Summary
Denne protokol beskriver en blækfri, etiketfri, substratuafhængig, cellemønstermetode med høj kapacitet baseret på den magnetiske Archimedes-effekt.
Abstract
Cellemønstre, der muliggør præcis kontrol af cellepositionering, giver en unik fordel i studiet af celleadfærd. I denne protokol introduceres en cellemønsterstrategi baseret på Magnetic-Archimedes (Mag-Arch) effekten. Denne fremgangsmåde muliggør præcis kontrol af cellefordeling uden brug af blækmaterialer eller mærkningspartikler. Ved at indføre et paramagnetisk reagens for at forbedre cellekulturmediets magnetiske modtagelighed frastødes celler af magneter og arrangerer sig i et mønster, der supplerer magnetsættene placeret under det mikrofluidiske substrat.
I denne artikel gives detaljerede procedurer for cellemønster ved hjælp af Mag-Arch-baseret strategi. Der tilbydes metoder til mønster af enkeltcelletyper samt flere celletyper til samkultureksperimenter. Derudover leveres omfattende instruktioner til fremstilling af mikrofluidiske enheder, der indeholder kanaler til cellemønster. At opnå denne funktion ved hjælp af parallelle metoder er udfordrende, men kan gøres på en forenklet og omkostningseffektiv måde. Anvendelse af Mag-Arch-baseret cellemønster udstyrer forskere med et kraftfuldt værktøj til in vitro-forskning .
Introduction
Cellemønstre udvikler sig til en intuitiv og kraftfuld teknologi til in vitro-undersøgelser 1. Ved at manipulere cellepositioner i dyrkningsplader giver det løsninger til en række eksperimenter, herunder cellemigration2, biomimetisk multicellulær co-kultur3, organoidsamling4, biomaterialeundersøgelser5 og mere. I de fleste situationer foretrækkes en blækfri, etiketfri metode til cellemønster, fordi den giver nem betjening og høj cellelevedygtighed til efterfølgende undersøgelser.
Mag-Arch-effekten er et fysisk fænomen, hvor diamagnetiske objekter i paramagnetiske væsker har tendens til at bevæge sig mod regioner med svage magnetfelter6. Levende celler er naturligt diamagnetiske, mens cellekulturmedier kan gøres paramagnetiske ved at tilføje opløselige paramagnetiske elementer, såsom gadopentetat dimeglumin (Gd-DTPA), der almindeligvis anvendes intravenøst i kernemagnetisk resonansbilleddannelse som kontrastmiddel7. Derfor forventes celler at blive frastødt af det omgivende paramagnetiske medium og bevæge sig mod regioner, hvor magnetfelter er svagere8. Et mønstret magnetfelt kan let genereres ved hjælp af et sæt neodymmagneter. Ideelt set samles cellemønstre i modsætning til magnetmønstrene. Teknisk set defineres dette som en etiketfri metode, fordi det eneste ekstra reagens, Gd-DTPA, forbliver i det ekstracellulære miljø og ikke binder til celler. Således kan potentielle påvirkninger på efterfølgende cellekultur let undgås ved at erstatte dyrkningsmediet. Sammenlignet med andre metoder 1,3,9,10 kræver den Mag-Arch-baserede strategi ikke bioblækkomponenter eller anvendelse af specifikke partikler for positivt at mærke cellerne. Desuden har det vist sig at arbejde på flere substrater til celleadhæsion og er i stand til high-throughput cellemønster4.
Denne artikel præsenterer en detaljeret protokol til cellemønster ved hjælp af Mag-Arch-baseret metode, der dækker alt fra enhedsfremstilling til justering af cellemønsteret. Ud over de mønstre, vi har demonstreret, kan brugerne nemt oprette forskellige cellemønstre ved hjælp af magneter og Gd-DTPA-løsning. Desuden leveres protokoller til samling af komplekse samkulturmønstre og manipulation af celler i lukkede mikrofluidiske chips.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Montering af magnetsættene
- Saml magnetsættene til strimmelmønstre.
- Vælg flade rektangulære magneter, som vist i figur 1A. Dimensionerne på de rektangulære magneter, der anvendes til denne demonstration, er 1,5 mm × 10 mm × 35 mm (tykkelse × højde × længde) (se materialetabel). Magneternes tykkelse bestemmer hullerne mellem cellestriberne.
- Skær 2 mm tykke silikoneplader (se materialetabel) i 2 mm × 8 mm × 30 mm rektangler. Sørg for, at de to sidstnævnte dimensioner af disse silikoneplader er lidt mindre end de rektangulære magneter, der er nævnt ovenfor for at optimere samlingen. Tykkelsen af silikonepladerne bestemmer bredden af cellestriberne.
- Saml de rektangulære magneter og silikonepladerne lag for lag, som illustreret i figur 1A. Hvert magnetsæt består af 4 magneter og 3 silikoneplader. Sørg for, at polerne på hver tilstødende magnet er modsatte, så magnetsættene automatisk kan justeres på grund af den iboende attraktive kraft.
- Steriliser magneterne før brug.
BEMÆRK: Det anbefales at vaske magnetsættene med rent vand og derefter nedsænke dem i 75% ethanol i 10 min. De overordnede dimensioner af disse magnetsæt er 12 mm × 10 mm × 35 mm, designet til at passe til standard 6-brønds cellekulturplader.
- Saml magnetsættene til matrixmønstre
- Vælg miniature cylindriske magneter, som vist i figur 1B. Dimensionerne af de cylindriske magneter, der anvendes til denne demonstration, er Φ1,5 mm × 10 mm (diameter × højde), magnetiseret i aksial retning.
- De cylindriske magneter samles som vist i figur 1B. Sørg for, at hvert magnetsæt består af 36 cylindriske magneter arrangeret i et 6 × 6 gitter. Sørg også for, at polerne på hver tilstødende magnet er modsatte, så magnetsættene automatisk justeres på grund af den iboende attraktive kraft.
- Magneterne steriliseres før brug efter samme fremgangsmåde som i trin 1.1.4. De overordnede dimensioner af disse magnetsæt er 9 mm × 10 mm × 9 mm, designet til at passe til standard 6-brønds cellekulturplader.
2. Cellemønster på glasglas
- Forbered cellekulturenheden.
- Brug 2 mm tykke silikoneplader til at skabe silikoneforme. Brug en puncher til at skabe et 1 cm × 1 cm rektangulært hul i pladen. Trim silikonepladen rundt om hullet for at lave en rund form (diameter = 25 mm) med hullet i midten, som vist i figur 1C.
- Rengør silikoneformene grundigt ved hjælp af en ultralydsrenser. Steriliser formene ved at vaske dem med rent vand i 10 min, efterfulgt af at erstatte vandet med 75% ethanol i yderligere 10 min. Til sidst tørres formene i en sterilisatorkasse ved 65 °C i 60 min.
- Fastgør den steriliserede silikoneform til et Φ25 mm rundt glascelleglas og tryk forsigtigt på det, så silikonen klæber til glasset, som vist i figur 1C. Den resulterende cellekulturanordning vil have en glasunderside og et 200 μL kulturhulrum. Enhedens dimensioner er Φ25 mm × 2,15 mm, hvilket gør den velegnet til standard 6-brønds cellekulturplader.
BEMÆRK: Cellekulturindretningen beskrevet ovenfor kan erstattes med andre petriskåle med undersiden tyndere end 0,5 mm, såsom konfokale skåle. - Placer magnetsættene på en plade med 6 brønde. Ikke-magnetisk pincet anbefales for nem betjening.
BEMÆRK: Alle efterfølgende trin skal udføres under sterile forhold fra dette tidspunkt og frem til observation af cellemønstre. - Placer cellekulturindretningen oven på magnetsættet i brønden på 6-brøndpladen. Sørg for, at cellekulturenheden er placeret vandret, og undersiden er i tæt kontakt med magnetsættet.
- Forbered cellekulturmediet indeholdende Gd-DTPA
- Forbered kommercielt tilgængelig Gd-DTPA-injektion (se materialetabel), normalt med en koncentration på 500 mM. Fortynd injektionen ved at tilsætte 30 μL Gd-DTPA-injektion til 470 μL komplet cellekulturmedium for at opnå en målkoncentration på 30 mM.
BEMÆRK: Afhængigt af lokale bestemmelser og tilgængelighed kan andre gadoliniumbaserede kontraststoffer (GBCA'er) med samme målkoncentration give lignende resultater11.
- Forbered kommercielt tilgængelig Gd-DTPA-injektion (se materialetabel), normalt med en koncentration på 500 mM. Fortynd injektionen ved at tilsætte 30 μL Gd-DTPA-injektion til 470 μL komplet cellekulturmedium for at opnå en målkoncentration på 30 mM.
- Opret cellemønstrene.
- Høstceller til mønster. I denne demonstration blev humane navlestrengendototelceller (HUVEC'er, se materialetabel) anvendt til mønster (figur 2). Cellerne centrifugeres i 5 minutter ved 200 x g (ved stuetemperatur) for at opsamle dem fra suspensionen og resuspendere dem i det Gd-DTPA-holdige medium. Tæl celletætheden.
- Celletætheden justeres til ca. ~2 × 105 celler/ml med Gd-DTPA-holdigt medium. Bland forsigtigt cellesuspensionen og tilsæt 200 μL til hulrummet i hver cellekulturform for at skabe en randen-fuld væskeoverflade.
- Overfør forsigtigt pladen til en cellekulturinkubator og inkuber i 3-6 timer, indtil cellerne klæber godt til substratet. Undgå at smække inkubatordøren for at forhindre interferens med samlingen af cellemønstre. For celler med dårlig vedhæftningshastighed er behandling natten over med GBCA'er generelt sikker12.
- Cellemønster betragtes som komplet, når celler klæber til bunden af hulrummet i cellekulturenheden. Udskift det Gd-DTPA-holdige medium med komplet dyrkningsmedium.
- Fjern cellekulturenheden fra magnetsættet. Man kan enten observere cellemønsteret med det samme eller overføre enheden til en ny kulturplade til videre dyrkning.
3. Co-kultur mønster af magnet sidelæns: fremstilling af den bevægelige skabelon
BEMÆRK: Følgende procedure præsenteres for at drage fordel af Mag-Arch-baseret cellemønster og undersøge muligheden for flere applikationer.
- Forbered enheden til stribecellemønster ved at følge trin 1 og trin 2. Reducer dog celletætheden til 1 × 105 celler / ml og udskift silikonepladerne, der adskiller magneterne med tyndere, hvilket gør hvert stribecellemønster tyndere.
BEMÆRK: Dette giver tilstrækkeligt areal til at lægge flere celler i stribemønstre. Som reference foreslår vi at bruge 1 mm silikoneplader i stedet for 2 mm til at adskille magneterne. - Mønster den første type celler som illustreret i trin 2.2-2.3. Dette trin kræver også 3-6 timer til cellefastgørelse.
BEMÆRK: For at skelne mellem forskellige celletyper i co-kultursystemet kan brugerne mærke celler med fluorescerende farvestoffer såsom DiI, DiD eller cellesporere (CMTPX, CMFDA, CMAC osv.) før mønster. For eksempel til DiI- og DiD-farvning tilsættes 1 μL stamopløsning (10 mM) (se materialetabel) pr. 1 ml FBS-frit medium og blandes godt for at opnå en arbejdsløsning. Udskift kulturmediet med arbejdsløsningen for at dække klæbende celler. Efter inkubation i 30 minutter og vask med PBS tre gange, fortsæt med cellehøstning. - Efter mønster af den første type celler flyttes cellekulturanordningen 1 mm fra magneterne nedenfor til højre, som illustreret i figur 3Aii.
- Glasobjektglassene vaskes forsigtigt med 200 μL PBS to gange. Undgå at lade rutsjebanerne tørre.
- Mønster den anden type celler på samme måde som illustreret i trin 2.2-2.3.
- Flyt cellekulturanordningen 1 mm fra magneterne nedenunder til højre, som vist i figur 3Aiii, og vask glasobjektglassene med 200 μL PBS igen. Mønster den tredje type celler på samme måde som illustreret i trin 2.2-2.3.
- Efter mønster af alle typer celler vaskes forsigtigt glasobjektglassene med 200 μL PBS to gange og erstattes med komplet cellekulturmedium.
- Fjern cellekulturenheden fra magnetsættet. Man kan derefter observere cellemønsteret eller overføre enheden til en ny kulturplade til videre dyrkning.
4. Co-kultur mønster ved at justere koncentrationen af Gd-DTPA
BEMÆRK: GBCA'er påvirker ikke signifikant celleadhæsion eller efterfølgende vækst ved arbejdskoncentrationer (≤75 mM). Derudover påvirkes cellemønstre af koncentrationen af Gd-DTPA: højere koncentrationer resulterer i mindre/tyndere cellemønstre. Det er således muligt at skabe samkultursystemer ved blot at justere koncentrationen af Gd-DTPA. Dette eksempel viser mønstrende koncentriske cirkulære arrays.
- Mønster den første type celler som illustreret i trin 2.2-2.3 ved hjælp af miniature cylindriske magneter fra trin 1.2. Mærk cellerne med fluorescerende farvestoffer såsom DiI, DiD eller cellesporere (se trin 3), før du høster dem for at skelne mellem forskellige celletyper i samkultursystemet.
BEMÆRK: Man skal bruge en højere koncentration af Gd-DTPA (50 mM i stedet for 30 mM) og en lavere celletæthed, ca. 1 × 105 celler/ml. - Efter mønster af det første cellesystem vaskes forsigtigt glasobjektglassene med 200 μL PBS to gange. Undgå at lade diasene tørre.
- Mønster den anden type celler efter samme procedure som før. Hold glasgliderne relativt ubevægelige på magneterne for at forhindre forskydning. Det anbefales at fastgøre en silikoneplade med en hul, der passer til magnetsættene på undersiden af glasglasset.
BEMÆRK: Her skal man bruge en lavere koncentration af Gd-DTPA (20 mM i stedet for 30 mM), så det andet cellemønster forventes at være større end det første, som illustreret i figur 3B. - Efter mønster af alle typer celler vaskes forsigtigt glasobjektglassene med 200 μL PBS to gange og erstattes med komplet cellekulturmedium.
- Fjern cellekulturenheden fra magnetsættet. Man kan derefter observere cellemønsteret eller overføre enheden til en ny kulturplade til videre dyrkning.
5. Cellemønster i mikrofluidisk chip
BEMÆRK: Den Mag-Arch-baserede metode har vist sig at fungere i lukkede smalle kamre i vores tidligere undersøgelse8. Her er et eksempel på mønster af prikarrays i en mikrofluidisk kanal.
- Fremstilling af microfluid chip
- Tilpas forme til 40 mm × 75 mm × 20 mm polytetrafluorethylen (PTFE) (se materialetabel), der indeholder et rektangulært hulrum på 24 mm × 50 mm × 8 mm, som illustreret i figur 4A.
- Flad en 0,5 mm tyk silikoneplade. Skær silikonepladerne i overensstemmelse med formen på væskekanalen, som har et rektangulært hulrum på 15 mm × 20 mm × 0,5 mm med trekantede bufferområder på både indløbs- og udløbssiden, som vist i figur 4A,B.
- Tilpas 40 mm × 75 mm rektangulære glasplader. Rengør glaspladerne med luftplasma i 30 sekunder.
- Umiddelbart efter luftplasmarensning dækkes glaspladerne med 0,5 ml af en kommercielt tilgængelig anti-vedhæftningsbuffer (se materialetabellen) og lad dem lufttørre. Vask glaspladerne en gang med ethanol og lad dem lufttørre.
- En silikoneplade, der er fremstillet i trin 5.1.2, fastgøres sikkert til midten af en glasplade som vist i figur 4A.
- Forbered polydimethylsiloxan (PDMS) præpolymer i henhold til producentens anvisninger (se materialetabel). For hver PDMS-chip afvejes 10 g af basisbestanddelen og 1 g af opstrammeren i et 50 ml centrifugeglas.
- Bland midlerne grundigt med en glasomrøringsstang, indtil små bobler fordeles ensartet i kolloidet. Blandingen tager 5-10 min, afhængigt af kolloidvolumenet. Centrifuger kolloidpræpolymeren i 1 min ved 500 x g (ved stuetemperatur) for at fjerne bobler.
- Hæld langsomt ~ 10 ml af præpolymeren i hulrummet for at fylde PTFE-formen.
- Placer forsigtigt formen i et vakuumreservoir og hold den vandret for at forhindre, at præpolymeren flyder væk.
- Fjern resterende luftbobler fra præpolymeren med en vakuumpumpe. Støvsugningen tager 120-180 min.
- Hæld om nødvendigt mere præpolymer for yderligere at fylde formhulrummet. Støvsug i yderligere 60 min.
- Dæk forsigtigt PTFE-formen med glaspladen med silicasiden vendt mod hulrummet, som illustreret i figur 4Bi.
- Sørg for, at alle bobler elimineres. Overfør formen til en 60 °C tørreovn, så præpolymeren størkner natten over.
- Fjern formen fra ovnen. Efter afkøling skal du forsigtigt afmontere det størknede PDMS-dæksel. Opret et indløb og et udløb med en Φ1 mm nålestanser.
- Vask PDMS-dækslet og 24 mm × 50 mm dækselskinner i henhold til trin 2.1.2.
BEMÆRK: Fortsæt med følgende trin under sterile forhold. - Fastgør et PDMS-dæksel og et dækglas for at skabe en mikrofluidchip, der indeholder en flowkanal på ca. ~ 500 μm i højden. Undersiden skal bestå af et ~ 0,15 mm glasdæksel for at muliggøre cellemønster med den Mag-Arch-baserede strategi.
- Saml kommercielt tilgængelige sterile adaptere i både indløbet og udløbet på mikrofluidchippen8.
- Forbered en 2% (w / v, opløst i PBS) gelatinebelægningsbuffer. Steriliser bufferen ved autoklavering.
- Injicer gelatinebelægningsbufferen i chippen via indløbsadapteren ved hjælp af en 1 ml sprøjte. Hvis der opstår bobler, skal du skylle dem ud med ekstra belægningsbuffer.
- Anbring chippen i en 10 cm cellekulturskål. Tilsæt 1 ml PBS omkring skålens bund for at undgå tørring. Overfør skålen til en cellekulturinkubator. Belægningen tager 30 min.
- Skyl belægningsbufferen ud med 2 ml Gd-indeholdt medium (30 mM) via indløbet.
- Injicer forsigtigt 1 ml cellesuspension indeholdende 30 mM Gd-DTPA med en 1 ml sprøjte.
- Mønsterceller som illustreret i trin 2.2-2.3 ved hjælp af miniature cylindriske magneter fra trin 1.2.
BEMÆRK: Det anbefales dog at fastgøre en silikoneplade med en hul, der passer til magnetsættene på undersiden af glasglasset, som vist i figur 4Ci. - Efter mønstret opfriskes forsigtigt det Gd-DTPA-indeholdte medium med 1 ml komplet substrat ved at skylle med en 1 ml sprøjte.
BEMÆRK: Processen med cellemønster i mikrofluidik, fra trin 5.7-5.9, tager ca. 180 minutter, hvilket svarer til cellemønster på standard glasglas. - Kvantificer mønstrene under et mikroskop. Tilslut om nødvendigt mikrofluidchippen til en cirkulerende kulturanordning til videre dyrkning.
BEMÆRK: Efter vores erfaring er celler i stand til at vokse i mindst 72 timer, når de understøttes af en simpel mikropumpebaseret enhed, som giver mikrofluidikken en kontinuerlig strøm af frisk kulturmedium i en celleinkubator8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rektangulære (1,5 mm × 10 mm × 35 mm) og cylindriske (Φ1,5 m × 10 mm) magneter blev valgt til at skabe cellemønstre som en demonstration. Brugere har fleksibiliteten til at ændre magneternes størrelse og form eller samle dem forskelligt for at skabe forskellige cellemønstre. I figur 1A, B blev magneterne samlet med de magnetiske poler afbildet i blåt (syd) og rødt (nord) for klarhed. I denne konfiguration tiltrækker magneter hinanden sideværts og justerer sig selv, som illustreret i figur 2. Figur 1C,D illustrerer cellekulturanordningens struktur og cellemønsterproceduren.
Figur 2 viser mono-type cellemønstre. GFP-mærkede HUVEC'er blev brugt til observation under et fluorescerende mikroskop. Cellerne blev organiseret i stripe og dot array mønstre ved hjælp af tilsvarende magnetsæt. For HUVEC'er, der klæber hurtigt til glasskinner (inden for 120-180 min), blev hele proceduren afsluttet på 4 timer. At følge protokollen resulterede i mønstre med veldefinerede kanter og høj ensartethed. For at bestemme levedygtigheden blev cellerne behandlet med Gd-DTPA i 12 timer, hvilket er meget længere end 3-6 timer i trin 2. Imidlertid viste både levende / død farvning og CCK8-assay8 intet signifikant fald i cellelevedygtighed. En relativt høj koncentration af Gd-DTPA (50 mM) inducerede en statistisk forskel, men bevarede stadig en levende rate på 90,76% ± 1,78% (supplerende figur 1).
Med udgangspunkt i monotype-cellemønsterprotokollen blev der givet eksempler på cellemønster af flere typer til potentielle co-culturing-applikationer. I dette scenarie blev HUVEC'er, A2780 ovariecancerceller og glatte muskelceller (SMC'er) anvendt. For at skelne mellem dem blev cellerne mærket med GFP, DiD og DiI før mønster. Ved at følge trin 3 blev der genereret et tredelt cellemønster af side-by-side-striber (figur 3A). Omvendt blev trin 4 brugt til at oprette koncentriske prikarrays ved at justere koncentrationen af Gd-DTPA (figur 3B). Det første lag af celler blev farvet med DiI (rød) og mønstret med 50 mM Gd-DTPA, mens det andet lag af celler blev mærket med GFP (grøn) og mønstret med 25 mM Gd-DTPA. Derfor var prikstørrelsen af det første lag mindre, omgivet koncentrisk af det andet lag af prikmønstrede celler. Forskellige celletyper udviste varierende vedhæftnings- og spredningshastigheder, hvor HUVEC'er fastgjorde og spredte sig hurtigt, A2780'er fastgjorde hurtigt, men spredte sig langsommere, og SMC'er fastgjorde og spredte sig relativt langsomt. Disse resultater viste, at forskellige celletyper kunne danne cellemønstre på 3 timer og udnyttes i co-kultureksperimenter.
Desuden blev det påvist, at cellemønster ved hjælp af et magnetfelt var kompatibelt med lukkede smalle kulturanordninger, såsom mikrofluidiske chips. Ved at følge trin 5 blev mikrofluidiske chips fremstillet, og der blev genereret prikarrayer i dem (figur 4).
Figur 1: Opsætning og skematisk diagram over mag-arch-baseret cellemønster . (A) Samling af magnetsæt til oprettelse af stribecellemønstre. (B) Samling af magnetsæt til generering af dot array-cellemønstre. (C) Opsætning af cellekulturenheden. (D) Trin-for-trin procedure for cellemønstre. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Samling af enheder og mønster af HUVEC'er i stribe- og prikarraymønstre. (A) Magnetsæt indesluttet i cellekulturanordninger (i) og anbragt i en cellekulturplade (ii). (B) og (C) magnetsæt og de tilsvarende cellemønstre. Celler blev mærket med grønt fluorescerende protein (GFP) til visualisering af cellemønsteret. Skalastænger = 1,5 mm; indsatser = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Mønster af samkultursystemer med trinvis strategi. (A) Samkulturmønstre ved hjælp af magnet sidelæns (i-iii). Celler blev mærket med GFP (grøn), DiD (blå) og DiI (rød) for at skelne mellem forskellige celletyper. Skalastænger = 1 mm. (B) Co-kulturmønster opnået ved justering af Gd-DTPA-koncentration; i) 50 mM, ii) 20 mM. Skalastænger = 1,5 mm; indsatser = 250 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Cellemønster i et mikrofluidisk kammer. (A) Skematisk diagram over den mikrofluidiske form. (B) Fremstilling af mikrofluidik ved hjælp af polydimethylsiloxan (PDMS) (i,ii). C) Cellemønster i den mikrofluidiske anordning (i,ii) og et repræsentativt resultat, der viser matrixcellemønstre (iii). Celler blev mærket med grønt fluorescerende protein (GFP). Vægtstang = 3 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Gd-DTPA's indflydelse på cellelevedygtighed. HUVEC'er blev behandlet med varierende koncentrationer af Gd-DTPA i 12 timer og derefter udsat for levende / død farvning eller CCK-8-analyse. a) Levende/død farvning af HUVEC'er. Skalabjælker = 200 μm. (B) Histogram, der viser levende/døde farvningsresultater. (C) Histogram, der viser CCK-8-assayresultater. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det Mag-Arch-baserede cellemønster giver en brugervenlig løsning til de fleste biomedicinske laboratorier. Denne metode udvikler sig parallelt med tegn i blækfri, etiketfri, substratuafhængig og evnen til mønster med høj kapacitet 8,13. Til mono-type cellemønster mønstrer det celler på en et-trins måde. Proceduren afsluttes simpelthen ved at opdatere kulturmedier.
Tidligere undersøgelser har brugt magnetiske partikler til at mærke celler og tiltrække dem med magneter for at danne præcise mønstre14,15. Tilstedeværelsen af magnetiske partikler på celler rejste imidlertid bekymringer om potentielle virkninger på celleadfærd. Mag-Arch-baseret cellemønster tager den modsatte strategi ved at gøre ekstracellulære væsker paramagnetiske snarere end celler. Denne strategi gør det meget lettere at fjerne de ekstra paramagnetiske reagenser ved at opdatere kulturmediet. Undersøgelser har genereret cellulære kugler og dot arrays med Mag-Arch-baseret cellemønster11,16. Sammenlignet med eksisterende Mag-Arch-baserede undersøgelser kan metoderne præsenteret af denne protokol frit tilpasse formen på mønstre. Desuden præsenterer protokollen strategier til fremstilling af samkultursystemer. Det har også vist sig at fungere inde i lukkede smalle cellekulturkamre, som vi testede i mikrofluidik.
I stedet for parallelle metoder, som kræver professionelt bioprintudstyr17, tilpassede skabeloner 18 eller overflademodifikation af kompleks19, kræver den Mag-Arch-baserede metode kun to nødvendigheder: magneter og GBCA'er. Magnetmønsterets overflade bestemmer cellemønsteret omvendt. Flere mønstre af striber og dot arrays som grundlæggende blev demonstreret. Brugere kan generere mønstre i frihed med forskellige former for magnetsæt, som er rigeligt kommercielt tilgængelige. For at opnå et ideelt resultat anbefales det at vedtage magneter, der leverer tilstrækkelig magnetisk kraft. I vores praksis vedtog vi N52 neodym-jern-bormagneter, hvis remanens var over 1430 mT og overflademagnetisme var over 100 mT på poler. For GBCA'er blev Gd-DTPA vedtaget, fordi det er stabilt under fysiologiske forhold og billigt tilgængeligt i de fleste lande og områder. Andre GBCA'er kunne vedtages alternativt. Makrocykliske ikke-ioniske GBCA'er, såsom gadobutrol og gadoteridol, kunne være et bedre valg til lavere cytotoksicitet ved mønster af sårbare celler til langvarig behandling11,12.
Begrænsningen af Mag-Arch-baseret cellemønster ligger hovedsageligt i arbejdsområdet for magnetfeltet genereret af magneter. Efter den omvendte firkantede formel falder magnetfeltet kraftigt med afstand8. Som følge heraf undlader Mag-Arch-metoden at samle ideelle cellemønstre på generelle polystyrencellekulturskåle eller plader, hvis bund er tykkere end 1 mm. Således skal protokollen arbejde på tyndere cellekulturoverflader, såsom glasglas eller konfokale cellekulturskåle. Ved mønster inde i mikrofluidik kræves det også, at bundgliderne af mikrofluidik skal være tyndere end 0,5 mm. Til etablering af samkultursystemer kan metoden være tidskrævende, for hver ekstra celletype øger tiden med 3-6 timer for cellefastgørelse.
Samlet set giver denne protokol en forenklet måde til cellemønster, som kunne replikeres i de fleste laboratorier uden specielt udstyr. Brugere kan vedtage det som et kraftfuldt værktøj til at studere celleadfærd, efterligne flercellede mikromiljøer eller teste celleaffiniteten af biomaterialer8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne undersøgelse støttes økonomisk af National Key R&D Program of China (2021YFA1101100), National Natural Science Foundation of China (32000971), Fundamental Research Funds for the Central Universities (nr. 2021FZZX001-42) og Starry Night Science Fund fra Zhejiang University Shanghai Institute for Advanced Study (bevillingsnr. SN-ZJU-SIAS-004).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A2780 ovarian cancer cells | Procell | CL-0013 | |
| Cell culture medium (DMEM, high glucose) | Gibco | 11995040 | |
| Cover slides | Citotest Scientific | 80340-3610 | For fabricating microfluidics. Dimension: 24 mm × 50 mm |
| DiD | MedChemExpress (MCE) | HY-D1028 | For labeling cells with red fluorescence (Ex: 640 nm) |
| DiI | MedChemExpress (MCE) | HY-D0083 | For labeling cells with orange fluorescence (Ex: 550 nm) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochannel | BC-SE-FBS07 | |
| Gadopentetate dimeglumine (Gd-DTPA) | Beijing Beilu Pharmaceutical | H10860002 | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | V900863 | |
| Glass cell slides | Citotest Scientific | 80346-2510 | Diameter: 25 mm; thickness: 0.19-0.22 mm |
| Glass plates | PURESHI hardware store | For fabricating microfluidics. Dimension: 40 mm × 75 mm | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) | Servicebio | STCC12103G-1 | |
| Neodymium-iron-boron magnets (N52) | Lalaci | ||
| Non-toxic glass plate coating (Gel Slick Solution) | Lonza | 1049286 | For convenience of demolding when fabricating microfluidics |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Servicebio | G4200 | |
| Plasma cleaner | SANHOPTT | PT-2S | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | DOWSIL | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | For fabricating microfluidics |
| Polytetrafluoroethylene (PFTE) mold | PURESHI hardware store | Customized online, for fabricating microfluidics | |
| Silicon plate | PURESHI hardware store | ||
| Smooth Muscle Cells (SMC) | Procell | CL-0517 | |
| Ultrasonic cleaner | Sapeen | CSA-02 |
References
- Christian, J., et al. Control of cell adhesion using hydrogel patterning techniques for applications in traction force microscopy. J Vis Exp. 179, e63121 (2022).
- Abbas, Y., Turco, M. Y., Burton, G. J., Moffett, A. Investigation of human trophoblast invasion in vitro. Hum Reprod Update. 26 (4), 501-513 (2020).
- Park, M., et al. Modulation of heterotypic and homotypic cell-cell interactions via zwitterionic lipid masks. Adv Healthc Mater. 6 (15), 1700063 (2017).
- Ren, T., Chen, P., Gu, L., Ogut, M. G., Demirci, U. Soft ring-shaped cellu-robots with simultaneous locomotion in batches. Adv Mater. 32 (8), e1905713 (2020).
- Ren, T., Steiger, W., Chen, P., Ovsianikov, A., Demirci, U. Enhancing cell packing in buckyballs by acoustofluidic activation. Biofabrication. 12 (2), 025033 (2020).
- Ge, S., et al. Magnetic levitation in chemistry, materials science, and biochemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 59 (41), 17810-17855 (2020).
- Puluca, N., et al. Levitating cells to sort the fit and the fat. Adv Biosyst. 4 (6), e1900300 (2020).
- Ren, T., et al. Programing cell assembly via ink-free, label-free magneto-archimedes based strategy. ACS Nano. 17 (13), 12072-12086 (2023).
- Li, Y. C., et al. Programmable laser-assisted surface microfabrication on a poly(vinyl alcohol)-coated glass chip with self-changing cell adhesivity for heterotypic cell patterning. ACS Appl Mater Interfaces. 7 (40), 22322-22332 (2015).
- Chliara, M. A., Elezoglou, S., Zergioti, I. Bioprinting on organ-on-chip: Development and applications. Biosensors (Basel). 12 (12), 1135 (2022).
- Moncal, K. K., Yaman, S., Durmus, N. G. Levitational 3D bioassembly and density-based spatial coding of levitoids. Adv Funct Mater. 32 (50), 2204092 (2022).
- Parfenov, V. A., et al. Magnetic levitational bioassembly of 3D tissue construct in space. Sci Adv. 6 (29), eaba4174 (2020).
- Dell, A. C., Wagner, G., Own, J., Geibel, J. P. 3D bioprinting using hydrogels: Cell inks and tissue engineering applications. Pharmaceutics. 14 (12), 2596 (2022).
- Ino, K., Ito, A., Honda, H. Cell patterning using magnetite nanoparticles and magnetic force. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1309-1317 (2007).
- Okochi, M., Matsumura, T., Honda, H. Magnetic force-based cell patterning for evaluation of the effect of stromal fibroblasts on invasive capacity in 3d cultures. Biosens Bioelectron. 42, 300-307 (2013).
- Mishriki, S., et al. Rapid magnetic 3D printing of cellular structures with mcf-7 cell inks. Research (Wash D C). 2019, 9854593 (2019).
- Ozturk-Oncel, M. O., Leal-Martinez, B. H., Monteiro, R. F., Gomes, M. E., Domingues, R. M. A. A dive into the bath: Embedded 3D bioprinting of freeform in vitro models. Biomater Sci. 11, 5462-5473 (2023).
- Sahni, G., Yuan, J., Toh, Y. C. Stencil micropatterning of human pluripotent stem cells for probing spatial organization of differentiation fates. J Vis Exp. 112, e54097 (2016).
- Joddar, B., et al. Engineering approaches for cardiac organoid formation and their characterization. Transl Res. 250, 46-67 (2022).
