Summary
离体 实时成像是一种强大的技术，用于研究活组织中细胞运动和相互作用的动态过程。在这里，我们提出了一种方案，该方案实施双光子显微镜以实时跟踪培养的全成年小鼠门牙中的牙齿上皮细胞。
Abstract
不断生长的小鼠门牙正在成为一种高度易于处理的模型系统，用于研究成人上皮和间充质干细胞的调节以及牙齿再生。这些祖细胞群积极分裂、移动和分化，以维持组织稳态并以响应性方式再生丢失的细胞。然而，使用固定组织切片的传统分析无法捕捉细胞运动和相互作用的动态过程，限制了我们研究其调控的能力。本文描述了一种在外植体培养系统中维持整个小鼠门牙并使用多光子延时显微镜实时跟踪牙齿上皮细胞的方案。这项技术增加了我们现有的牙科研究工具箱，并允许研究人员获得有关活组织中细胞行为和组织的时空信息。我们预计这种方法将帮助研究人员进一步探索控制牙齿更新和再生过程中发生的动态细胞过程的机制。
Introduction
在过去的二十年中，小鼠门牙已成为研究成体干细胞调节和牙齿再生原理的宝贵平台1,2。小鼠门牙在动物的一生中不断生长并自我更新。它通过维持上皮干细胞和间充质干细胞来做到这一点，这些干细胞可以自我更新并分化成牙齿的不同细胞类型 1,2。牙科上皮干细胞产生分泌牙釉质基质的成釉细胞，而牙科间充质干细胞产生成牙细胞、牙质母细胞和成纤维细胞，分别形成牙本质、牙骨质和牙周韧带 3,4,5,6。这种新细胞的持续供应维持了组织稳态，并允许更换因咀嚼磨损或损伤而丢失的旧细胞7,8。因此，阐明调节牙科干细胞维持和分化的细胞和分子机制对于理解牙齿再生至关重要，这是一个越来越受关注的领域。
在解剖学上，成年小鼠门牙的很大一部分被包裹在颌骨中。当牙齿的切口边缘暴露时，门牙的顶端适合牙槽内，并通过牙周韧带和结缔组织牢固地附着在周围的骨骼上（图1A，B）。门牙的顶端也是牙齿的生长区域，在上皮层和间充质牙髓中维持牙干细胞和祖细胞9,10,11,12,13。具体来说，牙科上皮干细胞维持在上皮的球状末端，称为顶芽，也称为唇颈袢（图1C）。与肠上皮和表皮类似，门牙的上皮更新主要由活跃的循环干细胞及其高度增殖的中间后代（称为转运扩增细胞14,15,16,17）支持，两者都位于宫颈袢的内部。然而，门牙上皮在再生过程中是否含有和利用静止干细胞仍有待确定。相比之下，在顶端牙髓中发现了活性和静止的牙科间充质干细胞，并且静止干细胞作为储备细胞群发挥作用，在损伤修复过程中被激活13,18。
许多关于小鼠门牙更新和再生生物学的发现都是从组织学研究中获得的，其中样本在不同的时间节点获得，固定，处理，然后沿特定平面切成微米薄的切片。通过对不同小鼠模型的组织学切片进行详细分析，科学家们已经确定了不同祖细胞群的细胞谱系，以及控制门牙稳态和损伤修复的遗传和信号通路19,20,21.然而，切片中非生命细胞的静态二维 （2D） 图像无法捕捉活组织中细胞行为和空间组织的全部光谱，例如细胞形状变化、运动和细胞动力学。检测和测量这些快速的细胞变化，这些变化发生在无法通过组织切片解决的时间尺度上，需要不同的策略。此外，获取这些信息对于了解牙齿细胞如何相互作用、对不同的信号刺激做出反应以及自组织以维持组织结构和功能也至关重要。
使用双光子显微镜22 的四维 （4D） 深层组织成像的出现，是一种将三个空间维度与时间分辨率相结合的技术，通过能够对培养的组织外植体、类器官甚至原位组织进行时空检查，克服了组织学分析的固有局限性 23,24,25,26 .例如，发育中的牙齿上皮的 4D 实时成像揭示了细胞分裂和迁移的时空模式，这些模式协调组织生长、信号转导中心形成和牙齿上皮形态发生 27,28,29,30,31,32.在成年小鼠门牙中，4D成像最近被用于研究牙齿上皮损伤修复过程中的细胞行为。实时成像显示，基底上层的中间层细胞可以直接转化为基底层的成釉细胞，使受损的上皮细胞再生，挑战了上皮损伤修复的传统范式15。
在这里，我们描述了成年小鼠门牙的解剖、培养和成像，重点是唇颈袢中的上皮细胞（图 1）。该技术可保持牙细胞活力超过 12 小时，并允许以单细胞分辨率实时跟踪荧光标记的细胞。这种方法可以研究细胞运动和迁移，以及正常培养条件下细胞形状和分裂方向的动态变化，或对遗传、物理和化学扰动的反应。
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Protocol
所有小鼠均保存在加州大学洛杉矶分校（UCLA）或耶路撒冷希伯来大学（HUJI）的无病原体动物设施中。所有涉及小鼠的实验均根据各自机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准的法规和协议进行 （ARC-2019-013;加州大学洛杉矶分校）或（MD-23-17184-3;HUJI）。实验步骤的一般工作流程如 图2A所示。有关本协议中使用的所有仪器、试剂和材料的详细信息，请参阅 材料表 。
1.溶液和凝胶的制备
- 解剖培养基：用0.5%葡萄糖制备新鲜的DMEM / F12，并在37°C下保持温暖，直到步骤2.4需要。
注意：我们使用不含酚红的 DMEM/F12 来减少实时成像期间的自发荧光。 - 1x 培养基：使用 50% DMEM/F12、50% 大鼠血清、1x 谷氨酰胺替代品、1x MEM 非必需氨基酸、1% 葡萄糖、0.1 mg/mL L-抗坏血酸和 0.5% 青霉素-链霉素制备新鲜培养基。在37°C下保持温暖，直到步骤5.5需要为止。该培养基用于在实时成像期间培养门牙外植体。
注意：大鼠血清应是高质量的，并且专门为研究人员或商业来源的全组织培养而制备。特别是，在开始形成凝血之前，必须将血液离心（在室温下以1,200× g 离心5分钟）。离心后，应挤压所得纤维蛋白凝块并丢弃33。 - 培养凝胶：凝胶的目的是在成像过程中固定样品，并且是新鲜制备的。
- 使用微波将 200 mg 低熔点琼脂糖溶解在 10 mL DMEM/F12 中，在 DMEM/F12 中制备 2% 凝胶。将2%凝胶保持在37°C。
- 通过混合 50% 大鼠血清、1x 谷氨酰胺替代品、1x MEM 非必需氨基酸、1% 葡萄糖、0.1 mg/mL L-抗坏血酸和 0.5% 青霉素-链霉素，制备 2x 培养基（不含 DMEM/F12）。将2x培养基（不含DMEM / F12）加热至37°C。
- 通过混合等体积的 2% 凝胶和 2x 培养基（不含 DMEM/F12）制备 1% 培养凝胶。将1%培养凝胶保持在37°C，直到步骤5.1中需要。
注意： 混合前确保所有溶液都是温热的，以避免胶凝。我们发现 1% 凝胶适合培养成年小鼠门牙。如果要培养其他组织，应根据经验确定凝胶百分比。
2.成鼠下颌骨的提取
- 使用IACUC批准的标准程序在所需年龄对小鼠实施安乐死。
注意：这里我们使用 CO2 窒息，然后是颈椎脱位。不同地区的动物安乐死法规可能有所不同。研究人员在进行实验之前应获得必要的机构批准，并确保遵守当地的动物护理法规。 - 使用70%乙醇对小鼠进行消毒。
- 将鼠标斩首并提取左右下颌骨。
- 将鼠标放在腹部，然后使用#9单刃工业剃须刀片在颈部区域切开，并将鼠标头部与身体其他部位分开。
注意：如果还要收集咽部或颈部区域的组织，则不应进行斩首，可以直接进行步骤2.3.2。 - 将鼠标翻转过来，使其腹侧朝上，下颌骨易于触及。
- 用拇指和食指轻轻握住动物的头部，固定动物的头部。
- 使用剃须刀片在矢状中段切开一个切口，从下唇到领口切开下颌皮肤。
注意：#15手术刀片也可用于切口和随后的解剖（步骤2.3.6-2.3.9）。 - 切口时，用拇指和食指张开切开的皮肤，露出下面的肌肉和颚骨。
- 使用剃须刀片切断下颌颊侧的咬肌，使左右半肢的外侧现在没有肌肉附着。
- 切断下颌骨内侧的舌骨肌，以去除那里的肌肉附着物。
- 在连接两个半骨的下颌联合处再做一个切口。切割后，下颌骨将分为左右两半。
- 将剃须刀片楔入下颌髁和颞下颌关节之间，并小心地从头部的其余部分解剖出半侧。
注意：我们发现在切割时同时轻轻拉动门牙很有帮助。应注意避免折断下颌骨和损坏其中的软组织。
- 将鼠标放在腹部，然后使用#9单刃工业剃须刀片在颈部区域切开，并将鼠标头部与身体其他部位分开。
- 立即将解剖的下颌骨转移到带有预热解剖培养基的培养皿中（步骤1.1），并使用#15手术刀片去除剩余的肌肉组织。
注意：将样品保存在冷培养基中会减慢细胞活性，导致活体成像期间某些细胞活性（如增殖或细胞运动）的回收延迟甚至失败。
3.整个小鼠门牙的分离
注意：门牙的进一步分离是在明场解剖显微镜下完成的。
- 目视识别下颌骨的椭圆形区域，该区域覆盖门牙窝并容纳门牙的顶端部分。
- 定位下颌骨，使内（舌）表面朝上。
- 在用一对锯齿镊将下颌骨固定到位的同时，使用 #15 手术刀片沿从髁突到臼齿的方向剃掉覆盖的膜骨，在椭圆形区域生成一个窗口。这会在内表面暴露顶端切牙的软组织。
- 将下颌骨翻转过来，使外（颊）表面朝上。
- 如步骤3.3所述，在外下颌骨的椭圆形区域生成一个窗口，并使用手术刀的尖端挑走边缘任何剩余的骨头碎片。确保从两侧都可以看到牙齿的顶端。
注意： 剃须时避免压力过大，以防止损坏下面的软组织。 - 系统地切掉门牙周围的骨头，以隔离整颗牙齿。
- 在紧邻顶切牙的平面上做一个干净的切口，首先去除髁突。
注意： 小心不要切入门牙。 - 在第三磨牙后方进行第二次切口，但在门牙背侧进行第二次切口，而不会损坏牙齿。这会去除包含冠状突的骨。
- 从角突的尖端向门牙连续切割，以逐步方式逐渐去除腹侧下颌骨。
注意：牙上皮和相关的牙周组织通常粘在骨头上，如果一次切掉大部分腹骨，很容易被撕掉。为了将骨头与门牙软组织分开，可以将手术刀（或一对锋利的非锯齿镊子）插入门牙顶端的两个组织之间，然后轻轻地向前滑动器械。 - 用臼齿切掉牙槽骨和任何仍然附着在门牙上的剩余骨头。
- 整个门牙现在被隔离了。将完全解剖的门牙转移到具有干净的温解剖介质的培养皿中（步骤1.1）。
- 在紧邻顶切牙的平面上做一个干净的切口，首先去除髁突。
- 重复步骤 3.2-3.6 以根据需要隔离其他门牙。
注意：小鼠的上颌/上门牙也维持成体干细胞，可用于研究牙齿再生34。牙科研究人员通常专注于下门牙，因为它们比上门牙更容易接近并且更容易解剖。下颌和上颌门牙祖细胞之间的差异仍有待确定。
4.切除牙周组织，露出门牙上皮颈袢
- 将整个门牙放在舌侧，同时用一对锯齿镊子将牙齿固定到位，使用一对 #5 细镊子开始塞入覆盖顶端门牙和颈袢区域的牙周组织。
- 小心地从顶芽上剥离牙周组织，使颈袢的外侧（或其他感兴趣的区域）在内窥镜下可见。
注意：应注意避免损坏牙齿上皮或将其从间充质中分离。如果门牙在感兴趣区域有荧光信号，并且有荧光解剖显微镜可用，则可以使用荧光信号来帮助区分组织类型并帮助解剖。重要的是有效地执行第 2-4 节，以便样品可以快速转移到培养基中，并通过外植体培养充分保存（见下文）。
5. 用于外植体培养的组织包埋
- 将 500 μL 温热的未固化培养凝胶加入 24 孔板中的孔中，并将解剖的整个门牙快速转移到孔中。旋转板几次以冲洗门牙。
- 将 400 μL 温热的未固化培养凝胶加入培养皿中，并将冲洗干净的门牙转移到培养皿中。
注意：我们使用与灌流设置兼容的市售培养皿。有关替代选项，请参阅步骤 6.4。 - 定向门牙以将颈袢区域（或其他感兴趣的区域）定位在培养皿的中心（图2A，B），并调整所需成像平面的顶端切牙的倾斜度。
注意：在完全凝胶化之前，应快速进行组织定位。 - 凝胶凝固后，使用一把细镊子去除感兴趣区域顶部的任何凝胶，使其不被凝胶覆盖。
- 通过缓慢移液到培养皿边缘以刚好覆盖样品（~150μL）来加入足够体积的温培养基。
- 将外植体培养物移至37°C细胞培养箱中，以使组织沉降并适应培养条件1小时。
6. 门牙外植体的延时显微镜
注意：在这个实验中，我们使用了一台正置显微镜，该显微镜配备了一个数值孔径为25倍的浸水物镜。一般来说，具有高数值孔径的浸水透镜最适合深层组织成像。
- 打开显微镜和双光子激光器。
- 将培养皿固定到载物台适配器上，并将灌注适配器环安装在顶部（图2C）。
- 将载物台适配器连接到温度控制器集，以将培养物保持在37°C。
- 将转接环的入口和出口连接到微灌注泵并开始灌注培养基，泵上的灌注速度设置为 20。这会在样品顶部产生缓慢流动的培养基（~5 mL/h）（图2C）。
注意： 有关将组织保持在稳定受控环境中的系统的详细信息 ，请参阅材料表 。也可以使用其他系统。也可以使用37°C加热板和自制灌注培养皿（补充图S1）的组合，该培养皿带有入口和连接到注射泵的出口。 - 将大气控制屏障环（ACBR）放在转接环的顶部，并通过ACBR降低物镜，使其与培养基接触（图2D）。
- 将激光波长调至 920 nm，以可视化 GFP 和红色荧光（例如 tdTomato）信号。
- 通过目镜定位样品，然后在显微镜的软件上定位样品。
- 使用该软件设置 Z 轴堆栈、多位置成像和时间间隔。要遵循此协议，请使用4μm的z步长和5分钟的时间间隔，持续14小时。
注意：我们发现超过5分钟的时间间隔通常不足以捕获平滑的细胞运动和分裂。 - 启动延时成像。
注意： 样品位置可能会在第一个小时内发生变化，可能需要进一步调整。 - 保存文件以进行下游数据处理和分析。
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Representative Results
成年小鼠门牙的顶端区域被包裹在下颌骨内（图1），因此，不能直接进入以可视化和实时跟踪居住在生长区域内的祖细胞。因此，我们开发了一种从颌骨中提取整个门牙并将其保存在外植体培养系统中进行双光子延时显微镜的方法（图2）。在这里，我们描述了捕捉上皮唇颈袢区域细胞增殖和运动的动态过程的代表性结果。
为了演示实验程序，我们使用了两种不同的小鼠模型，它们在牙齿上皮中表达绿色荧光。第一个小鼠系是 K14Cre;R26rtTA型;tetO-H2B-GFP，其中 K14Cre （MGI：2680713） 表达来自角蛋白 14 启动子35 的 Cre 重组酶，并激活来自 R26rtTA 等位基因36 （MGI：3584524） 的上皮中反向四环素控制的反式激活因子的表达。施用多西环素后，rtTA 诱导 tetO-H2B-GFP 等位基因37 （MGI：3043783） 的组蛋白 H2B-GFP 表达，并用绿色荧光标记上皮细胞核。这对于细胞追踪和检测细胞分裂特别有用。在这个实验中，我们在处死前用多西环素食物喂养动物 24 小时以激活 H2B-GFP 表达。第二个小鼠系是 K14Cre;R26mT/mG，其中 R26mT/mG （MGI：3803814） 是 Cre-reporter38。在没有 Cre 活性的情况下，细胞表达具有红色荧光的膜定位 tdTomato （mT）。在Cre介导的重组中，细胞表达膜GFP（mG）。 K14克雷;因此，R26mT/mG 用绿色荧光标记上皮细胞膜，使非上皮细胞保持红色。这样可以轻松可视化细胞形状、分裂和运动。
我们通过解剖下颌骨（图3A）开始手术，然后系统地切除门牙周围的所有骨头（图3B-G）。这产生了具有未受损上皮的整个门牙（图3H）。我们通过检查 K14Cre 中的绿色荧光来确认牙齿上皮的完整性;R26rtTA型;tetO-H2B-GFP 和 K14Cre;R26mT / mG小鼠（图4A，B，E，F）。在这个阶段，不透明的牙周组织仍然覆盖着顶端门牙，因此由于光散射，颈袢显得模糊，这同样会阻碍下游延时成像（图4C，G）。因此，我们小心翼翼地切除了牙周组织，因此可以在每个门牙中辨别带有颈袢的上皮（图4D，H）。
然后将门牙包埋在低熔点琼脂糖中，并在灌注装置中培养用于双光子实时成像，如 图 2 所示。对于此练习，我们专注于上皮的颈环区域，并在 14 小时内每 5 分钟以 4 μm 的间隔捕获 z 堆栈图像（图 5A）。值得注意的是，H2B-GFP信号主要在颈袢的转运扩增区域观察到，那里有活跃的细胞分裂（图5B）。这可能是因为在这些活性细胞中进行 DNA 复制后，开放染色质处的 H2B-GFP 交换和掺入核小体39。
随后，我们使用 ImageJ 检查了延时图像，并基于 H2B-GFP 信号40 的分离，我们能够在整个成像期间观察到许多细胞分裂（补充视频 S1 和补充视频 S2）。这表明组织在外植体培养物中得到充分维持，细胞是活跃的。具体来说，我们能够观察到有丝分裂细胞中期板上染色体的凝结和对齐，然后在后期将它们分离成两个子细胞（图5C-N，使用ImageJ插件TrackMate手动跟踪）。这些分裂中的大多数是垂直的或相对于基底膜的倾斜角度（图 5C-K 和补充视频S 1）。也可以检测到平行于基底膜的水平分裂，尽管发生频率较低（图 5L-N 和补充视频S 2）。需要指出的是，牙齿上皮细胞分裂通常在5-10分钟内迅速发生。因此，超过 5 分钟的延时间隔可能会错过其中一些分割。
细胞分裂事件在K14Cre中也很明显;R26mT/mG 宫颈环，其中所有上皮细胞膜都标记为绿色（图 6A）。我们可以通过细胞的四舍五入和胞质分裂来识别有丝分裂细胞（补充视频 S3），并且可以观察到垂直和水平细胞分裂（图 6B-G），因此与使用 H2B-GFP 获得的结果相似。总之，这些结果表明，当与荧光标记不同亚细胞结构的小鼠遗传模型相结合时，该协议可以作为研究门牙外植体细胞行为的有力工具。
图 1：小鼠下颌和门牙颈袢的示意图。 （A） 门牙的很大一部分嵌入颌骨中。生长区域位于牙齿的顶端，支持其持续生长（深绿色箭头）。（B） 被牙周组织包围的顶端切牙增大。牙齿由牙釉质和牙本质组成，它们是分别由成釉细胞和成牙细胞形成的高度矿化结构。（C）顶端切牙的矢状切面，显示牙齿上皮祖细胞和转运扩增细胞位于唇颈袢中，并在更远端的上皮细胞中产生成釉细胞（深绿色虚线箭头）。与唇颈袢相比，舌颈袢较小，通常不会形成成釉细胞。牙科间充质干细胞存在于牙髓（紫色区域）并产生成牙细胞。缩写：En = 珐琅;De = 牙本质;Am = 成釉细胞;Od = 成牙细胞;TACs = 转运扩增细胞;laCL = 唇颈袢;liCL = 舌侧颈袢。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：维护用于实时成像的小鼠门牙外植体。 （A） 描述方案关键步骤的示意图，从解剖门牙到将组织包埋在低熔点琼脂糖中以进行实时成像。灌注装置用于在成像过程中提供恒定的营养供应，并将培养物保持在37°C。 （B-D）用于实时成像的培养皿和灌注室的设置分步演示。介质入口和出口分别显示为粉红色和黄色箭头。缩写：ACBR = Atmospheric Control Barrier Ring。请点击这里查看此图的较大版本.
图3：整个小鼠门牙的分离。（A） 完整的下颌。（B-H）骨头逐渐被移除，露出整个门牙。B 和 C 中的红色虚线表示剃掉覆盖在门牙窝舌侧和颊侧的膜骨后暴露的顶端切牙软组织（协议中的步骤 3.3-3.5）。（D-G）蓝色箭头代表已被移除以隔离整个牙齿的髁突、臼齿和牙槽骨（协议中的步骤 3.6）。比例尺 = 2 mm （H）。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：去除牙周组织进行实时成像。（A-H）来自（A-D）K14Cre的代表性样品;R26rtTA型;tetO-H2B-GFP和（E-H）K14Cre;R26mT/mG小鼠用于我们的方案演示。解剖前，通过骨骼（A，E，黄色箭头）可见牙齿上皮中GFP的表达。白色虚线勾勒出未解剖的门牙。E'表示舌侧。在孤立的门牙（B，C，F，G）中，GFP荧光最初由覆盖顶端切牙的牙周组织（白色和红色箭头）衍射。F 和 G 中的红色荧光标记非上皮细胞。切除牙周组织可以清晰、畅通无阻地看到绿色荧光宫颈袢（D、H、绿色箭头）。比例尺 = 2 mm （A，E）;1.25 毫米（B，F）;和 300 μm （C，D，G，H）。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：K 14 Cre 的延时显微镜;R26rtTA型;tetO-H2B-GFP 颈袢。 （A） 说明延时摄影设置的示意图。（B） K14Cre的代表性z平面;R26rtTA型;tetO-H2B-GFP 门牙唇颈袢，显示 H2B-GFP 的核标记主要在细胞活跃分裂的转运扩增区域。黄色框表示如下所示的放大图像的大致区域。（C-K）延时图像显示相对于 BM 的垂直和倾斜细胞分裂。 （L-N） 延时图像显示了相对于 BM 的水平细胞分裂示例。 （D，G，J，M） 中间面板中显示了处于中期或后期的细胞。每个跟踪分区的原理图显示在右侧。N = 36 μm （B） 中的比例尺;5μm（C-N）。缩写：BM=基底膜。请点击这里查看此图的较大版本.
图6：K 14 Cre的延时显微镜;R26mT/mG 颈袢。 （A） K14Cre的代表性z平面;R26mT/mG 门牙唇颈袢。所有上皮细胞都表达膜GFP。黄色框表示放大图中显示的单元格跟踪区域。（B-G）相对于BM捕获（B-D）水平和（E-G）垂直细胞分裂的延时图像。 （C，F）中间面板显示有丝分裂细胞变圆。每个跟踪分区的原理图显示在右侧。比例尺 = 35 μm （A）;5μm（B-G）。缩写：BM=基底膜。请点击这里查看此图的较大版本.
补充图S1：自制灌注皿。 （A） 35 mm 培养皿可用于制作灌流培养皿。如果使用倒置显微镜进行成像，则可以使用玻璃底培养皿。（B） 用火焰加热钉子。（C） 使用加热的钉子在培养皿的两侧创建两个开口（白色箭头）。（D） 使用环氧树脂胶将两根钝头 16 G 针（一根作为介质入口，另一根作为介质出口）穿过开口。如果需要气体灌注，可以在培养皿中添加第三个开口/针头。 请点击此处下载此文件。
补充视频 S1： K14Cre 的实时成像;R26rtTA型;tetO-H2B-GFP 门牙唇颈袢，显示垂直和斜向细胞分裂。 细胞是手动跟踪的，不同颜色的点代表不同的母/子细胞对。比例尺 = 30 μm（左框）;7 μm（右框）。 请按此下载此影片。
补充视频 S2： K14Cre 的实时成像;R26rtTA型;tetO-H2B-GFP 门牙唇颈袢，显示水平细胞分裂的例子。 水平除法发生在 10 秒标记处，并使用蓝点手动跟踪。比例尺 = 30 μm（左框）;7 μm（右框）。 请按此下载此影片。
补充视频 S3： K14Cre 的实时成像;R26mT/mG 门牙唇颈袢，显示垂直和水平细胞分裂。 细胞是手动跟踪的，不同颜色的圆圈代表不同的母/子细胞对。比例尺 = 30 μm（左框）;7 μm（右框）。 请按此下载此影片。
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Discussion
活体组织成像是一种重要的技术，使我们能够研究细胞在其生态位环境中维持时的动态过程和行为41。理想情况下，实时成像是在 体内以高 时空分辨率进行的。然而，由于组织不可接近、光学不透明以及难以长时间固定动物或器官，哺乳动物器官的 体内 成像可能具有挑战性42。组织外植体绕过了其中一些挑战，并已在许多研究中成功采用，以跟踪细胞行为，例如在牙齿形态发生和外胚层器官发育过程中26。在这里，我们展示了一种相对简单但强大的方案，用于对培养的全成年小鼠门牙进行活体深层组织成像。该技术的应用将帮助我们了解牙齿再生过程中细胞运动的调节、命运决定和组织组织。
由于细胞分裂是易于观察的事件和再生组织的特征，因此我们在这项研究中专注于跟踪分裂细胞，以突出该协议的一种用法。我们发现门牙上皮祖细胞可以经历垂直和水平分裂，因此与其他上皮组织相似43。阐明调控分裂角度的机制并研究分裂取向在细胞命运决定中的作用对未来的研究具有重要意义。将实时成像与携带荧光细胞命运标记、信号通路报告基因或 Fucci 细胞周期报告基因44,45 的不同小鼠遗传模型相结合，将有助于揭示细胞分裂模式和细胞周期动力学如何有助于调节上皮稳态和再生。
该协议中的必要做法是以快速和谨慎的方式进行牙齿解剖，允许在适当的培养条件下快速过渡到并保存完整的组织。我们发现，对于活体成像，在温介质中解剖组织，而不是在旨在提取蛋白质和 mRNA46 的实验中解剖组织，可以保持细胞处于功能状态。由于门牙是一个相对较大的培养器官，因此通过培养基灌注稳定供应营养物质对于整个成像过程中组织的持续维持也至关重要47。如果祖细胞存在于感兴趣的区域，则观察频繁的细胞分裂是组织健康和活跃的良好指标。相反，细胞死亡应该很少见，如果使用核标记物，则可以通过在成像过程中检测明亮和凝聚的核体或在成像和组织固定后进行 TUNEL 染色来验证这一点 48。除营养物质外，氧气水平还可能影响外植体的活力，因为氧张力或不足都会破坏细胞存活、增殖和分化49,50,51。根据我们的经验，在成像过程中，当样品在有或没有额外氧气（例如，95% O2/5% CO2 碳原或 5% CO2/21% O2/平衡 N2）时，我们没有观察到细胞增殖和细胞死亡的明显差异，这表明系统中的痕量氧气足以将门牙上皮细胞维持在培养物中过夜，或者组织可以采用替代途径来维持正常的细胞功能52. 然而，其他细胞过程对氧气的需求或正确的基因表达应在未来的研究中进一步确定。
在我们对该协议的演示中，我们分别使用基因编码的H2B-GFP和膜GFP来标记细胞核和轮廓。这些荧光标记物在双光子显微镜下明亮且持久，因此是用于跟踪细胞运动和分裂的理想标记物。从理论上讲，荧光活染料也可用于标记不同的亚细胞区室，用于 离体 实时成像53，但染料对更深上皮细胞的渗透减少可能会限制它们的使用。同样，虽然标准共聚焦显微镜能够在低于 100 μm 的深度进行高分辨率实时成像，但双光子显微镜可增加成像深度，同时减少光漂白和光毒性54。因此，我们在大多数实时成像应用中选择双光子显微镜作为成像方式。
该协议的一个潜在局限性是门牙外植体可能无法完全概括体内环境和生物学。因此，数据代表了培养条件下的细胞行为，应相应地解释，并在适用时使用其他方法（如组织学）进行验证。我们还必须部分切除牙周组织，以便进入颈袢进行成像。因此，牙周组织和牙齿上皮之间的信号相互作用可能会被破坏。最后，虽然培养基灌注大大提高了培养组织的活力，但它可能会引入流体剪切应力，作为异位机械信号并影响结果55,56。我们尚未确定设置中不同流速的影响。然而，由于1-5 mL/h的低流速通常足以维持营养供应57，因此可以将剪切应力的影响降至最低。考虑到这些局限性，当实验中包含适当的对照时，离体实时成像可以作为一个强大的平台来研究细胞行为的变化。
持续生长的小鼠门牙是一种高度易处理的模型系统，用于研究基于干细胞的组织更新和损伤修复。本文描述的方案为研究人员提供了在培养物中维持整个成人门牙的方法，并通过延时显微镜提取有关细胞行为的时空信息。我们希望这项技术能够广泛地应用于研究牙科研究中使用的不同小鼠遗传模型，并有助于提高我们在牙齿再生领域的知识。
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Disclosures
作者没有需要披露的利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢加州大学洛杉矶分校高级光学显微镜/光谱实验室和加州纳米系统研究所的徕卡显微系统卓越中心（RRID：SCR_022789）提供双光子显微镜。AS得到了以色列科学基金会ISF 604-21的支持。JH 得到了 NIH/NIDCR 的R03DE030205和R01DE030471的支持。AS和JH还得到了美国-以色列两国科学基金会（BSF）的资助2021007。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well, flat bottom tissue culture plate | Olympus plastics | 25-107 | |
| 25x HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | 11507704 | |
| Ascorbic acid (Vitamin C) | Acros Organics | 352685000 | |
| D-(+)-Glucose bioxtra | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Delta T system | Bioptechs | 0420-4 | Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup |
| Dissection microscope- LEICA S9E | Leica | LED300 SLI | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | 11039047 | Basal media without phenol red |
| Feather surgical blade (#15) | Feather | 72044-15 | |
| Fine forceps | F.S.T | 11252-23 | |
| Glutamax | Thermo Scientific | 35050-061 | Glutamine substitute |
| Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | n/a | |
| low-melting agarose | NuSieve | 50080 | |
| non-essential amino acids (100x) | Thermo Scientific | 11140-050 | |
| penicillin–streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Petri dish | Gen Clone | 32-107G | 90 mm |
| Rat serum | Valley Biomedical | AS3061SC | Processed for live imaging |
| Razor blade #9 | VWR | 55411-050 | |
| Scalpel handle | F.S.T | 10003-12 | |
| Scissors | F.S.T | 37133 | |
| serrated forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| spring scissors | F.S.T | 91500-09 |
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