 PDMS 칩에 대해 기본 성분 10g과 퍼밍제 1g을 50mL 원심분리 튜브에 넣습니다.
- 작은 기포가 콜로이드에 균일하게 분포될 때까지 유리 교반 막대로 약제를 완전히 혼합합니다. 혼합은 콜로이드 부피에 따라 5-10분이 소요됩니다. 콜로이드 프리폴리머를 500 x g (실온)에서 1분 동안 원심분리하여 기포를 제거합니다.
- ~10mL의 프리폴리머를 캐비티에 천천히 부어 PTFE 몰드를 채웁니다.
- 금형을 진공 저장소에 조심스럽게 넣고 예비 중합체가 흘러 나오지 않도록 수평으로 유지하십시오.
- 진공 펌프로 프리폴리머에서 잔류 기포를 제거합니다. 진공 청소기로 청소하는 데 120-180분이 걸립니다.
- 필요한 경우 더 많은 프리폴리머를 부어 금형 캐비티를 더 채웁니다. 60분 더 진공 청소기로 청소합니다.
- 그림 4Bi와 같이 실리카 면이 캐비티를 향하도록 PTFE 몰드를 유리판으로 조심스럽게 덮습니다.
- 모든 기포가 제거되었는지 확인하십시오. 주형을 60°C 건조 오븐으로 옮겨 프리폴리머를 밤새 응고시킵니다.
- 오븐에서 곰팡이를 제거하십시오. 냉각 후 응고된 PDMS 커버를 조심스럽게 탈형합니다. Φ1mm 니들 펀처로 입구와 출구를 만듭니다.
- 2.1.2단계에 따라 PDMS 커버와 24mm × 50mm 커버 슬라이드를 세척합니다.
알림: 멸균 상태에서 다음 단계를 진행하십시오. - PDMS 커버와 커버 슬라이드를 부착하여 높이가 약 ~500μm인 유동 채널을 포함하는 미세유체 칩을 생성합니다. 바닥면은 Mag-Arch 기반 전략으로 셀 패터닝을 가능하게 하기 위해 ~0.15mm 유리 커버 슬라이드로 구성되어야 합니다.
- 시중에서 판매되는 멸균 어댑터를 미세유체 칩8의 입구와 출구 모두에 조립합니다.
- 2%(w/v, PBS에 용해됨) 젤라틴 코팅 완충액을 준비합니다. 고압멸균으로 완충액을 멸균합니다.
- 1mL 주사기를 사용하여 주입구 어댑터를 통해 젤라틴 코팅 완충액을 칩에 주입합니다. 기포가 생기면 여분의 코팅 버퍼로 씻어내십시오.
- 칩을 10cm 세포 배양 접시에 넣습니다. 건조를 방지하기 위해 접시 바닥 주위에 PBS 1mL를 추가합니다. 접시를 세포 배양 인큐베이터로 옮깁니다. 코팅은 30분 정도 걸립니다.
- 주입구를 통해 2mL의 Gd 함유 배지(30mM)로 코팅 버퍼를 씻어냅니다.
- 1mL 주사기로 30mM Gd-DTPA가 포함된 세포 현탁액 1mL를 부드럽게 주입합니다.
- 2.2단계의 소형 원통형 자석을 사용하여 2.3-1.2단계에 설명된 대로 셀을 패턴화합니다.
알림: 그러나 그림 4Ci와 같이 자석 세트를 유리 슬라이드의 밑면에 맞는 속이 빈 실리콘 플레이트를 부착하는 것이 좋습니다. - 패터닝 후 1mL 주사기로 플러싱하여 Gd-DTPA 함유 배지를 1mL의 완전한 배지로 부드럽게 새로 고칩니다.
참고: 미세유체역학의 세포 패턴화 과정은 5.7-5.9단계에서 약 180분이 소요되며, 이는 표준 유리 슬라이드의 세포 패턴화와 유사합니다. - 현미경으로 패턴을 정량화합니다. 필요한 경우 추가 배양을 위해 미세유체 칩을 순환 배양 장치에 연결합니다.
참고: 우리의 경험에 비추어 볼 때, 세포는 세포 인큐베이터(8)에서 신선한 배양 배지의 지속적인 흐름을 미세유체공학자에게 제공하는 간단한 마이크로펌프 기반 장치에 의해 지지될 때 최소 72시간 동안 성장할 수 있다.
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Representative Results
직사각형(1.5mm × 10mm × 35mm) 및 원통형(Φ1.5m × 10mm) 자석을 선택하여 시연으로 셀 패턴을 만들었습니다. 사용자는 자석의 크기와 모양을 수정하거나 다르게 조립하여 다양한 셀 패턴을 만들 수 있는 유연성이 있습니다. 그림 1A,B에서 자석은 명확성을 위해 파란색(남쪽)과 빨간색(북쪽)으로 표시된 자극으로 조립되었습니다. 이 구성에서 자석은 그림 2와 같이 서로 측면으로 끌어당기고 정렬됩니다. 도 1c,d는 세포 배양 장치의 구조 및 세포 패터닝 절차를 나타낸다.
그림 2는 모노형 셀 패턴을 보여줍니다. GFP 표지된 HUVEC는 형광 현미경으로 관찰하는 데 사용되었습니다. 세포는 해당 자석 세트를 사용하여 줄무늬 및 점 배열 패턴으로 구성되었습니다. 유리 슬라이드에 빠르게 부착되는 HUVEC의 경우(120-180분 이내) 전체 절차가 4시간 만에 완료되었습니다. 프로토콜을 따르면 가장자리가 잘 정의되고 균일성이 높은 패턴이 생성되었습니다. 생존력을 결정하기 위해, 세포를 12시간 동안 Gd-DTPA로 처리하였는데, 이는 단계 2의 3-6시간보다 훨씬 더 길다. 그러나 Live/Dead 염색과 CCK8 분석8 모두 세포 생존율이 크게 감소하지 않았습니다. 상대적으로 높은 농도의 Gd-DTPA(50mM)는 통계적 차이를 유발했지만 여전히 90.76% ± 1.78%의 생존율을 유지했습니다(보충 그림 1).
모노 타입 세포 패터닝 프로토콜을 기반으로 멀티 타입 셀 패터닝 예제가 잠재적인 공동 배양 응용 분야를 위해 제공되었습니다. 이 시나리오에서는 HUVEC, A2780 난소암 세포 및 평활근 세포(SMC)가 사용되었습니다. 이들을 구별하기 위해, 세포는 패터닝하기 전에 GFP, DiD 및 DiI로 표지되었습니다. 3단계에 따라 나란히 줄무늬가 있는 삼자 세포 패턴이 생성되었습니다(그림 3A). 반대로, 4단계는 Gd-DTPA의 농도를 조정하여 동심원 도트 어레이를 만드는 데 사용되었습니다(그림 3B). 세포의 첫 번째 층을 DiI(빨간색)로 염색하고 50mM Gd-DTPA로 패터닝한 반면, 세포의 두 번째 층을 GFP(녹색)로 표지하고 25mM Gd-DTPA로 패터닝했습니다. 결과적으로, 첫 번째 층의 도트 크기는 더 작았고, 도트 패턴 세포의 두 번째 레이어로 동심원으로 둘러싸여 있었습니다. 세포 유형에 따라 부착 및 확산 속도가 다양했는데, HUVEC은 빠르게 부착 및 확산되고, A2780은 빠르게 부착되지만 더 느리게 확산되며, SMC는 상대적으로 느리게 부착 및 확산됩니다. 이러한 결과는 다양한 세포 유형이 3시간 내에 세포 패턴을 형성하고 공동 배양 실험에 활용될 수 있음을 보여주었습니다.
또한, 자기장을 이용한 세포 패터닝이 미세유체 칩과 같은 밀폐된 좁은 배양 장치와 호환됨이 입증되었습니다. 5단계에 따라 미세유체 칩을 제작하고 그 안에 도트 어레이를 생성했습니다(그림 4).
그림 1: mag-arch 기반 셀 패터닝의 설정 및 개략도 . (A) 스트라이프 셀 패턴을 만들기 위한 자석 세트의 조립. (B) 도트 어레이 셀 패턴을 생성하기 위한 마그넷 세트의 조립. (C) 세포 배양 장치의 설정. (D) 세포 패터닝을 위한 단계별 절차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 장치 조립 및 HUVEC를 스트라이프 및 도트 어레이 패턴으로 패터닝 . (A) 세포 배양 장치(i) 내에 갇혀 있고 세포 배양 플레이트(ii)에 배치된 자석 세트. (B) 및 (C) 자석 세트 및 해당 셀 패턴. 세포 패턴의 시각화를 위해 녹색 형광 단백질(GFP)로 세포를 표지했습니다. 스케일 바 = 1.5mm; 삽입 = 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 단계별 전략으로 공동 배양 시스템 패터닝. (A) 자석 옆을 이용한 공동 배양 패터닝(i-iii). 세포는 GFP(녹색), DiD(파란색) 및 DiI(빨간색)로 표지되어 다양한 세포 유형을 구별했습니다. 척도 막대 = 1mm. (B) Gd-DTPA 농도를 조정하여 공동 배양 패터닝을 달성했습니다. (i) 50mM, (ii) 20mM. 스케일 바 = 1.5mm; 삽입 = 250 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 미세유체 챔버의 세포 패터닝. (A) 미세유체 금형의 개략도. (B) 폴리디메틸실록산(PDMS)을 이용한 미세유체공학 제조 (i,ii). (C) 미세유체 소자 내의 셀 패터닝(i,ii) 및 도트 어레이 셀 패턴(iii)을 나타내는 대표적인 결과. 세포는 녹색 형광 단백질(GFP)로 표지되었습니다. 축척 막대 = 3mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: Gd-DTPA가 세포 생존율에 미치는 영향. HUVEC을 12시간 동안 다양한 농도의 Gd-DTPA로 처리한 다음 Live/Dead 염색 또는 CCK-8 분석을 실시했습니다. (A) HUVEC의 살아있는/죽은 염색. 스케일 바 = 200 μm. (B) 라이브/데드 염색 결과를 보여주는 히스토그램. (C) CCK-8 분석 결과를 보여주는 히스토그램. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
Mag-Arch 기반 세포 패터닝은 대부분의 생물의학 실험실에 사용자 친화적인 솔루션을 제공합니다. 이 방법은 잉크가 없고, 라벨이 없고, 기판에 독립적이며, 고처리량 패터닝 8,13의 능력과 평행하게 발전합니다. 모노 타입 셀 패터닝의 경우 원스텝 방식으로 셀을 패터닝합니다. 절차는 배양 배지를 새로 고치는 것으로 간단히 끝납니다.
이전 연구에서는 자성 입자를 사용하여 세포를 표지하고 자석으로 끌어당겨 정확한 패턴을 형성했습니다14,15. 그러나 세포에 자성 입자가 존재하면 세포 행동에 대한 잠재적 영향에 대한 우려가 제기되었습니다. Mag-Arch 기반 세포 패터닝은 세포가 아닌 세포외 액체를 상자성으로 전환하여 반대 전략을 취합니다. 이 전략을 사용하면 배양 배지를 새로 고쳐 여분의 상자성 시약을 훨씬 쉽게 제거할 수 있습니다. 연구는 Mag-Arch 기반 세포 패터닝11,16을 사용하여 세포 구체와 도트 어레이를 생성했습니다. 기존의 Mag-Arch 기반 연구와 비교했을 때, 이 프로토콜에 의해 제시된 방법은 패턴의 모양을 자유롭게 사용자 정의할 수 있습니다. 더욱이, 이 의정서는 공동 문화 시스템을 구축하기 위한 전략을 제시한다. 또한 미세유체역학에서 테스트한 바와 같이 밀폐된 좁은 세포 배양 챔버 내부에서도 작동하는 것으로 입증되었습니다.
전문적인 바이오프린팅 장비(17), 맞춤형 템플릿(18) 또는 복합체(19)의 표면 개질을 필요로 하는 병렬 방법 대신에, Mag-Arch-기반 방법은 자석과 GBCA의 두 가지 필수품만을 필요로 한다. 자석 패턴의 표면은 셀 패턴을 반대로 결정합니다. 기본적으로 줄무늬와 점 배열의 몇 가지 패턴이 시연되었습니다. 사용자는 상업적으로 이용 가능한 다양한 모양의 자석 세트를 사용하여 자유롭게 패턴을 생성할 수 있습니다. 이상적인 결과를 얻으려면 충분한 자기력을 공급하는 자석을 채택하는 것이 좋습니다. 우리의 연습에서, 우리는 잔류 물이 1430mT 이상이고 표면 자기가 극에서 100mT 이상인 N52 네오디뮴-철-붕소 자석을 채택했습니다. GBCA의 경우 Gd-DTPA는 생리학적 조건에서 안정적이고 대부분의 국가 및 지역에서 저렴하게 구할 수 있기 때문에 채택되었습니다. 다른 GBCA를 대안으로 채택할 수 있습니다. 가도부트롤(gadobutrol) 및 가도테리돌(gadoteridol)과 같은 거대고리 비이온성 GBCA는 장기 치료를 위해 취약한 세포를 패터닝할 때 세포 독성을 낮추기 위한 더 나은 선택이 될 수 있습니다11,12.
Mag-Arch 기반 셀 패터닝의 한계는 주로 자석에 의해 생성된 자기장의 작업 영역에 있습니다. 역제곱 공식에 따라 자기장은 거리8에 따라 급격히 감소합니다. 결과적으로, Mag-Arch 방법은 바닥이 1mm보다 두꺼운 일반 폴리스티렌 세포 배양 접시 또는 플레이트에서 이상적인 세포 패턴을 조립하지 못합니다. 따라서 프로토콜은 유리 슬라이드 또는 컨포칼 세포 배양 접시와 같은 더 얇은 세포 배양 표면에서 작동해야 합니다. 미세유체역학 내부를 패턴화할 때 미세유체역학의 바닥 슬라이드가 0.5mm보다 얇아야 합니다. 공동 배양 시스템을 구축하기 위해 이 방법은 시간이 많이 소요될 수 있으며, 각 추가 세포 유형은 세포 부착에 3-6시간 더 소요됩니다.
전반적으로 이 프로토콜은 특별한 장비 없이 대부분의 실험실에서 복제할 수 있는 세포 패터닝을 위한 단순화된 방법을 제공합니다. 사용자는 세포 거동을 연구하거나, 다세포 미세환경을 모방하거나, 생체 재료의 세포 친화도를 테스트하기 위한 강력한 도구로 채택할 수 있다8.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국가 중점 R&D 프로그램(2021YFA1101100), 중국 국립 자연과학 재단(32000971), 중앙 대학 기초 연구 기금(No. 2021FZZX001-42), Zhejiang University Shanghai Institute for Advanced Study (Grant No. SN-ZJU-SIAS-004)를 참조하십시오.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A2780 ovarian cancer cells | Procell | CL-0013 | |
| Cell culture medium (DMEM, high glucose) | Gibco | 11995040 | |
| Cover slides | Citotest Scientific | 80340-3610 | For fabricating microfluidics. Dimension: 24 mm × 50 mm |
| DiD | MedChemExpress (MCE) | HY-D1028 | For labeling cells with red fluorescence (Ex: 640 nm) |
| DiI | MedChemExpress (MCE) | HY-D0083 | For labeling cells with orange fluorescence (Ex: 550 nm) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochannel | BC-SE-FBS07 | |
| Gadopentetate dimeglumine (Gd-DTPA) | Beijing Beilu Pharmaceutical | H10860002 | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | V900863 | |
| Glass cell slides | Citotest Scientific | 80346-2510 | Diameter: 25 mm; thickness: 0.19-0.22 mm |
| Glass plates | PURESHI hardware store | For fabricating microfluidics. Dimension: 40 mm × 75 mm | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) | Servicebio | STCC12103G-1 | |
| Neodymium-iron-boron magnets (N52) | Lalaci | ||
| Non-toxic glass plate coating (Gel Slick Solution) | Lonza | 1049286 | For convenience of demolding when fabricating microfluidics |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Servicebio | G4200 | |
| Plasma cleaner | SANHOPTT | PT-2S | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | DOWSIL | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | For fabricating microfluidics |
| Polytetrafluoroethylene (PFTE) mold | PURESHI hardware store | Customized online, for fabricating microfluidics | |
| Silicon plate | PURESHI hardware store | ||
| Smooth Muscle Cells (SMC) | Procell | CL-0517 | |
| Ultrasonic cleaner | Sapeen | CSA-02 |
References
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