Summary
Dit protocol beschrijft een inktvrije, labelvrije, substraatonafhankelijke, high-throughput celpatroonmethode op basis van het magnetische Archimedes-effect.
Abstract
Celpatronen, die nauwkeurige controle van de celpositionering mogelijk maken, bieden een uniek voordeel bij de studie van celgedrag. In dit protocol wordt een celpatroonstrategie geïntroduceerd op basis van het Magnetisch-Archimedes (Mag-Arch) effect. Deze aanpak maakt een nauwkeurige controle van de celverdeling mogelijk zonder het gebruik van inktmaterialen of etiketteringsdeeltjes. Door een paramagnetisch reagens in te brengen om de magnetische gevoeligheid van het celkweekmedium te vergroten, worden cellen afgestoten door magneten en rangschikken ze zich in een patroon dat complementair is aan de magneetsets die zich onder het microfluïdische substraat bevinden.
In dit artikel worden gedetailleerde procedures gegeven voor het maken van celpatronen met behulp van de op Mag-Arch gebaseerde strategie. Er worden methoden aangeboden voor het modelleren van eencellige typen en voor meerdere celtypen voor co-cultuurexperimenten. Daarnaast worden uitgebreide instructies gegeven voor het vervaardigen van microfluïdische apparaten die kanalen bevatten voor celpatronen. Het bereiken van deze functie met behulp van parallelle methoden is een uitdaging, maar kan op een vereenvoudigde en kosteneffectieve manier worden gedaan. Door gebruik te maken van op Mag-Arch gebaseerde celpatronen krijgen onderzoekers een krachtig hulpmiddel voor in-vitro-onderzoek .
Introduction
Celpatronen evolueren naar een intuïtieve en krachtige technologie voor in vitro studies1. Door celposities in kweekplaten te manipuleren, biedt het oplossingen voor een verscheidenheid aan experimenten, waaronder celmigratie2, biomimetische meercellige co-cultuur3, organoïde-assemblage4, biomateriaalstudies5 en meer. In de meeste situaties heeft een inktvrije, labelvrije methode de voorkeur voor celpatronen, omdat deze bedieningsgemak en een hoge cellevensvatbaarheid biedt voor latere onderzoeken.
Het Mag-Arch-effect is een natuurkundig fenomeen waarbij diamagnetische objecten in paramagnetische vloeistoffen de neiging hebben om naar gebieden met zwakke magnetische velden te bewegen6. Levende cellen zijn van nature diamagnetisch, terwijl celkweekmedia paramagnetisch kunnen worden gemaakt door oplosbare paramagnetische elementen toe te voegen, zoals gadopentetaat dimeglumine (Gd-DTPA), dat vaak intraveneus wordt gebruikt in beeldvorming met nucleaire magnetische resonantie als contrastmiddel7. Bijgevolg wordt verwacht dat cellen worden afgestoten door het omringende paramagnetische medium en zich verplaatsen naar gebieden waar magnetische velden zwakker zijn8. Een magnetisch veld met een patroon kan eenvoudig worden opgewekt met behulp van een set neodymiummagneten. Idealiter worden celpatronen geassembleerd in tegenstelling tot de magneetpatronen. Technisch gezien wordt dit gedefinieerd als een labelvrije methode omdat het enige extra reagens, Gd-DTPA, in de extracellulaire omgeving blijft en niet aan cellen bindt. Mogelijke invloeden op de volgende celkweek kunnen dus gemakkelijk worden vermeden door het kweekmedium te vervangen. In vergelijking met andere methoden 1,3,9,10, vereist de op Mag-Arch gebaseerde strategie geen bio-inktcomponenten of de toepassing van specifieke deeltjes om de cellen positief te labelen. Bovendien is aangetoond dat het werkt op meerdere substraten voor celadhesie en in staat is tot celpatronen met een hoge doorvoer4.
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het maken van celpatronen met behulp van de op Mag-Arch gebaseerde methode, waarbij alles aan bod komt, van de fabricage van apparaten tot het aanpassen van het celpatroon. Naast de patronen die we hebben gedemonstreerd, kunnen gebruikers eenvoudig verschillende celpatronen maken met behulp van magneten en een Gd-DTPA-oplossing. Verder zijn er ook protocollen voor het assembleren van complexe co-cultuurpatronen en het manipuleren van cellen in ingesloten microfluïdische chips.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Montage van de magneetsets
- Monteer de magneetsets voor strippatronen.
- Kies platte rechthoekige magneten, zoals afgebeeld in afbeelding 1A. De afmetingen van de rechthoekige magneten die voor deze demonstratie zijn gebruikt, zijn 1,5 mm × 10 mm × 35 mm (dikte × hoogte × lengte) (zie Materiaaltabel). De dikte van de magneten bepaalt de openingen tussen de celstrepen.
- Snijd siliconenplaten van 2 mm dik (zie Materiaaltabel) in rechthoeken van 2 mm × 8 mm × 30 mm. Zorg ervoor dat de laatste twee afmetingen van deze siliconen platen iets kleiner zijn dan die van de hierboven genoemde rechthoekige magneten om de montage te optimaliseren. De dikte van de siliconen platen bepaalt de breedte van de celstrepen.
- Monteer de rechthoekige magneten en de siliconen platen laag voor laag, zoals geïllustreerd in afbeelding 1A. Elke magneetset bestaat uit 4 magneten en 3 siliconen plaatjes. Zorg ervoor dat de polen van elke aangrenzende magneet tegenover elkaar liggen, zodat de magneetsets automatisch kunnen worden uitgelijnd vanwege de intrinsieke aantrekkingskracht.
- Steriliseer de magneten voor gebruik.
NOTITIE: Het wordt aanbevolen om de magneetsets met zuiver water te wassen en ze vervolgens gedurende 10 minuten onder te dompelen in 75% ethanol. De totale afmetingen van deze magneetsets zijn 12 mm × 10 mm × 35 mm, ontworpen om te passen op standaard 6-well celkweekplaten.
- Stel de magneetsets samen voor dot-array-patronen
- Kies miniatuur cilindrische magneten, zoals weergegeven in afbeelding 1B. De afmetingen van de cilindrische magneten die voor deze demonstratie zijn gebruikt, zijn Φ1,5 mm × 10 mm (diameter × hoogte), gemagnetiseerd in axiale richting.
- Monteer de cilindrische magneten zoals aangegeven in afbeelding 1B. Zorg ervoor dat elke magneetset bestaat uit 36 cilindrische magneten die in een raster van 6 × 6 zijn gerangschikt. Zorg er ook voor dat de polen van elke aangrenzende magneet tegengesteld zijn, zodat de magneetsets automatisch kunnen worden uitgelijnd vanwege de intrinsieke aantrekkingskracht.
- Steriliseer de magneten voor gebruik volgens dezelfde procedure als in stap 1.1.4. De totale afmetingen van deze magneetsets zijn 9 mm × 10 mm × 9 mm, ontworpen om te passen op standaard 6-well celkweekplaten.
2. Celpatroon op glasplaatjes
- Bereid het celkweekapparaat voor.
- Gebruik siliconen platen van 2 mm dik om siliconen mallen te maken. Gebruik een perforator om een rechthoekig gat van 1 cm × 1 cm in de plaat te maken. Snijd de siliconenplaat rond het gat af om een ronde mal (diameter = 25 mm) te maken met het gat in het midden, zoals afgebeeld in figuur 1C.
- Reinig de siliconen mallen grondig met een ultrasoon reinigingsmiddel. Steriliseer de mallen door ze 10 minuten met zuiver water te wassen, gevolgd door het water nog eens 10 minuten te vervangen door 75% ethanol. Droog de vormpjes ten slotte 60 minuten in een sterilisatordoos bij 65 °C.
- Bevestig de gesteriliseerde siliconen mal aan een Φ25 mm rond glascelglaasje en druk er voorzichtig op zodat de siliconen aan het glas hechten, zoals weergegeven in afbeelding 1C. Het resulterende celkweekapparaat heeft een glazen onderkant en een kweekholte van 200 μL. De afmetingen van het apparaat zijn Φ25 mm × 2,15 mm, waardoor het geschikt is voor standaard 6-well celkweekplaten.
OPMERKING: Het hierboven beschreven celkweekapparaat kan worden vervangen door andere petrischalen met een onderkant die dunner is dan 0,5 mm, zoals confocale schalen. - Plaats de magneetsets op een bord met 6 putjes. Niet-magnetische pincetten worden aanbevolen voor gebruiksgemak.
OPMERKING: Alle volgende stappen moeten vanaf dit punt onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd tot aan de waarneming van celpatronen. - Plaats het celkweekapparaat bovenop de magneetset in het putje van de plaat met 6 putjes. Zorg ervoor dat het celkweekapparaat horizontaal wordt geplaatst en dat de onderkant in nauw contact staat met de magneetset.
- Bereid het celkweekmedium voor dat Gd-DTPA bevat
- Bereid in de handel verkrijgbare Gd-DTPA-injectie voor (zie Materiaaltabel), meestal met een concentratie van 500 mM. Verdun de injectie door 30 μL Gd-DTPA-injectie toe te voegen aan 470 μL compleet celkweekmedium om een doelconcentratie van 30 mM te bereiken.
OPMERKING: Afhankelijk van de lokale regelgeving en beschikbaarheid kunnen andere contrastmiddelen op basis van gadolinium (GBCA's) met dezelfde doelconcentratie vergelijkbare resultaten opleveren11.
- Bereid in de handel verkrijgbare Gd-DTPA-injectie voor (zie Materiaaltabel), meestal met een concentratie van 500 mM. Verdun de injectie door 30 μL Gd-DTPA-injectie toe te voegen aan 470 μL compleet celkweekmedium om een doelconcentratie van 30 mM te bereiken.
- Maak de celpatronen.
- Oogst cellen voor patroonvorming. In deze demonstratie werden endotheelcellen van de menselijke navelstrengader (HUVEC's, zie Tabel met materialen) gebruikt voor het maken van patronen (Figuur 2). Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 200 x g (bij kamertemperatuur) om ze uit suspensie te halen en opnieuw te suspenderen in het Gd-DTPA-bevattende medium. Tel de celdichtheid.
- Pas de celdichtheid aan tot ongeveer ~2 × 105 cellen/ml met Gd-DTPA-bevattend medium. Meng de celsuspensie voorzichtig en voeg 200 μL toe aan de holte van elke celkweekvorm om een tot de rand gevuld vloeibaar oppervlak te creëren.
- Breng de plaat voorzichtig over in een celkweekincubator en incubeer gedurende 3-6 uur totdat de cellen goed aan het substraat hechten. Vermijd het dichtslaan van de couveusedeur om interferentie met de assemblage van celpatronen te voorkomen. Voor cellen met een slechte hechting is nachtelijke behandeling met GBCA's over het algemeen veilig12.
- Celpatronen worden als voltooid beschouwd wanneer cellen zich hechten aan de bodem van de holte van het celkweekapparaat. Vervang het Gd-DTPA-bevattende medium door een compleet kweekmedium.
- Verwijder het celkweekapparaat uit de magneetset. Men kan het celpatroon onmiddellijk observeren of het apparaat overbrengen naar een nieuwe kweekplaat voor verdere kweek.
3. Co-cultuur patronen door magneet zijwaarts: fabricage van de bewegende sjabloon
OPMERKING: De volgende procedure wordt gepresenteerd om te profiteren van op Mag-Arch gebaseerde celpatronen en om de mogelijkheid van meer toepassingen te onderzoeken.
- Bereid het apparaat voor op het maken van stripcelpatronen volgens stap 1 en stap 2. Verlaag echter de celdichtheid tot 1 × 105 cellen/ml en vervang de siliconenplaten die de magneten scheiden door dunnere, waardoor elk streepcelpatroon dunner wordt.
OPMERKING: Dit biedt voldoende ruimte voor het leggen van meerdere cellen in streeppatronen. Ter referentie raden wij aan om voor het scheiden van de magneten 1 mm siliconen platen te gebruiken in plaats van 2 mm. - Patroon van het eerste type cellen zoals geïllustreerd in de stappen 2.2-2.3. Deze stap vereist ook 3-6 uur voor celbevestiging.
OPMERKING: Om verschillende celtypen in het co-cultuursysteem te onderscheiden, kunnen gebruikers cellen labelen met fluorescerende kleurstoffen zoals DiI, DiD of celtrackers (CMTPX, CMFDA, CMAC, enz.) voordat ze een patroon maken. Voeg bijvoorbeeld voor DiI- en DiD-kleuring 1 μL van de stockoplossing (10 mM) (zie Materiaaltabel) per 1 ml FBS-vrij medium toe en meng goed om een werkoplossing te verkrijgen. Vervang het kweekmedium door de werkoplossing om de aanhangende cellen te bedekken. Na 30 minuten incuberen en drie keer wassen met PBS, gaat u verder met het oogsten van cellen. - Nadat u het eerste type cellen hebt gevormd, verplaatst u het celkweekapparaat 1 mm van de onderstaande magneten naar rechts, zoals geïllustreerd in figuur 3Aii.
- Was de objectglaasjes voorzichtig met 200 μL PBS tweemaal. Laat de dia's niet drogen.
- Patroon van het tweede type cellen op dezelfde manier als geïllustreerd in de stappen 2.2-2.3.
- Beweeg het celkweekapparaat 1 mm van de onderstaande magneten naar rechts, zoals geïllustreerd in figuur 3Aiii, en was de glasplaatjes opnieuw met 200 μL PBS. Patroon het derde type cellen op dezelfde manier als geïllustreerd in de stappen 2.2-2.3.
- Na het patroon van alle soorten cellen, wast u de glasglaasjes voorzichtig twee keer met 200 μL PBS en vervangt u ze door een compleet celkweekmedium.
- Verwijder het celkweekapparaat uit de magneetset. Men kan dan het celpatroon observeren of het apparaat overbrengen naar een nieuwe kweekplaat voor verdere kweek.
4. Co-cultuurpatronen door de concentratie van Gd-DTPA aan te passen
OPMERKING: GBCA's hebben geen significante invloed op de celadhesie of de daaropvolgende groei bij werkconcentraties (≤75 mM). Bovendien worden celpatronen beïnvloed door de concentratie van Gd-DTPA: hogere concentraties resulteren in kleinere/dunnere celpatronen. Het is dus mogelijk om co-cultuursystemen te creëren door simpelweg de concentratie van Gd-DTPA aan te passen. In dit voorbeeld ziet u patronen van concentrische cirkelvormige arrays.
- Patroon het eerste type cellen zoals geïllustreerd in stap 2.2-2.3 met behulp van miniatuur cilindrische magneten uit stap 1.2. Label de cellen met fluorescerende kleurstoffen zoals DiI, DiD of celtrackers (zie stap 3) voordat u ze oogst om verschillende celtypen in het co-cultuursysteem te onderscheiden.
OPMERKING: Men heeft een hogere concentratie Gd-DTPA nodig (50 mM in plaats van 30 mM) en een lagere celdichtheid, ongeveer 1 × 105 cellen/ml. - Na het vormen van de eerste celreeks, wast u de glasglaasjes voorzichtig twee keer met 200 μL PBS. Laat de glaasjes niet drogen.
- Patroon het tweede type cellen volgens dezelfde procedure als voorheen. Houd de glasplaatjes relatief onbeweeglijk op de magneten om ontwrichting te voorkomen. Het wordt aanbevolen om een siliconenplaat met een holte die op de magneetsets past, aan de onderkant van het glasplaatje te bevestigen.
OPMERKING: Hier heeft men een lagere concentratie Gd-DTPA nodig (20 mM in plaats van 30 mM), zodat de tweede celpatronen naar verwachting groter zullen zijn dan de eerste, zoals geïllustreerd in figuur 3B. - Na het patroon van alle soorten cellen, wast u de glasglaasjes twee keer voorzichtig met 200 μL PBS en vervangt u het medium door een compleet celkweekmedium.
- Verwijder het celkweekapparaat uit de magneetset. Men kan dan het celpatroon observeren of het apparaat overbrengen naar een nieuwe kweekplaat voor verdere kweek.
5. Celpatroon in microfluïdische chip
OPMERKING: In onze vorige studie is aangetoond dat de op Mag-Arch gebaseerde methode werkt in gesloten smalle kamers8. Hier is een voorbeeld van het maken van patronen in dot-arrays in een microfluïdisch kanaal.
- Fabricage van de microfluïdumchip
- Pas vormen van 40 mm × 75 mm × 20 mm polytetrafluorethyleen (PTFE) aan (zie Materiaaltabel) met een rechthoekige holte van 24 mm × 50 mm × 8 mm, zoals geïllustreerd in afbeelding 4A.
- Druk een siliconenplaat van 0,5 mm dik plat. Snijd de siliconenplaten volgens de vorm van het vloeistofkanaal, dat een rechthoekige holte heeft van 15 mm × 20 mm × 0,5 mm met driehoekige buffergebieden aan zowel de inlaat- als de uitlaatzijde, zoals geïllustreerd in figuur 4A,B.
- Personaliseer rechthoekige glasplaten van 40 mm × 75 mm. Reinig de glasplaten gedurende 30 s met luchtplasma.
- Bedek de glasplaten onmiddellijk na de luchtplasmareiniging met 0,5 ml van een in de handel verkrijgbare anti-adhesiebuffer (zie Materiaaltabel) en laat ze aan de lucht drogen. Was de glasplaten een keer met ethanol en laat ze aan de lucht drogen.
- Bevestig een in stap 5.1.2 voorbereide siliconenplaat stevig in het midden van een glasplaat, zoals geïllustreerd in figuur 4A.
- Bereid polydimethylsiloxaan (PDMS) prepolymeer volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel). Weeg voor elke PDMS-chip 10 g van het basisbestanddeel en 1 g van het verstevigingsmiddel af in een centrifugebuis van 50 ml.
- Meng de middelen grondig met een glazen roerstaaf tot kleine belletjes gelijkmatig in het colloïde zijn verdeeld. Het mengen duurt 5-10 minuten, afhankelijk van het colloïdvolume. Centrifugeer het colloïde prepolymeer gedurende 1 minuut op 500 x g (bij kamertemperatuur) om luchtbellen te verwijderen.
- Giet langzaam ~10 ml van het prepolymeer in de holte om de PTFE-mal te vullen.
- Plaats de mal voorzichtig in een vacuümreservoir en houd deze horizontaal om te voorkomen dat het prepolymeer wegvloeit.
- Verwijder resterende luchtbellen uit het prepolymeer met een vacuümpomp. Het stofzuigen duurt 120-180 min.
- Giet indien nodig meer prepolymeer om de vormholte verder te vullen. Stofzuig nog eens 60 minuten.
- Bedek de PTFE-mal voorzichtig met de glasplaat, met de silicazijde naar de holte gericht, zoals geïllustreerd in afbeelding 4Bi.
- Zorg ervoor dat alle luchtbellen worden geëlimineerd. Breng de vorm over naar een droogoven van 60 °C om het prepolymeer een nacht te laten stollen.
- Haal de vorm uit de oven. Na afkoeling de gestolde PDMS-afdekking voorzichtig omvormen. Maak een inlaat en een uitlaat met een naaldperforator van Φ1 mm.
- Was de PDMS-afdekking en de 24 mm × 50 mm afdekglaasjes volgens stap 2.1.2.
NOTITIE: Ga verder met de volgende stappen onder steriele omstandigheden. - Bevestig een PDMS-deksel en een afdekglaasje om een microfluïdumchip te maken met een stroomkanaal van ongeveer ~500 μm hoog. De onderkant moet bestaan uit een glazen afdekglaasje van ~0,15 mm om celpatronen mogelijk te maken met de op Mag-Arch gebaseerde strategie.
- Monteer in de handel verkrijgbare steriele adapters in zowel de inlaat als de uitlaat van de microfluïdumchip8.
- Bereid een 2% (w/v, opgelost in PBS) gelatinecoatingbuffer voor. Steriliseer de buffer door middel van autoclaveren.
- Injecteer de gelatinecoatingbuffer in de chip via de inlaatadapter met behulp van een spuit van 1 ml. Als er luchtbellen ontstaan, spoel ze dan weg met extra coatingbuffer.
- Plaats de chip in een celkweekschaal van 10 cm. Voeg 1 ml PBS toe rond de bodem van de schaal om uitdroging te voorkomen. Breng de schaal over naar een celkweekincubator. Het coaten duurt 30 min.
- Spoel de coatingbuffer uit met 2 ml Gd-houdend medium (30 mM) via de inlaat.
- Injecteer voorzichtig 1 ml celsuspensie met 30 mM Gd-DTPA met een spuit van 1 ml.
- Patrooncellen zoals geïllustreerd in stap 2.2-2.3 met behulp van miniatuur cilindrische magneten uit stap 1.2.
NOTITIE: Het wordt echter aanbevolen om een siliconenplaat met een holte die op de magneetsets past, aan de onderkant van het glasplaatje te bevestigen, zoals weergegeven in afbeelding 4Ci. - Ververs na het vormen van het patroon het Gd-DTPA-medium voorzichtig met 1 ml compleet medium door te spoelen met een spuit van 1 ml.
OPMERKING: Het proces van celpatroon in microfluïdica, van stap 5.7-5.9, duurt ongeveer 180 minuten, wat vergelijkbaar is met celpatronen op standaard glasplaatjes. - Kwantificeer de patronen onder een microscoop. Sluit indien nodig de microfluïdumchip aan op een circulerend kweekapparaat voor verdere teelt.
OPMERKING: Onze ervaring is dat cellen ten minste 72 uur kunnen groeien wanneer ze worden ondersteund door een eenvoudig apparaat op basis van een micropomp, dat de microfluïdica voorziet van een continue stroom vers kweekmedium in een celincubator8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rechthoekige (1,5 mm × 10 mm × 35 mm) en cilindrische (Φ1,5 m × 10 mm) magneten werden geselecteerd om als demonstratie celpatronen te creëren. Gebruikers hebben de flexibiliteit om de grootte en vorm van magneten aan te passen of ze anders te monteren om verschillende celpatronen te creëren. In figuur 1A,B werden de magneten geassembleerd, waarbij de magnetische polen voor de duidelijkheid in blauw (zuid) en rood (noord) zijn afgebeeld. In deze configuratie trekken magneten elkaar zijdelings aan en richten ze zich op elkaar, zoals geïllustreerd in figuur 2. Figuur 1C,D illustreert de structuur van het celkweekapparaat en de procedure voor het maken van celpatronen.
Figuur 2 toont mono-type celpatronen. GFP-gelabelde HUVEC's werden gebruikt voor observatie onder een fluorescerende microscoop. De cellen werden georganiseerd in streep- en dot-arraypatronen met behulp van overeenkomstige magneetsets. Voor HOVEC's, die snel hechten aan objectglaasjes (binnen 120-180 min), werd de hele procedure in 4 uur voltooid. Het volgen van het protocol resulteerde in patronen met goed gedefinieerde randen en een hoge uniformiteit. Om de levensvatbaarheid te bepalen, werden de cellen gedurende 12 uur behandeld met Gd-DTPA, wat veel langer is dan 3-6 uur in stap 2. Zowel de Levende/Dode kleuring als de CCK8-test8 vertoonden echter geen significante afname van de levensvatbaarheid van de cellen. Een relatief hoge concentratie Gd-DTPA (50 mM) veroorzaakte een statistisch verschil, maar behield nog steeds een leefbaar percentage van 90,76% ± 1,78% (aanvullende figuur 1).
Voortbouwend op het mono-type cell patterning protocol, werden multi-type cell patterning voorbeelden gegeven voor mogelijke co-culturing toepassingen. In dit scenario werden HUVEC's, A2780 eierstokkankercellen en gladde spiercellen (SMC's) gebruikt. Om onderscheid te maken, werden de cellen gelabeld met GFP, DiD en DiI voordat ze een patroon maakten. Door stap 3 te volgen, werd een driedelig celpatroon van zij-aan-zij strepen gegenereerd (Figuur 3A). Omgekeerd werd stap 4 gebruikt om concentrische dot-arrays te maken door de concentratie van Gd-DTPA aan te passen (Figuur 3B). De eerste laag cellen werd gekleurd met DiI (rood) en voorzien van een patroon met 50 mM Gd-DTPA, terwijl de tweede laag cellen werd gelabeld met GFP (groen) en een patroon kreeg met 25 mM Gd-DTPA. Bijgevolg was de puntgrootte van de eerste laag kleiner, concentrisch omgeven door de tweede laag cellen met een puntpatroon. Verschillende celtypen vertoonden verschillende aanhechtings- en verspreidingssnelheden, waarbij HUVEC's zich snel hechtten en zich verspreidden, A2780's zich snel hechtten maar zich langzamer verspreidden, en SMC's zich relatief langzaam hechtten en verspreidden. Deze resultaten toonden aan dat verschillende celtypen in 3 uur celpatronen kunnen vormen en kunnen worden gebruikt in co-cultuurexperimenten.
Bovendien werd aangetoond dat celpatronen met behulp van een magnetisch veld compatibel waren met gesloten smalkweekapparaten, zoals microfluïdische chips. Door stap 5 te volgen, werden microfluïdische chips gefabriceerd en werden er dot-arrays in gegenereerd (Figuur 4).
Figuur 1: Opzet en schematisch diagram van mag-arch-gebaseerde celpatronen . (A) Assemblage van magneetsets voor het maken van streepcelpatronen. (B) Assemblage van magneetsets voor het genereren van dot array celpatronen. (C) Installatie van het celkweekapparaat. (D) Stap-voor-stap procedure voor het maken van celpatronen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Assemblage van apparaten en patronen van HUVEC's in streep- en dot-arraypatronen. (A) Magneetsets die zijn opgesloten in celkweekapparaten (i) en geplaatst in een celkweekplaat (ii). (B) en (C) Magneetsets en de bijbehorende celpatronen. Cellen werden gelabeld met groen fluorescerend eiwit (GFP) voor visualisatie van het celpatroon. Schaalbalken = 1,5 mm; inzetstukken = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Patroonvorming van co-cultuursystemen met een stapsgewijze strategie. (A) Co-cultuurpatronen met behulp van een magneet zijwaarts (i-iii). Cellen werden gelabeld met GFP (groen), DiD (blauw) en DiI (rood) om verschillende celtypen te onderscheiden. Schaalbalken = 1 mm. (B) Co-cultuurpatroon bereikt door aanpassing van de Gd-DTPA-concentratie; i) 50 mM, ii) 20 mM. Schaalbalken = 1,5 mm; inzetstukken = 250 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Celpatroon in een microfluïdische kamer. (A) Schematisch diagram van de microfluïdische vorm. (B) Fabricage van microfluïdica met behulp van polydimethylsiloxaan (PDMS) (i,ii). (C) Celpatronen in het microfluïdische apparaat (i,ii) en een representatief resultaat met dot-array-celpatronen (iii). Cellen werden gelabeld met groen fluorescerend eiwit (GFP). Schaalbalk = 3 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Invloed van Gd-DTPA op de levensvatbaarheid van cellen. HUVEC's werden gedurende 12 uur behandeld met verschillende concentraties Gd-DTPA en vervolgens onderworpen aan een levende/dode kleuring of CCK-8-test. (A) Levende/dode kleuring van HUVEC's. Schaalbalken = 200 μm. (B) Histogram met de resultaten van de kleuring van levende/dode kleuren. (C) Histogram met CCK-8-testresultaten. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De op Mag-Arch gebaseerde celpatronen bieden een gebruiksvriendelijke oplossing voor de meeste biomedische laboratoria. Deze methode gaat parallel aan karakters van inktvrij, labelvrij, substraatonafhankelijk en de mogelijkheid voor high-throughput patronen 8,13. Voor mono-type celpatronen worden cellen in één stap gemodelleerd. De procedure eindigt eenvoudig met het opfrissen van kweekmediums.
Eerdere studies hebben magnetische deeltjes gebruikt om cellen te labelen en ze met magneten aan te trekken om precieze patronen te vormen14,15. De aanwezigheid van magnetische deeltjes op cellen leidde echter tot bezorgdheid over mogelijke effecten op het gedrag van cellen. Mag-Arch-gebaseerde celpatronen nemen de tegenovergestelde strategie door extracellulaire vloeistoffen paramagnetisch te maken in plaats van cellen. Deze strategie maakt het veel gemakkelijker om de extra paramagnetische reagentia te verwijderen door het kweekmedium te verversen. Studies hebben cellulaire bollen en dot-arrays gegenereerd met op Mag-Arch gebaseerde celpatronen11,16. Vergeleken met bestaande op Mag-Arch gebaseerde studies, kunnen de methoden die door dit protocol worden gepresenteerd, de vorm van patronen vrij aanpassen. Bovendien presenteert het protocol strategieën voor het fabriceren van co-cultuursystemen. Het is ook bewezen dat het werkt in gesloten smalle celkweekkamers, zoals we hebben getest in microfluïdica.
In plaats van parallelle methoden, waarvoor professionele bioprintapparatuur17, aangepaste sjablonen 18 of oppervlaktemodificatie van complex19 nodig zijn, vereist de op Mag-Arch gebaseerde methode slechts twee benodigdheden: magneten en GBCA's. Het oppervlak van het magneetpatroon bepaalt omgekeerd het celpatroon. Verschillende patronen van strepen en dot arrays als basis werden gedemonstreerd. Gebruikers kunnen naar believen patronen genereren met verschillende vormen van magneetsets, die in de handel overvloedig verkrijgbaar zijn. Om een ideaal resultaat te bereiken, is het aan te raden magneten te gebruiken die voldoende magneetkracht leveren. In onze praktijk gebruikten we N52 neodymium-ijzer-boormagneten, waarvan de remanentie meer dan 1430 mT was en het oppervlaktemagnetisme meer dan 100 mT op polen. Voor GBCA's werd Gd-DTPA aangenomen omdat het stabiel is in fysiologische omstandigheden en goedkoop verkrijgbaar is in de meeste landen en gebieden. Andere GBCA's zouden als alternatief kunnen worden aangenomen. Macrocyclische niet-ionische GBCA's, zoals gadobutrol en gadoteridol, zouden een betere keuze kunnen zijn voor lagere cytotoxiciteit bij het vormen van kwetsbare cellen voor langdurige behandeling11,12.
De beperking van Mag-Arch-gebaseerde celpatronen ligt voornamelijk in het werkgebied van het magnetische veld dat door magneten wordt gegenereerd. Volgens de omgekeerde kwadratenformule neemt het magnetisch veld sterk af met afstand8. Als gevolg hiervan slaagt de Mag-Arch-methode er niet in om ideale celpatronen samen te stellen op algemene polystyreencelkweekschalen of -platen, waarvan de bodem dikker is dan 1 mm. Het protocol moet dus werken op dunnere celkweekoppervlakken, zoals glasplaatjes of confocale celkweekschaaltjes. Bij het patroon in microfluïdica is het ook vereist dat de onderste glaasjes van microfluïdica dunner zijn dan 0,5 mm. Voor het opzetten van co-cultuursystemen kan de methode tijdrovend zijn, want elk extra celtype verlengt de tijd voor celhechting met 3-6 uur.
Over het algemeen biedt dit protocol een vereenvoudigde manier voor celpatronen, die in de meeste laboratoria kunnen worden gerepliceerd zonder speciale apparatuur. Gebruikers kunnen het gebruiken als een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van celgedrag, het nabootsen van meercellige micro-omgevingen of het testen van de celaffiniteit van biomaterialen8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Deze studie wordt financieel ondersteund door het National Key R&D-programma van China (2021YFA1101100), de National Natural Science Foundation of China (32000971), de Fundamental Research Funds for the Central Universities (nr. 2021FZZX001-42) en het Starry Night Science Fund van het Zhejiang University Shanghai Institute for Advanced Study (subsidienr. SN-ZJU-SIAS-004).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A2780 ovarian cancer cells | Procell | CL-0013 | |
| Cell culture medium (DMEM, high glucose) | Gibco | 11995040 | |
| Cover slides | Citotest Scientific | 80340-3610 | For fabricating microfluidics. Dimension: 24 mm × 50 mm |
| DiD | MedChemExpress (MCE) | HY-D1028 | For labeling cells with red fluorescence (Ex: 640 nm) |
| DiI | MedChemExpress (MCE) | HY-D0083 | For labeling cells with orange fluorescence (Ex: 550 nm) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochannel | BC-SE-FBS07 | |
| Gadopentetate dimeglumine (Gd-DTPA) | Beijing Beilu Pharmaceutical | H10860002 | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | V900863 | |
| Glass cell slides | Citotest Scientific | 80346-2510 | Diameter: 25 mm; thickness: 0.19-0.22 mm |
| Glass plates | PURESHI hardware store | For fabricating microfluidics. Dimension: 40 mm × 75 mm | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) | Servicebio | STCC12103G-1 | |
| Neodymium-iron-boron magnets (N52) | Lalaci | ||
| Non-toxic glass plate coating (Gel Slick Solution) | Lonza | 1049286 | For convenience of demolding when fabricating microfluidics |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Servicebio | G4200 | |
| Plasma cleaner | SANHOPTT | PT-2S | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | DOWSIL | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | For fabricating microfluidics |
| Polytetrafluoroethylene (PFTE) mold | PURESHI hardware store | Customized online, for fabricating microfluidics | |
| Silicon plate | PURESHI hardware store | ||
| Smooth Muscle Cells (SMC) | Procell | CL-0517 | |
| Ultrasonic cleaner | Sapeen | CSA-02 |
References
- Christian, J., et al. Control of cell adhesion using hydrogel patterning techniques for applications in traction force microscopy. J Vis Exp. 179, e63121 (2022).
- Abbas, Y., Turco, M. Y., Burton, G. J., Moffett, A. Investigation of human trophoblast invasion in vitro. Hum Reprod Update. 26 (4), 501-513 (2020).
- Park, M., et al. Modulation of heterotypic and homotypic cell-cell interactions via zwitterionic lipid masks. Adv Healthc Mater. 6 (15), 1700063 (2017).
- Ren, T., Chen, P., Gu, L., Ogut, M. G., Demirci, U. Soft ring-shaped cellu-robots with simultaneous locomotion in batches. Adv Mater. 32 (8), e1905713 (2020).
- Ren, T., Steiger, W., Chen, P., Ovsianikov, A., Demirci, U. Enhancing cell packing in buckyballs by acoustofluidic activation. Biofabrication. 12 (2), 025033 (2020).
- Ge, S., et al. Magnetic levitation in chemistry, materials science, and biochemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 59 (41), 17810-17855 (2020).
- Puluca, N., et al. Levitating cells to sort the fit and the fat. Adv Biosyst. 4 (6), e1900300 (2020).
- Ren, T., et al. Programing cell assembly via ink-free, label-free magneto-archimedes based strategy. ACS Nano. 17 (13), 12072-12086 (2023).
- Li, Y. C., et al. Programmable laser-assisted surface microfabrication on a poly(vinyl alcohol)-coated glass chip with self-changing cell adhesivity for heterotypic cell patterning. ACS Appl Mater Interfaces. 7 (40), 22322-22332 (2015).
- Chliara, M. A., Elezoglou, S., Zergioti, I. Bioprinting on organ-on-chip: Development and applications. Biosensors (Basel). 12 (12), 1135 (2022).
- Moncal, K. K., Yaman, S., Durmus, N. G. Levitational 3D bioassembly and density-based spatial coding of levitoids. Adv Funct Mater. 32 (50), 2204092 (2022).
- Parfenov, V. A., et al. Magnetic levitational bioassembly of 3D tissue construct in space. Sci Adv. 6 (29), eaba4174 (2020).
- Dell, A. C., Wagner, G., Own, J., Geibel, J. P. 3D bioprinting using hydrogels: Cell inks and tissue engineering applications. Pharmaceutics. 14 (12), 2596 (2022).
- Ino, K., Ito, A., Honda, H. Cell patterning using magnetite nanoparticles and magnetic force. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1309-1317 (2007).
- Okochi, M., Matsumura, T., Honda, H. Magnetic force-based cell patterning for evaluation of the effect of stromal fibroblasts on invasive capacity in 3d cultures. Biosens Bioelectron. 42, 300-307 (2013).
- Mishriki, S., et al. Rapid magnetic 3D printing of cellular structures with mcf-7 cell inks. Research (Wash D C). 2019, 9854593 (2019).
- Ozturk-Oncel, M. O., Leal-Martinez, B. H., Monteiro, R. F., Gomes, M. E., Domingues, R. M. A. A dive into the bath: Embedded 3D bioprinting of freeform in vitro models. Biomater Sci. 11, 5462-5473 (2023).
- Sahni, G., Yuan, J., Toh, Y. C. Stencil micropatterning of human pluripotent stem cells for probing spatial organization of differentiation fates. J Vis Exp. 112, e54097 (2016).
- Joddar, B., et al. Engineering approaches for cardiac organoid formation and their characterization. Transl Res. 250, 46-67 (2022).
