Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

استخدام التصوير الحي خارج الجسم الحي للتحقيق في انقسامات الخلايا وحركاتها أثناء تجديد أسنان الفأر

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/66020
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2, 1,3
1School of Dentistry, University of California Los Angeles, 2The Institute of Biomedical and Oral Research, Faculty of Dental Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 3Molecular Biology Institute, University of California Los Angeles
* These authors contributed equally

Summary

التصوير الحي خارج الجسم الحي هو تقنية قوية لدراسة العمليات الديناميكية للحركات الخلوية والتفاعلات في الأنسجة الحية. هنا ، نقدم بروتوكولا ينفذ الفحص المجهري ثنائي الفوتون لتتبع الخلايا الظهارية السنية الحية في قواطع الفئران البالغة المستزرعة.

Abstract

تظهر قاطعة الفأر المتنامية باستمرار كنظام نموذجي قابل للتتبع للغاية للتحقيق في تنظيم الخلايا الجذعية الظهارية والوسيطة البالغة وتجديد الأسنان. تنقسم هذه المجموعات السلفية وتتحرك وتتمايز بنشاط للحفاظ على توازن الأنسجة وتجديد الخلايا المفقودة بطريقة سريعة الاستجابة. ومع ذلك ، فإن التحليلات التقليدية باستخدام أقسام الأنسجة الثابتة لا يمكن أن تلتقط العمليات الديناميكية للحركات والتفاعلات الخلوية ، مما يحد من قدرتنا على دراسة لوائحها. تصف هذه الورقة بروتوكولا للحفاظ على قواطع الفئران الكاملة في نظام زراعة النباتات والخلايا الظهارية السنية الحية باستخدام المجهر متعدد الفوتونات. تضيف هذه التقنية إلى مجموعة أدواتنا الحالية لأبحاث الأسنان وتسمح للمحققين بالحصول على معلومات زمانية مكانية حول سلوكيات الخلايا ومنظماتها في الأنسجة الحية. نتوقع أن تساعد هذه المنهجية الباحثين على استكشاف الآليات التي تتحكم في العمليات الخلوية الديناميكية التي تحدث أثناء تجديد الأسنان وتجديدها.

Introduction

على مدى العقدين الماضيين ، برزت قاطعة الماوس كمنصة لا تقدر بثمن للتحقيق في مبادئ تنظيم الخلايا الجذعية البالغة وتجديد الأسنان 1,2. تنمو قاطعة الفأر باستمرار وتجدد نفسها طوال حياة. يقوم بذلك عن طريق الحفاظ على كل من الخلايا الجذعية الظهارية والوسيطة ، والتي يمكن أن تتجدد ذاتيا وتتمايز إلى أنواع مختلفة من خلايا السن 1,2. في حين أن الخلايا الجذعية الظهارية السنية تؤدي إلى ظهور الأرومات المينائية ، التي تفرز مصفوفة المينا ، فإن الخلايا الجذعية الوسيطة السنية تؤدي إلى ظهور الأرومات السنية ، والأرومات الأسمنتية ، والخلايا الليفية ، والتي تشكل العاج ، والملاط ، والرباط اللثوي ، على التوالي3،4،5،6. يحافظ هذا الإمداد المستمر للخلايا الجديدة على توازن الأنسجة ويسمح باستبدال الخلايا القديمة المفقودة بسبب تآكل المضغ أو الإصابات 7,8. لذلك فإن توضيح الآليات الخلوية والجزيئية التي تنظم صيانة وتمايز الخلايا الجذعية السنية أمر أساسي لفهم تجديد الأسنان ، وهو مجال يحظى باهتمام متزايد.

تشريحيا ، يتم تغليف جزء كبير من قاطعة الفأر البالغة في عظم الفك. أثناء تعرض الحافة القاطعة للسن ، فإن الطرف القمي للقواطع يتناسب مع التجويف ويتم ربطه بقوة بالعظم المحيط من خلال أربطة اللثة والأنسجة الضامة (الشكل 1 أ ، ب). النهاية القمية للقواطع هي أيضا منطقة نمو السن وتحافظ على جذع الأسنان والخلايا السلفية في كل من الطبقة الظهارية ولب اللحمة المتوسطة9،10،11،12،13. على وجه التحديد ، يتم الحفاظ على الخلايا الجذعية الطلائية السنية في الطرف المنتفخ من الظهارة ، والمعروفة باسم البرعم القمي ، والتي يشار إليها أيضا باسم حلقة عنق الرحم الشفوية (الشكل 1C). على غرار ظهارة الأمعاء والبشرة ، يتم دعم التجديد الظهاري في القاطعة بشكل أساسي من خلال تدوير الخلايا الجذعية بنشاط وأحفادها الوسيطة التكاثرية للغاية ، والتي تسمى خلايا تضخيم العبور14،15،16،17 ، وكلاهما مقيم في الجزء الداخلي من حلقة عنق الرحم. ومع ذلك ، لا يزال يتعين تحديد ما إذا كانت ظهارة القواطع تحتوي على خلايا جذعية هادئة وتستخدمها أثناء التجديد. في المقابل ، تم تحديد كل من الخلايا الجذعية الوسيطة السنية النشطة والهادئة في اللب القمي ، وتعمل الخلايا الجذعية الهادئة كمجموعة احتياطية يتم تنشيطها أثناء إصلاح الإصابة13,18.

نتجت العديد من الاكتشافات حول بيولوجيا تجديد وتجديد قاطعة الفأر عن التحقيقات النسيجية ، حيث يتم الحصول على عينات في منعطفات زمنية متميزة ، وتثبيتها ، ومعالجتها ، ثم تقسيمها إلى شرائح رقيقة ميكرون على طول مستوى معين. من خلال التحليل التفصيلي للأقسام النسيجية من نماذج الفئران المختلفة التي تمكن من تتبع النسب أو الاضطرابات الجينية ، حدد العلماء سلالات الخلايا لمختلف مجموعات السلف ، بالإضافة إلى المسارات الجينية والإشارات التي تتحكم في توازن القواطع وإصلاح الإصابات19،20،21. ومع ذلك ، فإن الصور الثابتة ثنائية الأبعاد (2D) للخلايا غير الحيوية في الأقسام لا يمكنها التقاط مجموعة كاملة من السلوكيات الخلوية والمنظمات المكانية في الأنسجة الحية ، مثل تغيرات شكل الخلية والحركات والحركية الخلوية. يتطلب اكتشاف وقياس هذه التغيرات الخلوية السريعة ، والتي تحدث في نطاق زمني غير قابل للحل من خلال تقسيم الأنسجة ، استراتيجية مختلفة. علاوة على ذلك ، يعد الحصول على مثل هذه المعلومات أمرا بالغ الأهمية أيضا لفهم كيفية تفاعل خلايا الأسنان مع بعضها البعض ، والتفاعل مع محفزات الإشارات المختلفة ، والتنظيم الذاتي للحفاظ على هياكل الأنسجة ووظائفها.

إن ظهور التصوير العميق للأنسجة رباعي الأبعاد (4D) باستخدام المجهر ثنائي الفوتون22 ، وهي تقنية تدمج ثلاثة أبعاد مكانية مع الدقة الزمنية ، يتغلب على القيود المتأصلة في التحليل النسيجي من خلال تمكين الفحص الزماني المكاني لنباتات الأنسجة المستزرعة أو المواد العضوية أو حتى الأنسجة في الموقع23،24،25،26. على سبيل المثال ، كشف التصوير الحي 4D لظهارة الأسنان النامية النقاب عن الأنماط الزمانية المكانية لانقسامات الخلايا والهجرات التي تنسق نمو الأنسجة ، وتشكيل مركز الإشارات ، وتشكل ظهارة الأسنان27،28،29،30،31،32. في قاطعة الفئران البالغة ، تم تكييف التصوير 4D مؤخرا لدراسة السلوكيات الخلوية أثناء إصلاح إصابة الأسنان الظهارية. كشف التصوير الحي أن الخلايا البينية للطبقة في الطبقة فوق القاعدية يمكن تحويلها مباشرة إلى أرومات المينائية في الطبقة القاعدية لتجديد الظهارة التالفة ، مما يتحدى النموذج التقليدي لإصلاح الإصابات الظهارية15.

هنا ، نصف تشريح وزراعة وتصوير قاطعة الفئران البالغة ، مع التركيز على الخلايا الظهارية في حلقة عنق الرحم الشفوية (الشكل 1). تحافظ هذه التقنية على حيوية خلايا الأسنان لأكثر من 12 ساعة وتسمح بالتتبع المباشر للخلايا ذات العلامات الفلورية بدقة خلية واحدة. يسمح هذا النهج بالتحقيق في حركة الخلية وهجرتها بالإضافة إلى التغيرات الديناميكية في شكل الخلية واتجاه الانقسام في ظل ظروف الثقافة العادية ، أو في الاستجابات للاضطرابات الجينية والفيزيائية والكيميائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الحفاظ على جميع الفئران في مرافق حيوانية خالية من مسببات الأمراض في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (UCLA) أو الجامعة العبرية في القدس (HUJI). تم إجراء جميع التجارب التي شملت الفئران وفقا للوائح والبروتوكولات المعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية المعنية لرعاية واستخدام (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) أو (MD-23-17184-3; هوجي). يظهر سير العمل العام للخطوات التجريبية في الشكل 2 أ. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع الأدوات والكواشف والمواد المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. إعداد الحلول والمواد الهلامية

  1. وسط التشريح: قم بإعداد DMEM / F12 الطازج مع 0.5٪ جلوكوز واحتفظ به دافئا عند 37 درجة مئوية حتى الحاجة إليه في الخطوة 2.4.
    ملاحظة: نستخدم DMEM / F12 بدون الفينول الأحمر لتقليل التألق الذاتي أثناء التصوير الحي.
  2. 1x وسط ثقافة: تحضير وسط طازج باستخدام 50٪ DMEM / F12 ، مصل الفئران 50٪ ، 1x بديل الجلوتامين ، 1x أحماض أمينية غير أساسية MEM ، 1٪ جلوكوز ، 0.1 مجم / مل حمض الأسكوربيك ، و 0.5٪ بنسلين ستربتومايسين. احتفظ بها دافئة عند 37 درجة مئوية حتى الحاجة إليها في الخطوة 5.5. تستخدم هذه الوسيلة لزراعة نباتات القواطع أثناء التصوير الحي.
    ملاحظة: يجب أن يكون مصل الفئران عالي الجودة ومعدا خصيصا لزراعة الأنسجة الكاملة من قبل الباحثين أو من مصدر تجاري. على وجه الخصوص ، يجب طرد الدم بالطرد المركزي (لمدة 5 دقائق عند 1200 × جم في درجة حرارة الغرفة) قبل أن يبدأ التخثر في التكون. بعد الطرد المركزي ، يجب ضغط جلطة الفيبرين الناتجة والتخلص منها33.
  3. جل الثقافة: الغرض من الجل هو شل حركة العينات أثناء التصوير ويتم تحضيرها طازجة.
    1. اصنع 2٪ جل في DMEM / F12 عن طريق إذابة 200 مجم من أغاروز نقطة الانصهار المنخفضة في 10 مل من DMEM / F12 باستخدام الميكروويف. احفظ الجل 2٪ عند 37 درجة مئوية.
    2. اصنع وسطا للاستزراع 2x (بدون DMEM / F12) عن طريق خلط 50٪ مصل الفئران ، 1x بديل الجلوتامين ، 1x أحماض أمينية غير أساسية MEM ، 1٪ جلوكوز ، 0.1 مجم / مل L-حمض الأسكوربيك ، و 0.5٪ بنسلين ستربتومايسين. قم بتسخين وسط الاستزراع 2x (بدون DMEM / F12) إلى 37 درجة مئوية.
    3. اصنع جل استزراع 1٪ عن طريق خلط كميات متساوية من 2٪ جل ووسط استزراع 2x (بدون DMEM / F12). احتفظ بجل المستنبتة 1٪ عند 37 درجة مئوية حتى الحاجة إليه في الخطوة 5.1.
      ملاحظة: تأكد من أن جميع المحاليل دافئة قبل الخلط لتجنب التبلور. وجدنا أن 1٪ جل مناسب لزراعة قاطعة الماوس البالغة. يجب تحديد نسبة الجل تجريبيا إذا كان سيتم زراعة الأنسجة الأخرى.

2. استخراج الفك السفلي للفأر البالغ

  1. القتل الرحيم للفئران في العمر المطلوب باستخدام الإجراءات القياسية المعتمدة من قبل IACUC.
    ملاحظة: هنا نستخدم اختناق CO2 متبوعا بخلع عنق الرحم. قد تختلف لوائح القتل الرحيم للحيوانات في مناطق مختلفة. يجب على الباحثين الحصول على الموافقة المؤسسية اللازمة قبل إجراء التجارب وضمان الامتثال للوائح رعاية المحلية.
  2. تطهير الماوس باستخدام 70 ٪ من الإيثانول.
  3. قطع رأس الماوس واستخراج الفك السفلي الأيسر والأيمن.
    1. ضع الماوس على بطنه ، ثم استخدم شفرة حلاقة صناعية أحادية الحافة # 9 لقطع منطقة الرقبة وفصل رأس الماوس عن بقية الجسم.
      ملاحظة: إذا كان سيتم جمع الأنسجة من البلعوم أو منطقة الرقبة أيضا ، فلا ينبغي إجراء قطع الرأس ، ويمكن للمرء المتابعة مباشرة إلى الخطوة 2.3.2.
    2. اقلب الماوس بحيث يكون جانبه البطني متجها لأعلى ويمكن الوصول إلى الفك السفلي بسهولة.
    3. قم بتأمين رأس عن طريق إمساكه برفق بين الإبهام والسبابة.
    4. استخدم شفرة الحلاقة لعمل شق منتصف السهمي يقطع جلد الفك السفلي من الشفة السفلية باتجاه خط العنق.
      ملاحظة: يمكن أيضا استخدام شفرة جراحية # 15 لإجراء الشق والتشريح اللاحق (الخطوات 2.3.6-2.3.9).
    5. أثناء إجراء الشق ، انشر الجلد المقطوع باستخدام الإبهام والسبابة لكشف العضلات وعظم الفك تحتها.
    6. استخدم شفرة الحلاقة لقطع عضلات العضل على الجانب الشدقي من الفك السفلي ، بحيث يكون الجزء الخارجي من النصف الأيسر والأيمن خاليا الآن من ملحقات العضلات.
    7. قطع العضلات النخاعية اللامية على طول الجانب الداخلي من الفك السفلي لإزالة المرفقات العضلية هناك.
    8. قم بعمل شق آخر في ارتفاق الفك السفلي الذي يربط بين نصفي الدم. بمجرد القطع ، سيتم فصل الفك السفلي إلى النصفين الأيسر والأيمن.
    9. إسفين شفرة الحلاقة بين لقمة الفك السفلي ومفصل الفك السفلي الصدغي وتشريح بعناية من hemimandible من بقية الرأس.
      ملاحظة: وجدنا أنه من المفيد سحب القاطعة برفق في نفس الوقت أثناء القطع. يجب توخي الحذر لتجنب كسر الفك السفلي وإتلاف الأنسجة الرخوة بداخله.
  4. انقل الفك السفلي المقطعي على الفور إلى طبق بتري باستخدام وسائط التشريح الدافئة (الخطوة 1.1) وقم بإزالة الأنسجة العضلية المتبقية باستخدام شفرة جراحية # 15.
    ملاحظة: يؤدي الاحتفاظ بالعينات في الوسائط الباردة إلى إبطاء أنشطة الخلايا ، مما يؤدي إلى تأخير أو حتى فشل عمليات استرداد بعض أنشطة الخلايا ، مثل التكاثر أو حركة الخلايا ، أثناء التصوير الحي.

3. عزل قواطع الماوس بأكملها

ملاحظة: يتم إجراء مزيد من العزل للقواطع تحت مجهر تشريح المجال الساطع.

  1. حدد بصريا المنطقة البيضاوية من الفك السفلي التي تغطي مقبس القاطعة وتضم الجزء القمي من القاطعة.
  2. ضع الفك السفلي بحيث يكون السطح الداخلي (اللساني) متجها لأعلى.
  3. أثناء تثبيت الفك السفلي في مكانه باستخدام ملقط مسنن ، قم بإنشاء نافذة في المنطقة البيضاوية عن طريق حلق عظم الغشاء المغطي باستخدام شفرة جراحية # 15 ، في اتجاه من اللقمة نحو الأضراس. هذا يكشف الأنسجة الرخوة للقاطعة القمية على السطح الداخلي.
  4. اقلب الفك السفلي بحيث يكون السطح الخارجي (الشدق) متجها لأعلى.
  5. قم بإنشاء نافذة في المنطقة البيضاوية على الفك السفلي الخارجي كما هو موضح في الخطوة 3.3 واستخدم طرف المشرط لالتقاط أي شظايا عظمية متبقية عند الحافة. تأكد من أن الطرف القمي للسن مرئي من كلا الجانبين.
    ملاحظة: تجنب الضغط المفرط أثناء حلق العظام لمنع تلف الأنسجة الرخوة الأساسية.
  6. قطع العظام المحيطة بالقاطعة بشكل منهجي لعزل السن بأكمله.
    1. قم بعمل قطع نظيف في مستوى مجاور مباشرة للقاطعة القمية لإزالة عملية اللقمة أولا.
      ملاحظة: احرص على عدم قطع القاطعة.
    2. جعل قطع الثانية فقط الخلفي إلى الضرس 3 ، ولكن الظهرية إلى القاطعة دون الإضرار بالسن. هذا يزيل العظم الذي يتضمن عملية الإكليل.
    3. قطع متسلسل من طرف العملية الزاوية نحو القاطعة لإزالة الفك السفلي البطني تدريجيا بطريقة تدريجية.
      ملاحظة: غالبا ما تكون ظهارة الأسنان وأنسجة اللثة المرتبطة بها عالقة في العظم ويمكن اقتلاعها بسهولة إذا تم قطع جزء كبير من العظم البطني دفعة واحدة. لفصل العظم عن الأنسجة الرخوة القاطعة ، يمكن للمرء إدخال المشرط (أو زوج من الملقط الحاد غير المسنن) بين النسجين في الطرف القمي للقاطعة وتحريك الأداة بدقة للأمام.
    4. قطع العظم السنخي مع الأضراس وأي عظام متبقية لا تزال متصلة بالقاطعة.
    5. القاطعة بأكملها معزولة الآن. انقل القاطعة التي تم تشريحها بالكامل إلى طبق به وسائط تشريح دافئة ونظيفة (الخطوة 1.1).
  7. كرر الخطوات من 3.2 إلى 3.6 لعزل القواطع الإضافية حسب الحاجة.
    ملاحظة: تحافظ القواطع الفكية / العلوية للفأر أيضا على الخلايا الجذعية البالغة ويمكن استخدامها لدراسة تجديد الأسنان34. يركز باحثو طب الأسنان عادة على القواطع السفلية لأنها أكثر سهولة ويمكن تشريحها بسهولة أكبر من القواطع العلوية. لا يزال يتعين تحديد الاختلافات بين الخلايا السلفية القاطعة للفك السفلي والفك العلوي.

4. إزالة أنسجة اللثة لفضح حلقة عنق الرحم الظهارية القاطعة

  1. مع وضع القاطعة بأكملها على جانبها اللساني وأثناء تثبيت السن في مكانه باستخدام ملقط مسنن ، استخدم زوجا من الملقط الناعم # 5 لبدء دس أنسجة اللثة التي تغطي القاطعة القمية ومنطقة حلقة عنق الرحم.
  2. انزع بعناية أنسجة اللثة من البرعم القمي ، بحيث يصبح الجانب الجانبي من حلقة عنق الرحم (أو مناطق أخرى ذات أهمية) مرئيا تحت النطاق.
    ملاحظة: يجب توخي الحذر لتجنب إتلاف ظهارة الأسنان أو فصلها عن اللحمة المتوسطة. إذا كان القواطع تحتوي على إشارات مضان في المنطقة محل الاهتمام ، وكان مجهر تشريح الفلورسنت متاحا ، فيمكن استخدام إشارات التألق للمساعدة في التمييز بين أنواع الأنسجة وتشريح المساعدة. من المهم تنفيذ الأقسام 2-4 بكفاءة حتى يمكن نقل العينات بسرعة إلى وسط الاستزراع وصيانتها بشكل كاف من خلال الاستزراع المزروع (انظر أدناه).

5. تضمين الأنسجة لثقافة النبات

  1. أضف 500 ميكرولتر من جل الاستزراع الدافئ غير الصلب إلى بئر في صفيحة مكونة من 24 بئرا وانقل القواطع الكاملة المشرحة بسرعة إلى البئر. قم بتدوير اللوحة عدة مرات لشطف القواطع.
  2. أضف 400 ميكرولتر من جل الثقافة الدافئ غير الصلب إلى طبق الاستزراع وانقل القواطع المغسولة إلى الطبق.
    ملاحظة: نستخدم طبق استزراع متوفر تجاريا ومتوافق مع إعداد التروية. راجع الخطوة 6.4 للحصول على خيارات بديلة.
  3. قم بتوجيه القاطعة لوضع منطقة حلقة عنق الرحم (أو مناطق أخرى ذات أهمية) في وسط الطبق (الشكل 2 أ ، ب) واضبط إمالة القاطعة القمية لمستوى التصوير المطلوب.
    ملاحظة: يجب أن يتم توجيه الأنسجة بسرعة قبل الهلام الكامل.
  4. بعد ضبط الجل ، استخدم زوجا من الملقط الدقيق لإزالة أي هلام أعلى المنطقة محل الاهتمام حتى لا يتم تغطيته بالهلام.
  5. أضف كمية كافية من وسائط الاستزراع الدافئة عن طريق سحبها ببطء على حافة الطبق لتغطية العينة فقط (~ 150 ميكرولتر).
  6. انقل مزرعة الزرع إلى حاضنة زراعة الخلايا 37 درجة مئوية للسماح باستقرار الأنسجة والتكيف مع حالة المزرعة لمدة 1 ساعة.

6. الفحص المجهري الفاصل الزمني لمحطات القواطع

ملاحظة: في هذه التجربة ، استخدمنا مجهرا رأسيا مزودا بهدف غمس الماء 25x بفتحة عددية تبلغ 1. بشكل عام ، تعد عدسة غمس الماء ذات الفتحة العددية العالية هي الأنسب لتصوير الأنسجة العميقة.

  1. قم بتشغيل المجهر والليزر ثنائي الفوتون.
  2. ثبت طبق الاستزراع بمحول المسرح وقم بتركيب حلقة محول التروية في الأعلى (الشكل 2 ج).
  3. قم بتوصيل محول المرحلة بجهاز التحكم في درجة الحرارة المحدد للحفاظ على الثقافة عند 37 درجة مئوية.
  4. قم بتوصيل مدخل ومخرج حلقة المحول بمضخة التروية الدقيقة وابدأ نضح وسط الاستزراع ، مع ضبط سرعة التروية على 20 على المضخة. وهذا يولد تدفقا بطيئا (~ 5 مل / ساعة) لوسط الاستزراع فوق الجزء العلوي من العينات (الشكل 2C).
    ملاحظة: انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول النظام للحفاظ على الأنسجة في بيئة يتم التحكم فيها بثبات. يمكن استخدام أنظمة أخرى أيضا. يمكن أيضا استخدام مزيج من صفيحة تسخين 37 درجة مئوية وطبق استزراع التروية محلي الصنع (الشكل التكميلي S1) مع مدخل ومخرج متصل بمضخات الحقن.
  5. ضع حلقة حاجز التحكم في الغلاف الجوي (ACBR) أعلى حلقة المحول وقم بخفض الهدف من خلال ACBR لمجرد الاتصال بوسط الاستزراع (الشكل 2D).
  6. اضبط الطول الموجي لليزر على 920 نانومتر لتصور كل من إشارات GFP والتألق الأحمر (على سبيل المثال ، tdTomato).
  7. حدد موقع العينات من خلال العدسات ثم على برنامج المجهر.
  8. قم بإعداد مكدسات Z والتصوير متعدد المواضع والفترات الزمنية باستخدام البرنامج. لاتباع هذا البروتوكول ، استخدم حجم z-step يبلغ 4 ميكرومتر وفاصل زمني قدره 5 دقائق لمدة 14 ساعة.
    ملاحظة: وجدنا أن الفاصل الزمني الذي يزيد عن 5 دقائق غالبا ما يكون غير كاف لالتقاط حركات الخلايا الملساء والانقسامات.
  9. بدء التصوير بفاصل زمني.
    ملاحظة: قد يتغير موضع العينة خلال الساعة الأولى وقد يلزم إجراء مزيد من التعديلات.
  10. حفظ الملفات لمعالجة البيانات النهائية وتحليلها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم تغليف المنطقة القمية لقواطع الفأر البالغة داخل الفك السفلي (الشكل 1) ، وبالتالي ، لا يمكن الوصول إليها مباشرة لتصور الخلايا السلفية المقيمة داخل منطقة النمو وتتبعها مباشرة. لذلك ، قمنا بتطوير طريقة لاستخراج القاطعة بأكملها من عظم الفك والحفاظ عليها في نظام استزراع نباتي للفحص المجهري ثنائي الفوتون (الشكل 2). هنا نصف النتائج التمثيلية التي تلتقط العملية الديناميكية لتكاثر الخلايا وحركتها في منطقة حلقة عنق الرحم الشفوية في ظهارة الأسنان.

لتوضيح الإجراءات التجريبية ، استخدمنا نموذجين مختلفين للفأر يعبران عن مضان أخضر في ظهارة الأسنان. خط الماوس الأول هو K14Cre. R26rtTA ؛ tetO-H2B-GFP ، حيث يعبر K14Cre (MGI: 2680713) عن Cre recombinase من مروج Keratin 1435 وينشط التعبير عن المنشط العكسي الذي يتحكم فيه التتراسيكلين في الظهارة من أليل R26rtTA 36 (MGI: 3584524). عند إعطاء الدوكسيسيكلين ، يحفز rtTA تعبير هيستون H2B-GFP من أليل tetO-H2B-GFP 37 (MGI: 3043783) ويسمي نوى الخلايا الظهارية بالتألق الأخضر. هذا مفيد بشكل خاص لتتبع الخلايا وللكشف عن انقسامات الخلايا. في هذه التجربة ، قمنا بإطعام بطعام الدوكسيسيكلين لمدة 24 ساعة قبل التضحية لتنشيط تعبير H2B-GFP. خط الماوس الثاني هو K14Cre. R26mT / mG ، حيث R26mT / mG (MGI: 3803814) هو مراسلCre-38. في غياب نشاط Cre ، تعبر الخلايا عن tdTomato (mT) الموضعي بالغشاء مع مضان أحمر. عند إعادة التركيب بوساطة Cre ، تعبر الخلايا عن غشاء GFP (mG). K14كري ؛ وبالتالي ، فإن R26mT / mG يسمي أغشية الخلايا الظهارية ذات التألق الأخضر ، تاركا الخلايا غير الظهارية حمراء. يتيح ذلك سهولة تصور أشكال الخلايا والانقسامات والحركات.

بدأنا الإجراء عن طريق تشريح الفك السفلي (الشكل 3 أ) ثم أزلنا بشكل منهجي جميع العظام المحيطة بالقاطعة (الشكل 3B-G). نتج عن ذلك قواطع كاملة ذات ظهارة غير تالفة (الشكل 3H). أكدنا سلامة ظهارة الأسنان من خلال فحص التألق الأخضر في K14Cre. R26rtTA ؛ tetO-H2B-GFP و K14Cre ؛ الفئران R26mT / mG (الشكل 4A ، B ، E ، F). في هذه المرحلة ، لا تزال أنسجة اللثة المعتمة تغطي القاطعة القمية ، وبالتالي تبدو حلقة عنق الرحم ضبابية بسبب تشتت الضوء ، مما يعيق بالمثل التصوير الفاصل الزمني في اتجاه مجرى النهر (الشكل 4C ، G). لذلك قمنا بإزالة أنسجة اللثة بعناية ، بحيث يمكن تمييز ظهارة الأسنان مع حلقة عنق الرحم في كل قاطعة (الشكل 4D ، H).

ثم تم تضمين القواطع في أغاروز نقطة انصهار منخفضة واستزراعها في إعداد التروية للتصوير الحي ثنائي الفوتون كما هو موضح في الشكل 2. في هذا التمرين ، ركزنا على منطقة حلقة عنق الرحم في ظهارة الأسنان والتقطنا صورا z-stack على فترات 4 ميكرومتر كل 5 دقائق على مدار 14 ساعة (الشكل 5 أ). والجدير بالذكر أن إشارات H2B-GFP لوحظت في الغالب في منطقة تضخيم العبور في حلقة عنق الرحم ، حيث توجد انقسامات خلوية نشطة (الشكل 5B). هذا على الأرجح بسبب وجود تبادل H2B-GFP أعلى في الكروماتين المفتوحة والاندماج في النيوكليوسومات بعد تكرار الحمض النووي في هذه الخلايا النشطة39.

قمنا بعد ذلك بفحص صور الفاصل الزمني باستخدام ImageJ واستنادا إلى فصل إشارات H2B-GFP40 ، تمكنا من ملاحظة العديد من انقسامات الخلايا طوال فترة التصوير (الفيديو التكميلي S1 والفيديو التكميلي S2). هذا يشير إلى أن الأنسجة تم الحفاظ عليها بشكل كاف في ثقافة الزرع وكانت الخلايا نشطة. على وجه التحديد ، تمكنا من ملاحظة تكثيف ومحاذاة الكروموسومات في لوحة الطور في الخلايا الانقسامية ، متبوعا بفصلها إلى خليتين ابنتين أثناء الطور (الشكل 5C-N ، يتم تتبعه يدويا باستخدام المكون الإضافي ImageJ TrackMate). كانت معظم هذه الانقسامات متعامدة أو بزاوية مائلة بالنسبة للغشاء القاعدي (الشكل 5C-K والفيديو التكميلي S1). يمكن أيضا اكتشاف الانقسامات الأفقية الموازية للغشاء القاعدي ، على الرغم من حدوثها بشكل أقل تكرارا (الشكل 5L-N والفيديو التكميلي S2). من المهم الإشارة إلى أن التحلل الخلوي في ظهارة الأسنان غالبا ما يحدث بسرعة ، في غضون 5-10 دقائق. نتيجة لذلك ، قد تفوت فترات الفاصل الزمني التي تزيد عن 5 دقائق بعض هذه الأقسام.

كانت أحداث انقسام الخلايا واضحة أيضا في K14Cre. حلقات عنق الرحم R26mT / mG ، حيث تم تمييز جميع أغشية الخلايا الظهارية باللون الأخضر (الشكل 6 أ). يمكننا تحديد الخلايا الانقسامية من خلال تقريب الخلايا ثم التحلل الخلوي (الفيديو التكميلي S3) ، وكان من الممكن ملاحظة كل من انقسامات الخلايا الرأسية والأفقية (الشكل 6B-G) ، وبالتالي تشبه النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام H2B-GFP. معا ، تظهر هذه النتائج أن هذا البروتوكول يمكن أن يكون بمثابة أداة قوية للتحقيق في سلوكيات الخلايا في النباتات القاطعة عند دمجها مع النماذج الجينية للفأر التي تصف بشكل فلوري الهياكل تحت الخلوية المتميزة.

Figure 1
الشكل 1: مخططات فك الفأر وحلقة عنق الرحم القاطعة. (أ) جزء كبير من القاطعة مضمن في عظم الفك. تقع منطقة النمو في الطرف القمي للسن وتدعم نموها المستمر (السهم الأخضر الداكن). ب: تضخم القاطعة القمية المحاطة بأنسجة اللثة. يتكون السن من المينا والعاج ، وهي هياكل عالية التمعدن تتكون من الأرومات المينائية والأرومات السنية ، على التوالي. ج: مقطع سهمي من القاطعة القمية، يوضح أن الخلايا السلفية الطلائية السنية والخلايا المضخمة للعبور تتواجد في الحلقة العنقية الشفوية وتؤدي إلى ظهور الأرومات المينائية في الظهارة البعيدة (سهم متقطع أخضر داكن). بالمقارنة مع حلقة عنق الرحم الشفوية ، فإن حلقة عنق الرحم اللسانية أصغر حجما ولا تشكل عادة أرومات المينائي. توجد الخلايا الجذعية الوسيطة السنية في لب الأسنان (المنطقة الأرجواني) وتؤدي إلى ظهور الأرومات السنية. الاختصارات: En = المينا. دي = العاج ؛ Am = أميلبلاست. Od = الأرومة السنية. TACs = خلايا تضخيم العبور ؛ laCL = حلقة عنق الرحم الشفوية. liCL = حلقة عنق الرحم اللسانية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الحفاظ على قاطعة الماوس للتصوير الحي. (أ) المخططات التي تصور الخطوات الرئيسية للبروتوكول، من تشريح القاطعة إلى تضمين الأنسجة في درجة انصهار منخفضة للأغار للتصوير الحي. يتم استخدام إعداد التروية لتوفير إمدادات ثابتة من العناصر الغذائية أثناء التصوير ويتم الحفاظ على الثقافة عند 37 درجة مئوية. (B-D) عرض توضيحي خطوة بخطوة لإعداد طبق الاستزراع وغرفة التروية للتصوير الحي. يتم عرض مدخل ومخرج الوسائط كسهمين وردي وأصفر على التوالي. اختصار: ACBR = حلقة حاجز التحكم في الغلاف الجوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: عزل قاطعة الفأر بأكملها. (أ) الفك السليم. (ب-ح) تمت إزالة العظام تدريجيا لفضح القاطعة بأكملها. تظهر الخطوط الحمراء المتقطعة في B و C الأنسجة الرخوة المكشوفة للقواطع القمية بعد حلق عظم الغشاء الذي يغطي الجوانب اللسانية والشدقية للتجويف القاطع (الخطوات 3.3-3.5 في البروتوكول). (د-ز) تمثل رؤوس الأسهم الزرقاء اللقمات والأضراس والعظام السنخية التي تمت إزالتها لعزل السن بالكامل (الخطوة 3.6 في البروتوكول). شريط المقياس = 2 مم (H). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: إزالة أنسجة اللثة للتصوير الحي. (أ-ح) عينات تمثيلية من (A-D) K14Cre ؛ R26rtTA ؛ tetO-H2B-GFP ، و (E-H) K14Cre ؛ تم استخدام الفئران R26mT / mGفي عرضنا للبروتوكول. قبل التشريح ، كان تعبير GFP في ظهارة الأسنان مرئيا من خلال العظام (A ، E ، رؤوس الأسهم الصفراء). الخطوط البيضاء المتقطعة تحدد القواطع غير المشرحة. E' يظهر الجانب اللغوي. في القواطع المعزولة (B ، C ، F ، G) ، تم انحراف مضان GFP في البداية بواسطة أنسجة اللثة التي تغطي القواطع القمية (رؤوس الأسهم البيضاء والحمراء). التألق الأحمر في F و G يسميات الخلايا غير الظهارية. تسمح إزالة أنسجة اللثة برؤية واضحة ودون عائق لحلقات عنق الرحم الفلورية الخضراء (D ، H ، رؤوس الأسهم الخضراء). شريط المقياس = 2 مم (A ، E) ؛ 1.25 مم (ب ، و) ؛ و 300 ميكرومتر (C ، D ، G ، H). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: الفحص المجهري الفاصل الزمني ل K14Cre ؛ R26rtTA ؛ tetO-H2B-GFP حلقة عنق الرحم. (أ) رسم تخطيطي يوضح إعداد الفاصل الزمني. (ب) طائرة Z تمثيلية من K14Cre ؛ R26rtTA ؛ حلقة عنق الرحم الشفوية القاطعة tetO-H2B-GFP ، تظهر العلامات النووية بواسطة H2B-GFP بشكل أساسي في منطقة تضخيم العبور ، حيث تنقسم الخلايا بنشاط. يمثل المربع الأصفر المنطقة العامة للصور المكبرة الموضحة أدناه. (سي - ك) تظهر صور الفاصل الزمني انقسامات الخلايا الرأسية والمائلة بالنسبة إلى BM. (L-N) تظهر صور الفاصل الزمني مثالا على الانقسام الأفقي للخلايا بالنسبة إلى BM. (D ، G ، J ، M) يتم عرض الخلايا في الطور أو الطور في اللوحات الوسطى. تظهر مخططات كل قسم متعقب على اليمين. شريط المقياس في N = 36 ميكرومتر (B) ؛ 5 ميكرومتر (C-N). اختصار: BM = الغشاء القاعدي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: الفحص المجهري الفاصل الزمني ل K14Cre ؛ R26mT / mG حلقة عنق الرحم. (أ) طائرة Z تمثيلية من K14Cre ؛ R26mT / mG حلقة عنق الرحم الشفوية القاطعة. جميع الخلايا الظهارية تعبر عن غشاء GFP. يمثل المربع الأصفر منطقة تتبع الخلية الموضحة في التكبيرات. (ب-ز) صور الفاصل الزمني التي تلتقط كلا من انقسامات الخلايا الأفقية (B-D) و (E-G) الرأسية ، بالنسبة إلى BM. (C ، F) تظهر اللوحات الوسطى تقريب الخلايا الانقسامية. تظهر مخططات كل قسم متعقب على اليمين. شريط المقياس = 35 ميكرومتر (أ) ؛ 5 ميكرومتر (B-G). اختصار: BM = الغشاء القاعدي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي S1: طبق نضح مصنوع في المنزل. (أ) يمكن استخدام طبق استزراع 35 مم لعمل طبق تروية. يمكن استخدام طبق القاع الزجاجي إذا تم إجراء التصوير باستخدام مجهر مقلوب. ب: سخني مسمارا باللهب. (ج) يتم إنشاء فتحتين (رؤوس أسهم بيضاء) على جانبي الطبق باستخدام الظفر الساخن. (د) تثبيت إبرتين حادتين 16 جم، إحداهما كمدخل للوسائط والأخرى كمنفذ للوسائط، من خلال الفتحات باستخدام غراء الإيبوكسي. إذا كانت هناك رغبة في تروية الغاز ، يمكن إضافة فتحة / إبرة ثالثة إلى الطبق. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

فيديو تكميلي S1 : التصوير الحي ل K14Cre ؛ R26rtTA ؛ tetO-H2B-GFP حلقة عنق الرحم الشفوية القاطعة ، تظهر انقسامات الخلايا الرأسية والمائلة. يتم تتبع الخلايا يدويا ، وتمثل النقاط الملونة المختلفة أزواجا مختلفة من خلايا الأم / الابنة. شريط المقياس = 30 ميكرومتر (الإطار الأيسر) ؛ 7 ميكرومتر (الإطار الأيمن). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

فيديو تكميلي S2 : التصوير الحي لكري K14 ؛ R26rtTA ؛ tetO-H2B-GFP حلقة عنق الرحم الشفوية القاطعة ، تظهر مثالا على انقسام الخلايا الأفقي. يحدث التقسيم الأفقي عند علامة 10 s ويتم تتبعه يدويا باستخدام النقاط الزرقاء. شريط المقياس = 30 ميكرومتر (الإطار الأيسر) ؛ 7 ميكرومتر (الإطار الأيمن). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

فيديو تكميلي S3 : التصوير الحي ل K14Cre ؛ R26mT / mG حلقة عنق الرحم الشفوية القاطعة ، تظهر انقسامات الخلايا الرأسية والأفقية. يتم تتبع الخلايا يدويا ، وتمثل الدوائر الملونة المختلفة أزواجا مختلفة من خلايا الأم / الابنة. شريط المقياس = 30 ميكرومتر (الإطار الأيسر) ؛ 7 ميكرومتر (الإطار الأيمن). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعد تصوير الأنسجة الحية تقنية مهمة تسمح لنا بدراسة العمليات والسلوكيات الديناميكية للخلايا عند الحفاظ عليها في بيئتها المتخصصة41. من الناحية المثالية ، يتم إجراء التصوير المباشر في الجسم الحي بدقة مكانية زمانية عالية. ومع ذلك ، يمكن أن يكون التصوير في الجسم الحي لأعضاء الثدييات أمرا صعبا بسبب عدم إمكانية الوصول إلى الأنسجة ، والتعتيم البصري ، وصعوبة شل حركة أو العضو لفترة طويلة42. تتجاوز نباتات الأنسجة بعض هذه التحديات وقد تم اعتمادها بنجاح في عدد من الدراسات لتتبع سلوكيات الخلايا ، مثل أثناء تكوين الأسنان وتطور أعضاء الأديم الظاهر26. هنا ، أظهرنا بروتوكولا بسيطا نسبيا ولكنه قوي لإجراء تصوير الأنسجة العميقة الحية على قواطع الفئران البالغة المستزرعة. سيساعدنا تطبيق هذه التقنية على فهم تنظيم حركات الخلايا وقرارات المصير ومنظمات الأنسجة أثناء تجديد الأسنان.

نظرا لأن انقسامات الخلايا هي أحداث يمكن ملاحظتها بسهولة وخصائص الأنسجة المتجددة ، فقد ركزنا على تتبع الخلايا المنقسمة في هذه الدراسة لتسليط الضوء على استخدام واحد للبروتوكول. وجدنا أن الأسلاف الظهارية القاطعة يمكن أن تخضع لانقسامات رأسية وأفقية ، وبالتالي تشبه الأنسجة الظهارية الأخرى43. سيكون توضيح الآلية التي تنظم زوايا الانقسام والتحقيق في دور توجهات الانقسام في قرارات مصير الخلية ذا أهمية في الدراسات المستقبلية. سيساعد الجمع بين التصوير الحي والنماذج الجينية المختلفة للفأر التي تحمل أيضا علامات مصير الخلايا الفلورية أو مراسلي مسار الإشارات أو مراسل دورة خلية Fucci44,45 في الكشف عن كيفية مساهمة أنماط انقسام الخلايا وديناميكيات دورة الخلية في تنظيم التوازن الظهاري والتجديد.

من الممارسات الضرورية في هذا البروتوكول إجراء تشريح الأسنان بطريقة سريعة ودقيقة ، مما يسمح بالانتقال السريع إلى الأنسجة السليمة والحفاظ عليها في ظل ظروف الزراعة المناسبة. لقد وجدنا أنه بالنسبة للتصوير الحي ، فإن تشريح الأنسجة في الوسائط الدافئة ، بدلا من الوسائط الباردة ، كما هو الحال في التجارب التي تهدف إلى استخراج البروتينات و mRNAs46 ، يحافظ على الخلايا في حالة وظيفية. نظرا لأن القاطعة عضو كبير نسبيا للزراعة ، فإن الإمداد الثابت بالعناصر الغذائية عبر نضح الوسائط أمر بالغ الأهمية أيضا للحفاظ على الأنسجة طوال التصوير47. إذا كانت الخلايا السلفية موجودة في المنطقة محل الاهتمام ، فإن ملاحظة الانقسامات الخلوية المتكررة هي مؤشر جيد على أن الأنسجة صحية ونشطة. في المقابل ، يجب أن يكون موت الخلايا نادرا ، ويمكن التحقق من ذلك عن طريق اكتشاف الأجسام النووية الساطعة والمكثفة أثناء التصوير إذا تم استخدام علامة نووية أو عن طريق إجراء تلطيخ TUNEL بعد التصوير وتثبيت الأنسجة48. بالإضافة إلى العناصر الغذائية ، قد تؤثر مستويات الأكسجين أيضا على صلاحية النبات ، حيث يمكن أن يؤدي توتر الأكسجين أو عدم كفايته إلى تعطيل بقاء الخلايا وتكاثرها وتمايزها49،50،51. في تجربتنا ، لم نلاحظ اختلافات واضحة في تكاثر الخلايا وموت الخلايا عندما تم تزويد العينات بأكسجين إضافي أو بدونه (على سبيل المثال ، 95٪ O2/5٪ CO2 carbogen أو 5٪ CO2/21٪ O2 / متوازن N2) أثناء التصوير ، مما يشير إلى أن كمية ضئيلة من الأكسجين في النظام كافية للحفاظ على ظهارة القاطعة في الثقافة بين عشية وضحاها أو يمكن للأنسجة استخدام مسارات بديلة للحفاظ على وظائف الخلية الطبيعية52. ومع ذلك ، ينبغي تحديد متطلبات الأكسجين في العمليات الخلوية الأخرى أو التعبير الجيني الصحيح في الدراسات المستقبلية.

في عرضنا للبروتوكول ، استخدمنا H2B-GFP المشفر وراثيا وغشاء GFP لتسمية نوى الخلية وخطوطها ، على التوالي. هذه العلامات الفلورية مشرقة وطويلة الأمد تحت المجهر ثنائي الفوتون ، وبالتالي فهي أمثلة على الملصقات المثالية لاستخدامها لتتبع حركات الخلايا وانقساماتها. من الناحية النظرية ، يمكن أيضا استخدام الأصباغ الحيوية الفلورية لتسمية مقصورات تحت خلوية مختلفة للتصوير الحي خارج الجسم الحي 53 ، ولكن من المحتمل أن يحد انخفاض تغلغل الأصباغ في الخلايا الظهارية العميقة من استخداماتها. وبالمثل ، في حين أن الفحص المجهري متحد البؤر القياسي قادر على التصوير الحي عالي الدقة على عمق أقل من 100 ميكرومتر ، يوفر الفحص المجهري ثنائي الفوتون عمق تصوير متزايد مع تقليل التبييض الضوئي والسمية الضوئية54. لذلك اخترنا الفحص المجهري ثنائي الفوتون كطريقة تصوير في معظم تطبيقات التصوير المباشر لدينا.

أحد القيود المحتملة لهذا البروتوكول هو أن نباتات القواطع قد لا تلخص بشكل كامل البيئة والبيولوجيا في الجسم الحي. لذلك تمثل البيانات سلوكيات الخلية في ظل ظروف الثقافة ويجب تفسيرها وفقا لذلك وكذلك التحقق من صحتها باستخدام طرق أخرى ، مثل علم الأنسجة ، عند الاقتضاء. كان علينا أيضا إزالة أنسجة اللثة جزئيا للوصول إلى حلقة عنق الرحم للتصوير. وبالتالي يمكن أن تتعطل تفاعلات الإشارات بين أنسجة اللثة وظهارة الأسنان. أخيرا ، في حين أن التروية الإعلامية تحسن بشكل كبير من صلاحية الأنسجة المستزرعة ، إلا أنها يمكن أن تؤدي إلى إجهاد قص السوائل الذي يعمل كإشارة ميكانيكية خارج الرحم ويؤثر على النتائج55,56. لم نحدد تأثير معدلات التدفق المختلفة في إعدادنا. ومع ذلك ، نظرا لأن معدل التدفق المنخفض من 1-5 مل / ساعة يكفي عادة للحفاظ على إمدادات المغذيات57 ، يمكن تقليل تأثير إجهاد القص. مع وضع هذه القيود في الاعتبار ، يعمل التصوير الحي خارج الجسم الحي كمنصة قوية لدراسة التغييرات في سلوكيات الخلية عندما يتم تضمين عناصر التحكم المناسبة في التجارب.

قاطعة الفأر المتنامية باستمرار هي نظام نموذجي قابل للتتبع للغاية لدراسة تجديد الأنسجة القائمة على الخلايا الجذعية وإصلاح الإصابة. يوفر البروتوكول الموصوف هنا للمحققين الوسائل اللازمة للحفاظ على القواطع البالغة بأكملها في الثقافة واستخراج المعلومات الزمانية المكانية حول سلوكيات الخلية من خلال الفحص المجهري بفاصل زمني. نتوقع أن تكون هذه التقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع لدراسة النماذج الجينية المختلفة للفأر المستخدمة في أبحاث طب الأسنان وللمساعدة في تطوير معرفتنا في مجال تجديد الأسنان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

نحن نعترف بمختبر الفحص المجهري / الطيفي المتقدم بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس ومركز التميز Leica Microsystems في معهد كاليفورنيا للأنظمة النانوية (RRID: SCR_022789) لتوفير مجهر ثنائي الفوتون. تم دعم AS من قبل ISF 604-21 من مؤسسة العلوم الإسرائيلية. تم دعم JH من قبل R03DE030205 و R01DE030471 من المعاهد الوطنية للصحة / NIDCR. كما تم دعم AS و JH من خلال 2021007 المنح من مؤسسة العلوم ثنائية القومية بين الولايات المتحدة وإسرائيل (BSF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well, flat bottom tissue culture plate Olympus plastics 25-107
25x HC IRAPO motCORR water dipping objective Leica 11507704
Ascorbic acid (Vitamin C) Acros Organics 352685000
D-(+)-Glucose bioxtra  Sigma Aldrich G7528
Delta T system  Bioptechs 0420-4 Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup
Dissection microscope- LEICA S9E Leica LED300 SLI
DMEM/F12 Thermo Scientific 11039047 Basal media without phenol red
Feather surgical blade (#15) Feather 72044-15
Fine forceps F.S.T 11252-23
Glutamax  Thermo Scientific 35050-061 Glutamine substitute
Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective  Leica n/a
low-melting agarose NuSieve 50080
non-essential amino acids (100x) Thermo Scientific 11140-050
penicillin–streptomycin Thermo Scientific 15140122 10,000 U/mL 
Petri dish Gen Clone 32-107G 90 mm 
Rat serum Valley Biomedical AS3061SC Processed for live imaging
Razor blade #9 VWR 55411-050
Scalpel handle F.S.T 10003-12
Scissors F.S.T 37133
serrated forceps F.S.T 11000-13
spring scissors F.S.T 91500-09

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
  2. Jing, J., et al. Rodent incisor as a model to study mesenchymal stem cells in tissue homeostasis and repair. Frontiers in Dental Medicine. 3, 1068494 (2022).
  3. Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and Fgf signaling. Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
  4. Warshawsky, H., Smith, C. E. Morphological classification of rat incisor ameloblasts. The Anatomical Record. 179 (4), 423-445 (1974).
  5. Lekic, P., McCulloch, C. A. Periodontal ligament cell population: the central role of fibroblasts in creating a unique tissue. The Anatomical Record. 245 (2), 327-341 (1996).
  6. Takahashi, A., et al. Autocrine regulation of mesenchymal progenitor cell fates orchestrates tooth eruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (2), 575-580 (2019).
  7. Ness, A. R. Eruption rates of impeded and unimpeded mandibular incisors of the adult laboratory mouse. Archives of Oral Biology. 10 (3), 439-451 (1965).
  8. Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
  9. Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), Cambridge, England. 3753-3761 (2010).
  10. Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
  11. Biehs, B., et al. BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nature Cell Biology. 15, 846-852 (2013).
  12. Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
  13. Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
  14. Li, L., Clevers, H. Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals. Science. 327 (5965), 542-545 (2010).
  15. Sharir, A., et al. A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage. Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).
  16. Hu, J. K. -H., et al. An FAK-YAP-mTOR signaling axis regulates stem cell-based tissue renewal in mice. Cell Stem Cell. 21 (1), 91-106 (2017).
  17. Yu, F., Li, F., Zheng, L., Ye, L. Epigenetic controls of Sonic hedgehog guarantee fidelity of epithelial adult stem cells trajectory in regeneration. Science Advances. 8 (29), (2022).
  18. An, Z., et al. A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors. Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).
  19. Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
  20. Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development. 147 (2), (2020).
  21. Krivanek, J., Buchtova, M., Fried, K., Adameyko, I. Plasticity of dental cell types in development, regeneration, and evolution. Journal of Dental Research. 102 (6), 589-598 (2023).
  22. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  23. Cetera, M., Leybova, L., Joyce, B., Devenport, D. Counter-rotational cell flows drive morphological and cell fate asymmetries in mammalian hair follicles. Nature Cell Biology. 20 (5), 541-552 (2018).
  24. Held, M., Santeramo, I., Wilm, B., Murray, P., Lévy, R. Ex vivo live cell tracking in kidney organoids using light sheet fluorescence microscopy. PLoS ONE. 13 (7), 0199918 (2018).
  25. Mesa, K. R., et al. Homeostatic epidermal stem cell self-renewal is driven by local differentiation. Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).
  26. Mogollón, I., Ahtiainen, L. Live tissue imaging sheds light on cell level events during ectodermal organ development. Frontiers in Physiology. 11, 818 (2020).
  27. Prochazka, J., et al. Migration of founder epithelial cells drives proper molar tooth positioning and morphogenesis. Developmental Cell. 35 (6), 713-724 (2015).
  28. Morita, R., et al. Coordination of cellular dynamics contributes to tooth epithelium deformations. PLOS ONE. 11 (9), 0161336 (2016).
  29. Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
  30. Panousopoulou, E., Green, J. B. A. Invagination of ectodermal placodes is driven by cell intercalation-mediated contraction of the suprabasal tissue canopy. PLoS biology. 14 (3), 1002405 (2016).
  31. Mogollón, I., Moustakas-Verho, J. E., Niittykoski, M., Ahtiainen, L. The initiation knot is a signaling center required for molar tooth development. Development. 148 (9), (2021).
  32. Kim, R., et al. Early perturbation of Wnt signaling reveals patterning and invagination-evagination control points in molar tooth development. Development. 148 (14), 199685 (2021).
  33. Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments JoVE. (90), e51969 (2014).
  34. Katsuragi, Y., et al. Bcl11b transcription factor plays a role in the maintenance of the ameloblast-progenitors in mouse adult maxillary incisors. Mechanisms of Development. 130 (9-10), 482-492 (2013).
  35. Dassule, H. R., Lewis, P., Bei, M., Maas, R., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127 (22), 4775-4785 (2000).
  36. Belteki, G., et al. Conditional and inducible transgene expression in mice through the combinatorial use of Cre-mediated recombination and tetracycline induction. Nucleic Acids Research. 33 (5), 51 (2005).
  37. Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
  38. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  39. Kimura, H., Cook, P. R. Kinetics of core histones in living human cells. The Journal of Cell Biology. 153 (7), 1341-1354 (2001).
  40. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology: CB. 8 (7), 377-385 (1998).
  41. Huang, Q., et al. The frontier of live tissue imaging across space and time. Cell Stem Cell. 28 (4), 603-622 (2021).
  42. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).
  43. Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
  44. Li, S., et al. Overview of the reporter genes and reporter mouse models. Animal Models and Experimental. 1 (1), 29-35 (2018).
  45. Mort, R. L., et al. Fucci2a: a bicistronic cell cycle reporter that allows Cre mediated tissue specific expression in mice. Cell Cycle. 13 (17), 2681-2696 (2014).
  46. Krivanek, J., et al. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nature Communications. 11 (1), 4816 (2020).
  47. Dailey, M. E., Marrs, G. S., Kurpius, D. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harbor protocols. 2011 (4), (2011).
  48. Gorczyca, W., Bruno, S., Darzynkiewicz, R., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. DNA strand breaks occurring during apoptosis - their early insitu detection by the terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays and prevention by serine protease inhibitors. International Journal of Oncology. 1 (6), 639-648 (1992).
  49. Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
  50. Wale, P. L., Gardner, D. K. Time-lapse analysis of mouse embryo development in oxygen gradients. Reproductive Biomedicine Online. 21 (3), 402-410 (2010).
  51. Tse, H. M., Gardner, G., Dominguez-Bendala, J., Fraker, C. A. The importance of proper oxygenation in 3D culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 634403 (2021).
  52. Spinelli, J. B., et al. Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain. Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).
  53. Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex-vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current Protocols in Cytometry. , CHAPTER, Unit9.39 (2012).
  54. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
  55. McCoy, R. J., O'Brien, F. J. Influence of shear stress in perfusion bioreactor cultures for the development of three-dimensional bone tissue constructs: a review. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (6), 587-601 (2010).
  56. Chen, K. D., et al. Mechanotransduction in response to shear stress. Roles of receptor tyrosine kinases, integrins, and Shc. The Journal of Biological Chemistry. 274 (26), 18393-18400 (1999).
  57. Seddiqi, H., et al. Inlet flow rate of perfusion bioreactors affects fluid flow dynamics, but not oxygen concentration in 3D-printed scaffolds for bone tissue engineering: Computational analysis and experimental validation. Computers in Biology and Medicine. 124, 103826 (2020).

Tags

علم الأحياء التنموي ، العدد 200 ، حركات الخلايا ، تجديد أسنان الفأر ، قاطعة الفأر ، الخلايا الجذعية الظهارية ، الخلايا الجذعية الوسيطة ، تجديد الأسنان ، توازن الأنسجة ، التفاعلات الخلوية ، نظام زراعة النباتات ، الفحص المجهري متعدد الفوتونات ، المعلومات الزمانية المكانية ، سلوكيات الخلية ، الأنسجة الحية ، أبحاث الأسنان ، العمليات الخلوية الديناميكية
استخدام التصوير <em>الحي خارج الجسم</em> الحي للتحقيق في انقسامات الخلايا وحركاتها أثناء تجديد أسنان الفأر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sundari Thooyamani, A., Shahin, E.,… More

Sundari Thooyamani, A., Shahin, E., Takano, S., Sharir, A., Hu, J. K. Using Ex Vivo Live Imaging to Investigate Cell Divisions and Movements During Mouse Dental Renewal. J. Vis. Exp. (200), e66020, doi:10.3791/66020 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter