Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Использование изображений ex vivo в реальном времени для исследования деления и движения клеток во время обновления зубов мыши

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/66020
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2, 1,3
1School of Dentistry, University of California Los Angeles, 2The Institute of Biomedical and Oral Research, Faculty of Dental Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 3Molecular Biology Institute, University of California Los Angeles
* These authors contributed equally

Summary

Визуализация ex vivo в реальном времени является мощным методом изучения динамических процессов клеточных движений и взаимодействий в живых тканях. Здесь мы представляем протокол, который реализует двухфотонную микроскопию для отслеживания эпителиальных клеток зубов в культивируемых цельных резцах взрослой мыши.

Abstract

Непрерывно растущий резец мыши становится модельной системой с высокой проходимостью для исследования регуляции взрослых эпителиальных и мезенхимальных стволовых клеток и регенерации зубов. Эти популяции-предшественники активно делятся, перемещаются и дифференцируются, поддерживая гомеостаз тканей и оперативно регенерируя утраченные клетки. Однако традиционные анализы с использованием фиксированных срезов тканей не могли охватить динамические процессы клеточных движений и взаимодействий, что ограничивало наши возможности по изучению их регуляции. В данной статье описывается протокол сохранения целых резцов мыши в системе культивирования эксплантов и отслеживания эпителиальных клеток зубов в реальном времени с помощью многофотонной таймлапс-микроскопии. Этот метод дополняет наш существующий инструментарий для стоматологических исследований и позволяет исследователям получать пространственно-временную информацию о поведении и организации клеток в живой ткани. Мы ожидаем, что эта методология поможет исследователям в дальнейшем изучении механизмов, контролирующих динамические клеточные процессы, происходящие как во время обновления зубов, так и во время регенерации.

Introduction

За последние два десятилетия резцы мыши стали бесценной платформой для исследования принципов регуляции взрослых стволовых клеток и регенерации зубов 1,2. Резец мыши постоянно растет и обновляется на протяжении всей жизни животного. Это достигается за счет поддержания как эпителиальных, так и мезенхимальных стволовых клеток, которые могут самообновляться и дифференцироваться в различные типы клеток зуба 1,2. В то время как зубные эпителиальные стволовые клетки дают начало амелобластам, которые секретируют эмалевый матрикс, зубные мезенхимальные стволовые клетки дают начало одонтобластам, цементобластам и фибробластам, которые образуют дентин, цемент и периодонтальную связку соответственно 3,4,5,6. Это постоянное поступление новых клеток поддерживает гомеостаз тканей и позволяет заменять старые клетки, которые теряются из-за жевательного износа или травм 7,8. Таким образом, выяснение клеточных и молекулярных механизмов, регулирующих поддержание и дифференцировку стоматологических стволовых клеток, занимает центральное место в понимании регенерации зубов, области, представляющей растущий интерес.

Анатомически большая часть резцов взрослой мыши заключена в челюстную кость. В то время как режущий край зуба обнажен, апикальный конец резца входит в лунку и прочно прикрепляется к окружающей кости через периодонтальные связки и соединительные ткани (рис. 1A, B). Апикальный конец резца также является областью роста зуба и поддерживает стволовые и прогениторные клетки зуба как в эпителиальном слое, так и в мезенхимальной пульпе 9,10,11,12,13. В частности, стволовые клетки зубного эпителия поддерживаются на луковичном конце эпителия, известном как апикальная почка, также называемая губной шейной петлей (рис. 1C). Подобно эпителию кишечника и эпидермису, обновление эпителия в резце в основном поддерживается активно циркулирующими стволовыми клетками и их высокопролиферативными промежуточными потомками, называемыми транзитно-амплифицирующими клетками14, 15, 16, 17, расположенными во внутренней части шейной петли. Тем не менее, содержит ли эпителий резца и использует ли он покоящиеся стволовые клетки во время регенерации, еще предстоит определить. Напротив, в апикальной пульпе были идентифицированы как активные, так и неподвижные зубные мезенхимальные стволовые клетки, а неподвижные стволовые клетки функционируют как резервная популяция, которая активируется во время восстановления травмы13,18.

Многие из открытий в области биологии обновления и регенерации резцов мышей являются результатом гистологических исследований, в ходе которых образцы получают в различных временных точках, фиксируют, обрабатывают, а затем разрезают на микронные тонкие срезы вдоль определенной плоскости. Благодаря детальному анализу гистологических срезов различных мышиных моделей, которые позволяют отслеживать родословную или генетические возмущения, ученые определили клеточные линии различных популяций предшественников, а также генетические и сигнальные пути, которые контролируют гомеостаз резцов и восстановление повреждений 19,20,21. Однако статические двумерные (2D) изображения невитальных клеток в разрезах не могут охватить весь спектр клеточного поведения и пространственных организаций в живой ткани, таких как изменения формы клеток, движения и клеточная кинетика. Обнаружение и измерение этих быстрых клеточных изменений, которые происходят в масштабе времени, неразрешимом с помощью срезов тканей, требуют другой стратегии. Более того, получение такой информации также имеет решающее значение для понимания того, как зубные клетки взаимодействуют друг с другом, реагируют на различные сигнальные стимулы и самоорганизуются для поддержания тканевых структур и функций.

Появление четырехмерной (4D) визуализации глубоких тканей с использованием двухфотонной микроскопии22, технологии, которая объединяет три пространственных измерения с временным разрешением, преодолевает ограничения, присущие гистологическому анализу, позволяя проводить пространственно-временное исследование культивируемых тканевых эксплантов, органоидов или даже тканей in situ 23,24,25,26 . Например, 4D-визуализация развивающегося эпителия зуба в реальном времени выявила пространственно-временные закономерности деления и миграции клеток, которые координируют рост тканей, формирование сигнального центра и морфогенез зубного эпителия 27,28,29,30,31,32. В резце взрослой мыши 4D-визуализация недавно была адаптирована для изучения клеточного поведения во время восстановления повреждений зубного эпителия. Визуализация в реальном времени показала, что промежуточные клетки слоя в надбазальном слое могут быть непосредственно преобразованы в амелобласты в базальном слое для регенерации поврежденного эпителия, что бросает вызов традиционной парадигме восстановления повреждений эпителия15.

Здесь мы опишем вскрытие, культивирование и визуализацию резца взрослой мыши, уделяя особое внимание эпителиальным клеткам в губной шейной петле (рис. 1). Этот метод сохраняет жизнеспособность зубных клеток в течение более 12 часов и позволяет отслеживать флуоресцентно меченные клетки в реальном времени с разрешением одной клетки. Этот подход позволяет исследовать движение и миграцию клеток, а также динамические изменения формы клеток и ориентации деления в нормальных условиях культивирования или в ответ на генетические, физические и химические возмущения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все мыши содержались в свободных от патогенов животных в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе (UCLA) или Еврейском университете в Иерусалиме (HUJI). Все эксперименты с участием мышей проводились в соответствии с правилами и протоколами, утвержденными соответствующим Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) (ARC-2019-013; Калифорнийский университет в Лос-Анджелесе) или (MD-23-17184-3; HUJI). Общий рабочий процесс экспериментальных этапов показан на рисунке 2A. См. Таблицу материалов для получения подробной информации, относящейся ко всем инструментам, реагентам и материалам, используемым в этом протоколе.

1. Приготовление растворов и гелей

  1. Среда для препарирования: Приготовьте свежий DMEM/F12 с 0,5% глюкозы и держите его теплым при температуре 37 °C до тех пор, пока он не понадобится на этапе 2.4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем DMEM/F12 без фенольного красителя для уменьшения автофлуоресценции во время визуализации в реальном времени.
  2. 1x питательная среда: Приготовьте свежую среду, используя 50% DMEM/F12, 50% крысиную сыворотку, 1x заменитель глютамина, 1x заменимые аминокислоты MEM, 1% глюкозы, 0,1 мг/мл L-аскорбиновой кислоты и 0,5% пенициллина-стрептомицина. Держите его в тепле при температуре 37 °C до тех пор, пока это не понадобится на шаге 5.5. Эта среда используется для культивирования эксплантов резцов во время визуализации в реальном времени.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сыворотка крыс должна быть высокого качества и специально подготовлена для культивирования целых тканей исследователями или из коммерческого источника. В частности, кровь должна быть центрифугирована (в течение 5 мин при 1200 × г при комнатной температуре) до того, как начнет формироваться свертывание. После центрифугирования образовавшийся фибриновый сгусток следует отжать и отбросить33.
  3. Культуральный гель: Целью геля является иммобилизация образцов во время визуализации и готовится в свежем виде.
    1. Приготовьте 2% гель в DMEM/F12, растворив 200 мг агарозы с низкой температурой плавления в 10 мл DMEM/F12 с помощью микроволновой печи. Храните 2% гель при температуре 37 °C.
    2. Сделайте 2x питательную среду (без DMEM/F12), смешав 50% крысиной сыворотки, 1x заменитель глютамина, 1x заменимые аминокислоты MEM, 1% глюкозы, 0,1 мг/мл L-аскорбиновой кислоты и 0,5% пенициллина-стрептомицина. Нагрейте питательную среду 2x (без DMEM/F12) до 37 °C.
    3. Приготовьте 1% гель для закваскивания, смешав равные объемы 2% геля и 2-кратной питательной среды (без DMEM/F12). Храните 1% гель для закваски при температуре 37 °C до тех пор, пока это не потребуется на шаге 5.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед смешиванием убедитесь, что все растворы теплые, чтобы избежать гелеобразования. Мы обнаружили, что 1% гель подходит для культивирования резцов взрослой мыши. Процентное содержание геля должно быть определено опытным путем, если необходимо культивировать другие ткани.

2. Извлечение жвалы взрослых мышей

  1. Усыпляйте мышей в желаемом возрасте, используя стандартные процедуры, одобренные IACUC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы используем асфиксиюСО2 с последующим вывихом шейки матки. Правила эвтаназии животных могут отличаться в разных регионах. Исследователи должны получить необходимое одобрение учреждения перед проведением экспериментов и обеспечить соблюдение местных правил ухода за животными.
  2. Продезинфицируйте мышь, используя 70% этанол.
  3. Обезглавьте мышь и извлеките левую и правую жвалы.
    1. Положите мышь на живот, затем используйте промышленную бритву #9 с одним лезвием, чтобы разрезать область шеи и отделить голову мыши от остальной части тела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если необходимо также собрать ткани из области глотки или шеи, обезглавливание не следует выполнять, и можно сразу перейти к шагу 2.3.2.
    2. Переверните мышь так, чтобы ее брюшная сторона была обращена вверх, а мандибулы были легко доступны.
    3. Зафиксируйте голову животного, осторожно удерживая ее между большим и указательным пальцами.
    4. Лезвием бритвы сделайте средний сагиттальный разрез, который разрезает кожу нижней челюсти от нижней губы к декольте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургическое лезвие #15 также может быть использовано для выполнения разреза и последующих рассечений (шаги 2.3.6-2.3.9).
    5. Когда разрез сделан, раздвиньте разрезанную кожу большим и указательным пальцами, чтобы обнажить мышцы и челюстную кость под ней.
    6. Используйте лезвие бритвы, чтобы разрезать жевательные мышцы на щечной стороне нижней челюсти, так что внешняя сторона левой и правой получелюстей теперь свободна от мышечных прикреплений.
    7. Разрежьте подъязычные мышцы вдоль внутренней стороны нижней челюсти, чтобы удалить там мышечные прикрепления.
    8. Сделайте еще один разрез на нижнечелюстном симфизе, который соединяет две гемимандибулы. После разрезания нижняя челюсть будет разделена на левую и правую половины.
    9. Вклините лезвие бритвы между мыщелком нижней челюсти и височно-нижнечелюстным суставом и осторожно отделите полумыщелк от остальной части головы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы сочли полезным одновременно осторожно потянуть за резец во время резки. Следует соблюдать осторожность, чтобы не сломать нижнюю челюсть и не повредить мягкие ткани внутри.
  4. Немедленно перенесите рассеченные нижние челюсти в чашку Петри с предварительно подогретой средой для диссекции (шаг 1.1) и удалите оставшиеся мышечные ткани с помощью хирургического лезвия #15.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хранение образцов в холодных средах замедляет активность клеток, что приводит к задержке или даже неудачному восстановлению определенных клеточных активностей, таких как пролиферация или движение клеток, во время визуализации в реальном времени.

3. Изоляция целых резцов мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Дальнейшая изоляция резца производится под диссекционным микроскопом с ярким полем.

  1. Визуально определите овальную область нижней челюсти, которая покрывает гнездо резца и содержит апикальную часть резца.
  2. Расположите нижнюю челюсть так, чтобы внутренняя (лингвальная) поверхность была обращена вверх.
  3. Удерживая нижнюю челюсть на месте с помощью пары зазубренных щипцов, создайте окно в овальной области, сбрив вышележащую мембранную кость хирургическим лезвием #15 в направлении от мыщелка к коренным зубам. При этом обнажаются мягкие ткани верхушечного резца на внутренней поверхности.
  4. Переверните нижнюю челюсть так, чтобы внешняя (щечная) поверхность была обращена вверх.
  5. Создайте окно в овальной области на внешней нижней челюсти, как описано в шаге 3.3, и кончиком скальпеля удалите все оставшиеся костные фрагменты по краю. Убедитесь, что апикальный конец зуба виден с обеих сторон.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте чрезмерного давления во время бритья костей, чтобы предотвратить повреждение подлежащих мягких тканей.
  6. Систематически вырезайте кости, окружающие резец, чтобы изолировать весь зуб.
    1. Сделайте чистый срез в плоскости, которая непосредственно примыкает к верхушечному резцу, чтобы сначала удалить мыщелковый отросток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не порезать резец.
    2. Сделайте второй разрез чуть кзади от 3-го моляра, но дорсально от резца, не повреждая зуб. При этом удаляется кость, которая включает в себя венечный отросток.
    3. Последовательно разрезают от кончика углового отростка по направлению к резцу, чтобы постепенно ступенчато удалить вентральную нижнюю челюсть.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эпителий зуба и связанные с ним ткани пародонта часто прилипают к кости и легко отрываются при одновременном разрезании большой части вентральной кости. Чтобы отделить кость от мягких тканей резца, можно вставить скальпель (или пару острых незазубренных щипцов) между двумя тканями на апикальном конце резца и осторожно сдвинуть инструмент вперед.
    4. Отрежьте альвеолярную кость с коренными зубами и все оставшиеся кости, которые все еще прикреплены к резцу.
    5. Теперь весь резец изолирован. Перенесите полностью рассеченный резец в чашку с чистой теплой средой для рассечения (шаг 1.1).
  7. Повторите шаги 3.2-3.6, чтобы при необходимости изолировать дополнительные резцы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Верхнечелюстные/верхние резцы мыши также содержат взрослые стволовые клетки и могут быть использованы для изучения регенерации зубов34. Исследователи в области стоматологии обычно сосредотачиваются на нижних резцах, потому что они более доступны и могут быть легко рассечены, чем верхние резцы. Различия между клетками-предшественниками нижнечелюстного и верхнечелюстного резцов еще предстоит определить.

4. Удаление тканей пародонта для обнажения эпителиальной шейной петли резцов

  1. Когда весь резец лежит на язычной стороне и удерживает зуб на месте с помощью пары зубчатых щипцов, используйте пару тонких щипцов #5, чтобы начать подворачивать ткани пародонта, покрывающие апикальный резец и область шейной петли.
  2. Осторожно отделите ткань пародонта от апикальной почки так, чтобы латеральная сторона шейной петли (или другие интересующие области) стала видна под эндоскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует соблюдать осторожность, чтобы не повредить эпителий зуба или не отделить его от мезенхимы. Если резец имеет флуоресцентные сигналы в интересующей области, и имеется флуоресцентный диссекционный микроскоп, флуоресцентные сигналы могут быть использованы для различения типов тканей и облегчения диссекции. Важно эффективно выполнять секции 2-4, чтобы образцы можно было быстро перенести в питательную среду и надлежащим образом поддерживать их с помощью культивирования эксплантов (см. ниже).

5. Встраивание тканей для эксплантированной культуры

  1. Добавьте 500 мкл теплого незатвердевшего культурального геля в лунку в 24-луночном планшете и быстро перенесите рассеченные целые резцы в лунку. Покрутите пластину несколько раз, чтобы промыть резцы.
  2. Добавьте 400 мкл теплого незатвердевшего геля для культивирования в чашку для культивирования и перенесите промытые резцы в чашку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем коммерчески доступную чашку для культивирования, совместимую с установкой перфузии. Альтернативные варианты см. в шаге 6.4.
  3. Расположите резец так, чтобы область шейной петли (или другие интересующие области) оказалась в центре чашки (рис. 2A, B) и отрегулируйте наклон апикального резца для желаемой плоскости изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ориентация тканей должна быть выполнена быстро, до полного гелеобразования.
  4. После того, как гель затвердеет, используйте тонкие щипцы, чтобы удалить гель поверх интересующей области, чтобы она не была покрыта гелем.
  5. Добавьте достаточный объем теплой питательной среды, медленно прижимая ее пипеткой к краю чашки, чтобы она просто покрыла образец (~150 мкл).
  6. Переместите эксплантированную культуру в инкубатор клеточных культур с температурой 37 °C, чтобы дать ткани возможность оседать и адаптироваться к условиям культуры в течение 1 ч.

6. Таймлапс-микроскопия эксплантов резцов

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте мы использовали вертикальный микроскоп, оснащенный 25-кратным объективом для погружения в воду с числовой апертурой 1. Как правило, погружная линза с высокой числовой апертурой лучше всего подходит для визуализации глубоких тканей.

  1. Включите микроскоп и двухфотонный лазер.
  2. Прикрепите чашку для культивирования к адаптеру столика и установите сверху кольцо адаптера для перфузии (Рисунок 2C).
  3. Подключите адаптер стола к регулятору температуры, настроенному на поддержание культуры при температуре 37 °C.
  4. Подсоедините входное и выходное кольцо переходного кольца к микроперфузионному насосу и начните перфузию питательной среды со скоростью перфузии, установленной на 20 на насосе. При этом образуется медленный поток (~5 мл/ч) питательной среды над образцами (рис. 2C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации о системе для поддержания ткани в стабильно контролируемой среде. Можно использовать и другие системы. Также можно использовать комбинацию нагревательной пластины 37 °C и самодельной чашки для перфузионной культуры (дополнительный рисунок S1) с входом и выходом, подключенными к шприцевым насосам.
  5. Поместите барьерное кольцо атмосферного контроля (ACBR) поверх переходного кольца и опустите объектив через ACBR, чтобы установить контакт с питательной средой (рис. 2D).
  6. Настройте длину волны лазера на 920 нм, чтобы визуализировать сигналы GFP и красной флуоресценции (например, tdTomato).
  7. Находите образцы с помощью окуляров, а затем с помощью программного обеспечения микроскопа.
  8. Настройте Z-стеки, многопозиционные изображения и временные интервалы с помощью программного обеспечения. Чтобы следовать этому протоколу, используйте размер z-шага 4 мкм и временной интервал 5 минут в течение 14 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обнаружили, что интервал времени, превышающий 5 минут, часто недостаточен для того, чтобы зафиксировать плавные движения и деления клеток.
  9. Запустите таймлапс-съемку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Положение образца может измениться в течение первого часа, и может потребоваться дальнейшая регулировка.
  10. Сохраняйте файлы для последующей обработки и анализа данных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Апикальная область резцов взрослой мыши заключена в нижнюю челюсть (рис. 1) и, следовательно, недоступна непосредственно для визуализации и отслеживания клеток-предшественников, находящихся в области роста. Поэтому мы разработали метод извлечения всего резца из челюстной кости и поддержания его в системе культивирования эксплантов для двухфотонной таймлапс-микроскопии (рис. 2). Здесь мы описываем репрезентативные результаты, которые отражают динамический процесс пролиферации и движения клеток в области губной шейной петли зубного эпителия.

Для демонстрации экспериментальных процедур мы использовали две разные модели мышей, которые экспрессируют зеленую флуоресценцию в зубном эпителии. Первая линия мыши - K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP, где K14Cre (MGI:2680713) экспрессирует Cre-рекомбиназу из промотора кератина 1435 и активирует экспрессию обратного тетрациклин-контролируемого трансактиватора в эпителии из аллеля R26rtTA 36 (MGI:3584524). При введении доксициклина rtTA индуцирует экспрессию гистонов H2B-GFP из аллеля tetO-H2B-GFP 37 (MGI:3043783) и помечает ядра эпителиальных клеток зеленой флуоресценцией. Это особенно полезно для отслеживания клеток и обнаружения клеточных делений. В этом эксперименте мы кормили животных доксициклиновым кормом в течение 24 часов перед жертвоприношением, чтобы активировать экспрессию H2B-GFP. Вторая линейка мышей - K14Cre; R26мТл/мГ, в которых R26мТл/мГ (MGI:3803814) является Cre-reporter38. В отсутствие активности Cre клетки экспрессируют мембранолокализованный tdTomato (мТ) с красной флуоресценцией. При Cre-опосредованной рекомбинации клетки экспрессируют мембранный GFP (mG). К14Кре; Таким образом, R26мТл/мГ помечает мембраны эпителиальных клеток зеленой флуоресценцией, оставляя неэпителиальные клетки красными. Это позволяет легко визуализировать формы, деления и движения клеток.

Мы начали процедуру с рассечения нижней челюсти (Рисунок 3A), а затем систематически удалили все кости, окружающие резец (Рисунок 3B-G). В результате получались целые резцы с неповрежденным эпителием (рис. 3H). Мы подтвердили интактность эпителия зуба, исследовав зеленую флуоресценцию в K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP и K14Cre; Мыши R26мТл/мГ (рис. 4A, B, E, F). На этом этапе непрозрачные ткани пародонта все еще покрывают апикальный резец, и шейная петля, таким образом, выглядит размытой из-за рассеяния света, что также затрудняет последующую таймлапс-визуализацию (рис. 4C, G). Поэтому мы осторожно удалили ткани пародонта, чтобы в каждом резце можно было различить эпителий зуба с шейной петлей (рис. 4D, H).

Затем резцы помещали в агарозу с низкой температурой плавления и культивировали в перфузионной установке для получения двухфотонной изображения в реальном времени, как показано на рисунке 2. В этом упражнении мы сосредоточились на области шейной петли зубного эпителия и получили изображения z-стека с интервалом 4 мкм каждые 5 минут в течение 14 часов (рис. 5A). Примечательно, что сигналы H2B-GFP в основном наблюдались в транзитно-усиливающей области шейной петли, где происходят активные клеточные деления (рис. 5B). Вероятно, это связано с тем, что в открытых хроматинах происходит более высокий обмен H2B-GFP и встраивание в нуклеосомы после репликации ДНК в этих активных клетках39.

Затем мы изучили таймлапс-изображения с помощью ImageJ и, основываясь на разделении сигналов H2B-GFP40, смогли наблюдать многочисленные деления клеток на протяжении всего периода визуализации (Supplemental Video S1 и Supplemental Video S2). Это указывало на то, что ткани были адекватно поддержаны в культуре экспланта и клетки были активны. В частности, мы смогли наблюдать конденсацию и выравнивание хромосом на метафазной пластинке в митотических клетках с последующей их сегрегацией на две дочерние клетки во время анафазы (рис. 5C-N, вручную отслеживается с помощью плагина ImageJ TrackMate). Большинство из этих делений были перпендикулярны или расположены под косым углом относительно базальной мембраны (рис. 5C-K и дополнительное видео S1). Горизонтальные деления, параллельные базальной мембране, также могут быть обнаружены, хотя и реже (рис. 5L-N и дополнительное видео S2). Важно отметить, что цитокинез в эпителии зубов часто происходит быстро, в течение 5-10 минут. В результате интервалы таймлапса более 5 минут могут пропустить некоторые из этих делений.

События клеточного деления также были очевидны в K14Cre; R26мТл/мГ цервикальных петель, где все мембраны эпителиальных клеток были помечены зеленым цветом (рис. 6А). Мы могли идентифицировать митотические клетки по их округлению, а затем цитокинезу (дополнительное видео S3), и наблюдались как вертикальные, так и горизонтальные клеточные деления (рис. 6B-G), что аналогично результатам, полученным с помощью H2B-GFP. Вместе эти результаты демонстрируют, что этот протокол может служить мощным инструментом для исследования поведения клеток в эксплантах резцов в сочетании с генетическими моделями мышей, которые флуоресцентно маркируют различные субклеточные структуры.

Figure 1
Рисунок 1: Схема шейной петли челюсти мыши и резца. (А) Значительная часть резца внедрена в челюстную кость. Область роста расположена на апикальном конце зуба и поддерживает его непрерывный рост (темно-зеленая стрелка). (Б) Увеличение верхушечного резца, который окружен тканями пародонта. Зуб состоит из эмали и дентина, которые представляют собой высокоминерализованные структуры, образованные амелобластами и одонтобластами соответственно. (C) Сагиттальный срез апикального резца, показывающий, что клетки-предшественники зубного эпителия и клетки, усиливающие транзит, находятся в губной шейной петле и дают начало амелобластам в более дистальном эпителии (темно-зеленая пунктирная стрелка). По сравнению с лабиальной шейной петлей, лингвальная шейная петля меньше по размеру и в норме не образует амелобластов. Зубные мезенхимальные стволовые клетки присутствуют в пульпе зуба (фиолетовая область) и дают начало одонтобластам. Сокращения: En = эмаль; De = дентин; Am = амелобласт; Од = одонтобласт; TACs = транзитно-усиливающие ячейки; laCL = лабиальная шейная петля; liCL = лингвальная шейная петля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Сохранение эксплантата резца мыши для визуализации в реальном времени. (A) Схемы, изображающие ключевые этапы протокола, от рассечения резца до встраивания ткани в агарозу с низкой температурой плавления для визуализации в реальном времени. Перфузионная установка используется для обеспечения постоянного поступления питательных веществ во время визуализации, а культура поддерживается при температуре 37 °C. (B-D) Пошаговая демонстрация настройки чашки для культивирования и перфузионной камеры для визуализации в реальном времени. Входное и выходное отверстия для носителя показаны розовыми и желтыми стрелками соответственно. Аббревиатура: ACBR = барьерное кольцо атмосферного контроля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Изоляция всего резца мыши. (А) Неповрежденная челюсть. (Б-Н) Кости постепенно удалялись, чтобы обнажить весь резец. Красными пунктирными линиями в В и С показаны обнаженные мягкие ткани апикального резца после сбривания мембранной кости, перекрывающей язычную и щечную стороны гнезда резца (шаги 3.3-3.5 в протоколе). (Д-Г) Синие наконечники стрелок обозначают мыщелки, моляры и альвеолярные кости, которые были удалены для изоляции всего зуба (шаг 3.6 в протоколе). Масштабная линейка = 2 мм (H). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Удаление тканей пародонта для визуализации в реальном времени. (А-Н) Репрезентативные пробы из (A-D) K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP и (E-H) K14Cre; В нашей демонстрации протокола использовались мыши R26mT/mG. До рассечения экспрессия GFP в эпителии зубов была видна через кость (А,Е, желтые наконечники стрелок). Белые пунктирные линии очерчивают нерассеченные резцы. E' показывает лингвальную сторону. В изолированных резцах (B, C, F, G) флуоресценция GFP первоначально дифрагировала тканями пародонта, покрывающими верхушечные резцы (белые и красные стрелки). Красная флуоресценция в F и G помечает неэпителиальные клетки. Удаление тканей пародонта позволяет четко и беспрепятственно видеть зеленые флуоресцентные шейные петли (D, H, зеленые стрелки). Масштабная линейка = 2 мм (A,E); 1,25 мм (B,F); и 300 мкм (C, D, G, H). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Таймлапс-микроскопия K14Cre; Р26ртТА; tetO-H2B-GFP шейная петля. (A) Схема, иллюстрирующая настройку таймлапса. (B) Репрезентативная z-плоскость K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP резцовая губная шейная петля, демонстрирующая ядерное мечение H2B-GFP преимущественно в транзитно-амплифицирующей области, где клетки активно делятся. Желтая рамка обозначает общую площадь увеличенных изображений, показанных ниже. (К-К) Таймлапс-изображения, показывающие вертикальное и косое деление клеток относительно БМ. (Л-Н) На таймлапс-изображениях показан пример горизонтального деления клеток относительно БМ. (D,G,J,M) Ячейки в метафазе или анафазе отображаются на средних панелях. Схемы каждого гусеничного дивизиона показаны справа. Масштабная линейка в N = 36 мкм (B); 5 мкм (C-N). Аббревиатура: BM = базальная мембрана. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Таймлапс-микроскопия K14Cre; R26мТл/мГ цервикальная петля. (A) Репрезентативная z-плоскость K14Cre; R26мТл/мГ резцовая губная шейная петля. Все эпителиальные клетки экспрессируют мембранный GFP. Желтая рамка представляет собой область отслеживания клеток, показанную в увеличениях. (Б-Г) Таймлапс-изображения, на которых запечатлены как (B-D), так и (E-G) вертикальные деления клеток относительно BM. (C,F) Средние панели показывают митотическое округление клеток. Схемы каждого гусеничного дивизиона показаны справа. Масштабная линейка = 35 мкм (А); 5 мкм (B-G). Аббревиатура: BM = базальная мембрана. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок S1: Перфузионная чашка собственного производства. (A) Для приготовления чашки для перфузии можно использовать 35-миллиметровую чашку для культивирования. Чашка со стеклянным дном может быть использована, если визуализация выполняется с помощью инвертированного микроскопа. (Б) Нагрейте гвоздь пламенем. (C) Два отверстия (белые наконечники стрел) создаются по обе стороны тарелки с помощью нагретого гвоздя. (D) Прикрепите две иглы 16 G с тупым концом, одну в качестве входного отверстия для носителя, а другую в качестве выходного отверстия для носителя, с помощью эпоксидного клея. Если требуется газовая перфузия, в чашку можно добавить третье отверстие/иглу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительное видео S1: Живое изображение K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP резцовая губная шейная петля, демонстрирующая вертикальное и косое деление клеток. Ячейки отслеживаются вручную, и точки разного цвета обозначают разные пары клеток мать/дочь. Масштабная линейка = 30 мкм (левая рамка); 7 мкм (правая рамка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Дополнительное видео S2: Живое изображение K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP резцовая губная шейная петля, демонстрирующая пример горизонтального деления клеток. Деление по горизонтали происходит на отметке 10 с и отслеживается вручную с помощью синих точек. Масштабная линейка = 30 мкм (левая рамка); 7 мкм (правая рамка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Дополнительное видео S3: Живое изображение K14Cre; R26мТл/мГ резцов лабиальной шейки матки, демонстрирующая как вертикальное, так и горизонтальное деление клеток. Ячейки отслеживаются вручную, а разноцветные кружки обозначают разные пары клеток мать/дочь. Масштабная линейка = 30 мкм (левая рамка); 7 мкм (правая рамка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Визуализация живых тканей является важным методом, который позволяет нам изучать динамические процессы и поведение клеток, когда они сохраняются в своей нишевойсреде. В идеале визуализация в реальном времени выполняется in vivo с высоким пространственно-временным разрешением. Тем не менее, визуализация органов млекопитающих in vivo может быть сложной задачей из-за недоступности тканей, оптической непрозрачности и трудностей с иммобилизацией животного или органа в течение длительного периодавремени. Тканевые экспланты обходят некоторые из этих проблем и были успешно применены в ряде исследований для отслеживания поведения клеток, например, во время морфогенеза зубов и развития эктодермальных органов26. Здесь мы продемонстрировали относительно простой, но надежный протокол для выполнения визуализации глубоких тканей в реальном времени на культивируемых резцах целых взрослых мышей. Применение этой методики поможет нам понять регуляцию движения клеток, решения о судьбе и организации тканей во время регенерации зубов.

Поскольку деление клеток является легко наблюдаемым событием и характерно для регенерирующих тканей, мы сосредоточились на отслеживании делящихся клеток в этом исследовании, чтобы выделить одно из применений протокола. Мы обнаружили, что предшественники резцового эпителия могут подвергаться как вертикальному, так и горизонтальному делению, таким образом, сходны с другими эпителиальными тканями43. Выяснение механизма, регулирующего углы деления, и изучение роли ориентации деления в принятии решений о судьбе клеток будет иметь важное значение в будущих исследованиях. Сочетание изображений в реальном времени с различными генетическими моделями мышей, которые также несут флуоресцентные маркеры судьбы клеток, репортеры сигнальных путей или репортер клеточного цикла Фуччи44,45, поможет раскрыть, как паттерны деления клеток и динамика клеточного цикла способствуют регуляции эпителиального гомеостаза и регенерации.

Необходимой практикой в этом протоколе является быстрое и тщательное проведение диссекции зубов, что позволяет быстро перейти и сохранить интактную ткань в соответствующих условиях культивирования. Мы обнаружили, что при живой визуализации препарирование тканей в теплой, а не в холодной среде, как в экспериментах по извлечению белков и мРНК46, поддерживает клетки в функционирующем состоянии. Поскольку резец является относительно большим органом для культивирования, постоянное поступление питательных веществ через перфузию среды также имеет решающее значение для поддержания ткани на протяжении всей визуализации47. Если клетки-предшественники присутствуют в интересующей области, наблюдение частых делений клеток является хорошим показателем того, что ткань здорова и активна. Напротив, гибель клеток должна быть нечастой, и это может быть проверено путем обнаружения ярких и конденсированных ядерных тел во время визуализации, если используется ядерный маркер, или путем выполнения окрашивания TUNEL после визуализации и фиксации тканей48. В дополнение к питательным веществам, уровень кислорода также может влиять на жизнеспособность экспланта, поскольку либо напряжение, либо недостаток кислорода могут нарушить выживание, пролиферацию и дифференцировку клеток 49,50,51. По нашему опыту, мы не наблюдали явных различий в пролиферации и гибели клеток, когда образцы получали дополнительный кислород или без него (например, 95% O2/5% CO2 карбогена или 5% CO2/21% O2 / сбалансированный N2) во время визуализации, предполагая, что либо следовое количество кислорода в системе достаточно для поддержания эпителия резцов в культуре в течение ночи, либо ткань может использовать альтернативные пути для поддержания нормальных функций клеток52. Тем не менее, потребность в кислороде в других клеточных процессах или правильная экспрессия генов должны быть дополнительно определены в будущих исследованиях.

В нашей демонстрации протокола мы использовали генетически кодируемый H2B-GFP и мембранный GFP для мечения клеточных ядер и контуров соответственно. Эти флуоресцентные маркеры являются яркими и долговечными под двухфотонной микроскопией и, таким образом, являются примерами идеальных меток для отслеживания движений и делений клеток. Теоретически флуоресцентные витальные красители также могут быть использованы для маркировки различных субклеточных компартментов для получения изображений ex vivo в реальномвремени, но снижение проникновения красителей в более глубокие эпителиальные клетки, вероятно, ограничивает их использование. Аналогичным образом, в то время как стандартная конфокальная микроскопия способна получать изображения высокого разрешения в реальном времени на глубине менее 100 мкм, двухфотонная микроскопия обеспечивает увеличенную глубину изображения с уменьшением фотообесцвечивания и фототоксичности54. Поэтому мы выбрали двухфотонную микроскопию в качестве метода визуализации в большинстве наших приложений для визуализации в реальном времени.

Одним из потенциальных ограничений этого протокола является то, что экспланты резцов могут не полностью повторять среду и биологию in vivo. Таким образом, данные отражают поведение клеток в условиях культивирования и должны быть соответствующим образом интерпретированы, а также проверены с помощью других методов, таких как гистология, когда это применимо. Нам также пришлось частично удалить ткани пародонта, чтобы получить доступ к шейной петле для визуализации. Таким образом, сигнальные взаимодействия между тканями пародонта и эпителием зуба могут быть нарушены. Наконец, в то время как перфузия среды значительно улучшает жизнеспособность культивируемых тканей, она может привести к напряжению сдвига жидкости, которое действует как эктопический механический сигнал и влияет на результаты55,56. Мы не определили влияние различных скоростей потока в нашей установке. Однако, поскольку низкий расход 1-5 мл/ч, как правило, достаточен для поддержания запасов питательных веществ57, влияние напряжения сдвига может быть сведено к минимуму. Принимая во внимание эти ограничения, визуализация ex vivo в реальном времени служит мощной платформой для изучения изменений в поведении клеток, когда в эксперименты включены соответствующие контрольные элементы.

Непрерывно растущий резец мыши представляет собой хорошо управляемую модельную систему для изучения обновления тканей на основе стволовых клеток и восстановления повреждений. Протокол, описанный в настоящем документе, предоставляет исследователям средства для сохранения целых взрослых резцов в культуре и извлечения пространственно-временной информации о поведении клеток с помощью таймлапс-микроскопии. Мы ожидаем, что этот метод будет широко применим для изучения различных генетических моделей мышей, используемых в стоматологических исследованиях, и поможет расширить наши знания в области регенерации зубов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Acknowledgments

Выражаем признательность Лаборатории передовой световой микроскопии/спектроскопии Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе и Центру передового опыта Leica Microsystems при Калифорнийском институте наносистем (RRID:SCR_022789) за предоставление двухфотонной микроскопии. AS был поддержан ISF 604-21 Израильским научным фондом. JH поддержали R03DE030205 и R01DE030471 из NIH/NIDCR. AS и JH также получили грант 2021007 от Американо-израильского двунационального научного фонда (BSF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well, flat bottom tissue culture plate Olympus plastics 25-107
25x HC IRAPO motCORR water dipping objective Leica 11507704
Ascorbic acid (Vitamin C) Acros Organics 352685000
D-(+)-Glucose bioxtra  Sigma Aldrich G7528
Delta T system  Bioptechs 0420-4 Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup
Dissection microscope- LEICA S9E Leica LED300 SLI
DMEM/F12 Thermo Scientific 11039047 Basal media without phenol red
Feather surgical blade (#15) Feather 72044-15
Fine forceps F.S.T 11252-23
Glutamax  Thermo Scientific 35050-061 Glutamine substitute
Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective  Leica n/a
low-melting agarose NuSieve 50080
non-essential amino acids (100x) Thermo Scientific 11140-050
penicillin–streptomycin Thermo Scientific 15140122 10,000 U/mL 
Petri dish Gen Clone 32-107G 90 mm 
Rat serum Valley Biomedical AS3061SC Processed for live imaging
Razor blade #9 VWR 55411-050
Scalpel handle F.S.T 10003-12
Scissors F.S.T 37133
serrated forceps F.S.T 11000-13
spring scissors F.S.T 91500-09

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
  2. Jing, J., et al. Rodent incisor as a model to study mesenchymal stem cells in tissue homeostasis and repair. Frontiers in Dental Medicine. 3, 1068494 (2022).
  3. Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and Fgf signaling. Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
  4. Warshawsky, H., Smith, C. E. Morphological classification of rat incisor ameloblasts. The Anatomical Record. 179 (4), 423-445 (1974).
  5. Lekic, P., McCulloch, C. A. Periodontal ligament cell population: the central role of fibroblasts in creating a unique tissue. The Anatomical Record. 245 (2), 327-341 (1996).
  6. Takahashi, A., et al. Autocrine regulation of mesenchymal progenitor cell fates orchestrates tooth eruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (2), 575-580 (2019).
  7. Ness, A. R. Eruption rates of impeded and unimpeded mandibular incisors of the adult laboratory mouse. Archives of Oral Biology. 10 (3), 439-451 (1965).
  8. Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
  9. Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), Cambridge, England. 3753-3761 (2010).
  10. Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
  11. Biehs, B., et al. BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nature Cell Biology. 15, 846-852 (2013).
  12. Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
  13. Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
  14. Li, L., Clevers, H. Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals. Science. 327 (5965), 542-545 (2010).
  15. Sharir, A., et al. A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage. Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).
  16. Hu, J. K. -H., et al. An FAK-YAP-mTOR signaling axis regulates stem cell-based tissue renewal in mice. Cell Stem Cell. 21 (1), 91-106 (2017).
  17. Yu, F., Li, F., Zheng, L., Ye, L. Epigenetic controls of Sonic hedgehog guarantee fidelity of epithelial adult stem cells trajectory in regeneration. Science Advances. 8 (29), (2022).
  18. An, Z., et al. A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors. Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).
  19. Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
  20. Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development. 147 (2), (2020).
  21. Krivanek, J., Buchtova, M., Fried, K., Adameyko, I. Plasticity of dental cell types in development, regeneration, and evolution. Journal of Dental Research. 102 (6), 589-598 (2023).
  22. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  23. Cetera, M., Leybova, L., Joyce, B., Devenport, D. Counter-rotational cell flows drive morphological and cell fate asymmetries in mammalian hair follicles. Nature Cell Biology. 20 (5), 541-552 (2018).
  24. Held, M., Santeramo, I., Wilm, B., Murray, P., Lévy, R. Ex vivo live cell tracking in kidney organoids using light sheet fluorescence microscopy. PLoS ONE. 13 (7), 0199918 (2018).
  25. Mesa, K. R., et al. Homeostatic epidermal stem cell self-renewal is driven by local differentiation. Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).
  26. Mogollón, I., Ahtiainen, L. Live tissue imaging sheds light on cell level events during ectodermal organ development. Frontiers in Physiology. 11, 818 (2020).
  27. Prochazka, J., et al. Migration of founder epithelial cells drives proper molar tooth positioning and morphogenesis. Developmental Cell. 35 (6), 713-724 (2015).
  28. Morita, R., et al. Coordination of cellular dynamics contributes to tooth epithelium deformations. PLOS ONE. 11 (9), 0161336 (2016).
  29. Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
  30. Panousopoulou, E., Green, J. B. A. Invagination of ectodermal placodes is driven by cell intercalation-mediated contraction of the suprabasal tissue canopy. PLoS biology. 14 (3), 1002405 (2016).
  31. Mogollón, I., Moustakas-Verho, J. E., Niittykoski, M., Ahtiainen, L. The initiation knot is a signaling center required for molar tooth development. Development. 148 (9), (2021).
  32. Kim, R., et al. Early perturbation of Wnt signaling reveals patterning and invagination-evagination control points in molar tooth development. Development. 148 (14), 199685 (2021).
  33. Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments JoVE. (90), e51969 (2014).
  34. Katsuragi, Y., et al. Bcl11b transcription factor plays a role in the maintenance of the ameloblast-progenitors in mouse adult maxillary incisors. Mechanisms of Development. 130 (9-10), 482-492 (2013).
  35. Dassule, H. R., Lewis, P., Bei, M., Maas, R., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127 (22), 4775-4785 (2000).
  36. Belteki, G., et al. Conditional and inducible transgene expression in mice through the combinatorial use of Cre-mediated recombination and tetracycline induction. Nucleic Acids Research. 33 (5), 51 (2005).
  37. Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
  38. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  39. Kimura, H., Cook, P. R. Kinetics of core histones in living human cells. The Journal of Cell Biology. 153 (7), 1341-1354 (2001).
  40. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology: CB. 8 (7), 377-385 (1998).
  41. Huang, Q., et al. The frontier of live tissue imaging across space and time. Cell Stem Cell. 28 (4), 603-622 (2021).
  42. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).
  43. Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
  44. Li, S., et al. Overview of the reporter genes and reporter mouse models. Animal Models and Experimental. 1 (1), 29-35 (2018).
  45. Mort, R. L., et al. Fucci2a: a bicistronic cell cycle reporter that allows Cre mediated tissue specific expression in mice. Cell Cycle. 13 (17), 2681-2696 (2014).
  46. Krivanek, J., et al. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nature Communications. 11 (1), 4816 (2020).
  47. Dailey, M. E., Marrs, G. S., Kurpius, D. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harbor protocols. 2011 (4), (2011).
  48. Gorczyca, W., Bruno, S., Darzynkiewicz, R., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. DNA strand breaks occurring during apoptosis - their early insitu detection by the terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays and prevention by serine protease inhibitors. International Journal of Oncology. 1 (6), 639-648 (1992).
  49. Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
  50. Wale, P. L., Gardner, D. K. Time-lapse analysis of mouse embryo development in oxygen gradients. Reproductive Biomedicine Online. 21 (3), 402-410 (2010).
  51. Tse, H. M., Gardner, G., Dominguez-Bendala, J., Fraker, C. A. The importance of proper oxygenation in 3D culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 634403 (2021).
  52. Spinelli, J. B., et al. Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain. Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).
  53. Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex-vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current Protocols in Cytometry. , CHAPTER, Unit9.39 (2012).
  54. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
  55. McCoy, R. J., O'Brien, F. J. Influence of shear stress in perfusion bioreactor cultures for the development of three-dimensional bone tissue constructs: a review. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (6), 587-601 (2010).
  56. Chen, K. D., et al. Mechanotransduction in response to shear stress. Roles of receptor tyrosine kinases, integrins, and Shc. The Journal of Biological Chemistry. 274 (26), 18393-18400 (1999).
  57. Seddiqi, H., et al. Inlet flow rate of perfusion bioreactors affects fluid flow dynamics, but not oxygen concentration in 3D-printed scaffolds for bone tissue engineering: Computational analysis and experimental validation. Computers in Biology and Medicine. 124, 103826 (2020).

Tags

Биология развития выпуск 200 Клеточные движения Обновление зубов у мышей Резцы мыши Эпителиальные стволовые клетки Мезенхимальные стволовые клетки Регенерация зубов Тканевый гомеостаз Клеточные взаимодействия Система культивирования эксплантов Многофотонная таймлапс-микроскопия Пространственно-временная информация Поведение клеток Живая ткань Стоматологические исследования Динамические клеточные процессы
<em>Использование изображений ex vivo</em> в реальном времени для исследования деления и движения клеток во время обновления зубов мыши
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sundari Thooyamani, A., Shahin, E.,… More

Sundari Thooyamani, A., Shahin, E., Takano, S., Sharir, A., Hu, J. K. Using Ex Vivo Live Imaging to Investigate Cell Divisions and Movements During Mouse Dental Renewal. J. Vis. Exp. (200), e66020, doi:10.3791/66020 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter