Summary
Этот протокол описывает метод создания высокопроизводительных ячеек без чернил, меток, не зависящий от субстрата, основанный на эффекте магнитного Архимеда.
Abstract
Клеточный паттерн, позволяющий точно контролировать их расположение, представляет собой уникальное преимущество в изучении поведения клеток. В этом протоколе представлена стратегия формирования ячеек на основе эффекта Магнитного Архимеда (Mag-Arch). Такой подход позволяет точно контролировать распределение ячеек без использования красящих материалов или частиц этикетки. При введении парамагнитного реагента для повышения магнитной восприимчивости среды клеточной культуры клетки отталкиваются магнитами и выстраиваются в структуру, дополняющую наборы магнитов, расположенные под микрофлюидной подложкой.
В данной статье подробно описаны процедуры формирования ячеек с использованием стратегии, основанной на Mag-Arch. Предложены методы структурирования одноклеточных типов, а также множественных типов клеток для экспериментов с кокультурами. Кроме того, предоставляются подробные инструкции по изготовлению микрофлюидных устройств, содержащих каналы для формирования клеточных структур. Достижение этой функции с помощью параллельных методов является сложной задачей, но может быть выполнено упрощенным и экономичным способом. Использование клеточного паттерна на основе Mag-Arch дает исследователям мощный инструмент для исследований in vitro .
Introduction
Определение клеточных структур превращается в интуитивно понятную и мощную технологию для исследований in vitro 1. Манипулируя положением клеток в культуральных планшетах, он предоставляет решения для различных экспериментов, включая миграцию клеток2, биомиметическую многоклеточную кокультуру3, сборку органоидов4, исследования биоматериалов5 и многое другое. В большинстве ситуаций для нанесения рисунка клеток предпочтительнее метод без чернил и этикеток, поскольку он обеспечивает простоту эксплуатации и высокую жизнеспособность клеток для последующих исследований.
Эффект Mag-Arch — это физическое явление, при котором диамагнитные объекты в парамагнитных жидкостях имеют тенденцию двигаться к областям со слабыми магнитнымиполями. Живые клетки по своей природе диамагнитны, в то время как питательные среды для клеточных культур можно сделать парамагнитными, добавив растворимые парамагнитные элементы, такие как гадопентетат димеглумин (Gd-DTPA), обычно используемый внутривенно в ядерной магнитно-резонансной томографии в качестве контрастного вещества7. Следовательно, ожидается, что клетки будут отталкиваться от окружающей парамагнитной среды и двигаться в области, где магнитныеполя слабее. Паттернированное магнитное поле может быть легко сгенерировано с помощью набора неодимовых магнитов. В идеале клеточные узоры собираются в противовес магнитным узорам. Технически этот метод определяется как метод без меток, потому что единственный дополнительный реагент, Gd-DTPA, остается во внеклеточной среде и не связывается с клетками. Таким образом, потенциального влияния на последующую культуру клеток можно легко избежать, заменив питательную среду. По сравнению с другими методами 1,3,9,10, стратегия, основанная на Mag-Arch, не требует компонентов биочернил или нанесения специфических частиц для положительной маркировки клеток. Кроме того, было показано, что он работает на нескольких субстратах для клеточной адгезии и способен создавать высокопроизводительные клеточные паттерны4.
В этой статье представлен подробный протокол формирования структуры ячеек с использованием метода на основе Mag-Arch, охватывающий все, от изготовления устройства до корректировки структуры ячеек. В дополнение к шаблонам, которые мы продемонстрировали, пользователи могут легко создавать различные узоры ячеек с помощью магнитов и решения Gd-DTPA. Кроме того, предоставляются протоколы для сборки сложных шаблонов кокультур и манипулирования клетками в вложенных микрофлюидных чипах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Сборка комплектов магнитов
- Соберите наборы магнитов для узоров полосок.
- Выберите плоские прямоугольные магниты, как показано на рисунке 1A. Размеры прямоугольных магнитов, используемых для этой демонстрации, составляют 1,5 мм × 10 мм × 35 мм (толщина × высота × длина) (см. Таблицу материалов). Толщина магнитов определяет зазоры между полосами ячеек.
- Силиконовые пластины толщиной 2 мм (см. Таблицу материалов) разрежьте на прямоугольники диаметром 2 мм × 8 мм × 30 мм. Убедитесь, что последние два размера этих силиконовых пластин немного меньше, чем у прямоугольных магнитов, упомянутых выше, чтобы оптимизировать сборку. Толщина силиконовых пластин определяет ширину полос ячеек.
- Соберите прямоугольные магниты и силиконовые пластины слой за слоем, как показано на рисунке 1A. Каждый набор магнитов состоит из 4 магнитов и 3 силиконовых пластин. Убедитесь, что полюса каждого соседнего магнита противоположны, чтобы наборы магнитов могли автоматически выровняться из-за собственной силы притяжения.
- Стерилизуйте магниты перед использованием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется промыть магнитные наборы чистой водой, а затем погрузить их в 75% этанол на 10 минут. Габаритные размеры этих магнитных наборов составляют 12 мм × 10 мм × 35 мм, предназначенных для установки стандартных 6-луночных планшетов для клеточных культур.
- Соберите наборы магнитов для точечных массивов
- Выбирайте миниатюрные цилиндрические магниты, как показано на рисунке 1B. Размеры цилиндрических магнитов, используемых для этой демонстрации, составляют Φ1,5 мм × 10 мм (диаметр × высота), намагниченных в осевом направлении.
- Соберите цилиндрические магниты, как показано на рисунке 1B. Убедитесь, что каждый набор магнитов состоит из 36 цилиндрических магнитов, расположенных в сетке 6 × 6. Кроме того, убедитесь, что полюса каждого соседнего магнита противоположны, чтобы наборы магнитов автоматически выравнивались за счет собственной силы притяжения.
- Перед использованием простерилизуйте магниты, выполнив ту же процедуру, что и в шаге 1.1.4. Габаритные размеры этих магнитных наборов составляют 9 мм × 10 мм × 9 мм, предназначены для установки стандартных 6-луночных планшетов для клеточных культур.
2. Рисунок ячеек на предметных стеклах
- Подготовьте устройство для культивирования клеток.
- Используйте силиконовые пластины толщиной 2 мм для создания силиконовых форм. Используйте дырокол, чтобы создать прямоугольное отверстие в пластине размером 1 см × 1 см. Обрежьте силиконовую пластину вокруг отверстия, чтобы создать круглую форму (диаметр = 25 мм) с отверстием в центре, как показано на рисунке 1C.
- Тщательно очистите силиконовые формы с помощью ультразвукового очистителя. Стерилизуйте формы, промывая их чистой водой в течение 10 мин, а затем заменив воду на 75% этиловый спирт еще на 10 минут. Наконец, высушите формы в стерилизаторе при температуре 65 °C в течение 60 минут.
- Прикрепите стерилизованную силиконовую форму к предметному стеклянному предметному стеклу диаметром 25 мм и осторожно прижмите его, чтобы силикон прилип к стеклу, как показано на рисунке 1C. Полученное устройство для культивирования клеток будет иметь стеклянную нижнюю сторону и полость для культивирования на 200 мкл. Размеры устройства составляют Φ25 мм × 2,15 мм, что делает его пригодным для стандартных 6-луночных планшетов для клеточных культур.
ПРИМЕЧАНИЕ: Описанное выше устройство для культивирования клеток может быть заменено другими чашками Петри с нижней стороной тоньше 0,5 мм, например, конфокальными чашками. - Поместите наборы магнитов на 6-луночную пластину. Для удобства работы рекомендуется использовать немагнитный пинцет.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие этапы должны выполняться в стерильных условиях, начиная с этого момента и до наблюдения за клеточным рисунком. - Расположите устройство для культивирования клеток поверх магнита, установленного в лунке 6-луночного планшета. Убедитесь, что устройство для культивирования клеток расположено горизонтально, а нижняя сторона находится в тесном контакте с набором магнитов.
- Приготовьте питательную среду для клеток, содержащую Gd-DTPA
- Готовят имеющиеся в продаже инъекции Gd-DTPA (см. Таблицу материалов), обычно с концентрацией 500 мМ. Разбавьте инъекцию, добавив 30 мкл инъекции Gd-DTPA к 470 мкл полной питательной среды для клеток до достижения целевой концентрации 30 мМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от местных нормативных актов и наличия других контрастных веществ на основе гадолиния (GBCA) с той же целевой концентрацией могут давать аналогичные результаты11.
- Готовят имеющиеся в продаже инъекции Gd-DTPA (см. Таблицу материалов), обычно с концентрацией 500 мМ. Разбавьте инъекцию, добавив 30 мкл инъекции Gd-DTPA к 470 мкл полной питательной среды для клеток до достижения целевой концентрации 30 мМ.
- Создайте шаблоны ячеек.
- Заготавливаем клетки для выкройки. В этой демонстрации для создания рисунка были использованы эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC, см. таблицу материалов) (рис. 2). Центрифугируют клетки в течение 5 мин при 200 x g (при комнатной температуре), чтобы извлечь их из суспензии и повторно суспендировать в среде, содержащей Gd-DTPA. Подсчитайте плотность клеток.
- Отрегулируйте плотность клеток примерно до ~2 × 105 клеток/мл с помощью среды, содержащей Gd-DTPA. Аккуратно перемешайте клеточную суспензию и добавьте 200 мкл в полость каждой формы для клеточной культуры, чтобы создать жидкую поверхность до краев.
- Осторожно переложите планшет в инкубатор клеточных культур и инкубируйте в течение 3-6 ч до тех пор, пока клетки хорошо не прилипнут к субстрату. Избегайте захлопывания дверцы инкубатора, чтобы не мешать сборке клеточных узоров. Для клеток с низкой степенью адгезии ночное лечение GBCA, как правило, безопасно12.
- Формирование клеточного рисунка считается завершенным, когда клетки прилипают ко дну полости клеточного культурального устройства. Замените среду, содержащую Gd-DTPA, на полную питательную среду.
- Извлеките устройство для культивирования клеток из набора магнитов. Можно либо наблюдать за клеточным рисунком сразу, либо переносить устройство в новую культуральную планшет для дальнейшего культивирования.
3. Совместное культивирование с помощью магнита сбоку: изготовление движущегося шаблона
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура представлена для того, чтобы воспользоваться преимуществами создания ячеистых шаблонов на основе Mag-Arch и изучить возможность большего количества применений.
- Подготовьте устройство к нанесению узора полосатых ячеек в соответствии с шагами 1 и 2. Тем не менее, уменьшите плотность ячеек до 1 × 105 ячеек/мл и замените силиконовые пластины, разделяющие магниты, на более тонкие, сделав каждый полосатый узор ячеек тоньше.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает достаточную площадь для укладки нескольких ячеек в виде полос. В качестве ориентира мы предлагаем использовать силиконовые пластины толщиной 1 мм вместо 2 мм для разделения магнитов. - Создайте первый тип клеток, как показано на шагах 2.2-2.3. На этом этапе также требуется 3-6 часов для прикрепления клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы различать различные типы клеток в системе совместного культивирования, пользователи могут помечать клетки флуоресцентными красителями, такими как DiI, DiD, или клеточными трекерами (CMTPX, CMFDA, CMAC и т. д.) перед нанесением узора. Например, для окрашивания DiI и DiD добавьте 1 мкл исходного раствора (10 мМ) (см. таблицу материалов) на 1 мл среды, не содержащей FBS, и хорошо перемешайте до получения рабочего раствора. Замените питательную среду рабочим раствором, чтобы покрыть адгезивные клетки. После инкубации в течение 30 минут и трехкратной промывки PBS приступают к забору клеток. - После создания образца клеток первого типа переместите устройство для культивирования клеток на 1 мм от магнитов ниже вправо, как показано на рисунке 3Aii.
- Аккуратно промойте предметные стекла 200 мкл PBS дважды. Не допускайте высыхания слайдов.
- Сформируйте ячейки второго типа таким же образом, как показано на шагах 2.2-2.3.
- Переместите устройство для культивирования клеток на 1 мм от магнитов внизу вправо, как показано на рисунке 3Aiii, и снова промойте предметные стекла 200 мкл PBS. Выстройте третий тип клеток таким же образом, как показано на шагах 2.2-2.3.
- После создания рисунка всех типов клеток осторожно промойте предметные стекла 200 мкл PBS дважды и замените полной питательной средой для клеток.
- Извлеките устройство для культивирования клеток из набора магнитов. Затем можно наблюдать за клеточным рисунком или переносить устройство на новую культуральную планшет для дальнейшего культивирования.
4. Совместное культивирование путем регулировки концентрации Gd-DTPA
ПРИМЕЧАНИЕ: GBCA не оказывают существенного влияния на адгезию клеток или последующий рост при рабочих концентрациях (≤75 мМ). Кроме того, концентрация Gd-DTPA влияет на структуру клеток: более высокие концентрации приводят к более мелким/тонким клеточным структурам. Таким образом, можно создавать системы совместного культивирования, просто регулируя концентрацию Gd-DTPA. В этом примере демонстрируется создание шаблонов для концентрических круговых массивов.
- Создайте первый тип ячеек, как показано на шагах 2.2-2.3, используя миниатюрные цилиндрические магниты из шага 1.2. Перед сбором пометьте клетки флуоресцентными красителями, такими как DiI, DiD или клеточные трекеры (см. шаг 3), чтобы различать различные типы клеток в системе совместной культуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Потребуется более высокая концентрация Gd-DTPA (50 мМ вместо 30 мМ) и более низкая плотность клеток, примерно 1 × 105 клеток/мл. - После создания рисунка первого массива ячеек осторожно промойте предметные стекла 200 мкл PBS дважды. Не допускайте высыхания предметных стекол.
- Создайте второй тип клеток, выполнив ту же процедуру, что и раньше. Держите предметные стекла относительно неподвижными на магнитах, чтобы предотвратить смещение. Рекомендуется прикрепить силиконовую пластину с углублением, которое подходит для наборов магнитов, к нижней поверхности предметного стекла.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае потребуется более низкая концентрация Gd-DTPA (20 мМ вместо 30 мМ), чтобы ожидается, что вторые ячейки будут крупнее первых, как показано на рисунке 3B. - После создания рисунка всех типов клеток осторожно промойте предметные стекла 200 мкл PBS дважды и замените среду полной питательной средой для клеток.
- Извлеките устройство для культивирования клеток из набора магнитов. Затем можно наблюдать за клеточным рисунком или переносить устройство на новую культуральную планшет для дальнейшего культивирования.
5. Формирование ячеистого рисунка в микрофлюидном чипе
ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем предыдущем исследовании8 было продемонстрировано, что метод, основанный на Mag-Arch, работает в закрытых узких камерах. Ниже приведен пример построения массивов точек в микрофлюидном канале.
- Изготовление микрофлюидного чипа
- Изготовьте пресс-формы из политетрафторэтилена (ПТФЭ) диаметром 40 мм × 75 мм × 20 мм (см. Таблицу материалов), содержащие прямоугольную полость 24 мм × 50 мм × 8 мм, как показано на рисунке 4A.
- Расплющите силиконовую пластину толщиной 0,5 мм. Разрежьте силиконовые пластины в соответствии с формой канала жидкости, который имеет прямоугольную полость 15 мм × 20 мм × 0,5 мм с треугольными буферными зонами как на входной, так и на выходной стороне, как показано на рисунке 4A, B.
- Изготовьте прямоугольные стеклянные пластины диаметром 40 мм × 75 мм. Очистите стеклянные пластины воздушной плазмой в течение 30 с.
- Сразу после воздушно-плазменной очистки накройте стеклянные пластины 0,5 мл имеющегося в продаже антиадгезионного буфера (см. Таблицу материалов) и дайте им высохнуть на воздухе. Вымойте стеклянные пластины один раз этиловым спиртом и дайте им высохнуть на воздухе.
- Надежно прикрепите силиконовую пластину, подготовленную на шаге 5.1.2, к середине стеклянной пластины, как показано на рисунке 4A.
- Приготовьте преполимер полидиметилсилоксана (ПДМС) в соответствии с инструкциями производителя (см. таблицу материалов). Для каждого чипа PDMS взвесьте 10 г основного компонента и 1 г укрепляющего агента в центрифужную пробирку объемом 50 мл.
- Тщательно перемешайте средства стеклянной палочкой для перемешивания до тех пор, пока мелкие пузырьки не будут равномерно распределены в коллоиде. Перемешивание занимает 5-10 мин, в зависимости от объема коллоида. Центрифугируйте коллоидный преполимер в течение 1 мин при 500 x g (при комнатной температуре) для удаления пузырьков.
- Медленно влейте ~10 мл преполимера в полость, чтобы заполнить форму из ПТФЭ.
- Осторожно поместите форму в вакуумный резервуар и держите ее горизонтально, чтобы преполимер не вытек.
- Удалите остаточные пузырьки воздуха из преполимера с помощью вакуумного насоса. Уборка пылесосом занимает 120-180 минут.
- При необходимости налейте больше преполимера, чтобы дополнительно заполнить полость формы. Пылесосьте еще 60 мин.
- Осторожно накройте форму из ПТФЭ стеклянной пластиной так, чтобы кварцевая сторона была обращена к полости, как показано на рисунке 4Bi.
- Убедитесь, что все пузырьки удалены. Переместите форму в сушильную печь с температурой 60 °C, чтобы преполимер затвердел в течение ночи.
- Достаньте форму из духовки. После охлаждения тщательно снимите затвердевшую крышку PDMS. Создайте входное и выходное отверстия с помощью иглопробивателя Φ1 мм.
- Вымойте крышку PDMS и салазки 24 мм × 50 мм в соответствии с шагом 2.1.2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие действия в стерильных условиях. - Прикрепите крышку PDMS и слайд крышки, чтобы создать микрофлюидный чип с проточным каналом высотой около ~500 мкм. Нижняя сторона должна состоять из стеклянной крышки толщиной ~0,15 мм, чтобы можно было создавать узоры ячеек с помощью стратегии, основанной на Mag-Arch.
- Установите имеющиеся в продаже стерильные адаптеры как на входе, так и на выходе микрофлюидной микросхемы8.
- Приготовьте 2%-ный (массовый, растворенный в PBS) буфер для желатиновой оболочки. Стерилизуйте буфер автоклавированием.
- Введите буфер желатиновой оболочки в чип через входной адаптер с помощью шприца объемом 1 мл. Если пузырьки появляются, промойте их дополнительным буфером для покрытия.
- Поместите чип в чашку для клеточной культуры диаметром 10 см. Добавьте 1 мл PBS на дно посуды, чтобы избежать высыхания. Перенесите чашку в инкубатор клеточных культур. Нанесение покрытия занимает 30 минут.
- Промойте буфер покрытия 2 мл среды, содержащей Gd (30 мМ), через входное отверстие.
- Осторожно ввести 1 мл клеточной суспензии, содержащей 30 мМ Gd-DTPA с помощью шприца объемом 1 мл.
- Выкройте ячейки, как показано на шагах 2.2-2.3, используя миниатюрные цилиндрические магниты из шага 1.2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тем не менее, рекомендуется прикрепить силиконовую пластину с углублением, которое подходит для наборов магнитов, к нижней поверхности предметного стекла, как показано на рисунке 4Ci. - После нанесения рисунка осторожно освежите среду, содержащую Gd-DTPA, 1 мл полной среды, промыв шприцем объемом 1 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс создания клеточного рисунка в микрофлюидике, начиная с этапов 5.7-5.9, занимает около 180 минут, что аналогично созданию клеточного рисунка на стандартных предметных стеклах. - Количественная оценка закономерностей под микроскопом. При необходимости подключите микрофлюидный чип к циркуляционному культивируемому устройству для дальнейшего культивирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: По нашему опыту, клетки способны расти в течение не менее 72 ч при поддержке простого устройства на основе микронасоса, которое обеспечивает микрофлюидику непрерывным потоком свежей питательной среды в клеточном инкубаторе8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для создания ячеек в качестве демонстрации были выбраны прямоугольные (1,5 мм × 10 мм × 35 мм) и цилиндрические (Φ1,5 м × 10 мм) магниты. Пользователи могут изменять размер и форму магнитов или собирать их по-разному для создания разнообразных ячеек. На рисунке 1A,B магниты были собраны, магнитные полюса изображены синим (юг) и красным (север) для наглядности. В этой конфигурации магниты притягиваются друг к другу с боков и выравниваются, как показано на рисунке 2. На рисунке 1C, D показана структура устройства для культивирования клеток и процедура формирования клеточного рисунка.
На рисунке 2 показаны шаблоны монотипных ячеек. GFP-меченые HUVEC использовали для наблюдения под флуоресцентным микроскопом. Ячейки были организованы в полосы и точечные массивы с использованием соответствующих наборов магнитов. Для HUVEC, которые быстро прилипают к предметным стеклам (в течение 120-180 минут), вся процедура была завершена за 4 часа. Следование протоколу привело к получению узоров с четко очерченными краями и высокой однородностью. Для определения жизнеспособности клетки обрабатывали Gd-DTPA в течение 12 ч, что значительно дольше, чем 3-6 ч на этапе 2. Тем не менее, как окрашивание Live/Dead, так и анализ CCK88 не показали значительного снижения жизнеспособности клеток. Относительно высокая концентрация Gd-DTPA (50 мМ) вызывала статистическую разницу, но все же сохраняла уровень жизни 90,76% ± 1,78% (дополнительный рисунок 1).
Основываясь на протоколе создания однотипных клеточных моделей, были предоставлены примеры многотипных клеточных моделей для потенциальных применений совместного культивирования. В этом сценарии использовались HUVEC, клетки рака яичников A2780 и гладкомышечные клетки (SMC). Чтобы различать их, клетки были помечены GFP, DiD и DiI перед созданием паттерна. На следующем шаге 3 был сгенерирован трехраздельный ячеистый узор из полос, расположенных бок о бок (рис. 3A). И наоборот, шаг 4 был использован для создания массивов концентрических точек путем регулировки концентрации Gd-DTPA (рис. 3B). Первый слой клеток был окрашен DiI (красный) и нанесен 50 мМ Gd-DTPA, в то время как второй слой клеток был помечен GFP (зеленым) и 25 мМ Gd-DTPA. Следовательно, размер точек первого слоя был меньше, окруженным концентрически вторым слоем ячеек с точечным рисунком. Различные типы клеток демонстрировали различную скорость прикрепления и распространения: HUVEC прикреплялись и распространялись быстро, A2780 прикреплялись быстро, но распространялись медленнее, а SMC прикреплялись и распространялись относительно медленно. Эти результаты продемонстрировали, что различные типы клеток могут формировать клеточные паттерны в течение 3 ч и использоваться в экспериментах с совместными культурами.
Кроме того, было продемонстрировано, что формирование клеточного рисунка с использованием магнитного поля совместимо с закрытыми узкими культуральными устройствами, такими как микрофлюидные чипы. На шаге 5 были изготовлены микрофлюидные чипы, в которых были сгенерированы точечные матрицы (рис. 4).
Рисунок 1: Настройка и принципиальная схема формирования ячеек на основе mag-arch . (A) Сборка наборов магнитов для создания узоров полосатых ячеек. (B) Сборка наборов магнитов для генерации точечных массивов ячеек. (C) Настройка устройства для культивирования клеток. (D) Пошаговая процедура формирования структуры клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Сборка устройств и структурирование HUVEC в полосы и точечные массивы. (A) Наборы магнитов, заключенные в устройствах для культивирования клеток (i) и помещенные в планшет для клеточных культур (ii). (B) и (C) Наборы магнитов и соответствующие им ячейки. Клетки были помечены зеленым флуоресцентным белком (GFP) для визуализации клеточного паттерна. Масштабные линейки = 1,5 мм; вставки = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Создание моделей систем совместного культивирования с помощью пошаговой стратегии. (A) Совместное культивирование с использованием магнита сбоку (i-iii). Клетки были помечены GFP (зеленый), DiD (синий) и DiI (красный), чтобы различать различные типы клеток. Масштабные линейки = 1 мм. (B) Совместное культивирование, достигаемое путем корректировки концентрации Gd-DTPA; (i) 50 мМ, (ii) 20 мМ. Масштабные линейки = 1,5 мм; вставки = 250 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Формирование структуры ячеек в микрофлюидной камере. (A) Принципиальная схема микрофлюидной формы. (B) Изготовление микрофлюидики с использованием полидиметилсилоксана (PDMS) (i,ii). (C) Формирование структуры клеток в микрофлюидном устройстве (i,ii) и репрезентативный результат, показывающий точечные структуры ячеек (iii). Клетки были помечены зеленым флуоресцентным белком (GFP). Масштабная линейка = 3 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Влияние Gd-DTPA на жизнеспособность клеток. HUVEC обрабатывали различными концентрациями Gd-DTPA в течение 12 ч, а затем подвергали окрашиванию Live/Dead или анализу CCK-8. (A) Живое/мертвое окрашивание HUVEC. Масштабные линейки = 200 мкм. (B) Гистограмма, показывающая результаты окрашивания. (C) Гистограмма, показывающая результаты анализа CCK-8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Клеточный паттерн на основе Mag-Arch представляет собой удобное решение для большинства биомедицинских лабораторий. Этот метод развивается параллельно с символами без чернил, без этикеток, независимо от подложки и возможностью высокопроизводительного нанесения рисунков 8,13. Для создания шаблонов монотипных ячеек он создает одношаговый шаблон клеток. Процедура завершается простым освежением питательных сред.
В предыдущих исследованиях магнитные частицы использовались для маркировки клеток и притяжения их магнитами для формирования точных узоров14,15. Тем не менее, присутствие магнитных частиц на клетках вызвало опасения по поводу потенциального влияния на поведение клеток. Клеточный паттерн на основе Mag-Arch использует противоположную стратегию, превращая внеклеточные жидкости в парамагнитные, а не в клетки. Эта стратегия значительно облегчает удаление лишних парамагнитных реагентов путем обновления питательной среды. В ходе исследований были получены клеточные сферы и точечные массивы с клеточным рисунком на основе Mag-Arch11,16. По сравнению с существующими исследованиями, основанными на Mag-Arch, методы, представленные этим протоколом, могут свободно настраивать форму паттернов. Кроме того, в протоколе представлены стратегии создания систем совместной культуры. Также было доказано, что он работает внутри закрытых узких камер для культивирования клеток, что мы тестировали в микрофлюидике.
В отличие от параллельных методов, которые требуют профессионального биопечатного оборудования17, индивидуальных шаблонов 18 или модификации поверхности комплекса19, метод, основанный на Mag-Arch, требует только двух потребностей: магнитов и GBCA. Поверхность магнитного рисунка определяет рисунок ячеек в обратном порядке. В качестве базовых было продемонстрировано несколько паттернов полос и точечных массивов. Пользователи могут свободно создавать узоры с помощью наборов магнитов различных форм, которые в изобилии имеются в продаже. Для достижения идеального результата рекомендуется использовать магниты, обеспечивающие достаточную магнитную силу. В нашей практике мы использовали неодим-железо-борные магниты N52, остаточная мощность которых составляла более 1430 мТл, а поверхностный магнетизм – более 100 мТл на полюсах. Для GBCA был принят Gd-DTPA, потому что он стабилен в физиологических условиях и дешево доступен в большинстве стран и регионов. В качестве альтернативы могут быть приняты и другие GBCA. Макроциклические неионогенные GBCA, такие как гадобутрол и гадотеридол, могут быть лучшим выбором для снижения цитотоксичности при моделировании уязвимых клеток для длительного лечения11,12.
Ограничение ячеистых структур на основе Mag-Arch в основном заключается в рабочей области магнитного поля, создаваемого магнитами. Следуя формуле обратных квадратов, магнитное поле резко уменьшается с расстоянием8. Как следствие, метод Mag-Arch не позволяет собрать идеальные клеточные узоры на обычных чашках или планшетах для культивирования клеток из полистирола, дно которых толщиной менее 1 мм. Таким образом, протокол должен работать на более тонких поверхностях клеточных культур, таких как предметные стекла или конфокальные чашки для культивирования клеток. При нанесении рисунка внутри микрофлюидики также требуется, чтобы нижние предметные стекла микрофлюидики были тоньше 0,5 мм. Для создания систем совместного культивирования этот метод может быть трудоемким, так как каждый дополнительный тип клеток увеличивает время прикрепления клеток на 3-6 ч.
В целом, этот протокол обеспечивает упрощенный способ определения клеточного паттерна, который может быть воспроизведен в большинстве лабораторий без какого-либо специального оборудования. Пользователи могут использовать его в качестве мощного инструмента для изучения поведения клеток, имитации многоклеточного микроокружения или тестирования клеточного сродствабиоматериалов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Это исследование выполнено при финансовой поддержке Национальной ключевой программы исследований и разработок Китая (2021YFA1101100), Национального фонда естественных наук Китая (32000971), Фондов фундаментальных исследований для центральных университетов (No 2021FZZX001-42) и Научного фонда «Звездная ночь» Шанхайского института перспективных исследований Чжэцзянского университета (грант No 2021). SN-ZJU-SIAS-004).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A2780 ovarian cancer cells | Procell | CL-0013 | |
| Cell culture medium (DMEM, high glucose) | Gibco | 11995040 | |
| Cover slides | Citotest Scientific | 80340-3610 | For fabricating microfluidics. Dimension: 24 mm × 50 mm |
| DiD | MedChemExpress (MCE) | HY-D1028 | For labeling cells with red fluorescence (Ex: 640 nm) |
| DiI | MedChemExpress (MCE) | HY-D0083 | For labeling cells with orange fluorescence (Ex: 550 nm) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochannel | BC-SE-FBS07 | |
| Gadopentetate dimeglumine (Gd-DTPA) | Beijing Beilu Pharmaceutical | H10860002 | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | V900863 | |
| Glass cell slides | Citotest Scientific | 80346-2510 | Diameter: 25 mm; thickness: 0.19-0.22 mm |
| Glass plates | PURESHI hardware store | For fabricating microfluidics. Dimension: 40 mm × 75 mm | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) | Servicebio | STCC12103G-1 | |
| Neodymium-iron-boron magnets (N52) | Lalaci | ||
| Non-toxic glass plate coating (Gel Slick Solution) | Lonza | 1049286 | For convenience of demolding when fabricating microfluidics |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Servicebio | G4200 | |
| Plasma cleaner | SANHOPTT | PT-2S | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | DOWSIL | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | For fabricating microfluidics |
| Polytetrafluoroethylene (PFTE) mold | PURESHI hardware store | Customized online, for fabricating microfluidics | |
| Silicon plate | PURESHI hardware store | ||
| Smooth Muscle Cells (SMC) | Procell | CL-0517 | |
| Ultrasonic cleaner | Sapeen | CSA-02 |
References
- Christian, J., et al. Control of cell adhesion using hydrogel patterning techniques for applications in traction force microscopy. J Vis Exp. 179, e63121 (2022).
- Abbas, Y., Turco, M. Y., Burton, G. J., Moffett, A. Investigation of human trophoblast invasion in vitro. Hum Reprod Update. 26 (4), 501-513 (2020).
- Park, M., et al. Modulation of heterotypic and homotypic cell-cell interactions via zwitterionic lipid masks. Adv Healthc Mater. 6 (15), 1700063 (2017).
- Ren, T., Chen, P., Gu, L., Ogut, M. G., Demirci, U. Soft ring-shaped cellu-robots with simultaneous locomotion in batches. Adv Mater. 32 (8), e1905713 (2020).
- Ren, T., Steiger, W., Chen, P., Ovsianikov, A., Demirci, U. Enhancing cell packing in buckyballs by acoustofluidic activation. Biofabrication. 12 (2), 025033 (2020).
- Ge, S., et al. Magnetic levitation in chemistry, materials science, and biochemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 59 (41), 17810-17855 (2020).
- Puluca, N., et al. Levitating cells to sort the fit and the fat. Adv Biosyst. 4 (6), e1900300 (2020).
- Ren, T., et al. Programing cell assembly via ink-free, label-free magneto-archimedes based strategy. ACS Nano. 17 (13), 12072-12086 (2023).
- Li, Y. C., et al. Programmable laser-assisted surface microfabrication on a poly(vinyl alcohol)-coated glass chip with self-changing cell adhesivity for heterotypic cell patterning. ACS Appl Mater Interfaces. 7 (40), 22322-22332 (2015).
- Chliara, M. A., Elezoglou, S., Zergioti, I. Bioprinting on organ-on-chip: Development and applications. Biosensors (Basel). 12 (12), 1135 (2022).
- Moncal, K. K., Yaman, S., Durmus, N. G. Levitational 3D bioassembly and density-based spatial coding of levitoids. Adv Funct Mater. 32 (50), 2204092 (2022).
- Parfenov, V. A., et al. Magnetic levitational bioassembly of 3D tissue construct in space. Sci Adv. 6 (29), eaba4174 (2020).
- Dell, A. C., Wagner, G., Own, J., Geibel, J. P. 3D bioprinting using hydrogels: Cell inks and tissue engineering applications. Pharmaceutics. 14 (12), 2596 (2022).
- Ino, K., Ito, A., Honda, H. Cell patterning using magnetite nanoparticles and magnetic force. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1309-1317 (2007).
- Okochi, M., Matsumura, T., Honda, H. Magnetic force-based cell patterning for evaluation of the effect of stromal fibroblasts on invasive capacity in 3d cultures. Biosens Bioelectron. 42, 300-307 (2013).
- Mishriki, S., et al. Rapid magnetic 3D printing of cellular structures with mcf-7 cell inks. Research (Wash D C). 2019, 9854593 (2019).
- Ozturk-Oncel, M. O., Leal-Martinez, B. H., Monteiro, R. F., Gomes, M. E., Domingues, R. M. A. A dive into the bath: Embedded 3D bioprinting of freeform in vitro models. Biomater Sci. 11, 5462-5473 (2023).
- Sahni, G., Yuan, J., Toh, Y. C. Stencil micropatterning of human pluripotent stem cells for probing spatial organization of differentiation fates. J Vis Exp. 112, e54097 (2016).
- Joddar, B., et al. Engineering approaches for cardiac organoid formation and their characterization. Transl Res. 250, 46-67 (2022).
