Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Bruke Ex Vivo Live Imaging for å undersøke celledelinger og bevegelser under fornyelse av musetenner

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/66020
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2, 1,3
1School of Dentistry, University of California Los Angeles, 2The Institute of Biomedical and Oral Research, Faculty of Dental Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 3Molecular Biology Institute, University of California Los Angeles
* These authors contributed equally

Summary

Ex vivo live imaging er en kraftig teknikk for å studere de dynamiske prosessene for cellulære bevegelser og interaksjoner i levende vev. Her presenterer vi en protokoll som implementerer to-foton mikroskopi for å live spore tannepitelceller i dyrkede hele voksne musefortenner.

Abstract

Den kontinuerlig voksende musesnittet fremstår som et svært håndterbart modellsystem for å undersøke reguleringen av voksne epitel- og mesenkymale stamceller og tannregenerering. Disse stampopulasjonene deler seg aktivt, beveger seg og differensierer for å opprettholde vevshomeostase og regenerere tapte celler på en responsiv måte. Tradisjonelle analyser ved hjelp av faste vevssnitt kunne imidlertid ikke fange opp de dynamiske prosessene i cellulære bevegelser og interaksjoner, noe som begrenset vår evne til å studere regelverket. Dette papiret beskriver en protokoll for å opprettholde hele musesnitt i et eksplantekultursystem og live-track dental epitelceller ved hjelp av multifoton timelapse-mikroskopi. Denne teknikken legger til vår eksisterende verktøykasse for tannforskning og gjør det mulig for etterforskere å skaffe seg spatiotemporal informasjon om celleadferd og organisasjoner i et levende vev. Vi forventer at denne metoden vil hjelpe forskere videre å utforske mekanismer som styrer de dynamiske cellulære prosessene som foregår under både tannfornyelse og regenerering.

Introduction

I løpet av de siste to tiårene har musesnittet dukket opp som en uvurderlig plattform for å undersøke prinsippene for regulering av stamceller hos voksne og tannregenerering 1,2. Musesnittet vokser kontinuerlig og fornyer seg gjennom hele dyrets liv. Det gjør den ved å opprettholde både epitel- og mesenkymale stamceller, som kan fornye seg og differensiere til forskjellige celletyper av tannen 1,2. Mens dental epitelial stamceller gir opphav til ameloblaster, som skiller ut emaljematrisen, dental mesenkymale stamceller gir opphav til odontoblaster, sementoblaster og fibroblaster, som danner dentin, sementum og periodontalt ligament, henholdsvis 3,4,5,6. Denne konstante tilførselen av nye celler opprettholder vevshomeostase og tillater erstatning av gamle celler som går tapt på grunn av masticatory slitasje eller skader 7,8. Å belyse de cellulære og molekylære mekanismene som regulerer vedlikehold og differensiering av dentale stamceller er derfor sentralt for å forstå tannregenerering, et område av økende interesse.

Anatomisk er en stor del av den voksne musesnittet innkapslet i kjevebenet. Mens snittkanten av tannen er eksponert, passer den apikale enden av fortennen i en sokkel og er godt festet til det omkringliggende beinet gjennom periodontale leddbånd og bindevev (figur 1A,B). Fortennens apikale ende er også tannens vekstområde og opprettholder tannstamme- og stamceller i både epitellaget og mesenkymalmassen 9,10,11,12,13. Spesielt opprettholdes dental epitelial stamceller ved den pæreformede enden av epitelet, kjent som den apikale knoppen, også referert til som labial cervical loop (figur 1C). I likhet med tarmepitelet og epidermis støttes epitelfornyelse i snittet primært av aktivt syklende stamceller og deres svært proliferative mellomliggende etterkommere, kalt transittforsterkende celler 14,15,16,17, begge bosatt i den indre delen av livmorhalsløkken. Men om snittepitelet inneholder og benytter hvilende stamceller under regenerering, gjenstår å bli bestemt. I motsetning til dette har både aktive og hvilende dental mesenkymale stamceller blitt identifisert i den apikale massen, og de hvilende stamcellene fungerer som en reservepopulasjon som blir aktivert under skadereparasjon13,18.

Mange av funnene på biologien til musesnittets fornyelse og regenerering har resultert fra histologiske undersøkelser, hvor prøver oppnås ved forskjellige temporale knutepunkter, fast, behandlet og deretter seksjonert i mikrontynne skiver langs et bestemt plan. Gjennom detaljert analyse av histologiske seksjoner fra forskjellige musemodeller som muliggjør avstamningssporing eller genetiske forstyrrelser, har forskere identifisert cellelinjene til forskjellige stampopulasjoner, samt de genetiske og signalveiene som styrer snitthomeostase og skadereparasjon 19,20,21. Imidlertid kan de statiske todimensjonale (2D) bildene av ikke-vitale celler i seksjoner ikke fange hele spekteret av cellulær atferd og romlige organisasjoner i levende vev, for eksempel celleformendringer, bevegelser og cellulær kinetikk. Å oppdage og måle disse raske cellulære endringene, som skjer i en tidsskala som ikke kan løses gjennom vevsseksjonering, krever en annen strategi. Videre er innhenting av slik informasjon også kritisk for å forstå hvordan tannceller samhandler med hverandre, reagerer på forskjellige signalstimuli og selvorganiserer for å opprettholde vevstrukturer og funksjoner.

Fremkomsten av firedimensjonal (4D) dypvevsavbildning ved hjelp av to-foton mikroskopi22, en teknologi som integrerer tre romlige dimensjoner med tidsmessig oppløsning, overvinner de iboende begrensningene i histologisk analyse ved å muliggjøre spatiotemporal undersøkelse av dyrkede vevseksplanter, organoider eller til og med vev in situ 23,24,25,26 . For eksempel har 4D live imaging av det utviklende tannepitelet avdekket de spatiotemporale mønstrene av celledelinger og migrasjoner som koordinerer vevsvekst, signalsenterdannelse og dental epitelial morfogenese 27,28,29,30,31,32 . I den voksne musen incisor, har 4D-bildebehandling nylig blitt tilpasset for å studere cellulær atferd under dental epitel skade reparasjon. Live imaging avslørte at stratum intermediumceller i det suprabasale laget kan omdannes direkte til ameloblaster i basallaget for å regenerere det skadede epitelet, og utfordrer det tradisjonelle paradigmet for epitelskadereparasjon15.

Her beskriver vi disseksjon, dyrkning og avbildning av den voksne musefortennennene, med fokus på epitelceller i labial cervikalsløyfe (figur 1). Denne teknikken bevarer tanncellenes vitalitet i mer enn 12 timer og tillater live sporing av fluorescerende merkede celler ved enkeltcelleoppløsning. Denne tilnærmingen tillater undersøkelse av cellebevegelse og migrasjon, samt dynamiske endringer i celleform og delingsorientering under normale kulturforhold, eller som svar på genetiske, fysiske og kjemiske forstyrrelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle mus ble vedlikeholdt i patogenfrie dyrefasiliteter ved University of California Los Angeles (UCLA) eller Det hebraiske universitetet i Jerusalem (HUJI). Alle eksperimenter med mus ble utført i henhold til forskrifter og protokoller godkjent av den respektive Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) eller (MD-23-17184-3; HUJI). En generell arbeidsflyt for de eksperimentelle trinnene er vist i figur 2A. Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle instrumenter, reagenser og materialer som brukes i denne protokollen.

1. Fremstilling av løsninger og geler

  1. Disseksjonsmedium: Tilbered fersk DMEM/F12 med 0,5 % glukose og hold den varm ved 37 °C til nødvendig i trinn 2.4.
    MERK: Vi bruker DMEM/F12 uten fenolrødt for å redusere autofluorescens under live bildebehandling.
  2. 1x Kultur medium: Forbered ferskt medium ved bruk av 50% DMEM / F12, 50% rotteserum, 1x glutaminerstatning, 1x MEM ikke-essensielle aminosyrer, 1% glukose, 0,1 mg / ml L-askorbinsyre og 0,5% penicillin-streptomycin. Hold den varm ved 37 °C til nødvendig i trinn 5.5. Dette mediet brukes til dyrking av fortenneksplanter under levende bildebehandling.
    MERK: Rotteserumet skal være av høy kvalitet og spesielt tilberedt for fullvevsdyrking av forskere eller fra en kommersiell kilde. Spesielt må blodet sentrifugeres (i 5 minutter ved 1.200 × g ved romtemperatur) før koagulering begynner å danne seg. Etter sentrifugering skal den resulterende fibrinproppen klemmes og kasseres33.
  3. Kultur gel: Formålet med gelen er å immobilisere prøver under avbildning og tilberedes frisk.
    1. Lag 2% gel i DMEM / F12 ved å oppløse 200 mg agarose med lavt smeltepunkt i 10 ml DMEM / F12 ved hjelp av en mikrobølgeovn. Hold 2 % gel ved 37 °C.
    2. Lag 2x kulturmedium (uten DMEM / F12) ved å blande 50% rotteserum, 1x glutaminerstatning, 1x MEM ikke-essensielle aminosyrer, 1% glukose, 0,1 mg / ml L-askorbinsyre og 0,5% penicillin-streptomycin. Varm opp 2x dyrkningsmedium (uten DMEM/F12) til 37 °C.
    3. Lag 1% kultur gel ved å blande like volumer av 2% gel og 2x kultur medium (uten DMEM / F12). Hold 1 % kulturgel ved 37 °C til nødvendig i trinn 5.1.
      MERK: Pass på at alle oppløsningene er varme før blanding for å unngå gelering. Vi fant 1% gel å være egnet for dyrking av den voksne musen fortenn. Gelprosent bør empirisk bestemmes hvis andre vev skal dyrkes.

2. Utvinning av de voksne musmandiblene

  1. Avlive mus i ønsket alder ved hjelp av standardprosedyrer godkjent av IACUC.
    MERK: Her bruker vi CO2 -kvelning etterfulgt av cervikal dislokasjon. Regelverket for avliving av dyr kan variere fra region til region. Forskere bør innhente nødvendig institusjonsgodkjenning før de utfører eksperimenter og sikre overholdelse av lokale dyrepleieforskrifter.
  2. Desinfiser musen med 70% etanol.
  3. Decapitate musen og trekk ut venstre og høyre mandibler.
    1. Legg musen på magen, og bruk deretter et # 9 single-edge industrielt barberblad for å kutte i nakkeområdet og skille musehodet fra resten av kroppen.
      MERK: Hvis vev fra svelget eller nakkeregionen også skal samles inn, bør halshugging ikke utføres, og man kan gå direkte videre til trinn 2.3.2.
    2. Snu musen slik at den ventrale siden vender opp og mandiblene er lett tilgjengelige.
    3. Fest dyrets hode ved å holde det forsiktig mellom tommelen og pekefingeren.
    4. Bruk barberbladet til å lage et midtsagittalt snitt som skjærer over huden på underkjeven fra underleppen mot halsen.
      MERK: En # 15 kirurgisk blad kan også brukes til å gjøre snittet og påfølgende disseksjoner (trinn 2.3.6-2.3.9).
    5. Når snittet er gjort, sprer du den kuttede huden med tommelen og pekefingeren for å avsløre musklene og kjevebenet under.
    6. Bruk barberbladet til å kutte massetermusklene på bukkalsiden av underkjeven, slik at utsiden av venstre og høyre hemimandibles nå er fri for muskelfester.
    7. Kutt mylohyoidmusklene langs innsiden av mandibelen for å fjerne muskelvedlegg der.
    8. Gjør et nytt snitt ved mandibulær symfyse som forbinder de to hemimandiblene. Når den er kuttet, blir mandibelen skilt i venstre og høyre halvdel.
    9. Kile barberbladet mellom mandibulær kondyle og temporal mandibulær ledd og forsiktig dissekere ut hemimandible fra resten av hodet.
      MERK: Vi fant det nyttig å samtidig trekke forsiktig i fortennen mens du kutter. Forsiktighet bør utvises for å unngå å bryte mandibelen og skade det myke vevet innenfor.
  4. Overfør umiddelbart dissekerte mandibler til en petriskål med det forvarmede disseksjonsmediet (trinn 1.1) og fjern det gjenværende muskelvevet ved hjelp av et #15 kirurgisk blad.
    MERK: Å holde prøver i kalde medier bremser celleaktivitetene, noe som resulterer i forsinket eller til og med mislykket gjenoppretting av visse celleaktiviteter, for eksempel spredning eller cellebevegelse, under levende bildebehandling.

3. Isolering av hele musefortennene

MERK: Ytterligere isolering av fortennen gjøres under et lysfeltdisseksjonsmikroskop.

  1. Identifiser visuelt den ovale delen av mandibelen som dekker snittkontakten og huser den apikale delen av snittet.
  2. Plasser kjeven slik at den indre (språklige) overflaten vender oppover.
  3. Mens du holder kjeven på plass med et par taggete tang, genererer du et vindu i det ovale området ved å barbere av det overliggende membranbenet ved hjelp av et #15 kirurgisk blad, i en retning som er fra kondylen mot jekslene. Dette eksponerer det myke vevet til det apikale snittet på den indre overflaten.
  4. Snu mandibelen slik at den ytre (bukkale) overflaten vender oppover.
  5. Generer et vindu i det ovale området på den ytre kjeven som beskrevet i trinn 3.3, og bruk tuppen av skalpellen til å plukke bort eventuelle gjenværende beinfragmenter i kanten. Sørg for at den apikale enden av tannen er synlig fra begge sider.
    MERK: Unngå overdreven trykk mens du barberer beinene for å forhindre skade på det underliggende bløtvevet.
  6. Skjær systematisk bort beinene rundt fortennen for å isolere hele tannen.
    1. Gjør et rent kutt på et plan som ligger umiddelbart ved siden av den apikale snittet for først å fjerne kondylærprosessen.
      MERK: Vær forsiktig så du ikke skjærer i fortennen.
    2. Gjør et andre kutt like bakre til 3. molar, men dorsal til snittet uten å skade tannen. Dette fjerner beinet som inkluderer coronoid-prosessen.
    3. Serielt kuttet fra spissen av vinkelprosessen mot snittet for gradvis å fjerne den ventrale mandibelen på en trinnvis måte.
      MERK: Tannepitelet og tilhørende periodontale vev er ofte fast til beinet og lett dratt av hvis en stor del av ventralbenet er kuttet på en gang. For å skille beinet fra fortennens bløtvev, kan man sette skalpellen (eller et par skarpe ikke-taggete tang) mellom de to vevene i den apikale enden av fortennen og skyve instrumentet forsiktig fremover.
    4. Klipp bort alveolarbenet med jeksler og eventuelle gjenværende bein som fortsatt er festet til snittet.
    5. Hele fortennen er nå isolert. Overfør det fullstendig dissekerte fortennet til en tallerken med rene varme disseksjonsmedier (trinn 1.1).
  7. Gjenta trinn 3.2-3.6 for å isolere flere fortenner etter behov.
    MERK: De maksillære / øvre snittene i musen opprettholder også voksne stamceller og kan brukes til å studere tannregenerering34. Tannforskere fokuserer vanligvis på de nedre snittene fordi de er mer tilgjengelige og lettere kan dissekeres enn de øvre snittene. Forskjeller mellom mandibulære og maksillære snittceller gjenstår å bli bestemt.

4. Fjerning av periodontale vev for å eksponere snittepitelial cervikal sløyfe

  1. Med hele fortennen liggende på sin linguale side og mens du holder tannen på plass med et par taggete tang, bruk et par # 5 fine tang for å begynne å stikke på periodontale vev som dekker den apikale snittet og cervical loop regionen.
  2. Fjern forsiktig periodontalt vev fra den apikale knoppen, slik at den laterale siden av livmorhalssløyfen (eller andre interesseområder) blir synlig under omfanget.
    MERK: Forsiktighet bør utvises for å unngå å skade tannepitelet eller løsne det fra mesenkymet. Hvis fortennen har fluorescenssignaler i interesseområdet, og et fluorescerende disseksjonsmikroskop er tilgjengelig, kan fluorescenssignaler brukes til å skille mellom vevstyper og hjelpe disseksjoner. Det er viktig å gjennomføre §§ 2-4 effektivt, slik at prøver raskt kan overføres til kulturmediet og vedlikeholdes tilstrekkelig gjennom eksplantdyrking (se nedenfor).

5. Vev embedding for explant kultur

  1. Tilsett 500 μL varm, ustivnet kulturgel til en brønn i en 24-brønnsplate og overfør raskt dissekerte hele snittene til brønnen. Virvle platen et par ganger for å skylle fortennene.
  2. Tilsett 400 μL varm, ustørknet kulturgel i en kulturskål og overfør de skyllede fortennene til retten.
    MERK: Vi bruker en kommersielt tilgjengelig kulturrett som er kompatibel med perfusjonsoppsettet. Se trinn 6.4 for alternative alternativer.
  3. Orienter snittet for å plassere cervikal sløyfeområdet (eller andre regioner av interesse) i midten av parabolen (figur 2A, B) og juster hellingen på det apikale snittet for ønsket bildeplan.
    MERK: Vevsorientering bør gjøres raskt før fullstendig gelering.
  4. Etter at gelen er satt, bruk et par fine tang for å fjerne gel på toppen av interesseområdet, slik at det ikke dekkes av gel.
  5. Tilsett et tilstrekkelig volum varmt kulturmedium ved å pipettere det sakte mot kanten av fatet for å bare dekke prøven (~150 μL).
  6. Flytt eksplantkulturen til en cellekulturinkubator på 37 °C for å tillate sedimentering av vev og justering av kulturbetingelsen i 1 time.

6. Timelapse-mikroskopi av fortenneksplanter

MERK: I dette eksperimentet brukte vi et oppreist mikroskop utstyrt med et 25x vanndyppemål som har en numerisk blenderåpning på 1. Generelt er en vanndyppelinse med høy numerisk blenderåpning best egnet for dypvevsavbildning.

  1. Slå på mikroskopet og to-foton laseren.
  2. Fest kulturfatet til sceneadapteren og monter perfusjonsadapterringen på toppen (figur 2C).
  3. Koble sceneadapteren til en temperaturregulator som er innstilt for å opprettholde kulturen ved 37 °C.
  4. Koble innløpet og utløpet til adapterringen til en mikroperfusjonspumpe og begynn perfusjonen av kulturmediet, med perfusjonshastigheten satt til 20 på pumpen. Dette genererer en langsom strømning (~ 5 ml / h) av kulturmediet over toppen av prøvene (figur 2C).
    MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer om systemet for å opprettholde vevet i et stabilt kontrollert miljø. Andre systemer kan også brukes. En kombinasjon av en 37 °C varmeplate og en hjemmelaget perfusjonsdyrkningsskål (tilleggsfigur S1) med inntak og utløp koblet til sprøytepumper kan også brukes.
  5. Plasser en atmosfærisk kontrollbarrierering (ACBR) på toppen av adapterringen og senk målet gjennom ACBR for bare å komme i kontakt med kulturmediet (figur 2D).
  6. Still inn laserbølgelengden til 920 nm for å visualisere både GFP- og rødfluorescenssignaler (f.eks. tdTomato).
  7. Finn prøver gjennom okularer og deretter på mikroskopets programvare.
  8. Sett opp Z-stabler, flerposisjonsbilder og tidsintervaller ved hjelp av programvaren. For å følge denne protokollen, bruk en z-trinnstørrelse på 4 μm og et tidsintervall på 5 minutter i 14 timer.
    MERK: Vi fant at et tidsintervall på lengre enn 5 min ofte er utilstrekkelig til å fange jevne cellebevegelser og divisjoner.
  9. Start timelapse-avbildningen.
    MERK: Prøveposisjonen kan endres i løpet av den første timen, og ytterligere justeringer kan være nødvendig.
  10. Lagre filer for nedstrøms databehandling og analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den apikale regionen av den voksne musefortennen er innkapslet i mandibelen (figur 1) og er derfor ikke direkte tilgjengelig for å visualisere og live-spore stamcellene som bor i vekstregionen. Derfor har vi utviklet en metode for å trekke ut hele fortennen fra kjevebenet og vedlikeholde den i et eksplantdyrkningssystem for to-foton timelapsemikroskopi (figur 2). Her beskriver vi representative resultater som fanger den dynamiske prosessen med celleproliferasjon og bevegelse i labial cervikal sløyferegion i tannepitelet.

For å demonstrere de eksperimentelle prosedyrene har vi brukt to forskjellige musemodeller som uttrykker grønn fluorescens i tannepitelet. Den første muselinjen er K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP, hvor K14Cre (MGI:2680713) uttrykker Cre-rekombinasen fra en Keratin 14-promotor35 og aktiverer ekspresjonen av den omvendte tetracyklinkontrollerte transaktivatoren i epitelet fra R26rtTA-allelet 36 (MGI:3584524). Ved administrering av doksysyklin induserer rtTA histon H2B-GFP-uttrykk fra tetO-H2B-GFP-allelet 37 (MGI:3043783) og merker epitelcellekjerner med grønn fluorescens. Dette er spesielt nyttig for cellesporing og for å oppdage celledelinger. I dette eksperimentet matet vi dyr med doksycyklinmat i 24 timer før ofring for å aktivere H2B-GFP-uttrykk. Den andre muselinjen er K14Cre; R26mT/mG, der R26mT/mG (MGI:3803814) er en Cre-reporter38. I fravær av Cre-aktivitet uttrykker celler membranlokalisert tdTomato (mT) med rød fluorescens. Ved Cre-mediert rekombinasjon uttrykker celler membran GFP (mG). K14Cre; R26mT/mG merker dermed epitelcellemembraner med grønn fluorescens, slik at ikke-epitelceller blir røde. Dette tillater enkel visualisering av celleformer, divisjoner og bevegelser.

Vi begynte prosedyren med å dissekere mandiblene (figur 3A) og fjernet deretter systematisk alle beinene rundt fortennen (figur 3B-G). Dette ga hele fortenner med uskadet epitel (figur 3H). Vi bekreftet intaktheten til tannepitelet ved å inspisere den grønne fluorescensen i K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP og K14Cre; R26mT/mG-mus (figur 4A,B,E,F). På dette stadiet dekker de ugjennomsiktige periodontale vevene fortsatt det apikale fortennet, og cervikalsløyfen virker dermed uklar på grunn av lysspredning, noe som på samme måte ville hindre nedstrøms timelapse-avbildning (figur 4C,G). Vi fjernet derfor periodontale vev forsiktig, slik at tannepitelet med cervikalsløyfen kunne skjelnes i hvert fortenner (figur 4D,H).

Fortennene ble deretter innebygd i agarose med lavt smeltepunkt og dyrket i et perfusjonsoppsett for to-foton levende avbildning som vist i figur 2. For denne øvelsen har vi fokusert på cervikalsløyfeområdet i tannepitelet og tatt z-stack-bilder med 4 μm intervaller hvert 5. minutt over en varighet på 14 timer (figur 5A). Spesielt ble H2B-GFP-signaler hovedsakelig observert i transittforsterkende regionen av livmorhalssløyfen, hvor det er aktive celledelinger (figur 5B). Dette er sannsynligvis fordi det er høyere H2B-GFP-utveksling ved åpne kromatiner og inkorporering i nukleosomer etter DNA-replikasjoner i disse aktive cellene39.

Vi undersøkte deretter timelapse-bildene ved hjelp av ImageJ, og basert på separasjonen av H2B-GFP-signalene40, kunne vi observere mange celledelinger gjennom avbildningsperioden (Supplemental Video S1 og Supplemental Video S2). Dette indikerte at vevene ble tilstrekkelig opprettholdt i eksplantkulturen og cellene var aktive. Spesielt var vi i stand til å observere kondensering og justering av kromosomer ved metafaseplaten i mitotiske celler, etterfulgt av deres segregering i to datterceller under anafase (figur 5C-N, manuelt sporet ved hjelp av ImageJ-plugin TrackMate). De fleste av disse inndelingene var vinkelrette eller i skrå vinkel i forhold til kjellermembranen (figur 5C-K og tilleggsvideo S1). Horisontale inndelinger parallelt med kjellermembranen kunne også påvises, men forekommer sjeldnere (figur 5L-N og supplerende video S2). Det er viktig å påpeke at cytokinesis i tannepitelet ofte skjer raskt, innen 5-10 min. Som et resultat kan timelapseintervaller på mer enn 5 min gå glipp av noen av disse divisjonene.

Celledelingshendelser var også tydelige i K14Cre; R26mT/mG cervikale sløyfer, der alle epitelcellemembraner var merket grønne (figur 6A). Vi kunne identifisere mitotiske celler ved deres celleavrunding og deretter cytokinese (Supplemental Video S3), og både vertikale og horisontale celledelinger var observerbare (figur 6B-G), og dermed lik resultatene oppnådd ved bruk av H2B-GFP. Sammen viser disse resultatene at denne protokollen kan tjene som et kraftig verktøy for å undersøke celleadferd i snitteksplantene når den kombineres med musegenetiske modeller som fluorescerende merker forskjellige subcellulære strukturer.

Figure 1
Figur 1: Skjema over musekjeven og fortennen cervikal løkke. (A) En betydelig del av fortennen er innebygd i kjevebenet. Vekstregionen ligger i den apikale enden av tannen og støtter dens kontinuerlige vekst (mørkegrønn pil). (B) En utvidelse av det apikale snittet, som er omgitt av periodontale vev. Tannen består av emalje og dentin, som er svært mineraliserte strukturer dannet av henholdsvis ameloblaster og odontoblaster. (C) Et sagittalt snitt av det apikale fortennen som viser at stamceller fra tannepitel og transittforsterkende celler befinner seg i den labiale cervikale sløyfen og gir opphav til ameloblaster i det mer distale epitelet (mørkegrønn stiplet pil). Sammenlignet med labial cervikal sløyfe er den linguale cervikale sløyfen mindre i størrelse og danner normalt ikke ameloblaster. Dental mesenkymale stamceller er tilstede i tannpulpa (lilla regionen) og gir opphav til odontoblaster. Forkortelser: En = emalje; De = dentin; Am = ameloblast; Od = odontoblast; TACs = transittforsterkende celler; laCL = labial cervikal sløyfe; liCL = lingual cervical loop. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Vedlikeholde musesnitt explant for live imaging. (A) Skjemaer som viser viktige trinn i protokollen, fra å dissekere fortennen til å legge inn vevet i agarose med lavt smeltepunkt for levende avbildning. Et perfusjonsoppsett brukes til å gi en konstant tilførsel av næringsstoffer under avbildning, og kulturen opprettholdes ved 37 ° C. (B-D) En trinnvis demonstrasjon av innstilling av kulturskålen og perfusjonskammeret for levende bildebehandling. Medieinntaket og utløpet vises som henholdsvis rosa og gule piler. Forkortelse: ACBR = Atmospheric Control Barrier Ring. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Isolering av hele musesnittet. (A) Intakt kjeve. (VG Nett) Bein ble gradvis fjernet for å eksponere hele fortennen. Røde stiplede linjer i B og C viser det eksponerte bløtvevet i det apikale fortennen etter barbering av membranbenet som ligger over de linguale og bukkale sidene av snittkontakten (trinn 3.3-3.5 i protokollen). (VG Nett) Blå pilspisser representerer kondyler, jeksler og alveolære bein som er fjernet for å isolere hele tannen (trinn 3.6 i protokollen). Skalastang = 2 mm (H). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4 Fjerning av periodontale vev for levende bildediagnostikk. (A-H) Representative prøver fra (A-D) K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP, og (E-H) K14Cre; R26mT/mG-musble brukt i vår demonstrasjon av protokollen. Før disseksjon var GFP-ekspresjon i tannepitelet synlig gjennom benet (A,E, gule pilspisser). Hvite stiplede linjer skisserer de udissekerte fortennene. E' viser den språklige siden. I isolerte fortenner (B,C,F,G) ble GFP-fluorescens initialt diffrakert av periodontale vev som dekket de apikale fortennene (hvite og røde pilspisser). Rød fluorescens i F og G merker ikke-epitelceller. Fjerning av periodontale vev gir en klar og uhindret utsikt over de grønne fluorescerende cervikale løkkene (D, H, grønne pilspisser). Skalastang = 2 mm (A,E); 1,25 mm (B,F); og 300 μm (C,D,G,H). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Timelapse-mikroskopi av K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP cervikal sløyfe. (A) Et skjema som illustrerer timelapse-oppsettet. (B) Et representativt z-plan for K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP incisor labial cervical loop, som viser kjernefysisk merking av H2B-GFP primært i transittforsterkende regionen, hvor celler aktivt deler seg. Den gule boksen representerer det generelle området for de forstørrede bildene som vises nedenfor. (VG Nett) Timelapse-bilder som viser vertikale og skrå celledelinger i forhold til BM. (L-N) Timelapse-bilder viser et eksempel på horisontal celledeling i forhold til BM. (D,G,J,M) Celler i metafase eller anafase vises i midtpanelene. Skjemaer for hver sporet divisjon vises til høyre. Skala bar i N = 36 μm (B); 5 μm (C-N). Forkortelse: BM = kjellermembran. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Timelapse-mikroskopi av K14Cre; R26mT/mG cervikal sløyfe. (A) Et representativt z-plan for K14Cre; R26mT/mG fortenner labial cervikal sløyfe. Alle epitelceller uttrykker membran GFP. Den gule boksen representerer området for cellesporing som vises i forstørrelsene. (VG Nett) Timelapse-bilder som fanger både (B-D) horisontale og (E-G) vertikale celledelinger, i forhold til BM. (C,F) Midtpaneler viser mitotisk celleavrunding. Skjemaer for hver sporet divisjon vises til høyre. Skala bar = 35 μm (A); 5 μm (B-G). Forkortelse: BM = kjellermembran. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur S1: Hjemmelaget perfusjonsfat. (A) En 35 mm kulturskål kan brukes til å lage en perfusjonsskål. En glassbunnskål kan brukes hvis avbildning utføres ved hjelp av et omvendt mikroskop. (B) Varm en spiker med en flamme. (C) To åpninger (hvite pilspisser) er opprettet på hver side av fatet ved hjelp av den oppvarmede neglen. (D) Fest to butte 16 G nåler, en som medieinnløp og den andre som medieuttak, gjennom åpningene ved hjelp av epoksylim. Hvis gassperfusjon er ønskelig, kan en tredje åpning/nål tilsettes fatet. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsvideo S1: Live avbildning av en K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP incisor labial cervical loop, som viser vertikale og skrå celledelinger. Celler spores manuelt, og forskjellige fargede prikker representerer forskjellige par mor/datter-celler. Skalastang = 30 μm (venstre ramme); 7 μm (høyre ramme). Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Supplerende Video S2: Live imaging av en K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP incisor labial cervical loop, som viser et eksempel på horisontal celledeling. Den horisontale delingen finner sted ved 10 s-merket og spores manuelt ved hjelp av blå prikker. Skalastang = 30 μm (venstre ramme); 7 μm (høyre ramme). Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Supplerende Video S3: Live avbildning av en K14Cre; R26mT/mG incisor labial cervical loop, som viser både vertikale og horisontale celledelinger. Celler spores manuelt, og sirkler med forskjellige farger representerer forskjellige par med mor/datter-celler. Skalastang = 30 μm (venstre ramme); 7 μm (høyre ramme). Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Levende vevsavbildning er en viktig teknikk som gjør at vi kan studere cellens dynamiske prosesser og atferd når de opprettholdes i sitt nisjemiljø41. Ideelt sett utføres live imaging in vivo med høy spatiotemporal oppløsning. Imidlertid kan in vivo-avbildning for pattedyrs organer være utfordrende på grunn av vevsutilgjengelighet, optisk ugjennomsiktighet og vanskeligheter med å immobilisere dyret eller organet i en lengre periode42. Vevseksplanter omgår noen av disse utfordringene og har blitt vellykket vedtatt i en rekke studier for å spore celleadferd, for eksempel under tannmorfogenese og utvikling av ektodermale organer26. Her demonstrerte vi en relativt enkel, men robust protokoll for å utføre levende dypvevsavbildning på kultiverte hele voksne musefortenner. Anvendelse av denne teknikken vil hjelpe oss å forstå reguleringen av cellebevegelser, skjebnebeslutninger og vevsorganisasjoner under tannregenerering.

Fordi celledelinger er lett observerbare hendelser og karakteristiske for regenererende vev, har vi fokusert på å spore delende celler i denne studien for å markere en bruk av protokollen. Vi fant at forløpsepitelprogenitorer kan gjennomgå både vertikale og horisontale divisjoner, og dermed ligner på andre epitelvev43. Å belyse mekanismen som regulerer divisjonsvinkler og undersøke hvilken rolle delingsorienteringer spiller i celleskjebnebeslutninger, vil være av betydning i fremtidige studier. Kombinere levende bildebehandling med forskjellige musegenetiske modeller som også bærer fluorescerende celleskjebnemarkører, signalveireportere eller Fucci-cellesyklusreporteren44,45, vil bidra til å avdekke hvordan celledelingsmønstre og cellesyklusdynamikk bidrar til regulering av epitelial homeostase og regenerering.

En nødvendig praksis i denne protokollen er å utføre tanndisseksjon på en rask og forsiktig måte, noe som muliggjør rask overgang til og bevaring av det intakte vevet under passende dyrkingsforhold. Vi har funnet ut at for levende bildebehandling, dissekerer vev i varme medier, i stedet for kalde medier, som i eksperimenter som tar sikte på å trekke ut proteiner og mRNA46, opprettholder celler i en fungerende tilstand. Fordi fortennen er et relativt stort organ for dyrking, er en jevn tilførsel av næringsstoffer via medieperfusjon også kritisk for opprettholdelsen av vevet gjennom avbildning47. Hvis stamcellene er tilstede i interesseområdet, er observasjon av hyppige celledelinger en god indikator på at vevet er sunt og aktivt. Derimot bør celledød være sjelden, og dette kan verifiseres ved å oppdage lyse og kondenserte kjernelegemer under avbildning hvis en nukleær markør brukes eller ved å utføre TUNEL-farging etter avbildning og vevsfiksering48. I tillegg til næringsstoffer kan oksygennivået også påvirke eksplantens levedyktighet, da enten oksygenspenning eller mangel kan forstyrre celleoverlevelse, spredning og differensiering 49,50,51. Etter vår erfaring har vi ikke observert tilsynelatende forskjeller i celleproliferasjon og celledød når prøver ble gitt med eller uten ekstra oksygen (f.eks. 95% O2 / 5% CO2 karbogen eller 5% CO2 / 21% O2 / balansert N2) under avbildning, noe som tyder på at enten spormengde oksygen i systemet er tilstrekkelig til å opprettholde snittepitel i kultur over natten eller vevet kan benytte alternative veier for å opprettholde normale cellefunksjoner52. Imidlertid bør kravet til oksygen i andre cellulære prosesser eller korrekt genuttrykk bestemmes nærmere i fremtidige studier.

I vår demonstrasjon av protokollen har vi brukt genetisk kodet H2B-GFP og membran GFP for å merke henholdsvis cellekjerner og konturer. Disse fluorescerende markørene er lyse og langvarige under to-foton mikroskopi og er dermed eksempler på ideelle etiketter som skal brukes til å spore cellebevegelser og divisjoner. I teorien kan fluorescerende vitale fargestoffer også brukes til å merke forskjellige subcellulære rom for ex vivo live imaging53, men redusert penetrasjon av fargestoffene i dypere epitelceller begrenser sannsynligvis deres bruk. På samme måte, mens standard konfokalmikroskopi er i stand til høyoppløselig levende bildebehandling på en dybde under 100 μm, gir to-foton mikroskopi økt bildedybde med redusert fotobleking og fototoksisitet54. Vi har derfor valgt to-foton mikroskopi som avbildningsmodalitet i de fleste av våre live bildeapplikasjoner.

En potensiell begrensning av denne protokollen er at fortennene ikke fullt ut rekapitulerer in vivo-miljøet og biologien. Data representerer derfor cellenes oppførsel under dyrkningsbetingelsen og bør tolkes tilsvarende, samt valideres ved hjelp av andre metoder, for eksempel histologi, når det er aktuelt. Vi måtte også delvis fjerne periodontale vev for å få tilgang til cervikalsløyfen for avbildning. Signalinteraksjoner mellom periodontale vev og tannepitelet kan dermed forstyrres. Til slutt, mens medieperfusjon forbedrer levedyktigheten til dyrkede vev, kan det introdusere væskeskjærspenning som fungerer som et ektopisk mekanisk signal og påvirker resultatene55,56. Vi har ikke bestemt virkningen av forskjellige strømningshastigheter i oppsettet vårt. Men fordi en lav strømningshastighet på 1-5 ml / t vanligvis er tilstrekkelig for å opprettholde næringstilførsel57, kan effekten av skjærspenning minimeres. Med disse begrensningene i tankene, fungerer ex vivo live imaging som en kraftig plattform for å studere endringer i celleadferd når de riktige kontrollene er inkludert i eksperimenter.

Den kontinuerlig voksende musesnittet er et svært håndterbart modellsystem for å studere stamcellebasert vevfornyelse og skadereparasjon. Protokollen beskrevet her gir etterforskere midler til å opprettholde hele voksne fortenner i kultur og trekke ut spatiotemporal informasjon om celleadferd gjennom timelapse-mikroskopi. Vi forventer at denne teknikken skal være bredt anvendelig for å studere forskjellige musegenetiske modeller som brukes i tannforskning og for å bidra til å fremme vår kunnskap innen tannregenerering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.

Acknowledgments

Vi anerkjenner UCLA Advanced Light Microscopy / Spectroscopy Laboratory og Leica Microsystems Center of Excellence ved California NanoSystems Institute (RRID: SCR_022789) for å gi to-foton mikroskopi. AS ble støttet av ISF 604-21 fra Israel Science Foundation. JH ble støttet av R03DE030205 og R01DE030471 fra NIH/NIDCR. AS og JH ble også støttet av tilskudd 2021007 fra USA-Israel Binational Science Foundation (BSF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well, flat bottom tissue culture plate Olympus plastics 25-107
25x HC IRAPO motCORR water dipping objective Leica 11507704
Ascorbic acid (Vitamin C) Acros Organics 352685000
D-(+)-Glucose bioxtra  Sigma Aldrich G7528
Delta T system  Bioptechs 0420-4 Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup
Dissection microscope- LEICA S9E Leica LED300 SLI
DMEM/F12 Thermo Scientific 11039047 Basal media without phenol red
Feather surgical blade (#15) Feather 72044-15
Fine forceps F.S.T 11252-23
Glutamax  Thermo Scientific 35050-061 Glutamine substitute
Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective  Leica n/a
low-melting agarose NuSieve 50080
non-essential amino acids (100x) Thermo Scientific 11140-050
penicillin–streptomycin Thermo Scientific 15140122 10,000 U/mL 
Petri dish Gen Clone 32-107G 90 mm 
Rat serum Valley Biomedical AS3061SC Processed for live imaging
Razor blade #9 VWR 55411-050
Scalpel handle F.S.T 10003-12
Scissors F.S.T 37133
serrated forceps F.S.T 11000-13
spring scissors F.S.T 91500-09

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
  2. Jing, J., et al. Rodent incisor as a model to study mesenchymal stem cells in tissue homeostasis and repair. Frontiers in Dental Medicine. 3, 1068494 (2022).
  3. Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and Fgf signaling. Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
  4. Warshawsky, H., Smith, C. E. Morphological classification of rat incisor ameloblasts. The Anatomical Record. 179 (4), 423-445 (1974).
  5. Lekic, P., McCulloch, C. A. Periodontal ligament cell population: the central role of fibroblasts in creating a unique tissue. The Anatomical Record. 245 (2), 327-341 (1996).
  6. Takahashi, A., et al. Autocrine regulation of mesenchymal progenitor cell fates orchestrates tooth eruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (2), 575-580 (2019).
  7. Ness, A. R. Eruption rates of impeded and unimpeded mandibular incisors of the adult laboratory mouse. Archives of Oral Biology. 10 (3), 439-451 (1965).
  8. Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
  9. Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), Cambridge, England. 3753-3761 (2010).
  10. Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
  11. Biehs, B., et al. BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nature Cell Biology. 15, 846-852 (2013).
  12. Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
  13. Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
  14. Li, L., Clevers, H. Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals. Science. 327 (5965), 542-545 (2010).
  15. Sharir, A., et al. A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage. Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).
  16. Hu, J. K. -H., et al. An FAK-YAP-mTOR signaling axis regulates stem cell-based tissue renewal in mice. Cell Stem Cell. 21 (1), 91-106 (2017).
  17. Yu, F., Li, F., Zheng, L., Ye, L. Epigenetic controls of Sonic hedgehog guarantee fidelity of epithelial adult stem cells trajectory in regeneration. Science Advances. 8 (29), (2022).
  18. An, Z., et al. A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors. Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).
  19. Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
  20. Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development. 147 (2), (2020).
  21. Krivanek, J., Buchtova, M., Fried, K., Adameyko, I. Plasticity of dental cell types in development, regeneration, and evolution. Journal of Dental Research. 102 (6), 589-598 (2023).
  22. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  23. Cetera, M., Leybova, L., Joyce, B., Devenport, D. Counter-rotational cell flows drive morphological and cell fate asymmetries in mammalian hair follicles. Nature Cell Biology. 20 (5), 541-552 (2018).
  24. Held, M., Santeramo, I., Wilm, B., Murray, P., Lévy, R. Ex vivo live cell tracking in kidney organoids using light sheet fluorescence microscopy. PLoS ONE. 13 (7), 0199918 (2018).
  25. Mesa, K. R., et al. Homeostatic epidermal stem cell self-renewal is driven by local differentiation. Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).
  26. Mogollón, I., Ahtiainen, L. Live tissue imaging sheds light on cell level events during ectodermal organ development. Frontiers in Physiology. 11, 818 (2020).
  27. Prochazka, J., et al. Migration of founder epithelial cells drives proper molar tooth positioning and morphogenesis. Developmental Cell. 35 (6), 713-724 (2015).
  28. Morita, R., et al. Coordination of cellular dynamics contributes to tooth epithelium deformations. PLOS ONE. 11 (9), 0161336 (2016).
  29. Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
  30. Panousopoulou, E., Green, J. B. A. Invagination of ectodermal placodes is driven by cell intercalation-mediated contraction of the suprabasal tissue canopy. PLoS biology. 14 (3), 1002405 (2016).
  31. Mogollón, I., Moustakas-Verho, J. E., Niittykoski, M., Ahtiainen, L. The initiation knot is a signaling center required for molar tooth development. Development. 148 (9), (2021).
  32. Kim, R., et al. Early perturbation of Wnt signaling reveals patterning and invagination-evagination control points in molar tooth development. Development. 148 (14), 199685 (2021).
  33. Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments JoVE. (90), e51969 (2014).
  34. Katsuragi, Y., et al. Bcl11b transcription factor plays a role in the maintenance of the ameloblast-progenitors in mouse adult maxillary incisors. Mechanisms of Development. 130 (9-10), 482-492 (2013).
  35. Dassule, H. R., Lewis, P., Bei, M., Maas, R., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127 (22), 4775-4785 (2000).
  36. Belteki, G., et al. Conditional and inducible transgene expression in mice through the combinatorial use of Cre-mediated recombination and tetracycline induction. Nucleic Acids Research. 33 (5), 51 (2005).
  37. Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
  38. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  39. Kimura, H., Cook, P. R. Kinetics of core histones in living human cells. The Journal of Cell Biology. 153 (7), 1341-1354 (2001).
  40. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology: CB. 8 (7), 377-385 (1998).
  41. Huang, Q., et al. The frontier of live tissue imaging across space and time. Cell Stem Cell. 28 (4), 603-622 (2021).
  42. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).
  43. Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
  44. Li, S., et al. Overview of the reporter genes and reporter mouse models. Animal Models and Experimental. 1 (1), 29-35 (2018).
  45. Mort, R. L., et al. Fucci2a: a bicistronic cell cycle reporter that allows Cre mediated tissue specific expression in mice. Cell Cycle. 13 (17), 2681-2696 (2014).
  46. Krivanek, J., et al. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nature Communications. 11 (1), 4816 (2020).
  47. Dailey, M. E., Marrs, G. S., Kurpius, D. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harbor protocols. 2011 (4), (2011).
  48. Gorczyca, W., Bruno, S., Darzynkiewicz, R., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. DNA strand breaks occurring during apoptosis - their early insitu detection by the terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays and prevention by serine protease inhibitors. International Journal of Oncology. 1 (6), 639-648 (1992).
  49. Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
  50. Wale, P. L., Gardner, D. K. Time-lapse analysis of mouse embryo development in oxygen gradients. Reproductive Biomedicine Online. 21 (3), 402-410 (2010).
  51. Tse, H. M., Gardner, G., Dominguez-Bendala, J., Fraker, C. A. The importance of proper oxygenation in 3D culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 634403 (2021).
  52. Spinelli, J. B., et al. Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain. Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).
  53. Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex-vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current Protocols in Cytometry. , CHAPTER, Unit9.39 (2012).
  54. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
  55. McCoy, R. J., O'Brien, F. J. Influence of shear stress in perfusion bioreactor cultures for the development of three-dimensional bone tissue constructs: a review. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (6), 587-601 (2010).
  56. Chen, K. D., et al. Mechanotransduction in response to shear stress. Roles of receptor tyrosine kinases, integrins, and Shc. The Journal of Biological Chemistry. 274 (26), 18393-18400 (1999).
  57. Seddiqi, H., et al. Inlet flow rate of perfusion bioreactors affects fluid flow dynamics, but not oxygen concentration in 3D-printed scaffolds for bone tissue engineering: Computational analysis and experimental validation. Computers in Biology and Medicine. 124, 103826 (2020).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 200 cellebevegelser fornyelse av tenner på mus musefortenner epitelstamceller mesenkymale stamceller tannregenerering vevshomeostase cellulære interaksjoner eksplantekultursystem multifoton timelapsemikroskopi spatiotemporal informasjon celleatferd levende vev tannforskning dynamiske cellulære prosesser
Bruke <em>Ex Vivo</em> Live Imaging for å undersøke celledelinger og bevegelser under fornyelse av musetenner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sundari Thooyamani, A., Shahin, E.,… More

Sundari Thooyamani, A., Shahin, E., Takano, S., Sharir, A., Hu, J. K. Using Ex Vivo Live Imaging to Investigate Cell Divisions and Movements During Mouse Dental Renewal. J. Vis. Exp. (200), e66020, doi:10.3791/66020 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter