Brug af ex vivo live imaging til at undersøge celledelinger og bevægelser under tandfornyelse hos mus

Summary

Ex vivo levende billeddannelse er en kraftfuld teknik til at studere de dynamiske processer i cellulære bevægelser og interaktioner i levende væv. Her præsenterer vi en protokol, der implementerer to-fotonmikroskopi for at live spore tandepitelceller i dyrkede hele voksne musefortænder.

Abstract

Den konstant voksende musefortænder fremstår som et meget håndterbart modelsystem til at undersøge reguleringen af voksne epitel- og mesenkymale stamceller og tandregenerering. Disse stamceller populationer deler sig aktivt, bevæger sig og differentierer for at opretholde vævshomeostase og regenerere tabte celler på en lydhør måde. Imidlertid kunne traditionelle analyser ved hjælp af faste vævssektioner ikke fange de dynamiske processer i cellulære bevægelser og interaktioner, hvilket begrænsede vores evne til at studere deres regulering. Dette papir beskriver en protokol til opretholdelse af hele musefortænder i et explantkultursystem og live-track dental epitelceller ved hjælp af multiphoton timelapse mikroskopi. Denne teknik føjer sig til vores eksisterende værktøjskasse til tandforskning og giver efterforskere mulighed for at erhverve rumlig tidsmæssig information om celleadfærd og organisationer i et levende væv. Vi forventer, at denne metode vil hjælpe forskere med yderligere at udforske mekanismer, der styrer de dynamiske cellulære processer, der finder sted under både tandfornyelse og regenerering.

Introduction

I løbet af de sidste to årtier har musens fortænder vist sig som en uvurderlig platform til at undersøge principperne for regulering af voksne stamceller og tandregenerering ^1,2. Musens fortænder vokser kontinuerligt og fornyer sig gennem dyrets liv. Det gør den ved at opretholde både epitel- og mesenkymale stamceller, som kan forny sig selv og differentiere sig til forskellige celletyper i tanden ^1,2. Mens dental epitelstamceller giver anledning til ameloblaster, som udskiller emaljematrixen, giver dental mesenkymale stamceller anledning til odontoblaster, cementoblaster og fibroblaster, som danner henholdsvis^dentin, cementum og periodontalt ledbånd 3,4,5,6. Denne konstante forsyning af nye celler opretholder vævshomeostase og tillader udskiftning af gamle celler, der går tabt på grund af tyggeslitage eller skader ^7,8. Belysning af de cellulære og molekylære mekanismer, der regulerer vedligeholdelse og differentiering af dentale stamceller, er derfor centralt for at forstå dental regenerering, et område af stigende interesse.

Anatomisk er en stor del af den voksne musefortænder indkapslet i kæbebenet. Mens tandens snitkant er udsat, passer den apikale ende af fortænderne inden for en sokkel og er fastgjort til den omgivende knogle gennem periodontale ledbånd og bindevæv (figur 1A, B). Fortændernes apikale ende er også tandens vækstområde og opretholder tandstammen og stamceller i både epitellaget og mesenkymalmassen ^{9,10,11,12,13}. Specifikt opretholdes dental epitelstamceller i den pæreformede ende af epitelet, kendt som den apikale knopp, også kaldet labial cervikal loop (figur 1C). I lighed med tarmepitelet og epidermis understøttes epitelfornyelsen i fortænderne primært af aktivt cyklende stamceller og deres stærkt proliferative mellemliggende efterkommere, kaldet transitforstærkende celler 14,15,16,17, begge bosiddende i den indre del af livmoderhalssløjfen. Men om fortandepitelet indeholder og udnytter hvilende stamceller under regenerering, er det stadig ikke bestemt. I modsætning hertil er både aktive og hvilende dental mesenkymale stamceller blevet identificeret i den apikale pulp, og de hvilende stamceller fungerer som en reservepopulation, der aktiveres under skadereparation^13,18.

Mange af opdagelserne om biologien af musefortændernes fornyelse og regenerering er resultatet af histologiske undersøgelser, hvor prøver opnås på forskellige tidsmæssige tidspunkter, fikseres, behandles og derefter sektioneres i mikrontynde skiver langs et bestemt plan. Gennem detaljeret analyse af histologiske sektioner fra forskellige musemodeller, der muliggør afstamningssporing eller genetiske forstyrrelser, har forskere identificeret cellelinjer fra forskellige stampopulationer samt de genetiske og signalveje, der styrer fortænderhomeostase og skadereparation 19,20,21. Imidlertid kan de statiske todimensionelle (2D) billeder af ikke-vitale celler i sektioner ikke fange det fulde spektrum af cellulær adfærd og rumlige organisationer i levende væv, såsom celleformændringer, bevægelser og cellulær kinetik. Detektering og måling af disse hurtige cellulære ændringer, som forekommer på en tidsskala, der ikke kan løses gennem vævssektionering, kræver en anden strategi. Desuden er erhvervelse af sådanne oplysninger også afgørende for at forstå, hvordan tandceller interagerer med hinanden, reagerer på forskellige signalstimuli og selvorganiserer for at opretholde vævsstrukturer og funktioner.

Fremkomsten af firedimensionel (4D) dyb vævsbilleddannelse ved hjælp af to-fotonmikroskopi²², en teknologi, der integrerer tre rumlige dimensioner med tidsmæssig opløsning, overvinder de iboende begrænsninger ved histologisk analyse ved at muliggøre rumlig tidsmæssig undersøgelse af dyrkede vævseksplanter, organoider eller endda væv in situ 23,24,25,26 . For eksempel har 4D live imaging af det udviklende tandepitel afsløret de rumlige tidsmønstre af celledelinger og migrationer, der koordinerer vævsvækst, signalcenterdannelse og dental epitelmorfogenese 27,28,29,30,31,32 . I den voksne musefortænder er 4D-billeddannelse for nylig blevet tilpasset til at studere cellulær adfærd under reparation af tandepitelskader. Live billeddannelse afslørede, at stratum intermediumceller i suprabasallaget kan omdannes direkte til ameloblaster i basallaget for at regenerere det beskadigede epitel, hvilket udfordrer det traditionelle paradigme for reparation af epitelskader¹⁵.

Her beskriver vi dissektion, dyrkning og billeddannelse af den voksne musefortænder med fokus på epitelceller i labial cervikal loop (figur 1). Denne teknik bevarer tandcellevitalitet i mere end 12 timer og tillader live sporing af fluorescerende mærkede celler ved enkeltcelleopløsning. Denne fremgangsmåde tillader undersøgelse af cellebevægelse og migration samt dynamiske ændringer i celleform og delingsorientering under normale dyrkningsforhold eller som reaktion på genetiske, fysiske og kemiske forstyrrelser.

Protocol

Alle mus blev opretholdt i patogenfrie dyrefaciliteter ved University of California Los Angeles (UCLA) eller Hebrew University of Jerusalem (HUJI). Alle forsøg med mus blev udført i henhold til regler og protokoller godkendt af den respektive Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) eller (MD-23-17184-3; HUJI). En generel arbejdsgang for de eksperimentelle trin er vist i figur 2A. Se materialefortegnelsen for detaljer vedrørende alle instru…

Representative Results

Den apikale region af den voksne musefortænder er indkapslet i underkæben (figur 1) og dermed ikke direkte tilgængelig til visualisering og live-sporing af stamcellerne, der er bosiddende i vækstområdet. Derfor har vi udviklet en metode til at trække hele fortænderne ud af kæbeknoglen og vedligeholde den i et eksplantatkultursystem til to-foton timelapse-mikroskopi (figur 2). Her beskriver vi repræsentative resultater, der fanger den dynamiske proces me…

Discussion

Levende vævsbilleddannelse er en vigtig teknik, der giver os mulighed for at studere cellernes dynamiske processer og adfærd, når de opretholdes i deres nichemiljø⁴¹. Ideelt set udføres live imaging in vivo med høj rumlig tidsmæssig opløsning. Imidlertid kan in vivo-billeddannelse for pattedyrorganer være udfordrende på grund af vævets utilgængelighed, optisk uigennemsigtighed og vanskeligheder med at immobilisere dyret eller organet i en længere periode<sup class="x…

Materials

24 well, flat bottom tissue culture plate	Olympus plastics	25-107
25x HC IRAPO motCORR water dipping objective	Leica	11507704
Ascorbic acid (Vitamin C)	Acros Organics	352685000
D-(+)-Glucose bioxtra	Sigma Aldrich	G7528
Delta T system	Bioptechs	0420-4	Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup
Dissection microscope- LEICA S9E	Leica	LED300 SLI
DMEM/F12	Thermo Scientific	11039047	Basal media without phenol red
Feather surgical blade (#15)	Feather	72044-15
Fine forceps	F.S.T	11252-23
Glutamax	Thermo Scientific	35050-061	Glutamine substitute
Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective	Leica	n/a
low-melting agarose	NuSieve	50080
non-essential amino acids (100x)	Thermo Scientific	11140-050
penicillin–streptomycin	Thermo Scientific	15140122	10,000 U/mL
Petri dish	Gen Clone	32-107G	90 mm
Rat serum	Valley Biomedical	AS3061SC	Processed for live imaging
Razor blade #9	VWR	55411-050
Scalpel handle	F.S.T	10003-12
Scissors	F.S.T	37133
serrated forceps	F.S.T	11000-13
spring scissors	F.S.T	91500-09