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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Utilisation de l’imagerie en direct ex vivo pour étudier les divisions et les mouvements cellulaires au cours du renouvellement dentaire de la souris

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/66020
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2, 1,3
1School of Dentistry, University of California Los Angeles, 2The Institute of Biomedical and Oral Research, Faculty of Dental Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 3Molecular Biology Institute, University of California Los Angeles
* These authors contributed equally

Summary

L’imagerie en direct ex vivo est une technique puissante pour étudier les processus dynamiques des mouvements et des interactions cellulaires dans les tissus vivants. Nous présentons ici un protocole qui met en œuvre la microscopie à deux photons pour suivre en direct les cellules épithéliales dentaires dans des incisives de souris adultes entières en culture.

Abstract

L’incisive de souris, qui ne cesse de croître, est en train de devenir un système modèle très facile à traiter pour étudier la régulation des cellules souches épithéliales et mésenchymateuses adultes et la régénération des dents. Ces populations progénitrices se divisent, se déplacent et se différencient activement pour maintenir l’homéostasie tissulaire et régénérer les cellules perdues de manière réactive. Cependant, les analyses traditionnelles utilisant des coupes de tissus fixes n’ont pas pu capturer les processus dynamiques des mouvements et des interactions cellulaires, ce qui limite notre capacité à étudier leurs régulations. Cet article décrit un protocole permettant de maintenir des incisives de souris entières dans un système de culture d’explants et de suivre en direct des cellules épithéliales dentaires à l’aide de la microscopie timelapse multiphotonique. Cette technique s’ajoute à notre boîte à outils existante pour la recherche dentaire et permet aux chercheurs d’acquérir des informations spatio-temporelles sur les comportements et les organisations cellulaires dans un tissu vivant. Nous prévoyons que cette méthodologie aidera les chercheurs à explorer davantage les mécanismes qui contrôlent les processus cellulaires dynamiques qui se déroulent à la fois pendant le renouvellement et la régénération dentaires.

Introduction

Au cours des deux dernières décennies, l’incisive de souris s’est imposée comme une plate-forme inestimable pour étudier les principes de la régulation des cellules souches adultes et de la régénération des dents 1,2. L’incisive de la souris grandit continuellement et se renouvelle tout au long de la vie de l’animal. Pour ce faire, il maintient à la fois les cellules souches épithéliales et mésenchymateuses, qui peuvent s’auto-renouveler et se différencier en différents types de cellules de la dent 1,2. Alors que les cellules souches épithéliales dentaires donnent naissance aux améloblastes, qui sécrètent la matrice de l’émail, les cellules souches mésenchymateuses dentaires donnent naissance aux odontoblastes, aux cémentoblastes et aux fibroblastes, qui forment respectivement la dentine, le cément et le ligament parodontal,respectivement 3,4,5,6. Cet apport constant de nouvelles cellules maintient l’homéostasie tissulaire et permet le remplacement des vieilles cellules perdues en raison de l’usure masticatoire ou de blessures 7,8. L’élucidation des mécanismes cellulaires et moléculaires qui régulent le maintien et la différenciation des cellules souches dentaires est donc au cœur de la compréhension de la régénération dentaire, un domaine d’intérêt croissant.

Anatomiquement, une grande partie de l’incisive de la souris adulte est enfermée dans l’os de la mâchoire. Alors que le bord incisif de la dent est exposé, l’extrémité apicale de l’incisive s’insère dans une alvéole et est fermement attachée à l’os environnant par les ligaments parodontaux et les tissus conjonctifs (Figure 1A,B). L’extrémité apicale de l’incisive est également la région de croissance de la dent et maintient les cellules souches dentaires et progénitrices à la fois dans la couche épithéliale et la pulpe mésenchymateuse 9,10,11,12,13. Plus précisément, les cellules souches épithéliales dentaires sont maintenues à l’extrémité bulbeuse de l’épithélium, connue sous le nom de bourgeon apical, également appelé anse cervicale labiale (Figure 1C). À l’instar de l’épithélium intestinal et de l’épiderme, le renouvellement épithélial de l’incisive est principalement soutenu par des cellules souches à cycle actif et leurs descendants intermédiaires hautement prolifératifs, appelés cellules amplificatrices du transit 14,15,16,17, toutes deux résidant dans la partie interne de l’anse cervicale. Cependant, il reste à déterminer si l’épithélium incisif contient et utilise des cellules souches quiescentes pendant la régénération. En revanche, des cellules souches mésenchymateuses dentaires actives et quiescentes ont été identifiées dans la pulpe apicale, et les cellules souches quiescentes fonctionnent comme une population de réserve qui s’active lors de la réparation des blessures13,18.

De nombreuses découvertes sur la biologie du renouvellement et de la régénération des incisives de souris ont résulté d’études histologiques, dans lesquelles des échantillons sont obtenus à des jonctions temporelles distinctes, fixés, traités, puis sectionnés en tranches d’une épaisseur de l’ordre du micron le long d’un plan particulier. Grâce à une analyse détaillée des coupes histologiques de différents modèles murins qui permettent de tracer la lignée ou les perturbations génétiques, les scientifiques ont identifié les lignées cellulaires de différentes populations progénitrices, ainsi que les voies génétiques et de signalisation qui contrôlent l’homéostasie des incisives et la réparation des blessures 19,20,21. Cependant, les images statiques bidimensionnelles (2D) de cellules non vitales en coupes ne peuvent pas capturer le spectre complet des comportements cellulaires et des organisations spatiales dans les tissus vivants, tels que les changements de forme cellulaire, les mouvements et la cinétique cellulaire. La détection et la mesure de ces changements cellulaires rapides, qui se produisent à une échelle de temps qui ne peut être résolue par la section des tissus, nécessitent une stratégie différente. De plus, l’acquisition de ces informations est également essentielle pour comprendre comment les cellules dentaires interagissent les unes avec les autres, réagissent à différents stimuli de signalisation et s’auto-organisent pour maintenir les structures et les fonctions des tissus.

L’avènement de l’imagerie quadridimensionnelle (4D) des tissus profonds à l’aide de la microscopie à deux photons22, une technologie qui intègre trois dimensions spatiales avec une résolution temporelle, permet de surmonter les limites inhérentes à l’analyse histologique en permettant l’examen spatio-temporel d’explants de tissus cultivés, d’organoïdes ou même de tissus in situ 23,24,25,26 . Par exemple, l’imagerie 4D en direct de l’épithélium dentaire en développement a révélé les modèles spatio-temporels des divisions et des migrations cellulaires qui coordonnent la croissance des tissus, la formation du centre de signalisation et la morphogenèse épithéliale dentaire 27,28,29,30,31,32. Dans l’incisive de la souris adulte, l’imagerie 4D a été récemment adaptée pour étudier les comportements cellulaires lors de la réparation des lésions épithéliales dentaires. L’imagerie en direct a révélé que les cellules de la couche intermédiaire de la couche suprabasale peuvent être directement converties en améloblastes dans la couche basale pour régénérer l’épithélium endommagé, remettant en question le paradigme traditionnel de la réparation des lésions épithéliales15.

Ici, nous décrivons la dissection, la culture et l’imagerie de l’incisive de souris adulte, en nous concentrant sur les cellules épithéliales de l’anse cervicale labiale (Figure 1). Cette technique préserve la vitalité des cellules dentaires pendant plus de 12 h et permet de suivre en direct les cellules marquées par fluorescence à une résolution unicellulaire. Cette approche permet d’étudier le mouvement et la migration des cellules ainsi que les changements dynamiques de la forme et de l’orientation de la division cellulaire dans des conditions normales de culture, ou en réponse à des perturbations génétiques, physiques et chimiques.

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Protocol

Toutes les souris ont été maintenues dans des animaleries exemptes d’agents pathogènes à l’Université de Californie à Los Angeles (UCLA) ou à l’Université hébraïque de Jérusalem (HUJI). Toutes les expériences impliquant des souris ont été réalisées conformément aux règlements et aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) (ARC-2019-013 ; UCLA) ou (MD-23-17184-3 ; HUJI). Un déroulement général des étapes expérimentales est illustré à la figure 2A. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les instruments, réactifs et matériaux utilisés dans ce protocole.

1. Préparation des solutions et des gels

  1. Milieu de dissection : Préparer du DMEM/F12 frais avec 0,5 % de glucose et le maintenir au chaud à 37 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin à l’étape 2.4.
    REMARQUE : Nous utilisons DMEM / F12 sans rouge de phénol pour réduire l’autofluorescence pendant l’imagerie en direct.
  2. 1x milieu de culture : Préparez un milieu frais en utilisant 50 % de DMEM/F12, 50 % de sérum de rat, 1 substitut de glutamine, 1 x acides aminés non essentiels MEM, 1 % de glucose, 0,1 mg/mL d’acide L-ascorbique et 0,5 % de pénicilline-streptomycine. Gardez-le au chaud à 37 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin à l’étape 5.5. Ce milieu est utilisé pour la culture d’explants d’incisives lors de l’imagerie en direct.
    REMARQUE : Le sérum de rat doit être de haute qualité et spécialement préparé pour la culture de tissus entiers par des chercheurs ou à partir d’une source commerciale. En particulier, le sang doit être centrifugé (pendant 5 min à 1 200 × g à température ambiante) avant que la coagulation ne commence à se former. Après centrifugation, le caillot de fibrine résultant doit être pressé et jeté33.
  3. Gel de culture : Le but du gel est d’immobiliser les échantillons pendant l’imagerie et il est préparé frais.
    1. Produire un gel à 2 % dans le DMEM/F12 en dissolvant 200 mg d’agarose à bas point de fusion dans 10 mL de DMEM/F12 à l’aide d’un micro-ondes. Maintenez le gel à 2 % à 37 °C.
    2. Préparez 2 milieux de culture (sans DMEM/F12) en mélangeant 50 % de sérum de rat, 1 substitut de glutamine, 1 acide aminé non essentiel MEM, 1 % de glucose, 0,1 mg/mL d’acide L-ascorbique et 0,5 % de pénicilline-streptomycine. Chauffer le milieu de culture 2x (sans DMEM/F12) à 37 °C.
    3. Préparez un gel de culture à 1 % en mélangeant des volumes égaux de gel à 2 % et de milieu de culture 2x (sans DMEM/F12). Conservez le gel de culture à 1 % à 37 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin à l’étape 5.1.
      REMARQUE : Assurez-vous que toutes les solutions sont chaudes avant de mélanger pour éviter la gélification. Nous avons trouvé que le gel à 1 % convenait à la culture de l’incisive de la souris adulte. Le pourcentage de gel doit être déterminé empiriquement si d’autres tissus doivent être cultivés.

2. Extraction des mandibules de souris adultes

  1. Euthanasier les souris à l’âge souhaité en utilisant des procédures standard approuvées par l’IACUC.
    REMARQUE : Ici, nous utilisons l’asphyxie au CO2 suivie d’une luxation cervicale. La réglementation sur l’euthanasie des animaux peut varier d’une région à l’autre. Les chercheurs doivent obtenir l’approbation institutionnelle nécessaire avant d’effectuer des expériences et s’assurer de la conformité avec les réglementations locales en matière de soins aux animaux.
  2. Désinfectez la souris avec de l’éthanol à 70 %.
  3. Décapitalisez la souris et extrayez les mandibules gauche et droite.
    1. Posez la souris sur le ventre, puis utilisez une lame de rasoir industrielle à un seul tranchant #9 pour couper au niveau de la région du cou et séparer la tête de la souris du reste du corps.
      REMARQUE : Si des tissus du pharynx ou de la région du cou doivent également être prélevés, la décapitation ne doit pas être effectuée et on peut passer directement à l’étape 2.3.2.
    2. Retournez la souris de manière à ce que sa face ventrale soit tournée vers le haut et que les mandibules soient facilement accessibles.
    3. Fixez la tête de l’animal en la tenant doucement entre le pouce et l’index.
    4. Utilisez la lame de rasoir pour faire une incision mi-sagittale qui coupe la peau de la mâchoire inférieure de la lèvre inférieure vers le décolleté.
      REMARQUE : Une lame chirurgicale #15 peut également être utilisée pour faire l’incision et les dissections subséquentes (étapes 2.3.6-2.3.9).
    5. Au fur et à mesure que l’incision est faite, écartez la peau coupée à l’aide du pouce et de l’index pour exposer les muscles et l’os de la mâchoire en dessous.
    6. Utilisez la lame de rasoir pour sectionner les muscles masséters du côté buccal de la mâchoire inférieure, de sorte que l’extérieur des hémimandibules gauche et droite soit maintenant libre d’attaches musculaires.
    7. Sectionnez les muscles mylohyoïdiens le long de la face interne de la mandibule pour éliminer les attaches musculaires qui s’y trouvent.
    8. Faites une autre incision au niveau de la symphyse mandibulaire qui relie les deux hémimandibules. Une fois coupée, la mandibule sera séparée en deux moitiés, l’une gauche et l’autre droite.
    9. Calez la lame de rasoir entre le condyle mandibulaire et l’articulation mandibulaire temporale et disséquez soigneusement l’hémimandibule du reste de la tête.
      REMARQUE : Nous avons trouvé utile de tirer simultanément doucement sur l’incisive pendant la coupe. Des précautions doivent être prises pour éviter de casser la mandibule et d’endommager les tissus mous à l’intérieur.
  4. Transférez immédiatement les mandibules disséquées dans une boîte de Pétri avec le milieu de dissection préchauffé (étape 1.1) et retirez les tissus musculaires restants à l’aide d’une lame chirurgicale #15.
    REMARQUE : La conservation des échantillons dans des milieux froids ralentit les activités cellulaires, ce qui entraîne des retards ou même des échecs de récupération de certaines activités cellulaires, telles que la prolifération ou le mouvement des cellules, pendant l’imagerie en direct.

3. Isolement de l’ensemble des incisives de la souris

REMARQUE : Un isolement supplémentaire de l’incisive est effectué sous un microscope de dissection à fond clair.

  1. Identifiez visuellement la région ovale de la mandibule qui recouvre l’alvéole de l’incisive et abrite la partie apicale de l’incisive.
  2. Positionnez la mandibule de manière à ce que la surface interne (linguale) soit orientée vers le haut.
  3. Tout en maintenant la mandibule en place à l’aide d’une paire de pinces dentelées, générez une fenêtre dans la région ovale en rasant l’os de la membrane sus-jacente à l’aide d’une lame chirurgicale #15, dans une direction qui va du condyle vers les molaires. Cela expose les tissus mous de l’incisive apicale sur la surface interne.
  4. Retournez la mandibule de manière à ce que la surface externe (buccale) soit tournée vers le haut.
  5. Générez une fenêtre dans la région ovale de la mandibule externe comme décrit à l’étape 3.3 et utilisez la pointe du scalpel pour prélever les fragments d’os restants sur le bord. Assurez-vous que l’extrémité apicale de la dent est visible des deux côtés.
    REMARQUE : Évitez une pression excessive pendant le rasage des os pour éviter d’endommager les tissus mous sous-jacents.
  6. Coupez systématiquement les os entourant l’incisive pour isoler l’ensemble de la dent.
    1. Faites une incision nette à un plan qui est immédiatement adjacent à l’incisive apicale pour d’abord enlever le processus condylien.
      REMARQUE : Veillez à ne pas couper dans l’incisive.
    2. Faites une deuxième incision juste en arrière de la 3e molaire, mais à l’arrière de l’incisive sans endommager la dent. Cela enlève l’os qui comprend le processus coronoïde.
    3. Couper en série de l’extrémité de l’apophyse angulaire vers l’incisive pour retirer progressivement la mandibule ventrale de manière progressive.
      REMARQUE : L’épithélium dentaire et les tissus parodontaux associés sont souvent collés à l’os et facilement arrachés si une grande partie de l’os ventral est coupée en une seule fois. Pour séparer l’os des tissus mous de l’incisive, on peut insérer le scalpel (ou une paire de pinces pointues non dentelées) entre les deux tissus à l’extrémité apicale de l’incisive et faire glisser délicatement l’instrument vers l’avant.
    4. Coupez l’os alvéolaire avec les molaires et tous les os restants qui sont encore attachés à l’incisive.
    5. L’ensemble de l’incisive est maintenant isolé. Transférez l’incisive entièrement disséquée dans une boîte avec un milieu de dissection propre et chaud (étape 1.1).
  7. Répétez les étapes 3.2 à 3.6 pour isoler d’autres incisives au besoin.
    REMARQUE : Les incisives maxillaires/supérieures de la souris maintiennent également des cellules souches adultes et peuvent être utilisées pour étudier la régénération dentaire34. Les chercheurs dentaires se concentrent généralement sur les incisives inférieures parce qu’elles sont plus accessibles et peuvent être plus facilement disséquées que les incisives supérieures. Les différences entre les cellules progénitrices de l’incisive mandibulaire et maxillaire restent à déterminer.

4. Ablation des tissus parodontaux pour exposer l’anse cervicale épithéliale incisive

  1. Avec l’incisive entière couchée sur son côté lingual et tout en maintenant la dent en place avec une paire de pinces dentelées, utilisez une paire de pinces fines #5 pour commencer à rentrer les tissus parodontaux recouvrant l’incisive apicale et la région de l’anse cervicale.
  2. Décollez soigneusement le tissu parodontal du bourgeon apical, de sorte que le côté latéral de l’anse cervicale (ou d’autres régions d’intérêt) devienne visible sous l’endoscope.
    REMARQUE : Des précautions doivent être prises pour éviter d’endommager l’épithélium dentaire ou de le détacher du mésenchyme. Si l’incisive a des signaux de fluorescence dans la région d’intérêt et qu’un microscope à dissection fluorescente est disponible, les signaux de fluorescence peuvent être utilisés pour aider à distinguer les types de tissus et faciliter les dissections. Il est important d’effectuer efficacement les sections 2 à 4 afin que les échantillons puissent être rapidement transférés dans le milieu de culture et maintenus de manière adéquate grâce à la culture par explants (voir ci-dessous).

5. Enrobage tissulaire pour la culture d’explants

  1. Ajouter 500 μL de gel de culture chaud et non solidifié dans un puits dans une plaque de 24 puits et transférer rapidement les incisives entières disséquées dans le puits. Faites tourner la plaque plusieurs fois pour rincer les incisives.
  2. Ajouter 400 μL de gel de culture chaud et non solidifié dans une boîte de culture et transférer les incisives rincées dans la boîte.
    REMARQUE : Nous utilisons une boîte de culture disponible dans le commerce qui est compatible avec la configuration de perfusion. Reportez-vous à l’étape 6.4 pour connaître d’autres options.
  3. Orientez l’incisive pour positionner la région de l’anse cervicale (ou d’autres régions d’intérêt) au centre de la parabole (Figure 2A,B) et ajustez l’inclinaison de l’incisive apicale pour le plan d’imagerie souhaité.
    REMARQUE : L’orientation des tissus doit être effectuée rapidement avant la gélification complète.
  4. Une fois le gel pris, utilisez une paire de pinces fines pour retirer tout gel sur la région d’intérêt afin qu’il ne soit pas recouvert de gel.
  5. Ajoutez un volume suffisant de milieu de culture chaud en le pipetant lentement contre le bord de la boîte pour recouvrir simplement l’échantillon (~150 μL).
  6. Déplacer la culture d’explants dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C pour permettre la stabilisation des tissus et l’adaptation aux conditions de culture pendant 1 h.

6. Microscopie timelapse des explants incisifs

REMARQUE : Dans cette expérience, nous avons utilisé un microscope vertical équipé d’un objectif à immersion dans l’eau 25x qui a une ouverture numérique de 1. En général, une lentille plongeante dans l’eau avec une ouverture numérique élevée est la mieux adaptée à l’imagerie des tissus profonds.

  1. Allumez le microscope et le laser à deux photons.
  2. Fixez la boîte de culture à l’adaptateur de platine et montez la bague d’adaptation de perfusion sur le dessus (Figure 2C).
  3. Connectez l’adaptateur de platine à un régulateur de température réglé pour maintenir la culture à 37 °C.
  4. Connectez l’entrée et la sortie de la bague d’adaptation à une pompe de micro-perfusion et commencez la perfusion du milieu de culture, avec la vitesse de perfusion réglée à 20 sur la pompe. Cela génère un débit lent (~5 mL/h) du milieu de culture au-dessus des échantillons (Figure 2C).
    REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur le système permettant de maintenir le tissu dans un environnement contrôlé de manière stable. D’autres systèmes peuvent également être utilisés. Il est également possible d’utiliser une combinaison d’une plaque chauffante à 37 °C et d’une boîte de culture de perfusion faite maison (figure supplémentaire S1) avec une entrée et une sortie reliées à des pousse-seringues.
  5. Placez un anneau de barrière de contrôle atmosphérique (ACBR) sur le dessus de la bague d’adaptation et abaissez l’objectif à travers l’ACBR pour entrer en contact avec le milieu de culture (Figure 2D).
  6. Réglez la longueur d’onde du laser sur 920 nm pour visualiser à la fois les signaux GFP et de fluorescence rouge (par exemple, tdTomato).
  7. Localisez les échantillons à l’aide d’oculaires, puis sur le logiciel du microscope.
  8. Configurez des piles Z, une imagerie multi-positions et des intervalles de temps à l’aide du logiciel. Pour suivre ce protocole, utilisez une taille z-step de 4 μm et un intervalle de temps de 5 min pendant 14 h.
    REMARQUE : Nous avons constaté qu’un intervalle de temps de plus de 5 minutes est souvent insuffisant pour capturer les mouvements et les divisions cellulaires lisses.
  9. Lancez l’imagerie timelapse.
    REMARQUE : La position de l’échantillon peut changer au cours de la première heure et d’autres ajustements peuvent être nécessaires.
  10. Enregistrez des fichiers pour le traitement et l’analyse des données en aval.

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Representative Results

La région apicale de l’incisive de la souris adulte est enfermée dans la mandibule (Figure 1) et, par conséquent, n’est pas directement accessible pour visualiser et suivre en direct les cellules progénitrices résidant dans la région de croissance. Par conséquent, nous avons développé une méthode pour extraire l’incisive entière de l’os de la mâchoire et la maintenir dans un système de culture d’explants pour la microscopie timelapse à deux photons (Figure 2). Nous décrivons ici des résultats représentatifs qui capturent le processus dynamique de prolifération et de mouvement cellulaire dans la région de la boucle cervicale labiale de l’épithélium dentaire.

Pour démontrer les procédures expérimentales, nous avons utilisé deux modèles murins différents qui expriment la fluorescence verte dans l’épithélium dentaire. La première lignée de souris est K14Cre ; R26rtTA ; tetO-H2B-GFP, où K14Cre (MGI :2680713) exprime la Cre recombinase à partir d’un promoteur de kératine 1435 et active l’expression du transactivateur contrôlé par la tétracycline inverse dans l’épithélium à partir de l’allèle R26rtTA 36 (MGI :3584524). Lors de l’administration de doxycycline, rtTA induit l’expression de l’histone H2B-GFP à partir de l’allèle tetO-H2B-GFP 37 (MGI :3043783) et marque les noyaux des cellules épithéliales avec une fluorescence verte. Ceci est particulièrement utile pour le suivi cellulaire et pour détecter les divisions cellulaires. Dans cette expérience, nous avons nourri les animaux avec de la nourriture à base de doxycycline pendant 24 h avant de les sacrifier pour activer l’expression de H2B-GFP. La deuxième lignée de souris est K14Cre ; R26mT/mG, dans lequel R26mT/mG (MGI :3803814) est un rapporteur de Cre38. En l’absence d’activité de Cre, les cellules expriment la tdTomato (mT) localisée par la membrane avec une fluorescence rouge. Lors de la recombinaison médiée par Cre, les cellules expriment la GFP membranaire (mG). K14Cre ; Le R26mT/mG marque ainsi les membranes cellulaires épithéliales avec une fluorescence verte, laissant les cellules non épithéliales rouges. Cela permet de visualiser facilement les formes, les divisions et les mouvements des cellules.

Nous avons commencé l’intervention en disséquant les mandibules (Figure 3A) puis en enlevant systématiquement tous les os entourant l’incisive (Figure 3B-G). Cela a donné des incisives entières avec un épithélium intact (Figure 3H). Nous avons confirmé l’intégrité de l’épithélium dentaire en inspectant la fluorescence verte dans le K14Cre ; R26rtTA ; tetO-H2B-GFP et K14Cre ; R26mT/mG souris (Figure 4A,B,E,F). À ce stade, les tissus parodontaux opaques recouvrent toujours l’incisive apicale, et l’anse cervicale apparaît donc floue en raison de la diffusion de la lumière, ce qui gênerait également l’imagerie timelapse en aval (Figure 4C,G). Nous avons donc soigneusement retiré les tissus parodontaux, de sorte que l’épithélium dentaire avec l’anse cervicale puisse être discerné dans chaque incisive (Figure 4D,H).

Les incisives ont ensuite été noyées dans de l’agarose à bas point de fusion et cultivées dans une configuration de perfusion pour l’imagerie vivante à deux photons, comme le montre la figure 2. Pour cet exercice, nous nous sommes concentrés sur la région de l’anse cervicale de l’épithélium dentaire et avons capturé des images z-stack à des intervalles de 4 μm toutes les 5 minutes sur une durée de 14 h (Figure 5A). Notamment, les signaux H2B-GFP ont été principalement observés dans la région amplificatrice du transit de la boucle cervicale, où il y a des divisions cellulaires actives (Figure 5B). Cela est probablement dû au fait qu’il y a un échange H2B-GFP plus élevé au niveau des chromatines ouvertes et une incorporation dans les nucléosomes après les réplications de l’ADN dans ces cellules actives39.

Nous avons ensuite examiné les images timelapse à l’aide d’ImageJ et sur la base de la séparation des signaux H2B-GFP40, nous avons pu observer de nombreuses divisions cellulaires tout au long de la période d’imagerie (vidéo supplémentaire S1 et vidéo supplémentaire S2). Cela indiquait que les tissus étaient correctement maintenus dans la culture de l’explant et que les cellules étaient actives. Plus précisément, nous avons pu observer la condensation et l’alignement des chromosomes au niveau de la plaque de métaphase dans les cellules mitotiques, suivis de leur ségrégation en deux cellules filles pendant l’anaphase (Figure 5C-N, suivi manuellement à l’aide du plugin TrackMate d’ImageJ). La plupart de ces divisions étaient perpendiculaires ou obliques par rapport à la membrane basale (figure 5C-K et vidéo supplémentaire S1). Des divisions horizontales parallèles à la membrane basale ont également pu être détectées, bien que moins fréquentes (figure 5L-N et vidéo supplémentaire S2). Il est important de souligner que la cytokinèse dans l’épithélium dentaire se produit souvent rapidement, dans les 5 à 10 minutes. Par conséquent, des intervalles de timelapse de plus de 5 minutes peuvent manquer certaines de ces divisions.

Des événements de division cellulaire ont également été observés dans K14Cre ; Anses cervicales R26mT/mG, où toutes les membranes des cellules épithéliales ont été marquées en vert (Figure 6A). Nous avons pu identifier les cellules mitotiques par leur arrondi cellulaire puis leur cytokinèse (vidéo supplémentaire S3), et les divisions cellulaires verticales et horizontales ont été observées (Figure 6B-G), donc similaires aux résultats obtenus avec H2B-GFP. Ensemble, ces résultats démontrent que ce protocole peut servir d’outil puissant pour étudier les comportements cellulaires dans les explants d’incisives lorsqu’il est combiné avec des modèles génétiques murins qui marquent par fluorescence des structures subcellulaires distinctes.

Figure 1
Figure 1 : Schémas de la mâchoire de la souris et de l’anse cervicale de l’incisive. (A) Une partie importante de l’incisive est enfoncée dans l’os de la mâchoire. La région de croissance est située à l’extrémité apicale de la dent et soutient sa croissance continue (flèche vert foncé). (B) Un élargissement de l’incisive apicale, qui est entourée de tissus parodontaux. La dent est composée d’émail et de dentine, qui sont des structures hautement minéralisées formées respectivement par des améloblastes et des odontoblastes. (C) Une coupe sagittale de l’incisive apicale, montrant que les cellules progénitrices de l’épithélium dentaire et les cellules amplifiant le transit résident dans l’anse cervicale labiale et donnent naissance aux améloblastes dans l’épithélium le plus distal (flèche pointillée vert foncé). Par rapport à l’anse cervicale labiale, l’anse cervicale linguale est de plus petite taille et ne forme normalement pas d’améloblastes. Les cellules souches mésenchymateuses dentaires sont présentes dans la pulpe dentaire (région violette) et donnent naissance à des odontoblastes. Abréviations : En = émail ; De = dentine ; Am = améloblaste ; Od = odontoblaste ; TACs = cellules amplificatrices de transit ; laCL = anse cervicale labiale ; liCL = anse cervicale linguale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Maintien de l’explant d’incisive de souris pour l’imagerie en direct. (A) Schémas décrivant les étapes clés du protocole, de la dissection de l’incisive à l’enrobage du tissu dans l’agarose à bas point de fusion pour l’imagerie en direct. Une installation de perfusion est utilisée pour fournir un apport constant de nutriments pendant l’imagerie et la culture est maintenue à 37 °C. (B-D) Une démonstration étape par étape du réglage de la boîte de culture et de la chambre de perfusion pour l’imagerie en direct. L’entrée et la sortie du support sont représentées respectivement par des flèches roses et jaunes. Abréviation : ACBR = Anneau de barrière de contrôle atmosphérique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Isolement de l’incisive entière de la souris. (A) Mâchoire intacte. (B-H) Les os ont été progressivement retirés pour exposer toute l’incisive. Les lignes pointillées rouges en B et C montrent les tissus mous exposés de l’incisive apicale après le rasage de l’os de la membrane recouvrant les côtés lingual et buccal de l’alvéole incisive (étapes 3.3-3.5 du protocole). (D-G) Les pointes de flèches bleues représentent les condyles, les molaires et les os alvéolaires qui ont été retirés pour isoler la dent entière (étape 3.6 du protocole). Barre d’échelle = 2 mm (H). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Prélèvement de tissus parodontaux pour l’imagerie en direct. (A-H) Échantillons représentatifs de (A-D) K14 Cre ; R26rtTA ; tetO-H2B-GFP, et (E-H) K14 Cre ; Des souris R26mT/mGont été utilisées dans notre démonstration du protocole. Avant la dissection, l’expression de la GFP dans l’épithélium dentaire était visible à travers l’os (A, E, pointes de flèches jaunes). Des lignes pointillées blanches délimitent les incisives non disséquées. E' montre le côté lingual. Dans les incisives isolées (B, C, F, G), la fluorescence de la GFP a d’abord été diffractée par les tissus parodontaux recouvrant les incisives apicales (pointes de flèches blanches et rouges). La fluorescence rouge dans les cellules non épithéliales F et G marque. L’ablation des tissus parodontaux permet une vue claire et dégagée des anses cervicales fluorescentes vertes (D, H, pointes de flèches vertes). Barre d’échelle = 2 mm (A,E) ; 1,25 mm (B,F) ; et 300 μm (C,D,G,H). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Microscopie timelapse du K14Cre ; R26rtTA ; tetO-H2B-GFP anse cervicale. (A) Un schéma illustrant la configuration du timelapse. (B) Un plan z représentatif du K14Cre ; R26rtTA ; tetO-H2B-GFP ansive labiale de la boucle cervicale, montrant le marquage nucléaire par H2B-GFP principalement dans la région amplificatrice du transit, où les cellules se divisent activement. La boîte jaune représente la zone générale des images agrandies ci-dessous. (C-K) Images timelapse montrant les divisions cellulaires verticales et obliques par rapport à la BM. (L-N) Les images Timelapse montrent un exemple de division cellulaire horizontale par rapport à la BM. (D,V,J,M) Les cellules en métaphase ou en anaphase sont affichées dans les panneaux du milieu. Les schémas de chaque division suivie sont présentés à droite. Barre d’échelle en N = 36 μm (B) ; 5 μm (C-N). Abréviation : BM = membrane basale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Microscopie timelapse du K14Cre ; R26mT/mG anse cervicale. (A) Un plan z représentatif du K14Cre ; R26mT/mG anse labiale incisive cervicale. Toutes les cellules épithéliales expriment la GFP membranaire. La case jaune représente la zone de suivi des cellules indiquée dans les agrandissements. (B-G) Images timelapse capturant à la fois les divisions cellulaires horizontales (B-D) et verticales (E-G), par rapport à la BM. (C,F) Les panneaux centraux montrent l’arrondi des cellules mitotiques. Les schémas de chaque division suivie sont présentés à droite. Barre d’échelle = 35 μm (A) ; 5 μm (B-G). Abréviation : BM = membrane basale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire S1 : Plat de perfusion fait maison. (A) Une boîte de culture de 35 mm peut être utilisée pour fabriquer une boîte de perfusion. Une boîte à fond en verre peut être utilisée si l’imagerie est effectuée à l’aide d’un microscope inversé. (B) Chauffez un clou avec une flamme. (C) Deux ouvertures (pointes de flèches blanches) sont créées de chaque côté du plat à l’aide du clou chauffé. (D) Fixer deux aiguilles émoussées de 16 G, l’une servant d’entrée et l’autre de sortie, à travers les ouvertures à l’aide de colle époxy. Si une perfusion de gaz est souhaitée, une troisième ouverture/aiguille peut être ajoutée à la boîte. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo supplémentaire S1 : Imagerie en direct d’un K14Cre ; R26rtTA ; tetO-H2B-GFP anse labiale incisive cervicale, montrant des divisions cellulaires verticales et obliques. Les cellules sont suivies manuellement et des points de différentes couleurs représentent différentes paires de cellules mère/fille. Barre d’échelle = 30 μm (image de gauche) ; 7 μm (cadre de droite). Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo supplémentaire S2 : Imagerie en direct d’un K14Cre ; R26rtTA ; tetO-H2B-GFP ansive labiale de l’incisive, montrant un exemple de division cellulaire horizontale. La division horizontale a lieu au bout de 10 s et est suivie manuellement à l’aide de points bleus. Barre d’échelle = 30 μm (image de gauche) ; 7 μm (cadre de droite). Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo supplémentaire S3 : Imagerie en direct d’un K14Cre ; Anse labiale incisive R26mT/mG , montrant des divisions cellulaires verticales et horizontales. Les cellules sont suivies manuellement et des cercles de différentes couleurs représentent différentes paires de cellules mère/fille. Barre d’échelle = 30 μm (image de gauche) ; 7 μm (cadre de droite). Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

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Discussion

L’imagerie des tissus vivants est une technique importante qui nous permet d’étudier les processus dynamiques et les comportements des cellules lorsqu’elles sont maintenues dans leur environnement de niche41. Idéalement, l’imagerie en direct est réalisée in vivo avec une haute résolution spatio-temporelle. Cependant, l’imagerie in vivo des organes de mammifères peut être difficile en raison de l’inaccessibilité des tissus, de l’opacité optique et de la difficulté à immobiliser l’animal ou l’organe pendant une période prolongée42. Les explants tissulaires contournent certains de ces défis et ont été adoptés avec succès dans un certain nombre d’études pour suivre les comportements cellulaires, tels que la morphogenèse dentaire et le développement des organes ectodermiques26. Ici, nous avons démontré un protocole relativement simple mais robuste pour effectuer une imagerie des tissus profonds en direct sur des incisives de souris adultes entières en culture. L’application de cette technique nous aidera à comprendre la régulation des mouvements cellulaires, les décisions de destin et l’organisation des tissus au cours de la régénération dentaire.

Étant donné que les divisions cellulaires sont des événements facilement observables et caractéristiques de la régénération des tissus, nous nous sommes concentrés sur le suivi des cellules en division dans cette étude pour mettre en évidence une utilisation du protocole. Nous avons constaté que les progéniteurs épithéliaux incisifs peuvent subir des divisions verticales et horizontales, donc similaires à d’autres tissus épithéliaux43. L’élucidation du mécanisme qui régule les angles de division et l’étude du rôle des orientations de division dans les décisions relatives au destin cellulaire seront importantes dans les études futures. La combinaison de l’imagerie en direct avec différents modèles génétiques de souris qui portent également des marqueurs de destin cellulaire fluorescents, des rapporteurs de voies de signalisation ou le rapporteur de cycle cellulaire de Fucci44,45 aidera à dévoiler comment les modèles de division cellulaire et la dynamique du cycle cellulaire contribuent à la régulation de l’homéostasie et de la régénération épithéliales.

Une pratique nécessaire dans ce protocole consiste à effectuer le curage dentaire de manière rapide et prudente, permettant une transition rapide et la préservation du tissu intact dans les conditions de culture appropriées. Nous avons constaté que pour l’imagerie en direct, la dissection de tissus dans des milieux chauds, plutôt que dans des milieux froids, comme dans les expériences visant à extraire des protéines et des ARNm46, maintient les cellules dans un état de fonctionnement. Étant donné que l’incisive est un organe relativement grand pour la culture, un apport constant de nutriments par perfusion de milieux est également essentiel pour le maintien du tissu tout au long de l’imagerie47. Si les cellules progénitrices sont présentes dans la région d’intérêt, l’observation de divisions cellulaires fréquentes est un bon indicateur que le tissu est sain et actif. En revanche, la mort cellulaire devrait être peu fréquente, et cela peut être vérifié en détectant des corps nucléaires brillants et condensés pendant l’imagerie si un marqueur nucléaire est utilisé ou en effectuant une coloration TUNEL après imagerie et fixation tissulaire48. En plus des nutriments, les niveaux d’oxygène peuvent également affecter la viabilité de l’explantation, car la tension ou l’insuffisance d’oxygène peut perturber la survie, la prolifération et la différenciation des cellules 49,50,51. D’après notre expérience, nous n’avons pas observé de différences apparentes dans la prolifération cellulaire et la mort cellulaire lorsque les échantillons ont été fournis avec ou sans oxygène supplémentaire (par exemple, 95 % d’O2/5 % de CO2 carbogène ou 5 % de CO2/21 % d’O2/N2 équilibré) pendant l’imagerie, ce qui suggère que soit une quantité infime d’oxygène dans le système est suffisante pour maintenir l’épithélium incisif en culture pendant la nuit, soit le tissu peut utiliser d’autres voies pour maintenir des fonctions cellulaires normales52. Toutefois, les besoins en oxygène dans d’autres processus cellulaires ou l’expression correcte des gènes devraient être déterminés plus en détail dans les études futures.

Dans notre démonstration du protocole, nous avons utilisé la H2B-GFP codée génétiquement et la GFP membranaire pour marquer les noyaux et les contours des cellules, respectivement. Ces marqueurs fluorescents sont brillants et durables en microscopie à deux photons et sont donc des exemples d’étiquettes idéales à utiliser pour suivre les mouvements et les divisions cellulaires. En théorie, les colorants vitaux fluorescents peuvent également être utilisés pour marquer différents compartiments subcellulaires pour l’imagerie en direct ex vivo 53, mais la pénétration réduite des colorants dans les cellules épithéliales plus profondes limite probablement leurs utilisations. De même, alors que la microscopie confocale standard est capable d’obtenir une imagerie en direct à haute résolution à une profondeur inférieure à 100 μm, la microscopie à deux photons offre une profondeur d’imagerie accrue avec une photoblanchiment et une phototoxicité réduits54. Nous avons donc choisi la microscopie à deux photons comme modalité d’imagerie dans la plupart de nos applications d’imagerie en direct.

L’une des limites potentielles de ce protocole est que les explants d’incisives peuvent ne pas récapituler complètement l’environnement et la biologie in vivo. Les données représentent donc les comportements cellulaires dans les conditions de culture et doivent être interprétées en conséquence et validées à l’aide d’autres méthodes, telles que l’histologie, le cas échéant. Nous avons également dû retirer partiellement des tissus parodontaux pour avoir accès à l’anse cervicale pour l’imagerie. Les interactions de signalisation entre les tissus parodontaux et l’épithélium dentaire pourraient ainsi être perturbées. Enfin, bien que la perfusion de milieux améliore considérablement la viabilité des tissus cultivés, elle pourrait introduire une contrainte de cisaillement du fluide qui agit comme un signal mécanique ectopique et affecte les résultats55,56. Nous n’avons pas déterminé l’impact des différents débits dans notre installation. Cependant, étant donné qu’un faible débit de 1 à 5 mL/h est généralement suffisant pour maintenir l’approvisionnement en éléments nutritifs57, l’effet de la contrainte de cisaillement peut être minimisé. Compte tenu de ces limites, l’imagerie en direct ex vivo constitue une plate-forme puissante pour étudier les changements de comportement des cellules lorsque les contrôles appropriés sont inclus dans les expériences.

L’incisive de souris en croissance continue est un système modèle très facile à traiter pour étudier le renouvellement tissulaire à base de cellules souches et la réparation des blessures. Le protocole décrit ici fournit aux chercheurs les moyens de maintenir des incisives adultes entières en culture et d’extraire des informations spatio-temporelles sur les comportements cellulaires grâce à la microscopie timelapse. Nous nous attendons à ce que cette technique soit largement applicable à l’étude de différents modèles génétiques de souris utilisés dans la recherche dentaire et qu’elle contribue à faire progresser nos connaissances dans le domaine de la régénération dentaire.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions le laboratoire de microscopie/spectroscopie optique avancée de l’UCLA et le centre d’excellence Leica Microsystems du California NanoSystems Institute (RRID :SCR_022789) pour avoir fourni la microscopie à deux photons. AS a été soutenu par l’ISF 604-21 de la Fondation israélienne pour la science. JH a reçu le soutien de R03DE030205 et R01DE030471 du NIH/NIDCR. AS et JH ont également bénéficié d’une subvention 2021007 de la Fondation scientifique binationale États-Unis-Israël (BSF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well, flat bottom tissue culture plate Olympus plastics 25-107
25x HC IRAPO motCORR water dipping objective Leica 11507704
Ascorbic acid (Vitamin C) Acros Organics 352685000
D-(+)-Glucose bioxtra  Sigma Aldrich G7528
Delta T system  Bioptechs 0420-4 Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup
Dissection microscope- LEICA S9E Leica LED300 SLI
DMEM/F12 Thermo Scientific 11039047 Basal media without phenol red
Feather surgical blade (#15) Feather 72044-15
Fine forceps F.S.T 11252-23
Glutamax  Thermo Scientific 35050-061 Glutamine substitute
Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective  Leica n/a
low-melting agarose NuSieve 50080
non-essential amino acids (100x) Thermo Scientific 11140-050
penicillin–streptomycin Thermo Scientific 15140122 10,000 U/mL 
Petri dish Gen Clone 32-107G 90 mm 
Rat serum Valley Biomedical AS3061SC Processed for live imaging
Razor blade #9 VWR 55411-050
Scalpel handle F.S.T 10003-12
Scissors F.S.T 37133
serrated forceps F.S.T 11000-13
spring scissors F.S.T 91500-09

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Biologie du développement Numéro 200 Mouvements cellulaires Renouvellement dentaire de la souris Incisive de souris Cellules souches épithéliales Cellules souches mésenchymateuses Régénération dentaire Homéostasie tissulaire Interactions cellulaires Système de culture d’explants Microscopie timelapse multiphotonique Information spatio-temporelle Comportements cellulaires Tissus vivants Recherche dentaire Processus cellulaires dynamiques
Utilisation de l’imagerie en direct <em>ex vivo</em> pour étudier les divisions et les mouvements cellulaires au cours du renouvellement dentaire de la souris
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Sundari Thooyamani, A., Shahin, E.,… More

Sundari Thooyamani, A., Shahin, E., Takano, S., Sharir, A., Hu, J. K. Using Ex Vivo Live Imaging to Investigate Cell Divisions and Movements During Mouse Dental Renewal. J. Vis. Exp. (200), e66020, doi:10.3791/66020 (2023).

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