Summary
Detta protokoll beskriver en bläckfri, etikettfri, substratoberoende, cellmönstringsmetod med hög genomströmning baserad på den magnetiska Archimedes-effekten.
Abstract
Cellmönstring, som möjliggör exakt kontroll av cellpositionering, ger en unik fördel i studiet av cellbeteende. I detta protokoll introduceras en cellmönstringsstrategi baserad på Magnetic-Archimedes (Mag-Arch) effekten. Detta tillvägagångssätt möjliggör exakt kontroll av celldistribution utan användning av bläckmaterial eller märkningspartiklar. Genom att introducera ett paramagnetiskt reagens för att förbättra den magnetiska känsligheten hos cellodlingsmediet, stöts cellerna bort av magneter och ordnar sig i ett mönster som kompletterar magnetuppsättningarna som är placerade under det mikrofluidiska substratet.
I den här artikeln finns detaljerade procedurer för cellmönster med hjälp av den Mag-Arch-baserade strategin. Metoder för att mönstra såväl encelliga som multipla celltyper för samodlingsexperiment erbjuds. Dessutom tillhandahålls omfattande instruktioner för tillverkning av mikrofluidiska enheter som innehåller kanaler för cellmönster. Att uppnå denna funktion med parallella metoder är utmanande men kan göras på ett förenklat och kostnadseffektivt sätt. Genom att använda Mag-Arch-baserad cellmönstring utrustas forskare med ett kraftfullt verktyg för in vitro-forskning .
Introduction
Cellmönstring håller på att utvecklas till en intuitiv och kraftfull teknik för in vitro-studier 1. Genom att manipulera cellpositioner i odlingsplattor ger den lösningar för en mängd olika experiment, inklusive cellmigration2, biomimetisk multicellulär samkultur3, organoidmontering4, biomaterialstudier5 och mer. I de flesta situationer är en bläckfri, etikettfri metod att föredra för cellmönstring eftersom den är enkel att använda och ger hög cellviabilitet för efterföljande undersökningar.
Mag-Arch-effekten är ett fysikaliskt fenomen där diamagnetiska objekt i paramagnetiska vätskor tenderar att röra sig mot områden med svaga magnetfält6. Levande celler är naturligt diamagnetiska, medan cellodlingsmedier kan göras paramagnetiska genom tillsats av lösliga paramagnetiska element, såsom gadopentetatdimeglumin (Gd-DTPA), som vanligtvis används intravenöst vid kärnmagnetisk resonanstomografi som kontrastmedel7. Följaktligen förväntas cellerna stötas bort av det omgivande paramagnetiska mediet och röra sig mot områden där magnetfälten ärsvagare. Ett mönstrat magnetfält kan enkelt genereras med hjälp av en uppsättning neodymmagneter. Idealet är att cellmönstren sätts ihop i motsats till magnetmönstren. Tekniskt definieras detta som en märkningsfri metod eftersom det enda ytterligare reagenset, Gd-DTPA, stannar kvar i den extracellulära miljön och inte binder till celler. Således kan potentiell påverkan på efterföljande cellodling enkelt undvikas genom att byta ut odlingsmediet. Jämfört med andra metoder 1,3,9,10 kräver den Mag-Arch-baserade strategin inte biobläckkomponenter eller applicering av specifika partiklar för att positivt märka cellerna. Dessutom har det visat sig fungera på flera substrat för cellvidhäftning och är kapabelt till cellmönstring med hög genomströmning4.
Den här artikeln presenterar ett detaljerat protokoll för cellmönstring med hjälp av den Mag-Arch-baserade metoden, som täcker allt från enhetstillverkning till justering av cellmönstret. Utöver de mönster vi har visat kan användare enkelt skapa olika cellmönster med hjälp av magneter och Gd-DTPA-lösning. Dessutom tillhandahålls protokoll för att sätta samman komplexa samodlingsmönster och manipulera celler i inneslutna mikrofluidikchips.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Montering av magnetsatserna
- Montera magnetsatserna för remsmönster.
- Välj platta rektangulära magneter, som visas i figur 1A. Måtten på de rektangulära magneterna som används för denna demonstration är 1,5 mm × 10 mm × 35 mm (tjocklek × höjd × längd) (se materialförteckning). Tjockleken på magneterna bestämmer mellanrummen mellan cellremsorna.
- Skär 2 mm tjocka silikonplattor (se materialtabell) i 2 mm × 8 mm × 30 mm rektanglar. Se till att de två senare dimensionerna av dessa silikonplattor är något mindre än de rektangulära magneterna som nämns ovan för att optimera monteringen. Tjockleken på silikonplattorna bestämmer bredden på cellremsorna.
- Montera de rektangulära magneterna och silikonplattorna lager för lager, som illustreras i figur 1A. Varje magnetset består av 4 magneter och 3 silikonplattor. Se till att polerna på varje intilliggande magnet är motsatta så att magnetuppsättningarna automatiskt kan riktas in på grund av den inneboende attraktionskraften.
- Sterilisera magneterna före användning.
OBS: Det rekommenderas att tvätta magnetsatserna med rent vatten och sedan sänka ner dem i 75 % etanol i 10 minuter. De totala måtten på dessa magnetuppsättningar är 12 mm × 10 mm × 35 mm, utformade för att passa standard 6-brunnars cellodlingsplattor.
- Montera magnetuppsättningarna för dot-array-mönster
- Välj cylindriska miniatyrmagneter, som visas i figur 1B. Måtten på de cylindriska magneterna som används för denna demonstration är Φ1,5 mm × 10 mm (diameter × höjd), magnetiserade i axiell riktning.
- Montera de cylindriska magneterna enligt figur 1B. Se till att varje magnetuppsättning består av 36 cylindriska magneter arrangerade i ett 6 × 6 rutnät. Se också till att polerna på varje intilliggande magnet är motsatta så att magnetuppsättningarna kan justeras automatiskt på grund av den inneboende attraktionskraften.
- Sterilisera magneterna före användning, enligt samma procedur som i steg 1.1.4. De övergripande måtten på dessa magnetuppsättningar är 9 mm × 10 mm × 9 mm, utformade för att passa vanliga 6-brunnars cellodlingsplattor.
2. Cellmönster på glasskivor
- Förbered cellodlingsanordningen.
- Använd 2 mm tjocka silikonplattor för att skapa silikonformar. Använd en stans för att skapa ett rektangulärt hål på 1 cm × 1 cm i plattan. Trimma silikonplattan runt hålet för att skapa en rund form (diameter = 25 mm) med hålet i mitten, som visas i figur 1C.
- Rengör silikonformarna noggrant med en ultraljudsrengörare. Sterilisera formarna genom att tvätta dem med rent vatten i 10 min, följt av att ersätta vattnet med 75 % etanol i ytterligare 10 min. Torka slutligen formarna i en steriliseringslåda vid 65 °C i 60 minuter.
- Fäst den steriliserade silikonformen på en Φ25 mm rund glascellskiva och tryck försiktigt på den så att silikonet fäster vid glaset, som visas i figur 1C. Den resulterande cellodlingsanordningen kommer att ha en glasundersida och en 200 μL odlingskavitet. Enhetens mått är Φ25 mm × 2,15 mm, vilket gör den lämplig för standardcellodlingsplattor med 6 brunnar.
OBS: Cellodlingsanordningen som beskrivs ovan kan ersättas med andra petriskålar med undersidor tunnare än 0.5 mm, såsom konfokala skålar. - Placera magnetsatserna på en 6-hålsplatta. Icke-magnetisk pincett rekommenderas för enkel användning.
OBS: Alla efterföljande steg bör utföras under sterila förhållanden från och med denna punkt tills cellmönstren observeras. - Placera cellodlingsanordningen ovanpå magnetuppsättningen i brunnen på 6-hålsplattan. Se till att cellodlingsanordningen är placerad horisontellt och att undersidan är i nära kontakt med magnetuppsättningen.
- Bered cellodlingsmediet som innehåller Gd-DTPA
- Förbered kommersiellt tillgänglig Gd-DTPA-injektion (se materialtabell), vanligtvis med en koncentration på 500 mM. Späd injektionen genom att tillsätta 30 μl Gd-DTPA-injektion till 470 μl komplett cellodlingsmedium för att uppnå en målkoncentration på 30 mM.
OBS: Beroende på lokala bestämmelser och tillgänglighet kan andra gadoliniumbaserade kontrastmedel (GBCA) med samma målkoncentration ge liknande resultat11.
- Förbered kommersiellt tillgänglig Gd-DTPA-injektion (se materialtabell), vanligtvis med en koncentration på 500 mM. Späd injektionen genom att tillsätta 30 μl Gd-DTPA-injektion till 470 μl komplett cellodlingsmedium för att uppnå en målkoncentration på 30 mM.
- Skapa cellmönstren.
- Skörda celler för mönstring. I denna demonstration användes humana endotelceller i navelvenen (HUVEC, se materialtabell) för mönstring (figur 2). Centrifugera cellerna i 5 minuter vid 200 x g (vid rumstemperatur) för att samla upp dem från suspensionen och återsuspendera dem i det medium som innehåller Gd-DTPA. Räkna celltätheten.
- Justera celldensiteten till cirka ~2 × 105 celler/ml med Gd-DTPA-innehållande medium. Blanda försiktigt cellsuspensionen och tillsätt 200 μL till hålrummet i varje cellodlingsform för att skapa en bräddfull flytande yta.
- Överför försiktigt plattan till en cellodlingsinkubator och inkubera i 3-6 timmar tills cellerna fäster väl på substratet. Undvik att smälla igen inkubatordörren för att förhindra störningar i sammansättningen av cellmönster. För celler med dålig vidhäftningshastighet är behandling över natten med GBCA i allmänhet säker12.
- Cellmönstringen anses vara fullständig när cellerna fäster vid botten av håligheten i cellodlingsanordningen. Byt ut det Gd-DTPA-innehållande mediet mot ett komplett odlingsmedium.
- Ta bort cellodlingsanordningen från magnetsetet. Man kan antingen observera cellmönstret omedelbart eller överföra enheten till en ny odlingsplatta för vidare odling.
3. Samkulturmönstring med magnet i sidled: tillverkning av den rörliga mallen
OBS: Följande procedur presenteras för att dra nytta av Mag-Arch-baserad cellmönstring och utforska möjligheten till fler applikationer.
- Förbered enheten för randcellsmönster enligt steg 1 och steg 2. Minska dock celldensiteten till 1 × 105 celler/ml och byt ut silikonplattorna som separerar magneterna mot tunnare, vilket gör varje randcellsmönster tunnare.
OBS: Detta ger tillräckligt med yta för att lägga flera celler i randmönster. Som referens föreslår vi att du använder 1 mm silikonplattor istället för 2 mm för att separera magneterna. - Mönstra den första typen av celler enligt anvisningarna i steg 2.2-2.3. Detta steg kräver också 3-6 timmar för cellfäste.
OBS: För att särskilja olika celltyper i samodlingssystemet kan användare märka celler med fluorescerande färgämnen som DiI, DiD eller cellspårare (CMTPX, CMFDA, CMAC, etc.) före mönstring. Till exempel, för DiI- och DiD-färgning, tillsätt 1 μL stamlösning (10 mM) (se Materialtabell) per 1 ml FBS-fritt medium och blanda väl för att få en fungerande lösning. Ersätt odlingsmediet med arbetslösningen för att täcka vidhäftande celler. Efter inkubation i 30 minuter och tvättning med PBS tre gånger, fortsätt med cellskörden. - Efter att ha mönstrat den första typen av celler, flytta cellodlingsanordningen 1 mm från magneterna nedan till höger, som illustreras i figur 3Aii.
- Tvätta försiktigt glasskivorna med 200 μL PBS två gånger. Undvik att låta objektglasen torka.
- Mönstra den andra typen av celler på samma sätt som illustreras i steg 2.2-2.3.
- Flytta cellodlingsanordningen 1 mm från magneterna nedanför till höger, som illustreras i figur 3Aiii, och tvätta glasskivorna med 200 μL PBS igen. Mönstra den tredje typen av celler på samma sätt som illustreras i steg 2.2-2.3.
- Efter att ha mönstrat alla typer av celler, tvätta glasskivorna försiktigt med 200 μL PBS två gånger och ersätt med ett komplett cellodlingsmedium.
- Ta bort cellodlingsanordningen från magnetsetet. Man kan sedan observera cellmönstret eller överföra enheten till en ny odlingsplatta för vidare odling.
4. Samkulturmönster genom justering av koncentrationen av Gd-DTPA
OBS: GBCA påverkar inte signifikant celladhesion eller efterföljande tillväxt vid arbetskoncentrationer (≤75 mM). Dessutom påverkas cellmönstren av koncentrationen av Gd-DTPA: högre koncentrationer resulterar i mindre/tunnare cellmönster. Således är det möjligt att skapa samkultursystem genom att helt enkelt justera koncentrationen av Gd-DTPA. Det här exemplet visar mönstring av koncentriska cirkulära matriser.
- Mönstra den första typen av celler som illustreras i steg 2.2-2.3 med hjälp av miniatyrcylindriska magneter från steg 1.2. Märk cellerna med fluorescerande färgämnen som DiI, DiD eller cellspårare (se steg 3) innan du skördar dem för att särskilja olika celltyper i samodlingssystemet.
OBS: Man kommer att behöva en högre koncentration av Gd-DTPA (50 mM istället för 30 mM) och en lägre celldensitet, cirka 1 × 105 celler/ml. - Efter att ha mönstrat den första cellmatrisen, tvätta försiktigt glasskivorna med 200 μL PBS två gånger. Undvik att låta objektglasen torka.
- Mönstra den andra typen av celler enligt samma procedur som tidigare. Håll glasskivorna relativt orörliga på magneterna för att förhindra förskjutning. Att fästa en silikonplatta med en ihålighet som passar magnetsatserna på undersidan av glasskivan rekommenderas.
OBS: Här kommer man att behöva en lägre koncentration av Gd-DTPA (20 mM istället för 30 mM) så att de andra cellmönstren förväntas vara större än de första, som illustreras i figur 3B. - Efter att ha mönstrat alla typer av celler, tvätta glasskivorna försiktigt med 200 μL PBS två gånger och ersätt mediet med ett komplett cellodlingsmedium.
- Ta bort cellodlingsanordningen från magnetsetet. Man kan sedan observera cellmönstret eller överföra enheten till en ny odlingsplatta för vidare odling.
5. Cellmönstring i mikrofluidikchip
OBS: Den Mag-Arch-baserade metoden har visat sig fungera i slutna smala kammare i vår tidigare studie8. Här är ett exempel på mönstring av punktmatriser i en mikrofluidisk kanal.
- Tillverkning av mikrofluidchip
- Anpassa 40 mm × 75 mm × 20 mm polytetrafluoreten (PTFE) formar (se materialtabell) som innehåller ett rektangulärt hålrum på 24 mm × 50 mm × 8 mm, som illustreras i figur 4A.
- Platta till en 0,5 mm tjock silikonplatta. Skär silikonplattorna enligt formen på vätskekanalen, som har ett rektangulärt hålrum på 15 mm × 20 mm × 0,5 mm med triangulära buffertområden på både inlopps- och utloppssidan, som illustreras i figur 4A,B.
- Anpassa 40 mm × 75 mm rektangulära glasplattor. Rengör glasplattorna med luftplasma i 30 s.
- Omedelbart efter rengöring av luftplasma, täck glasplattorna med 0.5 ml av en kommersiellt tillgänglig anti-vidhäftningsbuffert (se materialtabell) och låt dem lufttorka. Tvätta glasskivorna en gång med etanol och låt dem lufttorka.
- Fäst en silikonplatta som förberetts i steg 5.1.2 ordentligt i mitten av en glasplatta, som illustreras i figur 4A.
- Bered polydimetylsiloxan (PDMS) prepolymer enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning). För varje PDMS-chip, väg upp 10 g av basbeståndsdelen och 1 g av fasthetsmedlet i ett 50 ml centrifugrör.
- Blanda medlen noggrant med en omrörningsstav av glas tills små bubblor är jämnt fördelade i kolloiden. Blandningen tar 5-10 min, beroende på kolloidvolymen. Centrifugera kolloidprepolymeren i 1 minut vid 500 x g (vid rumstemperatur) för att eliminera bubblor.
- Häll långsamt ~10 ml av prepolymeren i hålrummet för att fylla PTFE-formen.
- Placera försiktigt formen i en vakuumbehållare och håll den horisontell för att förhindra att prepolymeren rinner bort.
- Ta bort kvarvarande luftbubblor från prepolymeren med en vakuumpump. Dammsugningen tar 120-180 min.
- Om det behövs, häll mer prepolymer för att ytterligare fylla formhåligheten. Dammsug i ytterligare 60 min.
- Täck försiktigt PTFE-formen med glasplattan, med kiseldioxidsidan vänd mot håligheten, som illustreras i figur 4Bi.
- Se till att alla bubblor elimineras. Överför formen till en 60 °C torkugn för att prepolymeren ska stelna över natten.
- Ta ut formen ur ugnen. Efter kylning, deforma det stelnade PDMS-locket försiktigt. Skapa ett inlopp och ett utlopp med en Φ1 mm nålstansare.
- Tvätta PDMS-skyddet och 24 mm × 50 mm täckglas enligt steg 2.1.2.
OBS: Fortsätt med följande steg under sterila förhållanden. - Fäst ett PDMS-lock och ett lockglas för att skapa ett mikrofluidchip som innehåller en flödeskanal på cirka ~500 μm i höjd. Undersidan bör bestå av en glaskupa på ~0,15 mm för att möjliggöra cellmönster med den Mag-Arch-baserade strategin.
- Montera kommersiellt tillgängliga sterila adaptrar i både inloppet och utloppet på mikrovätskechipet8.
- Bered en gelatinbeläggningsbuffert på 2 % (vikt/volym, upplöst i PBS). Sterilisera bufferten genom autoklavering.
- Injicera gelatinbeläggningsbufferten i chipet via inloppsadaptern med en 1 ml spruta. Om bubblor dyker upp, spola ut dem med extra beläggningsbuffert.
- Lägg chipset i en 10 cm cellodlingsform. Tillsätt 1 ml PBS runt skålens botten för att undvika uttorkning. Överför skålen till en cellodlingsinkubator. Beläggningen tar 30 min.
- Spola ur beläggningsbufferten med 2 ml Gd-inneslutet medium (30 mM) via inloppet.
- Injicera försiktigt 1 ml cellsuspension innehållande 30 mM Gd-DTPA med en 1 ml spruta.
- Mönstra celler som illustreras i steg 2.2-2.3 med hjälp av cylindriska miniatyrmagneter från steg 1.2.
OBS: Det rekommenderas dock att fästa en silikonplatta med en ihålighet som passar magnetuppsättningarna på undersidan av glasskivan, som visas i figur 4Ci. - Efter mönstring, uppdatera försiktigt det Gd-DTPA-innehållna mediet med 1 ml helmedium genom att spola med en 1 ml spruta.
OBS: Processen med cellmönstring i mikrofluidik, från steg 5.7-5.9, tar cirka 180 minuter, vilket liknar cellmönstring på vanliga glasglas. - Kvantifiera mönstren i mikroskop. Om det behövs, anslut mikrovätskechipet till en cirkulerande odlingsanordning för vidare odling.
OBS: Enligt vår erfarenhet kan celler växa i minst 72 timmar när de stöds av en enkel mikropumpbaserad enhet, som förser mikrofluidikerna med ett kontinuerligt flöde av färskt odlingsmedium i en cellinkubator8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rektangulära (1,5 mm × 10 mm × 35 mm) och cylindriska (Φ1,5 m × 10 mm) magneter valdes ut för att skapa cellmönster som en demonstration. Användare har flexibiliteten att ändra storleken och formen på magneter eller sätta ihop dem på olika sätt för att skapa olika cellmönster. I figur 1A,B monterades magneterna, med de magnetiska polerna avbildade i blått (söder) och rött (norr) för tydlighetens skull. I denna konfiguration attraherar magneter varandra i sidled och riktar in sig, som illustreras i figur 2. Figur 1C,D illustrerar strukturen hos cellodlingsanordningen och cellmönstringsproceduren.
Figur 2 visar cellmönster av monotyp. GFP-märkta HUVECs användes för observation under ett fluorescerande mikroskop. Cellerna organiserades i rand- och punktmatrismönster med hjälp av motsvarande magnetuppsättningar. För HUVEC, som fäster snabbt på glasskivor (inom 120-180 minuter), slutfördes hela proceduren på 4 timmar. Att följa protokollet resulterade i mönster med väldefinierade kanter och hög enhetlighet. För att bestämma livskraften behandlades cellerna med Gd-DTPA i 12 timmar, vilket är mycket längre än 3-6 timmar i steg 2. Både levande/död färgning och CCK8-analys8 visade dock ingen signifikant minskning av cellviabiliteten. En relativt hög koncentration av Gd-DTPA (50 mM) inducerade en statistisk skillnad, men bibehöll ändå en levnadsgrad på 90,76 % ± 1,78 % (tilläggsfigur 1).
Med utgångspunkt i protokollet för cellmönstring av monotyp tillhandahölls exempel på cellmönstring av flera typer för potentiella samodlingstillämpningar. I detta scenario användes HUVEC, A2780 äggstockscancerceller och glatta muskelceller (SMC). För att skilja dem åt märktes cellerna med GFP, DiD och DiI före mönstring. Genom att följa steg 3 genererades ett tredelat cellmönster med ränder sida vid sida (figur 3A). Omvänt användes steg 4 för att skapa koncentriska punktmatriser genom att justera koncentrationen av Gd-DTPA (figur 3B). Det första lagret av celler färgades med DiI (rött) och mönstrades med 50 mM Gd-DTPA, medan det andra lagret av celler märktes med GFP (grönt) och mönstrades med 25 mM Gd-DTPA. Följaktligen var punktstorleken på det första lagret mindre, omgivet koncentriskt av det andra lagret av punktmönstrade celler. Olika celltyper uppvisade varierande bindnings- och spridningshastigheter, med HUVECs som fäste och spred sig snabbt, A2780 som fäste snabbt men spred sig långsammare, och SMC:er som fäste och spred sig relativt långsamt. Dessa resultat visade att olika celltyper kunde bilda cellmönster på 3 timmar och användas i samodlingsexperiment.
Dessutom visades det att cellmönstring med hjälp av ett magnetfält var kompatibelt med slutna smalodlingsenheter, såsom mikrofluidiska chips. Genom att följa steg 5 tillverkades mikrofluidiska chips och punktmatriser genererades i dem (figur 4).
Figur 1: Uppställning och schematisk bild av mag-arch-baserad cellmönstring . (A) Montering av magnetuppsättningar för att skapa randcellsmönster. (B) Sammansättning av magnetuppsättningar för generering av matriscellmönster. (C) Inställning av cellodlingsanordningen. (D) Steg-för-steg-procedur för cellmönster. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Montering av enheter och mönstring av HUVEC till rand- och punktmatrismönster. A) Magnetuppsättningar som är inneslutna i cellodlingsanordningar (i) och placerade i en cellodlingsplatta (ii). (B) och (C) Magnetuppsättningar och motsvarande cellmönster. Cellerna märktes med grönt fluorescerande protein (GFP) för visualisering av cellmönstret. Skalstänger = 1,5 mm; infällningar = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Mönstring av samkultursystem med steg-för-steg-strategi. (A) Samkulturmönstring med magnet i sidled (i-iii). Cellerna märktes med GFP (grön), DiD (blå) och DiI (röd) för att skilja olika celltyper åt. Skalstreck = 1 mm. (B) Samkulturmönster uppnås genom justering av Gd-DTPA-koncentrationen. i) 50 mM, ii) 20 mM. Skalstänger = 1,5 mm; infällningar = 250 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Cellmönster i en mikrofluidisk kammare. (A) Schematisk bild av den mikrofluidiska formen. (B) Tillverkning av mikrofluidik med användning av polydimetylsiloxan (PDMS) (i,ii). (C) Cellmönster i mikrofluidikanordningen (i,ii) och ett representativt resultat som visar punktmatriscellmönster (iii). Cellerna märktes med grönt fluorescerande protein (GFP). Skalstreck = 3 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggsfigur 1: Inverkan av Gd-DTPA på cellviabilitet. HUVEC behandlades med varierande koncentrationer av Gd-DTPA i 12 timmar och utsattes sedan för levande/död färgning eller CCK-8-analys. (A) Levande/död färgning av HUVEC. Skalstreck = 200 μm. (B) Histogram som visar resultat av levande/död färgning. C) Histogram som visar CCK-8-analysresultat. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den Mag-Arch-baserade cellmönstringen ger en användarvänlig lösning för de flesta biomedicinska laboratorier. Denna metod avancerar parallellt med tecken för bläckfri, etikettfri, substratoberoende och förmågan till mönstring med hög genomströmning 8,13. För cellmönster av monotyp mönstrar den celler i ett steg. Proceduren avslutas helt enkelt genom att fräscha upp odlingsmedierna.
Tidigare studier har använt magnetiska partiklar för att märka celler och attrahera dem med magneter för att bilda exakta mönster14,15. Närvaron av magnetiska partiklar på celler väckte dock oro för potentiella effekter på cellbeteenden. Mag-Arch-baserad cellmönstring tar den motsatta strategin genom att göra extracellulära vätskor paramagnetiska, snarare än celler. Denna strategi gör det mycket lättare att ta bort de extra paramagnetiska reagenserna genom att fräscha upp odlingsmediet. Studier har genererat cellulära sfärer och punktmatriser med Mag-Arch-baserad cellmönstring11,16. Jämfört med befintliga Mag-Arch-baserade studier kan de metoder som presenteras av detta protokoll fritt anpassa formen på mönstren. Dessutom presenterar protokollet strategier för att tillverka samkultursystem. Det har också visat sig fungera i slutna odlingskammare med smala celler, som vi testade i mikrofluidik.
I stället för parallella metoder, som kräver professionell bioprintningsutrustning17, anpassade mallar 18 eller ytmodifiering av komplex19, kräver den Mag-Arch-baserade metoden endast två nödvändigheter: magneter och GBCA. Ytan på magnetmönstret bestämmer cellmönstret omvänt. Flera mönster av ränder och punktmatriser som grundläggande demonstrerades. Användare kan skapa mönster fritt med olika former av magnetuppsättningar, som är rikligt kommersiellt tillgängliga. För att uppnå ett idealiskt resultat rekommenderas det att använda magneter som ger tillräcklig magnetisk kraft. I vår praktik antog vi N52 neodym-järn-bormagneter, vars remanens var över 1430 mT och ytmagnetism var över 100 mT på poler. För GBCA antogs Gd-DTPA eftersom det är stabilt under fysiologiska förhållanden och billigt tillgängligt i de flesta länder och områden. Andra GBCA-avtal skulle kunna antas som alternativ. Makrocykliska icke-joniska GBCA, såsom gadobutrol och gadoteridol, kan vara ett bättre val för lägre cytotoxicitet vid mönstring av sårbara celler för långtidsbehandling11,12.
Begränsningen för Mag-Arch-baserad cellmönstring ligger huvudsakligen i arbetsområdet för magnetfältet som genereras av magneter. Enligt den omvända kvadratformeln minskar magnetfältet kraftigt med avståndet8. Som en konsekvens misslyckas Mag-Arch-metoden med att montera idealiska cellmönster på allmänna polystyrencellodlingsskålar eller plattor, vars bottnar är tjockare än 1 mm. Således måste protokollet fungera på tunnare cellodlingsytor, såsom glasglas eller konfokala cellodlingsskålar. Vid mönstring inuti mikrofluidik krävs också att mikrofluidikens bottenglas ska vara tunnare än 0,5 mm. För att etablera samodlingssystem kan metoden vara tidskrävande, för varje ytterligare celltyp ökar tiden med 3-6 timmar för cellbindning.
Sammantaget ger detta protokoll ett förenklat sätt för cellmönster, som kan replikeras i de flesta laboratorier utan någon speciell utrustning. Användare kan använda det som ett kraftfullt verktyg för att studera cellbeteenden, efterlikna multicellulära mikromiljöer eller testa cellaffiniteten hos biomaterial8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Denna studie stöds ekonomiskt av National Key R&D Program of China (2021YFA1101100), National Natural Science Foundation of China (32000971), Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. 2021FZZX001-42) och Starry Night Science Fund of Zhejiang University Shanghai Institute for Advanced Study (Grant No. SN-ZJU-SIAS-004).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A2780 ovarian cancer cells | Procell | CL-0013 | |
| Cell culture medium (DMEM, high glucose) | Gibco | 11995040 | |
| Cover slides | Citotest Scientific | 80340-3610 | For fabricating microfluidics. Dimension: 24 mm × 50 mm |
| DiD | MedChemExpress (MCE) | HY-D1028 | For labeling cells with red fluorescence (Ex: 640 nm) |
| DiI | MedChemExpress (MCE) | HY-D0083 | For labeling cells with orange fluorescence (Ex: 550 nm) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochannel | BC-SE-FBS07 | |
| Gadopentetate dimeglumine (Gd-DTPA) | Beijing Beilu Pharmaceutical | H10860002 | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | V900863 | |
| Glass cell slides | Citotest Scientific | 80346-2510 | Diameter: 25 mm; thickness: 0.19-0.22 mm |
| Glass plates | PURESHI hardware store | For fabricating microfluidics. Dimension: 40 mm × 75 mm | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) | Servicebio | STCC12103G-1 | |
| Neodymium-iron-boron magnets (N52) | Lalaci | ||
| Non-toxic glass plate coating (Gel Slick Solution) | Lonza | 1049286 | For convenience of demolding when fabricating microfluidics |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Servicebio | G4200 | |
| Plasma cleaner | SANHOPTT | PT-2S | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | DOWSIL | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | For fabricating microfluidics |
| Polytetrafluoroethylene (PFTE) mold | PURESHI hardware store | Customized online, for fabricating microfluidics | |
| Silicon plate | PURESHI hardware store | ||
| Smooth Muscle Cells (SMC) | Procell | CL-0517 | |
| Ultrasonic cleaner | Sapeen | CSA-02 |
References
- Christian, J., et al. Control of cell adhesion using hydrogel patterning techniques for applications in traction force microscopy. J Vis Exp. 179, e63121 (2022).
- Abbas, Y., Turco, M. Y., Burton, G. J., Moffett, A. Investigation of human trophoblast invasion in vitro. Hum Reprod Update. 26 (4), 501-513 (2020).
- Park, M., et al. Modulation of heterotypic and homotypic cell-cell interactions via zwitterionic lipid masks. Adv Healthc Mater. 6 (15), 1700063 (2017).
- Ren, T., Chen, P., Gu, L., Ogut, M. G., Demirci, U. Soft ring-shaped cellu-robots with simultaneous locomotion in batches. Adv Mater. 32 (8), e1905713 (2020).
- Ren, T., Steiger, W., Chen, P., Ovsianikov, A., Demirci, U. Enhancing cell packing in buckyballs by acoustofluidic activation. Biofabrication. 12 (2), 025033 (2020).
- Ge, S., et al. Magnetic levitation in chemistry, materials science, and biochemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 59 (41), 17810-17855 (2020).
- Puluca, N., et al. Levitating cells to sort the fit and the fat. Adv Biosyst. 4 (6), e1900300 (2020).
- Ren, T., et al. Programing cell assembly via ink-free, label-free magneto-archimedes based strategy. ACS Nano. 17 (13), 12072-12086 (2023).
- Li, Y. C., et al. Programmable laser-assisted surface microfabrication on a poly(vinyl alcohol)-coated glass chip with self-changing cell adhesivity for heterotypic cell patterning. ACS Appl Mater Interfaces. 7 (40), 22322-22332 (2015).
- Chliara, M. A., Elezoglou, S., Zergioti, I. Bioprinting on organ-on-chip: Development and applications. Biosensors (Basel). 12 (12), 1135 (2022).
- Moncal, K. K., Yaman, S., Durmus, N. G. Levitational 3D bioassembly and density-based spatial coding of levitoids. Adv Funct Mater. 32 (50), 2204092 (2022).
- Parfenov, V. A., et al. Magnetic levitational bioassembly of 3D tissue construct in space. Sci Adv. 6 (29), eaba4174 (2020).
- Dell, A. C., Wagner, G., Own, J., Geibel, J. P. 3D bioprinting using hydrogels: Cell inks and tissue engineering applications. Pharmaceutics. 14 (12), 2596 (2022).
- Ino, K., Ito, A., Honda, H. Cell patterning using magnetite nanoparticles and magnetic force. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1309-1317 (2007).
- Okochi, M., Matsumura, T., Honda, H. Magnetic force-based cell patterning for evaluation of the effect of stromal fibroblasts on invasive capacity in 3d cultures. Biosens Bioelectron. 42, 300-307 (2013).
- Mishriki, S., et al. Rapid magnetic 3D printing of cellular structures with mcf-7 cell inks. Research (Wash D C). 2019, 9854593 (2019).
- Ozturk-Oncel, M. O., Leal-Martinez, B. H., Monteiro, R. F., Gomes, M. E., Domingues, R. M. A. A dive into the bath: Embedded 3D bioprinting of freeform in vitro models. Biomater Sci. 11, 5462-5473 (2023).
- Sahni, G., Yuan, J., Toh, Y. C. Stencil micropatterning of human pluripotent stem cells for probing spatial organization of differentiation fates. J Vis Exp. 112, e54097 (2016).
- Joddar, B., et al. Engineering approaches for cardiac organoid formation and their characterization. Transl Res. 250, 46-67 (2022).
