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Bioengineering

चुंबकीय-आर्किमिडीज रणनीति का उपयोग करके सेल पैटर्निंग

Published: February 2, 2024 doi: 10.3791/66063
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Cardiology of The Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2State Key Laboratory of Transvascular Implantation Devices, 3Cardiovascular Key Laboratory of Zhejiang Province

Summary

यह प्रोटोकॉल चुंबकीय आर्किमिडीज प्रभाव के आधार पर एक स्याही-मुक्त, लेबल-मुक्त, सब्सट्रेट-स्वतंत्र, उच्च-थ्रूपुट सेल पैटर्निंग विधि का वर्णन करता है।

Abstract

सेल पैटर्निंग, सेल पोजिशनिंग के सटीक नियंत्रण की अनुमति देता है, सेल व्यवहार के अध्ययन में एक अनूठा लाभ प्रस्तुत करता है। इस प्रोटोकॉल में, चुंबकीय-आर्किमिडीज (मैग-आर्क) प्रभाव पर आधारित एक सेल पैटर्निंग रणनीति पेश की जाती है। यह दृष्टिकोण स्याही सामग्री या लेबलिंग कणों के उपयोग के बिना सेल वितरण के सटीक नियंत्रण को सक्षम बनाता है। सेल संस्कृति माध्यम की चुंबकीय संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए एक पैरामैग्नेटिक अभिकर्मक शुरू करके, कोशिकाओं को मैग्नेट द्वारा खदेड़ दिया जाता है और खुद को माइक्रोफ्लुइडिक सब्सट्रेट के नीचे स्थित चुंबक सेट के पूरक पैटर्न में व्यवस्थित किया जाता है।

इस लेख में, मैग-आर्क-आधारित रणनीति का उपयोग करके सेल पैटर्निंग के लिए विस्तृत प्रक्रियाएं प्रदान की गई हैं। एकल सेल प्रकार के रूप में अच्छी तरह से सह संस्कृति प्रयोगों के लिए कई सेल प्रकार patterning के लिए तरीके की पेशकश कर रहे हैं. इसके अतिरिक्त, सेल पैटर्निंग के लिए चैनल युक्त माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के निर्माण के लिए व्यापक निर्देश प्रदान किए जाते हैं। समानांतर तरीकों का उपयोग करके इस सुविधा को प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण है लेकिन इसे सरल और लागत प्रभावी तरीके से किया जा सकता है। मैग-आर्क-आधारित सेल पैटर्निंग को नियोजित करना शोधकर्ताओं को इन विट्रो अनुसंधान के लिए एक शक्तिशाली उपकरण से लैस करता है।

Introduction

सेल patterning इन विट्रो अध्ययन1 में के लिए एक सहज और शक्तिशाली तकनीक में विकसित हो रहा है. संस्कृति प्लेटों में सेल पदों में हेरफेर करके, यह सेल माइग्रेशन2, बायोमिमेटिक बहुकोशिकीय सह-संस्कृति3, ऑर्गेनॉइड असेंबली4, बायोमटेरियल अध्ययन5, और अधिक सहित विभिन्न प्रयोगों के लिए समाधान प्रदान करता है। ज्यादातर स्थितियों में, एक स्याही मुक्त, लेबल मुक्त विधि सेल patterning के लिए पसंद किया है क्योंकि यह आपरेशन और बाद की जांच के लिए उच्च सेल व्यवहार्यता की आसानी प्रदान करता है.

मैग-आर्क प्रभाव एक भौतिक घटना है जिसमें अनुचुंबकीय तरल पदार्थों में प्रतिचुंबकीय वस्तुएं कमजोर चुंबकीय क्षेत्र6 वाले क्षेत्रों की ओर बढ़ती हैं। जीवित कोशिकाएं स्वाभाविक रूप से डायमैग्नेटिक होती हैं, जबकि सेल कल्चर मीडिया को घुलनशील पैरामैग्नेटिक तत्वों को जोड़कर पैरामैग्नेटिक बनाया जा सकता है, जैसे कि गैडोपेंटेट डाइमेग्लुमिन (जीडी-डीटीपीए), आमतौर पर एक विपरीत एजेंट7 के रूप में परमाणु चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग में अंतःशिरा रूप से उपयोग किया जाता है। नतीजतन, कोशिकाओं को आसपास के पैरामैग्नेटिक माध्यम द्वारा खदेड़ दिया जाता है और उन क्षेत्रों की ओर बढ़ने की उम्मीद की जाती है जहां चुंबकीय क्षेत्र कमजोर होते हैं8. एक पैटर्न चुंबकीय क्षेत्र आसानी से neodymium मैग्नेट का एक सेट का उपयोग उत्पन्न किया जा सकता है. आदर्श रूप से, सेल पैटर्न चुंबक पैटर्न के विरोध में इकट्ठे होते हैं। तकनीकी रूप से, इसे एक लेबल-मुक्त विधि के रूप में परिभाषित किया गया है क्योंकि एकमात्र अतिरिक्त अभिकर्मक, Gd-DTPA, बाह्य वातावरण में रहता है और कोशिकाओं से बंधता नहीं है। इस प्रकार, बाद सेल संस्कृति पर संभावित प्रभाव आसानी से संस्कृति माध्यम की जगह से बचा जा सकता है. अन्य तरीकों 1,3,9,10 की तुलना में, मैग-आर्क-आधारित रणनीति को कोशिकाओं को सकारात्मक रूप से लेबल करने के लिए जैव-स्याही घटकों या विशिष्ट कणों के आवेदन की आवश्यकता नहीं होती है। इसके अलावा, यह सेल आसंजन के लिए कई substrates पर काम करने के लिए दिखाया गया है और उच्च throughput सेल patterning4 के लिए सक्षम है.

यह लेख मैग-आर्क-आधारित विधि का उपयोग करके सेल पैटर्निंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जिसमें डिवाइस निर्माण से लेकर सेल पैटर्न को समायोजित करने तक सब कुछ शामिल है। हमारे द्वारा प्रदर्शित पैटर्न के अलावा, उपयोगकर्ता मैग्नेट और जीडी-डीटीपीए समाधान का उपयोग करके आसानी से विभिन्न सेल पैटर्न बना सकते हैं। इसके अलावा, जटिल सह-संस्कृति पैटर्न को इकट्ठा करने और संलग्न माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स में कोशिकाओं में हेरफेर करने के लिए प्रोटोकॉल भी प्रदान किए जाते हैं।

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Protocol

1. चुंबक सेट को इकट्ठा करना

  1. पट्टी पैटर्न के लिए चुंबक सेट इकट्ठा.
    1. फ्लैट आयताकार मैग्नेट चुनें, जैसा कि चित्रा 1 ए में दर्शाया गया है। इस प्रदर्शन के लिए उपयोग किए जाने वाले आयताकार मैग्नेट के आयाम 1.5 मिमी × 10 मिमी × 35 मिमी (मोटाई × ऊंचाई × लंबाई) हैं ( सामग्री की तालिकादेखें)। मैग्नेट की मोटाई सेल धारियों के बीच अंतराल को निर्धारित करती है।
    2. 2 मिमी-मोटी सिलिकॉन प्लेटों ( सामग्री की तालिकादेखें) को 2 मिमी × 8 मिमी × 30 मिमी आयतों में काटें। सुनिश्चित करें कि इन सिलिकॉन प्लेटों के बाद के दो आयाम असेंबली को अनुकूलित करने के लिए ऊपर वर्णित आयताकार मैग्नेट की तुलना में थोड़े छोटे हैं। सिलिकॉन प्लेटों की मोटाई सेल धारियों की चौड़ाई निर्धारित करती है।
    3. आयताकार मैग्नेट और सिलिकॉन प्लेटों परत परत इकट्ठा, के रूप में चित्रा 1 ए में सचित्र. प्रत्येक चुंबक सेट में 4 मैग्नेट और 3 सिलिकॉन प्लेट होते हैं। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक आसन्न चुंबक के ध्रुव विपरीत हैं ताकि चुंबक सेट आंतरिक आकर्षक बल के कारण स्वचालित रूप से संरेखित हो सकें।
    4. उपयोग करने से पहले मैग्नेट को जीवाणुरहित करें।
      नोट: चुंबक सेट को शुद्ध पानी से धोने और फिर उन्हें 10 मिनट के लिए 75% इथेनॉल में डुबोने की सिफारिश की जाती है। इन चुंबक सेट के समग्र आयाम मानक 6 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों फिट करने के लिए डिज़ाइन किए गए 12 मिमी × 10 मिमी × 35 मिमी हैं।
  2. डॉट-सरणी पैटर्न के लिए चुंबक सेट इकट्ठा करें
    1. लघु बेलनाकार मैग्नेट चुनें, जैसा कि चित्र 1B में दिखाया गया है। इस प्रदर्शन के लिए उपयोग किए जाने वाले बेलनाकार मैग्नेट के आयाम अक्षीय दिशा में चुंबकित Φ1.5 मिमी × 10 मिमी (व्यास × ऊंचाई) हैं।
    2. चित्रा 1 बी में संकेत के रूप में बेलनाकार मैग्नेट इकट्ठा. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक चुंबक सेट में 6 × 6 ग्रिड में व्यवस्थित 36 बेलनाकार मैग्नेट होते हैं। इसके अलावा, सुनिश्चित करें कि प्रत्येक आसन्न चुंबक के ध्रुव आंतरिक आकर्षक बल के कारण चुंबक सेट को स्वचालित रूप से संरेखित करने की अनुमति देने के लिए विपरीत हैं।
    3. उपयोग करने से पहले मैग्नेट को जीवाणुरहित करें, चरण 1.1.4 के समान प्रक्रिया का पालन करें। इन चुंबक सेट के समग्र आयाम 9 मिमी × 10 मिमी × 9 मिमी हैं, जिन्हें मानक 6-वेल सेल कल्चर प्लेटों को फिट करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।

2. ग्लास स्लाइड पर सेल patterning

  1. सेल संस्कृति डिवाइस तैयार करें.
    1. सिलिकॉन मोल्ड बनाने के लिए 2 मिमी-मोटी सिलिकॉन प्लेटों का उपयोग करें। प्लेट में 1 सेमी × 1 सेमी आयताकार छेद बनाने के लिए एक पंचर का उपयोग करें। केंद्र में छेद के साथ एक गोल मोल्ड (व्यास = 25 मिमी) शिल्प करने के लिए छेद के चारों ओर सिलिकॉन प्लेट ट्रिम करें, जैसा कि चित्रा 1 सी में दर्शाया गया है।
    2. अल्ट्रासोनिक क्लीनर का उपयोग करके सिलिकॉन मोल्ड्स को अच्छी तरह से साफ करें। उन्हें 10 मिनट के लिए शुद्ध पानी से धोकर नए साँचे बाँझ, एक और 10 मिनट के लिए 75% इथेनॉल के साथ पानी की जगह के द्वारा पीछा किया. अंत में, 60 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक स्टरलाइज़र बॉक्स में नए नए साँचे सूखी.
    3. निष्फल सिलिकॉन मोल्ड को Φ25 मिमी गोल ग्लास सेल स्लाइड में संलग्न करें और धीरे से इसे दबाएं ताकि सिलिकॉन ग्लास का पालन करे, जैसा कि चित्र 1C में दिखाया गया है। परिणामस्वरूप सेल संस्कृति डिवाइस में एक ग्लास अंडरसाइड और 200 माइक्रोन संस्कृति गुहा होगा। डिवाइस के आयाम Φ25 मिमी × 2.15 मिमी हैं, जो इसे मानक 6-वेल सेल कल्चर प्लेटों के लिए उपयुक्त बनाते हैं।
      नोट: ऊपर वर्णित सेल संस्कृति डिवाइस को 0.5 मिमी से पतले अंडरसाइड्स के साथ अन्य पेट्री डिश के साथ बदला जा सकता है, जैसे कि कॉन्फोकल डिश।
    4. चुंबक सेट को 6-वेल प्लेट पर रखें। ऑपरेशन में आसानी के लिए गैर-चुंबकीय चिमटी की सिफारिश की जाती है।
      नोट: बाद के सभी चरणों सेल पैटर्न के अवलोकन तक इस बिंदु से बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए.
    5. 6 अच्छी तरह से थाली के कुएं में सेट चुंबक के शीर्ष पर सेल संस्कृति डिवाइस स्थिति. सुनिश्चित करें कि सेल संस्कृति डिवाइस क्षैतिज रखा गया है, और नीचे चुंबक सेट के साथ निकट संपर्क में है.
  2. Gd-DTPA युक्त सेल संस्कृति माध्यम तैयार
    1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जीडी-डीटीपीए इंजेक्शन ( सामग्री की तालिकादेखें) तैयार करें, आमतौर पर 500 मिमी की एकाग्रता के साथ। 30 मिमी की लक्ष्य एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पूर्ण सेल संस्कृति माध्यम के 470 माइक्रोन में जीडी-डीटीपीए इंजेक्शन के 30 माइक्रोन जोड़कर इंजेक्शन को पतला करें।
      नोट: स्थानीय नियमों और उपलब्धता के आधार पर, एक ही लक्ष्य एकाग्रता के साथ अन्य गैडोलीनियम आधारित विपरीत एजेंट (जीबीसीए) समान परिणाम11 उपज सकते हैं।
  3. सेल पैटर्न बनाएँ।
    1. पैटर्न के लिए फसल कोशिकाओं. इस प्रदर्शन में, मानव गर्भनाल शिरा एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचयूवीईसी, सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग पैटर्निंग(चित्रा 2)के लिए किया गया था। उन्हें निलंबन से इकट्ठा करने के लिए 200 x ग्राम (कमरे के तापमान पर) पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें और उन्हें जीडी-डीटीपीए युक्त माध्यम में फिर से निलंबित करें। सेल घनत्व की गणना.
    2. जीडी-डीटीपीए युक्त माध्यम के साथ सेल घनत्व को लगभग ~ 2 × 105 कोशिकाओं / एमएल में समायोजित करें। धीरे सेल निलंबन मिश्रण और एक ब्रिम पूर्ण तरल सतह बनाने के लिए प्रत्येक सेल संस्कृति मोल्ड की गुहा के लिए 200 माइक्रोन जोड़ें.
    3. ध्यान से एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में थाली हस्तांतरण और 3-6 घंटे के लिए सेते हैं जब तक कोशिकाओं सब्सट्रेट के लिए अच्छी तरह से पालन करते हैं. सेल पैटर्न की विधानसभा के साथ हस्तक्षेप को रोकने के लिए इनक्यूबेटर दरवाजा पटकने से बचें. गरीब आसंजन दर के साथ कोशिकाओं के लिए, जीबीसीए के साथ रात भर उपचार आम तौर पर12 सुरक्षित है.
    4. सेल पैटर्निंग को पूरा माना जाता है जब कोशिकाएं सेल कल्चर डिवाइस की गुहा के नीचे का पालन करती हैं। Gd-DTPA युक्त माध्यम को पूर्ण संस्कृति माध्यम से बदलें।
    5. चुंबक सेट से सेल संस्कृति डिवाइस निकालें. कोई या तो तुरंत सेल पैटर्न का निरीक्षण कर सकता है या आगे की खेती के लिए डिवाइस को एक नई संस्कृति प्लेट में स्थानांतरित कर सकता है।

3. चुंबक बग़ल में द्वारा सह-संस्कृति पैटर्निंग: चलती टेम्पलेट का निर्माण

नोट: मैग-आर्क-आधारित सेल पैटर्निंग का लाभ उठाने और अधिक अनुप्रयोगों की संभावना का पता लगाने के लिए निम्नलिखित प्रक्रिया प्रस्तुत की गई है।

  1. चरण 1 और चरण 2 के बाद धारी सेल patterning के लिए डिवाइस तैयार करें. हालांकि, सेल घनत्व को 1 × 105 कोशिकाओं / एमएल तक कम करें और सिलिकॉन प्लेटों को प्रतिस्थापित करें जो मैग्नेट को पतले लोगों से अलग करते हैं, जिससे प्रत्येक पट्टी सेल पैटर्न पतला हो जाता है।
    नोट: यह पट्टी पैटर्न में कई कोशिकाओं को बिछाने के लिए पर्याप्त क्षेत्र प्रदान करता है। एक संदर्भ के रूप में, हम मैग्नेट को अलग करने के लिए 2 मिमी के बजाय 1 मिमी सिलिकॉन प्लेटों का उपयोग करने का सुझाव देते हैं।
  2. पहले प्रकार की कोशिकाओं को पैटर्न करें जैसा कि चरण 2.2-2.3 में दिखाया गया है। इस कदम को सेल अटैचमेंट के लिए 3-6 घंटे की भी आवश्यकता होती है।
    नोट: सह-संस्कृति प्रणाली में विभिन्न सेल प्रकारों को अलग करने के लिए, उपयोगकर्ता प्रतिमान से पहले DiI, DiD, या सेल ट्रैकर्स (CMTPX, CMFDA, CMAC, आदि) जैसे फ्लोरोसेंट रंगों के साथ कोशिकाओं को लेबल कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, डीआईआई और डीआईडी धुंधला होने के लिए, एफबीएस मुक्त माध्यम के प्रति 1 एमएल स्टॉक समाधान (10 मिमी) ( सामग्री की तालिकादेखें) के 1 माइक्रोन जोड़ें और एक कार्यशील समाधान प्राप्त करने के लिए अच्छी तरह मिलाएं। पालन कोशिकाओं को कवर करने के लिए काम कर रहे समाधान के साथ संस्कृति माध्यम बदलें. 30 मिनट के लिए ऊष्मायन और तीन बार पीबीएस के साथ धोने के बाद, सेल कटाई के साथ आगे बढ़ें।
  3. कोशिकाओं के पहले प्रकार patterning के बाद, सही करने के लिए नीचे मैग्नेट से सेल संस्कृति डिवाइस 1 मिमी ले जाएँ, के रूप में चित्रा 3Aii में सचित्र है.
  4. धीरे पीबीएस के 200 माइक्रोन के साथ कांच स्लाइड धो दो बार. स्लाइड्स सूखी दे से बचें.
  5. दूसरे प्रकार की कोशिकाओं को उसी तरीके से पैटर्न करें जैसा कि चरण 2.2-2.3 में दिखाया गया है।
  6. नीचे मैग्नेट से सेल कल्चर डिवाइस 1 मिमी को दाईं ओर ले जाएं, जैसा कि चित्र 3Aiii में दिखाया गया है, और ग्लास स्लाइड को फिर से पीबीएस के 200 माइक्रोन के साथ धो लें। तीसरे प्रकार की कोशिकाओं को उसी तरीके से पैटर्न करें जैसा कि चरण 2.2-2.3 में दिखाया गया है।
  7. कोशिकाओं के सभी प्रकार patterning के बाद, धीरे दो बार पीबीएस के 200 माइक्रोन के साथ कांच स्लाइड धो लें और पूरा सेल संस्कृति माध्यम के साथ बदलें.
  8. चुंबक सेट से सेल संस्कृति डिवाइस निकालें. फिर कोई सेल पैटर्न का निरीक्षण कर सकता है या आगे की खेती के लिए डिवाइस को एक नई कल्चर प्लेट में स्थानांतरित कर सकता है।

4. जीडी-डीटीपीए की एकाग्रता को समायोजित करके सह-संस्कृति पैटर्निंग

नोट: जीबीसीए काम कर रहे सांद्रता (≤75 मिमी) पर सेल आसंजन या बाद में वृद्धि को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं करते हैं। इसके अतिरिक्त, सेल पैटर्न Gd-DTPA की एकाग्रता से प्रभावित होते हैं: उच्च सांद्रता के परिणामस्वरूप छोटे/पतले सेल पैटर्न होते हैं। इस प्रकार, केवल Gd-DTPA की एकाग्रता को समायोजित करके सह-संस्कृति प्रणाली बनाना संभव है। यह उदाहरण पैटर्निंग संकेंद्रित परिपत्र सरणियों को प्रदर्शित करता है।

  1. चरण 1.2 से लघु बेलनाकार मैग्नेट का उपयोग करके चरण 2.2-2.3 में सचित्र के रूप में कोशिकाओं के पहले प्रकार पैटर्न. ऐसे DiI, DiD, या सेल ट्रैकर्स (चरण 3 देखें) के रूप में फ्लोरोसेंट रंगों के साथ कोशिकाओं लेबल उन्हें कटाई करने से पहले उन्हें सह संस्कृति प्रणाली में अलग करने के लिए.
    नोट: एक Gd-DTPA (50 मिमी के बजाय 30 मिमी) और एक कम सेल घनत्व, लगभग 1 × 105 कोशिकाओं / एमएल की एक उच्च एकाग्रता की आवश्यकता होगी.
  2. पहले सेल सरणी patterning के बाद, धीरे पीबीएस के 200 माइक्रोन के साथ दो बार कांच स्लाइड धो लें. स्लाइड्स को सूखने देने से बचें।
  3. पहले की तरह ही प्रक्रिया का पालन करते हुए दूसरे प्रकार की कोशिकाओं को पैटर्न करें। अव्यवस्था को रोकने के लिए मैग्नेट पर कांच की स्लाइड को अपेक्षाकृत गतिहीन रखें। एक खोखले के साथ एक सिलिकॉन प्लेट संलग्न करना जो चुंबक सेट को ग्लास स्लाइड के नीचे की सतह पर फिट करता है, की सिफारिश की जाती है।
    नोट: यहां, किसी को जीडी-डीटीपीए (30 मिमी के बजाय 20 मिमी) की कम एकाग्रता की आवश्यकता होगी ताकि दूसरे सेल पैटर्न पहले से बड़ा होने की उम्मीद है, जैसा कि चित्रा 3 बी में दिखाया गया है।
  4. कोशिकाओं के सभी प्रकार patterning के बाद, धीरे दो बार पीबीएस के 200 माइक्रोन के साथ कांच स्लाइड धो लें और पूरा सेल संस्कृति माध्यम के साथ माध्यम की जगह.
  5. चुंबक सेट से सेल संस्कृति डिवाइस निकालें. फिर कोई सेल पैटर्न का निरीक्षण कर सकता है या आगे की खेती के लिए डिवाइस को एक नई कल्चर प्लेट में स्थानांतरित कर सकता है।

5. माइक्रोफ्लुइडिक चिप में सेल पैटर्निंग

नोट: मैग-आर्क-आधारित विधि को हमारे पिछले अध्ययन8 में संलग्न संकीर्ण कक्षों में काम करने के लिए प्रदर्शित किया गया है। यहाँ एक microfluidic चैनल में डॉट सरणियों patterning का एक उदाहरण है.

  1. माइक्रोफ्लुइड चिप का निर्माण
    1. 40 मिमी × 75 मिमी × 20 मिमी पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन (पीटीएफई) मोल्ड्स ( सामग्री की तालिकादेखें) को अनुकूलित करें जिसमें 24 मिमी × 50 मिमी × 8 मिमी की आयताकार गुहा होती है, जैसा कि चित्र 4ए में दिखाया गया है।
    2. 0.5 मिमी मोटी सिलिकॉन प्लेट को समतल करें। द्रव चैनल के आकार के अनुसार सिलिकॉन प्लेटों को काटें, जिसमें इनलेट और आउटलेट दोनों पक्षों पर त्रिकोणीय बफर क्षेत्रों के साथ 15 मिमी × 20 मिमी × 0.5 मिमी की आयताकार गुहा है, जैसा कि चित्रा 4 ए, बी में दिखाया गया है।
    3. 40 मिमी × 75 मिमी आयताकार ग्लास प्लेटों को अनुकूलित करें। 30 एस के लिए हवा प्लाज्मा के साथ कांच की प्लेटों को साफ करें।
    4. इसके तुरंत बाद हवा प्लाज्मा सफाई के बाद, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विरोधी आसंजन बफर ( सामग्री की तालिकादेखें) के 0.5 एमएल के साथ ग्लास प्लेटों को कवर करें और उन्हें हवा में सूखने दें। कांच की प्लेटों को एक बार इथेनॉल से धो लें और उन्हें हवा में सूखने दें।
    5. चरण 5.1.2 में तैयार एक सिलिकॉन प्लेट को ग्लास प्लेट के बीच में सुरक्षित रूप से संलग्न करें, जैसा कि चित्र 4A में दिखाया गया है।
    6. निर्माता के निर्देशों के अनुसार पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) प्रीपोलिमर तैयार करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। प्रत्येक पीडीएमएस चिप के लिए, आधार घटक के 10 ग्राम और फर्मिंग एजेंट के 1 ग्राम का वजन 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में करें।
    7. एजेंटों को एक ग्लास सरगर्मी रॉड के साथ अच्छी तरह मिलाएं जब तक कि छोटे बुलबुले समान रूप से कोलाइड में वितरित न हों। कोलाइड की मात्रा के आधार पर मिश्रण 5-10 मिनट लेता है। बुलबुले को खत्म करने के लिए 500 x ग्राम (कमरे के तापमान पर) पर 1 मिनट के लिए कोलाइड प्रीपोलीमर को सेंट्रीफ्यूज करें।
    8. धीरे-धीरे PTFE मोल्ड को भरने के लिए गुहा में प्रीपोलिमर के ~ 10 एमएल डालें।
    9. मोल्ड को सावधानी से एक वैक्यूम जलाशय में रखें और प्रीपोलिमर को बहने से रोकने के लिए इसे क्षैतिज रखें।
    10. एक वैक्यूम पंप के साथ prepolymer से अवशिष्ट हवा बुलबुले निकालें. वैक्यूमिंग में 120-180 मिनट लगते हैं।
    11. यदि आवश्यक हो, तो मोल्ड गुहा को और भरने के लिए अधिक प्रीपोलिमर डालें। एक और 60 मिनट के लिए वैक्यूम।
    12. ग्लास प्लेट के साथ PTFE मोल्ड को ध्यान से कवर करें, सिलिका पक्ष गुहा का सामना कर रहा है, जैसा कि चित्र 4Bi में दिखाया गया है।
    13. सुनिश्चित करें कि सभी बुलबुले समाप्त हो गए हैं. रात भर जमने के लिए प्रीपोलिमर के लिए मोल्ड को 60 डिग्री सेल्सियस सुखाने वाले ओवन में स्थानांतरित करें।
    14. मोल्ड को ओवन से निकालें। ठंडा होने के बाद, ठोस पीडीएमएस कवर को सावधानी से डिमोल्ड करें। Φ1 मिमी सुई पंचर के साथ एक इनलेट और एक आउटलेट बनाएं।
    15. पीडीएमएस कवर और 24 मिमी × 50 मिमी कवर स्लाइड को चरण 2.1.2 के अनुसार धो लें।
      नोट: बाँझ परिस्थितियों में निम्नलिखित चरणों के साथ आगे बढ़ें।
    16. ऊंचाई में लगभग ~ 500 माइक्रोन के प्रवाह चैनल युक्त एक माइक्रोफ्लुइड चिप बनाने के लिए एक पीडीएमएस कवर और एक कवर स्लाइड संलग्न करें। नीचे की तरफ मैग-आर्क-आधारित रणनीति के साथ सेल पैटर्निंग को सक्षम करने के लिए ~ 0.15 मिमी ग्लास कवर स्लाइड शामिल होनी चाहिए।
  2. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बाँझ एडेप्टर को माइक्रोफ्लुइड चिप8 के इनलेट और आउटलेट दोनों में इकट्ठा करें।
  3. एक 2% (डब्ल्यू / वी, पीबीएस में भंग) जिलेटिन कोटिंग बफर तैयार करें। आटोक्लेविंग द्वारा बफर बाँझ.
  4. एक 1 एमएल सिरिंज का उपयोग कर इनलेट एडाप्टर के माध्यम से चिप में जिलेटिन कोटिंग बफर इंजेक्षन. यदि बुलबुले निकलते हैं, तो उन्हें अतिरिक्त कोटिंग बफर के साथ फ्लश करें।
  5. चिप को 10 सेमी सेल कल्चर डिश में रखें। सुखाने से बचने के लिए डिश तल के आसपास पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें. डिश को सेल कल्चर इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें। कोटिंग में 30 मिनट लगते हैं।
  6. इनलेट के माध्यम से जीडी निहित माध्यम (30 मिमी) के 2 एमएल के साथ कोटिंग बफर को फ्लश करें।
  7. धीरे एक 1 एमएल सिरिंज के साथ 30 एमएम जीडी-डीटीपीए युक्त सेल निलंबन के 1 एमएल इंजेक्षन.
  8. चरण 1.2 से लघु बेलनाकार मैग्नेट का उपयोग करके चरण 2.2-2.3 में सचित्र पैटर्न कोशिकाएं।
    नोट: हालांकि, एक खोखले के साथ एक सिलिकॉन प्लेट संलग्न करना जो चुंबक सेट को ग्लास स्लाइड के नीचे की सतह पर फिट करता है, की सिफारिश की जाती है, जैसा कि चित्र 4Ci में दिखाया गया है।
  9. patterning के बाद, धीरे एक 1 एमएल सिरिंज के साथ फ्लशिंग द्वारा पूरा माध्यम के 1 एमएल के साथ GD-DTPA निहित माध्यम ताज़ा करें.
    नोट: माइक्रोफ्लुइडिक्स में सेल पैटर्निंग की प्रक्रिया, 5.7-5.9 कदम से, मानक ग्लास स्लाइड पर सेल पैटर्निंग के समान है जो लगभग 180 मिनट लेता है।
  10. एक खुर्दबीन के तहत पैटर्न की मात्रा निर्धारित करें। यदि आवश्यक हो, तो आगे की खेती के लिए माइक्रोफ्लुइड चिप को एक परिसंचारी संस्कृति उपकरण से कनेक्ट करें।
    नोट: हमारे अनुभव में, कोशिकाओं को कम से कम 72 घंटे के लिए विकसित करने में सक्षम हैं जब एक साधारण micropump आधारित डिवाइस है, जो एक सेल इनक्यूबेटर8 में ताजा संस्कृति माध्यम का एक सतत प्रवाह के साथ microfluidics प्रदान करता है द्वारा समर्थित.

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Representative Results

आयताकार (1.5 मिमी × 10 मिमी × 35 मिमी) और बेलनाकार (Φ1.5 मीटर × 10 मिमी) मैग्नेट को प्रदर्शन के रूप में सेल पैटर्न बनाने के लिए चुना गया था। उपयोगकर्ताओं के पास मैग्नेट के आकार और आकार को संशोधित करने या विविध सेल पैटर्न बनाने के लिए उन्हें अलग तरह से इकट्ठा करने का लचीलापन है। चित्रा 1 ए, बी में, मैग्नेट को इकट्ठा किया गया था, जिसमें चुंबकीय ध्रुवों को स्पष्टता के लिए नीले (दक्षिण) और लाल (उत्तर) में दर्शाया गया था। इस विन्यास में, मैग्नेट एक दूसरे को पार्श्व रूप से आकर्षित करते हैं और खुद को संरेखित करते हैं, जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है। चित्रा 1 सी, डी सेल संस्कृति डिवाइस और सेल पैटर्निंग प्रक्रिया की संरचना को दर्शाता है।

चित्रा 2 मोनो प्रकार सेल पैटर्न प्रदर्शित करता है. GFP लेबल HUVECs एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत अवलोकन के लिए उपयोग किया गया. कोशिकाओं को संबंधित चुंबक सेट का उपयोग करके पट्टी और डॉट सरणी पैटर्न में व्यवस्थित किया गया था। एचयूवीईसी के लिए, जो ग्लास स्लाइड (120-180 मिनट के भीतर) का तेजी से पालन करते हैं, पूरी प्रक्रिया 4 घंटे में पूरी हुई थी। प्रोटोकॉल के बाद अच्छी तरह से परिभाषित किनारों और उच्च एकरूपता के साथ पैटर्न में हुई. व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए, कोशिकाओं को 12 घंटे के लिए जीडी-डीटीपीए के साथ इलाज किया गया था, जो चरण 2 में 3-6 घंटे से अधिक लंबा है। हालांकि, लाइव/डेड स्टेनिंग और CCK8 परख8 दोनों ने सेल व्यवहार्यता में कोई महत्वपूर्ण कमी नहीं दिखाई। जीडी-डीटीपीए (50 मिमी) की अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता ने एक सांख्यिकीय अंतर को प्रेरित किया, लेकिन फिर भी 90.76% ± 1.78% (अनुपूरक चित्रा 1) की जीवित दर को संरक्षित किया।

मोनो प्रकार सेल patterning प्रोटोकॉल पर बिल्डिंग, बहु प्रकार सेल patterning उदाहरण संभावित सह संवर्धन अनुप्रयोगों के लिए प्रदान की गई. इस परिदृश्य में, एचयूवीईसी, ए 2780 डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं, और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (एसएमसी) को नियोजित किया गया था। उनके बीच अंतर करने के लिए, कोशिकाओं को पैटर्निंग से पहले GFP, DiD और DiI के साथ लेबल किया गया था। चरण 3 का पालन करके, साइड-बाय-साइड धारियों का एक त्रिपक्षीय सेल पैटर्न उत्पन्न किया गया था(चित्र 3ए)। इसके विपरीत, चरण 4 का उपयोग जीडी-डीटीपीए(चित्रा 3बी)की एकाग्रता को समायोजित करके संकेंद्रित डॉट सरणियों को बनाने के लिए किया गया था। कोशिकाओं की पहली परत DiI (लाल) के साथ दाग दिया गया था और 50 मिमी Gd-DTPA के साथ patterned, जबकि कोशिकाओं की दूसरी परत GFP (हरा) के साथ लेबल और 25 मिमी Gd-DTPA के साथ patterned था. नतीजतन, पहली परत का डॉट आकार छोटा था, जो डॉट-पैटर्न वाली कोशिकाओं की दूसरी परत से केंद्रित रूप से घिरा हुआ था। विभिन्न सेल प्रकारों ने अलग-अलग लगाव और प्रसार दरों का प्रदर्शन किया, जिसमें एचयूवीईसी संलग्न होते हैं और तेजी से फैलते हैं, ए 2780 तेजी से संलग्न होते हैं लेकिन अधिक धीरे-धीरे फैलते हैं, और एसएमसी अपेक्षाकृत धीरे-धीरे जुड़ते हैं और फैलते हैं। इन परिणामों से पता चला है कि विभिन्न सेल प्रकार 3 घंटे में सेल पैटर्न बना सकते हैं और सह-संस्कृति प्रयोगों में उपयोग किए जा सकते हैं।

इसके अलावा, यह प्रदर्शित किया गया था कि चुंबकीय क्षेत्र का उपयोग करके सेल पैटर्निंग संलग्न संकीर्ण संस्कृति उपकरणों, जैसे माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स के साथ संगत थी। चरण 5 का पालन करके, माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स गढ़े गए थे, और डॉट सरणियों को उनके भीतर उत्पन्न किया गया था (चित्र 4)।

Figure 1
चित्रा 1: मैग-आर्क-आधारित सेल पैटर्निंग का सेटअप और योजनाबद्ध आरेख । (ए) पट्टी सेल पैटर्न बनाने के लिए चुंबक सेट की विधानसभा। (बी)डॉट सरणी सेल पैटर्न उत्पन्न करने के लिए चुंबक सेट की विधानसभा। (सी) सेल कल्चर डिवाइस का सेटअप। (डी) सेल पैटर्निंग के लिए चरण-दर-चरण प्रक्रिया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: उपकरणों की असेंबली और पट्टी और डॉट सरणी पैटर्न में एचयूवीईसी पैटर्निंग । (ए) चुंबक सेट सेल संस्कृति उपकरणों (i) के भीतर सीमित है और एक सेल संस्कृति प्लेट (ii) में रखा गया है। (बी) और (सी) चुंबक सेट और इसी सेल पैटर्न. सेल पैटर्न के दृश्य के लिए कोशिकाओं को हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के साथ लेबल किया गया था। स्केल बार = 1.5 मिमी; इनसेट = 500 माइक्रोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: चरण-दर-चरण रणनीति के साथ सह-संस्कृति प्रणालियों को पैटर्न करना। (ए) चुंबक बग़ल में (i-iii) का उपयोग करके सह-संस्कृति पैटर्निंग। कोशिकाओं GFP (हरा), DiD (नीला), और DiI (लाल) के साथ लेबल किया गया था विभिन्न सेल प्रकार भेद करने के लिए. स्केल बार = 1 मिमी। (बी) जीडी-डीटीपीए एकाग्रता को समायोजित करके प्राप्त सह-संस्कृति पैटर्निंग; (i) 50 मिमी, (ii) 20 मिमी। स्केल बार = 1.5 मिमी; इनसेट = 250 माइक्रोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एक माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष में सेल पैटर्निंग। (ए) माइक्रोफ्लुइडिक मोल्ड का योजनाबद्ध आरेख। (बी) पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) (i, ii) का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक्स का निर्माण। (सी) माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस (i, ii) के भीतर सेल पैटर्निंग और डॉट सरणी सेल पैटर्न (iii) दिखाने वाला एक प्रतिनिधि परिणाम। कोशिकाओं को हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के साथ लेबल किया गया था। स्केल बार = 3 मिमी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 1: सेल व्यवहार्यता पर जीडी-डीटीपीए का प्रभाव। HUVECs 12 घंटे के लिए Gd-DTPA की अलग-अलग सांद्रता के साथ इलाज किया गया और फिर लाइव/डेड स्टेनिंग या CCK-8 परख के अधीन किया गया। (ए) एचयूवीईसी का लाइव/डेड धुंधलापन। स्केल बार = 200 माइक्रोन। (बी) हिस्टोग्राम लाइव/मृत धुंधला परिणाम चित्रण. (सी) सीसीके -8 परख परिणाम दिखा हिस्टोग्राम. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

मैग-आर्क-आधारित सेल पैटर्निंग अधिकांश बायोमेडिकल प्रयोगशालाओं के लिए उपयोगकर्ता के अनुकूल समाधान प्रदान करता है। यह विधि स्याही मुक्त, लेबल-मुक्त, सब्सट्रेट-स्वतंत्र, और उच्च-थ्रूपुट पैटर्निंग 8,13 के लिए क्षमता के समानांतर आगे बढ़ती है। मोनो प्रकार सेल patterning के लिए, यह एक कदम रास्ते में कोशिकाओं पैटर्न. प्रक्रिया बस संस्कृति माध्यमों को ताज़ा करके समाप्त होती है।

पिछले अध्ययनों ने कोशिकाओं को लेबल करने और उन्हें मैग्नेट के साथ आकर्षित करने के लिए चुंबकीय कणों का उपयोग किया है ताकि सटीक पैटर्न14,15 बन सकें। हालांकि, कोशिकाओं पर चुंबकीय कणों की उपस्थिति ने सेल व्यवहार पर संभावित प्रभावों के बारे में चिंताओं को उठाया। मैग-आर्क-आधारित सेल पैटर्निंग कोशिकाओं के बजाय बाह्य तरल पदार्थ पैरामैग्नेटिक को बदलकर विपरीत रणनीति लेता है। यह रणनीति संस्कृति माध्यम को ताज़ा करके अतिरिक्त पैरामैग्नेटिक अभिकर्मकों को हटाने के लिए बहुत आसान बनाती है। अध्ययनों ने मैग-आर्क-आधारित सेल पैटर्निंग11,16 के साथ सेलुलर क्षेत्रों और डॉट सरणियों को उत्पन्न किया है। मौजूदा मैग-आर्क-आधारित अध्ययनों की तुलना में, इस प्रोटोकॉल द्वारा प्रस्तुत विधियां पैटर्न के आकार को स्वतंत्र रूप से अनुकूलित कर सकती हैं। इसके अलावा, प्रोटोकॉल सह-संस्कृति प्रणालियों के निर्माण के लिए रणनीति प्रस्तुत करता है। यह संलग्न संकीर्ण सेल संस्कृति कक्षों के अंदर काम करने के लिए भी साबित हुआ है, जैसा कि हमने माइक्रोफ्लुइडिक्स में परीक्षण किया था।

समानांतर तरीकों के बजाय, जिसके लिए पेशेवर बायोप्रिंटिंग उपकरण17, अनुकूलित टेम्प्लेट18, या जटिल19 के सतह संशोधन की आवश्यकता होती है, मैग-आर्क-आधारित विधि के लिए केवल दो आवश्यकताओं की आवश्यकता होती है: मैग्नेट और जीबीसीए। चुंबक पैटर्न की सतह सेल पैटर्न को विपरीत रूप से निर्धारित करती है। बुनियादी के रूप में धारियों और डॉट सरणियों के कई पैटर्न का प्रदर्शन किया गया था। उपयोगकर्ता चुंबक सेट के विभिन्न आकारों के साथ स्वतंत्रता पर पैटर्न उत्पन्न कर सकते हैं, जो प्रचुर मात्रा में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। एक आदर्श परिणाम प्राप्त करने के लिए, मैग्नेट को अपनाने की सिफारिश की जाती है जो पर्याप्त चुंबकीय बल प्रदान करते हैं। हमारे अभ्यास में, हमने N52 नियोडिमियम-लौह-बोरॉन मैग्नेट को अपनाया, जिसका अवशेष 1430 mT से अधिक था और सतह चुंबकत्व ध्रुवों पर 100 mT से अधिक था। जीबीसीए के लिए, जीडी-डीटीपीए को अपनाया गया था क्योंकि यह शारीरिक परिस्थितियों में स्थिर है और अधिकांश देशों और क्षेत्रों में सस्ते में उपलब्ध है। अन्य जीबीसीए को वैकल्पिक रूप से अपनाया जा सकता है। मैक्रोसाइक्लिक गैर-आयनिक जीबीसीए, जैसे गैडोब्यूट्रोल और गैडोटेरिडोल, लंबे समय तक उपचार11,12के लिए कमजोर कोशिकाओं को पैटर्न करते समय कम साइटोटॉक्सिसिटी के लिए बेहतर विकल्प हो सकता है।

मैग-आर्क-आधारित सेल पैटर्निंग की सीमा मुख्य रूप से मैग्नेट द्वारा उत्पन्न चुंबकीय क्षेत्र के कार्य क्षेत्र में निहित है। व्युत्क्रम-वर्ग सूत्र के बाद, चुंबकीय क्षेत्र दूरी8 के साथ तेजी से घटता है। नतीजतन, मैग-आर्क विधि सामान्य पॉलीस्टायर्न सेल संस्कृति व्यंजन या प्लेटों पर आदर्श सेल पैटर्न को इकट्ठा करने में विफल रहती है, जिनके बॉटम्स 1 मिमी से अधिक मोटे होते हैं। इस प्रकार, प्रोटोकॉल पतली सेल संस्कृति सतहों, इस तरह के ग्लास स्लाइड या confocal सेल संस्कृति व्यंजन के रूप में काम करने के लिए है. माइक्रोफ्लुइडिक्स के अंदर पैटर्न करते समय, यह भी आवश्यक है कि माइक्रोफ्लुइडिक्स की निचली स्लाइड 0.5 मिमी से पतली होनी चाहिए। सह-संस्कृति प्रणालियों की स्थापना के लिए, विधि समय लेने वाली हो सकती है, प्रत्येक अतिरिक्त सेल प्रकार के लिए सेल लगाव के लिए 3-6 घंटे तक समय बढ़ जाता है।

कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल सेल patterning, जो किसी भी विशेष उपकरण के बिना सबसे प्रयोगशालाओं में दोहराया जा सकता है के लिए एक सरलीकृत तरीका प्रदान करता है. उपयोगकर्ता इसे सेल व्यवहार का अध्ययन करने, बहुकोशिकीय माइक्रोएन्वायरमेंट की नकल करने, या बायोमैटेरियल्स8 की सेल आत्मीयता का परीक्षण करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में अपना सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

यह अध्ययन चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (2021YFA1101100), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (32000971), केंद्रीय विश्वविद्यालयों के लिए मौलिक अनुसंधान कोष (संख्या 2021FZZX001-42), और झेजियांग विश्वविद्यालय शंघाई इंस्टीट्यूट फॉर एडवांस्ड स्टडी (अनुदान सं। एसएन-जेडजेयू-एसआईएएस -004)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A2780 ovarian cancer cells Procell CL-0013
Cell culture medium (DMEM, high glucose) Gibco 11995040
Cover slides Citotest Scientific 80340-3610 For fabricating microfluidics. Dimension: 24 mm × 50 mm
DiD MedChemExpress (MCE)  HY-D1028 For labeling cells with red fluorescence (Ex: 640 nm)
DiI MedChemExpress (MCE)  HY-D0083  For labeling cells with orange fluorescence (Ex: 550 nm)
Fetal Bovine Serum (FBS) Biochannel BC-SE-FBS07
Gadopentetate dimeglumine (Gd-DTPA) Beijing Beilu Pharmaceutical  H10860002
Gelatin Sigma Aldrich V900863
Glass cell slides Citotest Scientific 80346-2510 Diameter: 25 mm; thickness: 0.19-0.22 mm
Glass plates PURESHI hardware store For fabricating microfluidics. Dimension: 40 mm × 75 mm
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) Servicebio STCC12103G-1
Neodymium-iron-boron magnets (N52) Lalaci
Non-toxic glass plate coating (Gel Slick Solution) Lonza 1049286 For convenience of demolding when fabricating microfluidics
Phosphate Buffered Saline (PBS) Servicebio G4200
Plasma cleaner SANHOPTT PT-2S
Polydimethylsiloxane (PDMS) kit DOWSIL SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit For fabricating microfluidics
Polytetrafluoroethylene (PFTE) mold PURESHI hardware store Customized online, for fabricating microfluidics
Silicon plate PURESHI hardware store
Smooth Muscle Cells (SMC) Procell CL-0517
Ultrasonic cleaner Sapeen CSA-02

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 204
चुंबकीय-आर्किमिडीज रणनीति का उपयोग करके सेल पैटर्निंग
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Zhou, X., Maitusong, M., Ren, T.,… More

Zhou, X., Maitusong, M., Ren, T., Wu, Y. Cell Patterning Using Magnetic-Archimedes Strategy. J. Vis. Exp. (204), e66063, doi:10.3791/66063 (2024).

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