Ex vivo live beeldvorming is een krachtige techniek voor het bestuderen van de dynamische processen van cellulaire bewegingen en interacties in levende weefsels. Hier presenteren we een protocol dat twee-fotonmicroscopie implementeert om tandepitheelcellen live te volgen in gekweekte snijtanden van hele volwassen muizen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Ex vivo live beeldvorming gebruiken om celdelingen en bewegingen tijdens tandvernieuwing bij muizen te onderzoeken
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De continu groeiende muizensnijtand is in opkomst als een zeer handelbaar modelsysteem om de regulatie van volwassen epitheliale en mesenchymale stamcellen en tandregeneratie te onderzoeken. Deze voorloperpopulaties delen, verplaatsen en differentiëren actief om de weefselhomeostase te handhaven en verloren cellen op een responsieve manier te regenereren. Traditionele analyses met behulp van vaste weefselsecties konden de dynamische processen van cellulaire bewegingen en interacties echter niet vastleggen, waardoor ons vermogen om hun regulatie te bestuderen werd beperkt. Dit artikel beschrijft een protocol voor het onderhouden van hele muizensnijtanden in een explantatiekweeksysteem en live-track tandepitheelcellen met behulp van multifoton timelapse-microscopie. Deze techniek is een aanvulling op onze bestaande gereedschapskist voor tandheelkundig onderzoek en stelt onderzoekers in staat om spatiotemporele informatie te verkrijgen over celgedrag en organisaties in een levend weefsel. We verwachten dat deze methodologie onderzoekers zal helpen bij het verder onderzoeken van mechanismen die de dynamische cellulaire processen beheersen die plaatsvinden tijdens zowel tandheelkundige vernieuwing als regeneratie.
Inleiding
In de afgelopen twee decennia is de snijtand van muizen naar voren gekomen als een platform van onschatbare waarde voor het onderzoeken van de principes van volwassen stamcelregulatie en tandregeneratie 1,2. De muizensnijtand groeit continu en vernieuwt zichzelf gedurende het hele leven van het dier. Het doet dit door zowel epitheliale als mesenchymale stamcellen in stand te houden, die zichzelf kunnen vernieuwen en differentiëren in verschillende celtypen van de tand 1,2. Terwijl tandepitheliale stamcellen aanleiding geven tot ameloblasten, die de gla....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle muizen werden gehouden in pathogeenvrije dierfaciliteiten aan de Universiteit van Californië Los Angeles (UCLA) of de Hebreeuwse Universiteit van Jeruzalem (HUJI). Alle experimenten met muizen werden uitgevoerd volgens voorschriften en protocollen die zijn goedgekeurd door de respectieve Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) of (MD-23-17184-3; HUJI). Een algemene workflow van de experimentele stappen is weergegeven in figuur 2A. Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle instrumenten, reagentia en materialen die in dit protocol worden gebruikt.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het apicale gebied van de snijtand van de volwassen muis is ingekapseld in de onderkaak (figuur 1) en is daarom niet direct toegankelijk voor het visualiseren en live volgen van de voorlopercellen die zich in het groeigebied bevinden. Daarom hebben we een methode ontwikkeld om de hele snijtand uit het kaakbot te halen en te bewaren in een explantatiekweeksysteem voor timelapse-microscopie met twee fotonen (Figuur 2). Hier beschrijven we representatieve resultate.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Beeldvorming van levend weefsel is een belangrijke techniek die ons in staat stelt de dynamische processen en gedragingen van cellen te bestuderen wanneer ze in hun niche-omgeving worden gehouden41. Idealiter wordt live beeldvorming in vivo uitgevoerd met een hoge spatiotemporele resolutie. In vivo beeldvorming voor zoogdierorganen kan echter een uitdaging zijn vanwege de ontoegankelijkheid van weefsel, optische ondoorzichtigheid en de moeilijkheid om het dier of het orgaan gedur.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Dankbetuigingen
We erkennen het UCLA Advanced Light Microscopy/Spectroscopy Laboratory en Leica Microsystems Center of Excellence bij het California NanoSystems Institute (RRID: SCR_022789) voor het leveren van twee-fotonmicroscopie. AS werd ondersteund door ISF 604-21 van de Israel Science Foundation. JH werd ondersteund door R03DE030205 en R01DE030471 van de NIH/NIDCR. AS en JH werden ook ondersteund door subsidie 2021007 van de United States-Israel Binational Science Foundation (BSF).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 24 well, flat bottom tissue culture plate | Olympus plastics | 25-107 | |
| 25x HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | 11507704 | |
| Ascorbic acid (Vitamin C) | Acros Organics | 352685000 | |
| D-(+)-Glucose bioxtra | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Delta T system | Bioptechs | 0420-4 | Met temperatuurregeling, kweekschalen en perfusie-opstelling |
| Dissection microscope- LEICA S9E | Leica | LED300 SLI | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | 11039047 | Basaal medium zonder fenolrood |
| Feather chirurgisch mes (#15) | Feather | 72044-15 | |
| Fijne pincet | F.S.T | 11252-23 | |
| Glutamax | Thermo Scientific | 35050-061 | Glutamine-vervanger |
| Leica SP8-DIVE uitgerust met een 25X HC IRAPO motCORR water-dipping objectief | Leica | n/a | |
| Laagsmeltende agarose | NuSieve | 50080 | |
| Niet-essentiële aminozuren (100x) | Thermo Scientific | 11140-050 | |
| Penicilline–streptomycine | Thermo Scientific | 15140122 | 10.000 U/mL |
| Petrischaal | Gen Clone | 32-107G | 90 mm |
| Rattenserum | Valley Biomedical | AS3061SC | Verwerkt voor live beeldvorming |
| Veiligheidsmes #9 | VWR | 55411-050 | |
| Scalpelgreep | F.S.T | 10003-12 | |
| Schaar | F.S.T | 37133 | |
| Gekartelde pincet | F.S.T | 11000-13 | |
| Vedermes | F.S.T | 91500-09 |
Referenties
- Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
- Jing, J., et al. Ro....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
