Summary
Ex vivo live beeldvorming is een krachtige techniek voor het bestuderen van de dynamische processen van cellulaire bewegingen en interacties in levende weefsels. Hier presenteren we een protocol dat twee-fotonmicroscopie implementeert om tandepitheelcellen live te volgen in gekweekte snijtanden van hele volwassen muizen.
Abstract
De continu groeiende muizensnijtand is in opkomst als een zeer handelbaar modelsysteem om de regulatie van volwassen epitheliale en mesenchymale stamcellen en tandregeneratie te onderzoeken. Deze voorloperpopulaties delen, verplaatsen en differentiëren actief om de weefselhomeostase te handhaven en verloren cellen op een responsieve manier te regenereren. Traditionele analyses met behulp van vaste weefselsecties konden de dynamische processen van cellulaire bewegingen en interacties echter niet vastleggen, waardoor ons vermogen om hun regulatie te bestuderen werd beperkt. Dit artikel beschrijft een protocol voor het onderhouden van hele muizensnijtanden in een explantatiekweeksysteem en live-track tandepitheelcellen met behulp van multifoton timelapse-microscopie. Deze techniek is een aanvulling op onze bestaande gereedschapskist voor tandheelkundig onderzoek en stelt onderzoekers in staat om spatiotemporele informatie te verkrijgen over celgedrag en organisaties in een levend weefsel. We verwachten dat deze methodologie onderzoekers zal helpen bij het verder onderzoeken van mechanismen die de dynamische cellulaire processen beheersen die plaatsvinden tijdens zowel tandheelkundige vernieuwing als regeneratie.
Introduction
In de afgelopen twee decennia is de snijtand van muizen naar voren gekomen als een platform van onschatbare waarde voor het onderzoeken van de principes van volwassen stamcelregulatie en tandregeneratie 1,2. De muizensnijtand groeit continu en vernieuwt zichzelf gedurende het hele leven van het dier. Het doet dit door zowel epitheliale als mesenchymale stamcellen in stand te houden, die zichzelf kunnen vernieuwen en differentiëren in verschillende celtypen van de tand 1,2. Terwijl tandepitheliale stamcellen aanleiding geven tot ameloblasten, die de glazuurmatrix afscheiden, geven tandheelkundige mesenchymale stamcellen aanleiding tot odontoblasten, cementoblasten en fibroblasten, die respectievelijk dentine, cement en parodontaal ligament vormen 3,4,5,6. Deze constante toevoer van nieuwe cellen handhaaft de weefselhomeostase en maakt de vervanging mogelijk van oude cellen die verloren zijn gegaan als gevolg van kauwslijtage of verwondingen 7,8. Het ophelderen van de cellulaire en moleculaire mechanismen die het onderhoud en de differentiatie van tandheelkundige stamcellen reguleren, staat daarom centraal in het begrijpen van tandheelkundige regeneratie, een gebied van groeiende belangstelling.
Anatomisch gezien is een groot deel van de snijtand van de volwassen muis ingekapseld in het kaakbot. Terwijl de incisale rand van de tand zichtbaar is, past het apicale uiteinde van de snijtand in een kom en is het stevig bevestigd aan het omringende bot via parodontale ligamenten en bindweefsel (Figuur 1A,B). Het apicale uiteinde van de snijtand is ook het groeigebied van de tand en onderhoudt tandstam- en voorlopercellen in zowel de epitheellaag als de mesenchymale pulpa 9,10,11,12,13. In het bijzonder worden tandepitheelstamcellen gehandhaafd aan het bolvormige uiteinde van het epitheel, bekend als de apicale knop, ook wel de labiale cervicale lus genoemd (Figuur 1C). Net als bij het darmepitheel en de epidermis, wordt de epitheelvernieuwing in de snijtand voornamelijk ondersteund door actief cyclende stamcellen en hun zeer proliferatieve intermediaire afstammelingen, transit-amplificerende cellen 14,15,16,17 genaamd, die zich beide in het binnenste deel van de cervicale lus bevinden. Of het snijtandepitheel tijdens de regeneratie slapende stamcellen bevat en gebruikt, moet echter nog worden bepaald. Daarentegen zijn zowel actieve als slapende dentale mesenchymale stamcellen geïdentificeerd in de apicale pulpa, en de slapende stamcellen functioneren als een reservepopulatie die wordt geactiveerd tijdens het herstel van letsel13,18.
Veel van de ontdekkingen over de biologie van de vernieuwing en regeneratie van de snijtanden van muizen zijn het resultaat van histologisch onderzoek, waarbij monsters op verschillende tijdstippen worden verkregen, gefixeerd, verwerkt en vervolgens in microndunne plakjes langs een bepaald vlak worden verdeeld. Door gedetailleerde analyse van histologische secties van verschillende muismodellen die het traceren van afstammingslijnen of genetische verstoringen mogelijk maken, hebben wetenschappers de cellijnen van verschillende voorloperpopulaties geïdentificeerd, evenals de genetische en signaalroutes die de homeostase van de snijtanden en het herstel van verwondingen regelen 19,20,21 . De statische tweedimensionale (2D) beelden van niet-vitale cellen in secties kunnen echter niet het volledige spectrum van cellulair gedrag en ruimtelijke organisaties in levend weefsel vastleggen, zoals veranderingen in celvorm, bewegingen en cellulaire kinetiek. Het detecteren en meten van deze snelle cellulaire veranderingen, die optreden op een tijdschaal die onoplosbaar is door weefselsectie, vereist een andere strategie. Bovendien is het verkrijgen van dergelijke informatie ook van cruciaal belang om te begrijpen hoe tandcellen met elkaar omgaan, reageren op verschillende signaalstimuli en zichzelf organiseren om weefselstructuren en -functies te behouden.
De komst van vierdimensionale (4D) diepe weefselbeeldvorming met behulp van twee-fotonmicroscopie22, een technologie die drie ruimtelijke dimensies integreert met temporele resolutie, overwint de inherente beperkingen van histologische analyse door spatiotemporeel onderzoek van gekweekte weefselexplantaten, organoïden of zelfs weefsels in situ mogelijk te maken 23,24,25,26 . 4D live beeldvorming van het zich ontwikkelende tandepitheel heeft bijvoorbeeld de spatiotemporele patronen van celdelingen en migraties onthuld die weefselgroei, signaalcentrumvorming en tandepitheliale morfogenese coördineren 27,28,29,30,31,32. In de snijtand van volwassen muizen is onlangs 4D-beeldvorming aangepast om cellulair gedrag te bestuderen tijdens herstel van tandepitheelletsel. Live beeldvorming onthulde dat stratum intermedium cellen in de suprabasale laag direct kunnen worden omgezet in ameloblasten in de basale laag om het beschadigde epitheel te regenereren, waardoor het traditionele paradigma van herstel van epitheelletsel wordt uitgedaagd15.
Hier beschrijven we de dissectie, kweek en beeldvorming van de snijtand van volwassen muizen, met de nadruk op epitheelcellen in de labiale cervicale lus (Figuur 1). Deze techniek behoudt de vitaliteit van de tandcellen gedurende meer dan 12 uur en maakt het mogelijk om fluorescerend gelabelde cellen live te volgen met een resolutie van één cel. Deze benadering maakt het mogelijk om celbeweging en -migratie te onderzoeken, evenals dynamische veranderingen in celvorm en delingsoriëntatie onder normale kweekomstandigheden, of in reacties op genetische, fysische en chemische verstoringen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle muizen werden gehouden in pathogeenvrije dierfaciliteiten aan de Universiteit van Californië Los Angeles (UCLA) of de Hebreeuwse Universiteit van Jeruzalem (HUJI). Alle experimenten met muizen werden uitgevoerd volgens voorschriften en protocollen die zijn goedgekeurd door de respectieve Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) of (MD-23-17184-3; HUJI). Een algemene workflow van de experimentele stappen is weergegeven in figuur 2A. Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle instrumenten, reagentia en materialen die in dit protocol worden gebruikt.
1. Bereiding van oplossingen en gels
- Dissectiemedium: Bereid verse DMEM/F12 met 0,5% glucose en houd deze warm bij 37 °C tot het nodig is in stap 2.4.
OPMERKING: We gebruiken DMEM/F12 zonder fenolrood om autofluorescentie tijdens live beeldvorming te verminderen. - 1x kweekmedium: Bereid vers medium met 50% DMEM/F12, 50% rattenserum, 1x glutaminevervanger, 1x MEM niet-essentiële aminozuren, 1% glucose, 0,1 mg/ml L-ascorbinezuur en 0,5% penicilline-streptomycine. Houd het warm op 37 °C tot het nodig is in stap 5.5. Dit medium wordt gebruikt voor het kweken van explantaten snijtanden tijdens live beeldvorming.
OPMERKING: Het rattenserum moet van hoge kwaliteit zijn en speciaal zijn bereid voor het kweken van hele weefsels door onderzoekers of van een commerciële bron. In het bijzonder moet het bloed worden gecentrifugeerd (gedurende 5 minuten bij 1.200 × g bij kamertemperatuur) voordat de stolling zich begint te vormen. Na centrifugeren moet het resulterende fibrinestolsel worden uitgeknepen en weggegooid33. - Kweekgel: Het doel van de gel is om monsters te immobiliseren tijdens beeldvorming en wordt vers bereid.
- Maak 2% gel in DMEM/F12 door 200 mg agarose met een laag smeltpunt op te lossen in 10 ml DMEM/F12 met behulp van een magnetron. Houd de 2% gel op 37 °C.
- Maak 2x kweekmedium (zonder DMEM/F12) door 50% rattenserum, 1x glutaminevervanger, 1x MEM niet-essentiële aminozuren, 1% glucose, 0,1 mg/ml L-ascorbinezuur en 0,5% penicilline-streptomycine te mengen. Verwarm het 2x kweekmedium (zonder DMEM/F12) tot 37 °C.
- Maak 1% kweekgel door gelijke volumes van 2% gel en 2x kweekmedium (zonder DMEM/F12) te mengen. Houd de 1% kweekgel op 37 °C tot het nodig is in stap 5.1.
NOTITIE: Zorg ervoor dat alle oplossingen warm zijn voordat u ze mengt om geleren te voorkomen. We vonden 1% gel geschikt voor het kweken van de snijtand voor volwassen muizen. Het gelpercentage moet empirisch worden bepaald als andere weefsels moeten worden gekweekt.
2. Extractie van de volwassen muizenkaken
- Euthanaseer muizen op de gewenste leeftijd met behulp van standaardprocedures die zijn goedgekeurd door de IACUC.
OPMERKING: Hier gebruiken we CO2 -verstikking gevolgd door cervicale dislocatie. De regelgeving voor euthanasie bij dieren kan per regio verschillen. Onderzoekers moeten de nodige institutionele goedkeuring verkrijgen voordat ze experimenten uitvoeren en ervoor zorgen dat ze voldoen aan de lokale regelgeving voor dierenverzorging. - Desinfecteer de muis met 70% ethanol.
- Onthoofd de muis en haal de linker- en rechterkaken eruit.
- Leg de muis op zijn buik en gebruik vervolgens een #9 industrieel scheermesje met één rand om in de nek te snijden en de muiskop te scheiden van de rest van het lichaam.
OPMERKING: Als er ook weefsels uit de keelholte of het nekgebied moeten worden verzameld, mag onthoofding niet worden uitgevoerd en kan men direct doorgaan naar stap 2.3.2. - Draai de muis om zodat de buikzijde naar boven wijst en de kaken gemakkelijk toegankelijk zijn.
- Zet de kop van het dier vast door deze voorzichtig tussen duim en wijsvinger te houden.
- Gebruik het scheermesje om een mid-sagittale incisie te maken die over de huid van de onderkaak snijdt van de onderlip naar de halslijn.
OPMERKING: Een #15 chirurgisch mes kan ook worden gebruikt om de incisie en daaropvolgende dissecties te maken (stappen 2.3.6-2.3.9). - Terwijl de incisie wordt gemaakt, spreidt u de gesneden huid open met de duim en de wijsvinger om de spieren en het kaakbot eronder bloot te leggen.
- Gebruik het scheermesje om de kauwspieren aan de buccale zijde van de onderkaak door te snijden, zodat de buitenkant van de linker- en rechterhersenhelft nu vrij is van spieraanhechtingen.
- Snijd de mylohyoid-spieren langs de binnenkant van de onderkaak door om daar spieraanhechtingen te verwijderen.
- Maak nog een incisie bij de mandibulaire symfyse die de twee hemimandibles met elkaar verbindt. Eenmaal gesneden, wordt de onderkaak gescheiden in de linker- en rechterhelft.
- Klem het scheermesje tussen de mandibulaire condylus en het temporale mandibulaire gewricht en ontleed voorzichtig het hemimandible van de rest van het hoofd.
OPMERKING: We vonden het handig om tegelijkertijd zachtjes aan de snijtand te trekken tijdens het snijden. Er moet voor worden gezorgd dat de onderkaak niet breekt en de zachte weefsels binnenin worden beschadigd.
- Leg de muis op zijn buik en gebruik vervolgens een #9 industrieel scheermesje met één rand om in de nek te snijden en de muiskop te scheiden van de rest van het lichaam.
- Breng de ontlede onderkaken onmiddellijk over in een petrischaal met de voorverwarmde dissectiemedia (stap 1.1) en verwijder de resterende spierweefsels met behulp van een #15 chirurgisch mes.
OPMERKING: Het bewaren van monsters in koude media vertraagt de celactiviteiten, wat resulteert in vertraagd of zelfs mislukt herstel van bepaalde celactiviteiten, zoals proliferatie of celbeweging, tijdens live beeldvorming.
3. Isolatie van de snijtanden van de hele muis
OPMERKING: Verdere isolatie van de snijtand wordt gedaan onder een heldervelddissectiemicroscoop.
- Identificeer visueel het ovale gebied van de onderkaak dat de snijtand bedekt en het apicale deel van de snijtand herbergt.
- Plaats de onderkaak zo dat het binnenste (linguale) oppervlak naar boven wijst.
- Terwijl u de onderkaak op zijn plaats houdt met een gekartelde pincet, genereert u een venster in het ovale gebied door het bovenliggende membraanbot af te scheren met een #15 chirurgisch mes, in een richting die van de condylus naar de kiezen is. Hierdoor komt het zachte weefsel van de apicale snijtand aan de binnenkant bloot te liggen.
- Draai de onderkaak om zodat het buitenste (buccale) oppervlak naar boven wijst.
- Genereer een venster in het ovale gebied op de buitenonderkaak zoals beschreven in stap 3.3 en gebruik de punt van de scalpel om eventuele resterende botfragmenten aan de rand weg te halen. Zorg ervoor dat het apicale uiteinde van de tand van beide kanten zichtbaar is.
NOTITIE: Vermijd overmatige druk tijdens het scheren van de botten om schade aan het onderliggende zachte weefsel te voorkomen. - Snijd systematisch de botten rond de snijtand weg om de hele tand te isoleren.
- Maak een zuivere snede in een vlak dat direct grenst aan de apicale snijtand om eerst de processus condylair te verwijderen.
NOTITIE: Pas op dat u niet in de snijtand snijdt. - Maak een tweede snede net achter de 3e kies, maar dorsaal van de snijtand zonder de tand te beschadigen. Dit verwijdert het bot dat de processus coronoides omvat.
- Serieel gesneden vanaf de punt van de processus angularis naar de snijtand om de ventrale onderkaak geleidelijk stapsgewijs te verwijderen.
OPMERKING: Het tandepitheel en de bijbehorende parodontale weefsels zitten vaak aan het bot vast en worden gemakkelijk afgescheurd als een groot deel van het ventrale bot in één keer wordt doorgesneden. Om het bot van het zachte weefsel van de snijtand te scheiden, kan men de scalpel (of een scherpe niet-gekartelde pincet) tussen de twee weefsels aan het apicale uiteinde van de snijtand steken en het instrument voorzichtig naar voren schuiven. - Snijd het alveolaire bot met kiezen weg en eventuele resterende botten die nog aan de snijtand vastzitten.
- De hele snijtand is nu geïsoleerd. Breng de volledig ontlede snijtand over in een schaal met schone, warme snijmedia (stap 1.1).
- Maak een zuivere snede in een vlak dat direct grenst aan de apicale snijtand om eerst de processus condylair te verwijderen.
- Herhaal stap 3.2-3.6 om indien nodig extra snijtanden te isoleren.
OPMERKING: De maxillaire/bovenste snijtanden van de muis behouden ook volwassen stamcellen en kunnen worden gebruikt om tandregeneratie te bestuderen34. Tandheelkundig onderzoekers richten zich meestal op de onderste snijtanden omdat ze toegankelijker zijn en gemakkelijker kunnen worden ontleed dan de bovenste snijtanden. Verschillen tussen voorlopercellen van de onderkaak en de maxillaire snijtanden moeten nog worden bepaald.
4. Verwijdering van parodontale weefsels om de cervicale lus van de snijtand bloot te leggen
- Met de hele snijtand liggend op de linguale kant en terwijl u de tand op zijn plaats houdt met een gekartelde pincet, gebruikt u een paar #5 fijne pincetten om te beginnen met het instoppen van de parodontale weefsels die de apicale snijtand en het cervicale lusgebied bedekken.
- Trek voorzichtig het parodontale weefsel van de apicale knop, zodat de laterale zijde van de cervicale lus (of andere interessegebieden) zichtbaar wordt onder de scoop.
OPMERKING: Er moet voor worden gezorgd dat het tandepitheel niet wordt beschadigd of loskomt van het mesenchym. Als de snijtand fluorescentiesignalen heeft in het interessegebied en er een fluorescerende dissectiemicroscoop beschikbaar is, kunnen fluorescentiesignalen worden gebruikt om onderscheid te maken tussen weefseltypes en dissecties te ondersteunen. Het is belangrijk om secties 2-4 efficiënt uit te voeren, zodat monsters snel kunnen worden overgebracht naar de kweekmedia en adequaat kunnen worden onderhouden door middel van explantatiekweek (zie hieronder).
5. Weefselinbedding voor explantatiekweek
- Voeg 500 μL warme, niet-gestolde kweekgel toe aan een putje in een plaat met 24 putjes en breng de ontlede hele snijtanden snel over naar het putje. Draai de plaat een paar keer rond om de snijtanden te spoelen.
- Voeg 400 μL warme, ongestolde kweekgel toe aan een kweekschaal en breng de gespoelde snijtanden over in de schaal.
NOTITIE: We gebruiken een in de handel verkrijgbare kweekschaal die compatibel is met de perfusie-opstelling. Zie stap 6.4 voor alternatieve opties. - Oriënteer de snijtand om het cervicale lusgebied (of andere interessante gebieden) in het midden van de schaal te plaatsen (Figuur 2A,B) en pas de kanteling van de apicale snijtand aan voor het gewenste beeldvlak.
OPMERKING: Weefseloriëntatie moet snel worden gedaan voordat de gel volledig is. - Nadat de gel is uitgehard, gebruikt u een fijne pincet om alle gel bovenop het interessegebied te verwijderen, zodat deze niet door de gel wordt bedekt.
- Voeg een voldoende hoeveelheid warme kweekmedia toe door deze langzaam tegen de rand van de schaal te pipetteren om het monster net te bedekken (~150 μL).
- Verplaats de explantatiecultuur naar een celkweekincubator van 37 °C om gedurende 1 uur weefselbezinking en aanpassing aan de kweektoestand mogelijk te maken.
6. Timelapse-microscopie van snijtandexplantaten
OPMERKING: In dit experiment gebruikten we een rechtopstaande microscoop die was uitgerust met een 25x waterdompelobjectief met een numerieke apertuur van 1. Over het algemeen is een waterdompellens met een hoge numerieke apertuur het meest geschikt voor beeldvorming van diep weefsel.
- Zet de microscoop en de twee-fotonlaser aan.
- Bevestig de kweekschaal aan de tafeladapter en monteer de perfusieadapterring erop (Figuur 2C).
- Sluit de stage-adapter aan op een temperatuurregelaar die is ingesteld om de cultuur op 37 °C te houden.
- Sluit de inlaat en de uitlaat van de adapterring aan op een microperfusiepomp en begin met de perfusie van het kweekmedium, met de perfusiesnelheid ingesteld op 20 op de pomp. Dit genereert een langzame stroom (~5 ml/uur) van het kweekmedium over de bovenkant van de monsters (Figuur 2C).
OPMERKING: Zie de materiaaltabel voor details over het systeem om het weefsel in een stabiel gecontroleerde omgeving te houden. Er kunnen ook andere systemen worden gebruikt. Er kan ook een combinatie worden gebruikt van een verwarmingsplaat van 37 °C en een zelfgemaakte perfusiekweekschaal (aanvullende figuur S1) met een inlaat en een uitlaat die is aangesloten op spuitpompen. - Plaats een Atmospheric Control Barrier Ring (ACBR) bovenop de adapterring en laat het objectief door de ACBR zakken om net contact te maken met het kweekmedium (Figuur 2D).
- Stem de lasergolflengte af op 920 nm om zowel GFP- als rode fluorescentiesignalen (bijv. tdTomato) te visualiseren.
- Lokaliseer monsters via oculairs en vervolgens via de software van de microscoop.
- Stel Z-stacks, multi-position imaging en tijdsintervallen in met behulp van de software. Om dit protocol te volgen, gebruikt u een z-stapgrootte van 4 μm en een tijdsinterval van 5 minuten gedurende 14 uur.
OPMERKING: We ontdekten dat een tijdsinterval van langer dan 5 minuten vaak onvoldoende is om vloeiende celbewegingen en -delingen vast te leggen. - Start de timelapse-beeldvorming.
NOTITIE: De monsterpositie kan tijdens het eerste uur verschuiven en verdere aanpassingen kunnen nodig zijn. - Sla bestanden op voor downstream gegevensverwerking en analyses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het apicale gebied van de snijtand van de volwassen muis is ingekapseld in de onderkaak (figuur 1) en is daarom niet direct toegankelijk voor het visualiseren en live volgen van de voorlopercellen die zich in het groeigebied bevinden. Daarom hebben we een methode ontwikkeld om de hele snijtand uit het kaakbot te halen en te bewaren in een explantatiekweeksysteem voor timelapse-microscopie met twee fotonen (Figuur 2). Hier beschrijven we representatieve resultaten die het dynamische proces van celproliferatie en -beweging in het labiale cervicale lusgebied van het tandepitheel vastleggen.
Om de experimentele procedures te demonstreren, hebben we twee verschillende muismodellen gebruikt die groene fluorescentie tot expressie brengen in het tandepitheel. De eerste muislijn is K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP, waarbij K14Cre (MGI:2680713) de Cre-recombinase van een Keratine 14-promotor35 tot expressie brengt en de expressie van de omgekeerde tetracycline-gecontroleerde transactivator in het epitheel van het R26rtTA-allel 36 (MGI:3584524) activeert. Na toediening van doxycycline induceert rtTA histon H2B-GFP-expressie van het tetO-H2B-GFP-allel 37 (MGI:3043783) en labelt epitheelcelkernen met groene fluorescentie. Dit is vooral handig voor het volgen van cellen en voor het detecteren van celdelingen. In dit experiment hebben we dieren 24 uur voor het offeren gevoed met doxycyclinevoedsel om de H2B-GFP-expressie te activeren. De tweede muislijn is K14Cre; R26mT/mG, waarin R26mT/mG (MGI:3803814) een Cre-reporteris 38. Bij afwezigheid van Cre-activiteit brengen cellen membraangelokaliseerde tdTomaat (mT) met rode fluorescentie tot expressie. Bij Cre-gemedieerde recombinatie brengen cellen membraan GFP (mG) tot expressie. K14Cre; R26mT/mG labelt dus epitheelcelmembranen met groene fluorescentie, waardoor niet-epitheelcellen rood blijven. Dit maakt eenvoudige visualisatie van celvormen, delingen en bewegingen mogelijk.
We begonnen de procedure met het ontleden van de kaken (Figuur 3A) en verwijderden vervolgens systematisch alle botten rond de snijtand (Figuur 3B-G). Dit leverde hele snijtanden op met onbeschadigd epitheel (Figuur 3H). We bevestigden de intactheid van het tandepitheel door de groene fluorescentie in de K14Cre te inspecteren; R26rtTA; tetO-H2B-GFP en K14Cre; R26mT/mG muizen (Figuur 4A,B,E,F). In dit stadium bedekken de ondoorzichtige parodontale weefsels nog steeds de apicale snijtand en lijkt de cervicale lus dus wazig als gevolg van lichtverstrooiing, wat op dezelfde manier stroomafwaartse timelapse-beeldvorming zou belemmeren (Figuur 4C,G). Daarom hebben we de parodontale weefsels zorgvuldig verwijderd, zodat het tandepitheel met de cervicale lus in elke snijtand kon worden onderscheiden (Figuur 4D,H).
De snijtanden werden vervolgens ingebed in agarose met een laag smeltpunt en gekweekt in een perfusie-opstelling voor live-beeldvorming met twee fotonen, zoals afgebeeld in figuur 2. Voor deze oefening hebben we ons gericht op het cervicale lusgebied van het tandepitheel en hebben we z-stack-beelden vastgelegd met intervallen van 4 μm om de 5 minuten gedurende een duur van 14 uur (Figuur 5A). Met name H2B-GFP-signalen werden meestal waargenomen in het transitversterkende gebied van de cervicale lus, waar actieve celdelingen zijn (Figuur 5B). Dit komt waarschijnlijk omdat er een hogere H2B-GFP-uitwisseling is bij open chromatines en opname in nucleosomen na DNA-replicaties in deze actieve cellen39.
Vervolgens onderzochten we de timelapse-beelden met behulp van ImageJ en op basis van de scheiding van de H2B-GFP-signalen40 konden we gedurende de beeldvormingsperiode talrijke celdelingen waarnemen (aanvullende video S1 en aanvullende video S2). Dit gaf aan dat de weefsels voldoende werden onderhouden in de explantatiecultuur en dat de cellen actief waren. In het bijzonder waren we in staat om de condensatie en uitlijning van chromosomen op de metafaseplaat in mitotische cellen te observeren, gevolgd door hun segregatie in twee dochtercellen tijdens de anafase (Figuur 5C-N, handmatig gevolgd met behulp van de ImageJ-plug-in TrackMate). De meeste van deze verdelingen stonden loodrecht of onder een schuine hoek ten opzichte van het basale membraan (Figuur 5C-K en aanvullende video S1). Horizontale scheidingen evenwijdig aan het basaalmembraan konden ook worden gedetecteerd, hoewel ze minder vaak voorkwamen (Figuur 5L-N en aanvullende video S2). Het is belangrijk erop te wijzen dat cytokinese in het tandepitheel vaak snel gebeurt, binnen 5-10 minuten. Als gevolg hiervan kunnen timelapse-intervallen van meer dan 5 minuten sommige van deze divisies missen.
Celdelingsgebeurtenissen waren ook duidelijk in K14Cre; R26mT/mG cervicale lussen, waarbij alle epitheelcelmembranen groen waren gelabeld (Figuur 6A). We konden mitotische cellen identificeren aan de hand van hun celafronding en vervolgens cytokinese (Supplemental Video S3), en zowel verticale als horizontale celdelingen waren waarneembaar (Figuur 6B-G), dus vergelijkbaar met de resultaten verkregen met H2B-GFP. Samen tonen deze resultaten aan dat dit protocol kan dienen als een krachtig hulpmiddel om celgedrag in de snijtandexplantaten te onderzoeken in combinatie met genetische muismodellen die verschillende subcellulaire structuren fluorescerend labelen.
Figuur 1: Schema's van de kaak van de muis en de cervicale lus van de snijtand. (A) Een aanzienlijk deel van de snijtand is ingebed in het kaakbot. Het groeigebied bevindt zich aan het apicale uiteinde van de tand en ondersteunt de continue groei (donkergroene pijl). (B) Een vergroting van de apicale snijtand, die is omgeven door parodontale weefsels. De tand is samengesteld uit glazuur en dentine, dit zijn sterk gemineraliseerde structuren die worden gevormd door respectievelijk ameloblasten en odontoblasten. (C) Een sagittale doorsnede van de apicale snijtand, waaruit blijkt dat tandepitheliale voorlopercellen en transitamplificerende cellen zich in de labiale cervicale lus bevinden en aanleiding geven tot ameloblasten in het meer distale epitheel (donkergroene stippelpijl). In vergelijking met de labiale cervicale lus is de linguale cervicale lus kleiner van formaat en vormt deze normaal gesproken geen ameloblasten. Dentale mesenchymale stamcellen zijn aanwezig in de tandpulpa (paarse regio) en geven aanleiding tot odontoblasten. Afkortingen: En = email; De = dentine; Am = ameloblast; Od = odontoblast; TAC's = transit-amplificerende cellen; laCL = labiale cervicale lus; liCL = linguale cervicale lus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Behoud van de explantatie van de snijtanden van muizen voor live beeldvorming. (A) Schema's die de belangrijkste stappen van het protocol weergeven, van het ontleden van de snijtand tot het inbedden van het weefsel in agarose met een laag smeltpunt voor live beeldvorming. Een perfusie-opstelling wordt gebruikt om een constante toevoer van voedingsstoffen te bieden tijdens de beeldvorming en de kweek wordt op 37 °C gehouden. (B-D) Een stap-voor-stap demonstratie van het instellen van de kweekschaal en de perfusiekamer voor live beeldvorming. De media-inlaat en -uitlaat worden weergegeven als respectievelijk roze en gele pijlen. Afkorting: ACBR = Atmospheric Control Barrier Ring. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Isolatie van de hele snijtand van de muis. (A) Intacte kaak. (B-H) Botten werden geleidelijk verwijderd om de hele snijtand bloot te leggen. Rode stippellijnen in B en C tonen het blootgestelde zachte weefsel van de apicale snijtand na het afscheren van het membraanbot dat over de linguale en buccale zijden van de snijtand ligt (stappen 3.3-3.5 in het protocol). (D-G) Blauwe pijlpunten vertegenwoordigen de condylen, kiezen en alveolaire botten die zijn verwijderd om de hele tand te isoleren (stap 3.6 in het protocol). Schaalbalk = 2 mm (H). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Verwijdering van parodontale weefsels voor live beeldvorming. (A-H) Representatieve monsters van (A-D) K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP, en (E-H) K14Cre; R26mT/mG-muizenwerden gebruikt in onze demonstratie van het protocol. Vóór dissectie was GFP-expressie in het tandepitheel zichtbaar door het bot (A,E, gele pijlpunten). Witte stippellijnen omlijnen de niet-ontlede snijtanden. E' laat de linguale kant zien. In geïsoleerde snijtanden (B,C,F,G) werd GFP-fluorescentie aanvankelijk gediffracteerd door de parodontale weefsels die de apicale snijtanden (witte en rode pijlpunten) bedekten. Rode fluorescentie in F- en G-labels niet-epitheelcellen. Het verwijderen van parodontale weefsels zorgt voor een duidelijk en onbelemmerd zicht op de groene fluorescerende cervicale lussen (D,H, groene pijlpunten). Schaalbalk = 2 mm (A,E); 1,25 mm (B,F); en 300 μm (C,D,G,H). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Timelapse microscopie van de K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP cervicale lus. (A) Een schema dat de timelapse-instelling illustreert. b) een representatief z-vlak van de K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP snijtand labiale cervicale lus, die nucleaire etikettering door H2B-GFP voornamelijk in het transit-amplificerende gebied vertoont, waar cellen zich actief delen. Het gele vak vertegenwoordigt het algemene gebied van de vergrote afbeeldingen die hieronder worden weergegeven. (C-K) Timelapse-afbeeldingen die verticale en schuine celdelingen tonen ten opzichte van de BM. (L-N) Timelapse-afbeeldingen tonen een voorbeeld van horizontale celdeling ten opzichte van de BM. (D,G,J,M) Cellen in metafase of anafase worden weergegeven in de middelste panelen. Schema's van elke bijgehouden divisie worden aan de rechterkant weergegeven. Schaalbalk in N = 36 μm (B); 5 μm (C-N). Afkorting: BM = basaalmembraan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Timelapse microscopie van de K14Cre; R26mT/mG cervicale lus. (A) Een representatief z-vlak van de K14Cre; R26mT/mG snijtand labiale cervicale lus. Alle epitheelcellen brengen membraan GFP tot expressie. Het gele vak vertegenwoordigt het gebied van celtracking dat wordt weergegeven in de vergrotingen. (B-G) Timelapse-beelden die zowel (B-D) horizontale als (E-G) verticale celdelingen vastleggen, ten opzichte van de BM. (C,F) Middelste panelen tonen mitotische celafronding. Schema's van elke bijgehouden divisie worden aan de rechterkant weergegeven. Schaalbalk = 35 μm (A); 5 μm (B-G). Afkorting: BM = basaalmembraan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende afbeelding S1: In eigen huis gemaakte perfusieschaal. (A) Een kweekschaal van 35 mm kan worden gebruikt om een perfusieschaal te maken. Een schotel met glazen bodem kan worden gebruikt als beeldvorming wordt uitgevoerd met behulp van een omgekeerde microscoop. (B) Verwarm een spijker met een vlam. (C) Met behulp van de verwarmde nagel worden aan weerszijden van de schaal twee openingen (witte pijlpunten) gemaakt. (D) Steek met epoxylijm twee naalden van 16 G met stomp uiteinde, één als media-inlaat en de andere als media-uitgang, door de openingen. Als gasperfusie gewenst is, kan een derde opening/naald aan de schaal worden toegevoegd. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende video S1: Live beeldvorming van een K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP snijtor labiale cervicale lus, met verticale en schuine celdelingen. Cellen worden handmatig bijgehouden en verschillende gekleurde stippen vertegenwoordigen verschillende paren moeder/dochtercellen. Schaalbalk = 30 μm (linker frame); 7 μm (rechter frame). Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullende video S2: Live beeldvorming van een K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP snijtand labiale cervicale lus, met een voorbeeld van horizontale celdeling. De horizontale verdeling vindt plaats bij de 10 s-markering en wordt handmatig gevolgd met behulp van blauwe stippen. Schaalbalk = 30 μm (linker frame); 7 μm (rechter frame). Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullende video S3: Live beeldvorming van een K14Cre; R26mT/mG snijtand labiale cervicale lus, die zowel verticale als horizontale celdelingen vertoont. Cellen worden handmatig bijgehouden en verschillende gekleurde cirkels vertegenwoordigen verschillende paren moeder/dochtercellen. Schaalbalk = 30 μm (linker frame); 7 μm (rechter frame). Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beeldvorming van levend weefsel is een belangrijke techniek die ons in staat stelt de dynamische processen en gedragingen van cellen te bestuderen wanneer ze in hun niche-omgeving worden gehouden41. Idealiter wordt live beeldvorming in vivo uitgevoerd met een hoge spatiotemporele resolutie. In vivo beeldvorming voor zoogdierorganen kan echter een uitdaging zijn vanwege de ontoegankelijkheid van weefsel, optische ondoorzichtigheid en de moeilijkheid om het dier of het orgaan gedurende een langere periode te immobiliseren42. Weefselexplantaten omzeilen sommige van deze uitdagingen en zijn met succes toegepast in een aantal onderzoeken om celgedrag te volgen, zoals tijdens tandmorfogenese en de ontwikkeling van ectodermale organen26. Hier demonstreerden we een relatief eenvoudig maar robuust protocol om live deep tissue imaging uit te voeren op gekweekte snijtanden van hele volwassen muizen. Toepassing van deze techniek zal ons helpen de regulatie van celbewegingen, lotsbeslissingen en weefselorganisaties tijdens tandheelkundige regeneratie te begrijpen.
Omdat celdelingen gemakkelijk waarneembare gebeurtenissen zijn en kenmerkend zijn voor het regenereren van weefsels, hebben we ons in deze studie gericht op het volgen van delende cellen om één gebruik van het protocol te benadrukken. We ontdekten dat voorlopercellen van het snijtandepitheel zowel verticale als horizontale delingen kunnen ondergaan, dus vergelijkbaar met andere epitheelweefsels43. Het ophelderen van het mechanisme dat delingshoeken reguleert en het onderzoeken van de rol van delingsoriëntaties bij beslissingen over het lot van cellen zal van belang zijn in toekomstige studies. Het combineren van live beeldvorming met verschillende genetische muismodellen die ook fluorescerende cellotmarkers, signaalrouteverslaggevers of de Fucci-celcyclusverslaggever 44,45 dragen, zal helpen onthullen hoe celdelingspatronen en celcyclusdynamiek bijdragen aan de regulatie van epitheliale homeostase en regeneratie.
Een noodzakelijke praktijk in dit protocol is om tanddissectie op een snelle en zorgvuldige manier uit te voeren, waardoor een snelle overgang naar en behoud van het intacte weefsel onder de juiste kweekomstandigheden mogelijk is. We hebben ontdekt dat voor live beeldvorming, het ontleden van weefsels in warme media, in plaats van koude media, zoals in experimenten gericht op het extraheren van eiwitten en mRNA's46, cellen in een functionerende toestand houdt. Omdat de snijtand een relatief groot kweekorgaan is, is een constante toevoer van voedingsstoffen via mediaperfusie ook van cruciaal belang voor het behoud van het weefsel tijdens debeeldvorming47. Als de voorlopercellen aanwezig zijn in het interessegebied, is observatie van frequente celdelingen een goede indicator dat het weefsel gezond en actief is. Daarentegen zou celdood zeldzaam moeten zijn, en dit kan worden geverifieerd door heldere en gecondenseerde kernlichamen te detecteren tijdens beeldvorming als een nucleaire marker wordt gebruikt of door TUNEL-kleuring uit te voeren na beeldvorming en weefselfixatie48. Naast voedingsstoffen kan het zuurstofgehalte ook de levensvatbaarheid van de plant beïnvloeden, aangezien zuurstofspanning of -insufficiëntie de overleving, proliferatie en differentiatie van cellen kan verstoren 49,50,51. In onze ervaring hebben we geen duidelijke verschillen waargenomen in celproliferatie en celdood wanneer monsters werden voorzien van of zonder extra zuurstof (bijv. 95% O2/5% CO2 carbogen of 5% CO2/21% O2/gebalanceerd N2) tijdens beeldvorming, wat suggereert dat ofwel een sporenhoeveelheid zuurstof in het systeem voldoende is om snijtandepitheel 's nachts in kweek te houden of dat het weefsel alternatieve routes kan gebruiken om normale celfuncties te behouden52. De behoefte aan zuurstof in andere cellulaire processen of aan correcte genexpressie moet echter in toekomstige studies nader worden bepaald.
In onze demonstratie van het protocol hebben we genetisch gecodeerde H2B-GFP en membraan-GFP gebruikt om respectievelijk celkernen en contouren te labelen. Deze fluorescerende markers zijn helder en gaan lang mee onder twee-fotonmicroscopie en zijn dus voorbeelden van ideale labels om te gebruiken voor het volgen van celbewegingen en -delingen. In theorie kunnen fluorescerende vitale kleurstoffen ook worden gebruikt om verschillende subcellulaire compartimenten te labelen voor ex vivo live beeldvorming53, maar verminderde penetratie van de kleurstoffen in diepere epitheelcellen beperkt waarschijnlijk hun gebruik. Evenzo, terwijl standaard confocale microscopie in staat is tot live beeldvorming met hoge resolutie op een diepte van minder dan 100 μm, biedt twee-fotonmicroscopie een grotere beeldvormingsdiepte met verminderde fotobleken en fototoxiciteit54. Daarom hebben we gekozen voor twee-fotonmicroscopie als beeldvormingsmodaliteit in de meeste van onze live beeldvormingstoepassingen.
Een mogelijke beperking van dit protocol is dat explantaten van snijtanden de in vivo omgeving en biologie mogelijk niet volledig recapituleren. Gegevens vertegenwoordigen daarom celgedrag onder de kweekconditie en moeten dienovereenkomstig worden geïnterpreteerd en gevalideerd met behulp van andere methoden, zoals histologie, indien van toepassing. We moesten ook parodontale weefsels gedeeltelijk verwijderen om toegang te krijgen tot de cervicale lus voor beeldvorming. Signaalinteracties tussen parodontale weefsels en het tandepitheel kunnen zo worden verstoord. Ten slotte, hoewel mediaperfusie de levensvatbaarheid van gekweekte weefsels aanzienlijk verbetert, kan het vloeibare schuifspanning introduceren die werkt als een ectopisch mechanisch signaal en de resultaten beïnvloedt55,56. We hebben de impact van verschillende debieten in onze opstelling niet bepaald. Omdat een laag debiet van 1-5 ml/u echter doorgaans voldoende is om de toevoer van voedingsstoffen op peil te houden57, kan het effect van schuifspanning worden geminimaliseerd. Met deze beperkingen in het achterhoofd dient ex vivo live beeldvorming als een krachtig platform om veranderingen in celgedrag te bestuderen wanneer de juiste controles in experimenten worden opgenomen.
De continu groeiende muizensnijtand is een zeer handelbaar modelsysteem om weefselvernieuwing en letselherstel op basis van stamcellen te bestuderen. Het hierin beschreven protocol biedt onderzoekers de middelen om hele volwassen snijtanden in kweek te houden en spatiotemporele informatie over celgedrag te extraheren door middel van timelapse-microscopie. We verwachten dat deze techniek breed toepasbaar zal zijn bij het bestuderen van verschillende genetische muismodellen die worden gebruikt in tandheelkundig onderzoek en om onze kennis op het gebied van tandheelkundige regeneratie te vergroten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
We erkennen het UCLA Advanced Light Microscopy/Spectroscopy Laboratory en Leica Microsystems Center of Excellence bij het California NanoSystems Institute (RRID: SCR_022789) voor het leveren van twee-fotonmicroscopie. AS werd ondersteund door ISF 604-21 van de Israel Science Foundation. JH werd ondersteund door R03DE030205 en R01DE030471 van de NIH/NIDCR. AS en JH werden ook ondersteund door subsidie 2021007 van de United States-Israel Binational Science Foundation (BSF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well, flat bottom tissue culture plate | Olympus plastics | 25-107 | |
| 25x HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | 11507704 | |
| Ascorbic acid (Vitamin C) | Acros Organics | 352685000 | |
| D-(+)-Glucose bioxtra | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Delta T system | Bioptechs | 0420-4 | Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup |
| Dissection microscope- LEICA S9E | Leica | LED300 SLI | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | 11039047 | Basal media without phenol red |
| Feather surgical blade (#15) | Feather | 72044-15 | |
| Fine forceps | F.S.T | 11252-23 | |
| Glutamax | Thermo Scientific | 35050-061 | Glutamine substitute |
| Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | n/a | |
| low-melting agarose | NuSieve | 50080 | |
| non-essential amino acids (100x) | Thermo Scientific | 11140-050 | |
| penicillin–streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Petri dish | Gen Clone | 32-107G | 90 mm |
| Rat serum | Valley Biomedical | AS3061SC | Processed for live imaging |
| Razor blade #9 | VWR | 55411-050 | |
| Scalpel handle | F.S.T | 10003-12 | |
| Scissors | F.S.T | 37133 | |
| serrated forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| spring scissors | F.S.T | 91500-09 |
References
- Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
- Jing, J., et al. Rodent incisor as a model to study mesenchymal stem cells in tissue homeostasis and repair. Frontiers in Dental Medicine. 3, 1068494 (2022).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and Fgf signaling. Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Warshawsky, H., Smith, C. E. Morphological classification of rat incisor ameloblasts. The Anatomical Record. 179 (4), 423-445 (1974).
- Lekic, P., McCulloch, C. A. Periodontal ligament cell population: the central role of fibroblasts in creating a unique tissue. The Anatomical Record. 245 (2), 327-341 (1996).
- Takahashi, A., et al. Autocrine regulation of mesenchymal progenitor cell fates orchestrates tooth eruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (2), 575-580 (2019).
- Ness, A. R. Eruption rates of impeded and unimpeded mandibular incisors of the adult laboratory mouse. Archives of Oral Biology. 10 (3), 439-451 (1965).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), Cambridge, England. 3753-3761 (2010).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
- Biehs, B., et al. BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nature Cell Biology. 15, 846-852 (2013).
- Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
- Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Li, L., Clevers, H. Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals. Science. 327 (5965), 542-545 (2010).
- Sharir, A., et al. A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage. Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).
- Hu, J. K. -H., et al. An FAK-YAP-mTOR signaling axis regulates stem cell-based tissue renewal in mice. Cell Stem Cell. 21 (1), 91-106 (2017).
- Yu, F., Li, F., Zheng, L., Ye, L. Epigenetic controls of Sonic hedgehog guarantee fidelity of epithelial adult stem cells trajectory in regeneration. Science Advances. 8 (29), (2022).
- An, Z., et al. A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors. Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).
- Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
- Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development. 147 (2), (2020).
- Krivanek, J., Buchtova, M., Fried, K., Adameyko, I. Plasticity of dental cell types in development, regeneration, and evolution. Journal of Dental Research. 102 (6), 589-598 (2023).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Cetera, M., Leybova, L., Joyce, B., Devenport, D. Counter-rotational cell flows drive morphological and cell fate asymmetries in mammalian hair follicles. Nature Cell Biology. 20 (5), 541-552 (2018).
- Held, M., Santeramo, I., Wilm, B., Murray, P., Lévy, R. Ex vivo live cell tracking in kidney organoids using light sheet fluorescence microscopy. PLoS ONE. 13 (7), 0199918 (2018).
- Mesa, K. R., et al. Homeostatic epidermal stem cell self-renewal is driven by local differentiation. Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).
- Mogollón, I., Ahtiainen, L. Live tissue imaging sheds light on cell level events during ectodermal organ development. Frontiers in Physiology. 11, 818 (2020).
- Prochazka, J., et al. Migration of founder epithelial cells drives proper molar tooth positioning and morphogenesis. Developmental Cell. 35 (6), 713-724 (2015).
- Morita, R., et al. Coordination of cellular dynamics contributes to tooth epithelium deformations. PLOS ONE. 11 (9), 0161336 (2016).
- Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
- Panousopoulou, E., Green, J. B. A. Invagination of ectodermal placodes is driven by cell intercalation-mediated contraction of the suprabasal tissue canopy. PLoS biology. 14 (3), 1002405 (2016).
- Mogollón, I., Moustakas-Verho, J. E., Niittykoski, M., Ahtiainen, L. The initiation knot is a signaling center required for molar tooth development. Development. 148 (9), (2021).
- Kim, R., et al. Early perturbation of Wnt signaling reveals patterning and invagination-evagination control points in molar tooth development. Development. 148 (14), 199685 (2021).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments JoVE. (90), e51969 (2014).
- Katsuragi, Y., et al. Bcl11b transcription factor plays a role in the maintenance of the ameloblast-progenitors in mouse adult maxillary incisors. Mechanisms of Development. 130 (9-10), 482-492 (2013).
- Dassule, H. R., Lewis, P., Bei, M., Maas, R., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127 (22), 4775-4785 (2000).
- Belteki, G., et al. Conditional and inducible transgene expression in mice through the combinatorial use of Cre-mediated recombination and tetracycline induction. Nucleic Acids Research. 33 (5), 51 (2005).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Kimura, H., Cook, P. R. Kinetics of core histones in living human cells. The Journal of Cell Biology. 153 (7), 1341-1354 (2001).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology: CB. 8 (7), 377-385 (1998).
- Huang, Q., et al. The frontier of live tissue imaging across space and time. Cell Stem Cell. 28 (4), 603-622 (2021).
- Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).
- Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
- Li, S., et al. Overview of the reporter genes and reporter mouse models. Animal Models and Experimental. 1 (1), 29-35 (2018).
- Mort, R. L., et al. Fucci2a: a bicistronic cell cycle reporter that allows Cre mediated tissue specific expression in mice. Cell Cycle. 13 (17), 2681-2696 (2014).
- Krivanek, J., et al. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nature Communications. 11 (1), 4816 (2020).
- Dailey, M. E., Marrs, G. S., Kurpius, D. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harbor protocols. 2011 (4), (2011).
- Gorczyca, W., Bruno, S., Darzynkiewicz, R., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. DNA strand breaks occurring during apoptosis - their early insitu detection by the terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays and prevention by serine protease inhibitors. International Journal of Oncology. 1 (6), 639-648 (1992).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Wale, P. L., Gardner, D. K. Time-lapse analysis of mouse embryo development in oxygen gradients. Reproductive Biomedicine Online. 21 (3), 402-410 (2010).
- Tse, H. M., Gardner, G., Dominguez-Bendala, J., Fraker, C. A. The importance of proper oxygenation in 3D culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 634403 (2021).
- Spinelli, J. B., et al. Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain. Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex-vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current Protocols in Cytometry. , CHAPTER, Unit9.39 (2012).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- McCoy, R. J., O'Brien, F. J. Influence of shear stress in perfusion bioreactor cultures for the development of three-dimensional bone tissue constructs: a review. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (6), 587-601 (2010).
- Chen, K. D., et al. Mechanotransduction in response to shear stress. Roles of receptor tyrosine kinases, integrins, and Shc. The Journal of Biological Chemistry. 274 (26), 18393-18400 (1999).
- Seddiqi, H., et al. Inlet flow rate of perfusion bioreactors affects fluid flow dynamics, but not oxygen concentration in 3D-printed scaffolds for bone tissue engineering: Computational analysis and experimental validation. Computers in Biology and Medicine. 124, 103826 (2020).
