Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

שימוש בהדמיה חיה של Ex Vivo כדי לחקור חלוקות תאים ותנועות במהלך חידוש שיניים של עכבר

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/66020
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2, 1,3
1School of Dentistry, University of California Los Angeles, 2The Institute of Biomedical and Oral Research, Faculty of Dental Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 3Molecular Biology Institute, University of California Los Angeles
* These authors contributed equally

Summary

הדמיה חיה Ex vivo היא טכניקה רבת עוצמה לחקר התהליכים הדינמיים של תנועות תאים ואינטראקציות ברקמות חיות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המיישם מיקרוסקופ של שני פוטונים למעקב חי אחר תאי אפיתל דנטליים בחותכות עכבר בוגרות שלמות בתרבית.

Abstract

החותכת לעכבר הגדלה ללא הרף מתגלה כמערכת מודל בעלת יכולת טיפול גבוהה כדי לחקור את הרגולציה של תאי גזע אפיתל ומזנכימליים בוגרים והתחדשות שיניים. אוכלוסיות אבות אלה מחולקות, נעות ומתמיינות באופן פעיל כדי לשמור על הומאוסטזיס רקמות ולחדש תאים אבודים באופן מגיב. עם זאת, ניתוחים מסורתיים באמצעות קטעי רקמות קבועים לא יכלו ללכוד את התהליכים הדינמיים של תנועות תאים ואינטראקציות, מה שהגביל את יכולתנו לחקור את התקנות שלהם. מאמר זה מתאר פרוטוקול לשמירה על חותכות עכבר שלמות במערכת תרבית אקספלנט ותאי אפיתל דנטליים במסלול חי באמצעות מיקרוסקופ קיטוע זמן מולטיפוטון. טכניקה זו מוסיפה לארגז הכלים הקיים שלנו למחקר דנטלי ומאפשרת לחוקרים לרכוש מידע מרחבי-זמני על התנהגויות תאים וארגונים ברקמה חיה. אנו צופים כי מתודולוגיה זו תסייע לחוקרים להמשיך ולחקור מנגנונים השולטים בתהליכים התאיים הדינמיים המתרחשים הן במהלך חידוש השיניים והן במהלך התחדשותן.

Introduction

במהלך שני העשורים האחרונים, החותכת לעכבר התפתחה כפלטפורמה רבת ערך לחקר עקרונות ויסות תאי גזע בוגרים והתחדשות שיניים 1,2. החותכת לעכבר גדלה ברציפות ומתחדשת לאורך כל חיי החיה. הוא עושה זאת על ידי שמירה על תאי גזע אפיתל ומזנכימליים, אשר יכולים לחדש את עצמם ולהתמיין לסוגי תאים שונים של השן 1,2. בעוד שתאי גזע אפיתליאליים דנטליים מולידים אמלובלסטים, המפרישים את מטריצת האמייל, תאי גזע מזנכימליים דנטליים מולידים אודונטובלסטים, צמנטובלסטים ופיברובלסטים, היוצרים דנטין, צמנטום ורצועה חניכית, בהתאמה 3,4,5,6. אספקה קבועה זו של תאים חדשים שומרת על הומאוסטזיס רקמות ומאפשרת החלפה של תאים ישנים שאבדו עקב שחיקה או פציעות 7,8. הבהרת המנגנונים התאיים והמולקולריים המווסתים את התחזוקה וההתמיינות של תאי גזע דנטליים היא אפוא מרכזית להבנת התחדשות השיניים, תחום בעל עניין הולך וגובר.

מבחינה אנטומית, חלק גדול מהחותכת של העכבר הבוגר עטוף בעצם הלסת. בזמן שהקצה החתך של השן חשוף, הקצה האפי של החותכת נכנס לתוך שקע ומחובר היטב לעצם שמסביב דרך רצועות חניכיים ורקמות חיבור (איור 1A,B). הקצה האפי של החותך הוא גם אזור הצמיחה של השן ושומר על תאי גזע ואב דנטליים הן בשכבת האפיתל והן במוך השן 9,10,11,12,13. באופן ספציפי, תאי גזע אפיתליאליים דנטליים נשמרים בקצה הבולבוסי של האפיתל, הידוע בשם ניצן אפיקלי, המכונה גם לולאה צווארית שפתיים (איור 1C). בדומה לאפיתל המעי ולאפידרמיס, חידוש האפיתל בחותכת נתמך בעיקר על ידי מחזור פעיל של תאי גזע וצאצאיהם המתווכים המתרבים מאוד, הנקראים תאים מגבירי מעבר 14,15,16,17, שניהם שוכנים בחלק הפנימי של לולאת צוואר הרחם. עם זאת, עדיין לא ברור אם אפיתל החותך מכיל ומשתמש בתאי גזע שקטים במהלך ההתחדשות. לעומת זאת, במוך השן זוהו תאי גזע מזנכימליים דנטליים פעילים ושקטים כאחד, ותאי הגזע השקטים מתפקדים כאוכלוסיית מילואים המופעלת במהלך תיקון פציעה13,18.

רבות מהתגליות על הביולוגיה של ההתחדשות וההתחדשות של החותכות בעכבר נבעו מחקירות היסטולוגיות, שבהן הדגימות מתקבלות בצמתים זמניים נפרדים, מקובעות, מעובדות ואז נחתכות לפרוסות דקות מיקרון לאורך מישור מסוים. באמצעות ניתוח מפורט של קטעים היסטולוגיים ממודלים שונים של עכברים המאפשרים מעקב אחר שושלות או הפרעות גנטיות, מדענים זיהו את שושלות התאים של אוכלוסיות אבות שונות, כמו גם את המסלולים הגנטיים והאיתות השולטים בהומאוסטזיס חותך ותיקון פציעות 19,20,21. עם זאת, התמונות הדו-ממדיות (דו-ממדיות) הסטטיות של תאים לא חיוניים במקטעים אינן יכולות ללכוד את הספקטרום המלא של התנהגויות תאיות וארגונים מרחביים ברקמה חיה, כגון שינויים בצורת התא, תנועות וקינטיקה תאית. זיהוי ומדידה של שינויים תאיים מהירים אלה, המתרחשים בקנה מידה של ציר זמן שאינו ניתן לפתרון באמצעות חתך רקמות, דורשים אסטרטגיה שונה. יתר על כן, רכישת מידע כזה היא גם קריטית להבנת האופן שבו תאים דנטליים מתקשרים זה עם זה, מגיבים לגירויי איתות שונים ומתארגנים בעצמם כדי לשמור על מבנים ותפקודים של רקמות.

הופעתו של דימות רקמות עמוק ארבע-ממדי (4D) באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני22, טכנולוגיה המשלבת שלושה ממדים מרחביים עם רזולוציה טמפורלית, מתגברת על המגבלות המובנות של ניתוח היסטולוגי בכך שהיא מאפשרת בדיקה מרחבית-זמנית של צמחי רקמה בתרבית, אורגנואידים או אפילו רקמות באתרן 23,24,25,26 . לדוגמה, הדמיה חיה 4D של אפיתל השן המתפתח חשפה את הדפוסים המרחביים-זמניים של חלוקות תאים ונדידה המתאמים צמיחת רקמות, היווצרות מרכזי איתות ומורפוגנזה אפיתל דנטלי 27,28,29,30,31,32. בחותך עכבר בוגר, הותאמה לאחרונה הדמיה 4D לחקר התנהגויות תאיות במהלך תיקון פגיעה באפיתל דנטלי. הדמיה חיה גילתה כי תאים בין-בינוניים בשכבה העל-בסיסית יכולים להיות מומרים ישירות לאמלובלסטים בשכבת הבסיס כדי לחדש את האפיתל הפגוע, מה שמאתגר את הפרדיגמה המסורתית של תיקון פגיעה אפיתל15.

כאן אנו מתארים את הדיסקציה, ההתרבות וההדמיה של חותך העכבר הבוגר, תוך התמקדות בתאי אפיתל בלולאה הצווארית העבתית (איור 1). טכניקה זו משמרת את חיוניות תאי השיניים למשך יותר מ-12 שעות ומאפשרת מעקב חי אחר תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי ברזולוציה של תא יחיד. גישה זו מאפשרת לחקור את תנועת התא ונדידתו, כמו גם שינויים דינמיים בצורת התא ובכיוון החלוקה בתנאי תרבית רגילים, או בתגובות להפרעות גנטיות, פיזיקליות וכימיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל העכברים הוחזקו במתקנים נטולי פתוגנים של בעלי חיים באוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס (UCLA) או באוניברסיטה העברית בירושלים (HUJI). כל הניסויים בעכברים בוצעו בהתאם לתקנות ולפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) או (MD-23-17184-3; הוג'י). זרימת עבודה כללית של שלבי הניסוי מוצגת באיור 2A. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל המכשירים, הריאגנטים והחומרים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הכנת פתרונות וג'לים

  1. אמצעי דיסקציה: הכינו DMEM/F12 טרי עם 0.5% גלוקוז ושמרו אותו חם בטמפרטורה של 37°C עד לצורך בשלב 2.4.
    הערה: אנו משתמשים ב-DMEM/F12 ללא פנול אדום כדי להפחית את הפלואורסצנטיות העצמית במהלך הדמיה חיה.
  2. 1x מדיום תרבית: הכינו מדיום טרי באמצעות 50% DMEM/F12, 50% סרום חולדות, 1x תחליף גלוטמין, 1x MEM חומצות אמינו לא חיוניות, 1% גלוקוז, 0.1 מ"ג/מ"ל חומצה L-אסקורבית, ו-0.5% פניצילין-סטרפטומיצין. שמור אותו חם ב 37 ° C עד הצורך בשלב 5.5. מדיום זה משמש לגידול צמחים חותכים במהלך הדמיה חיה.
    הערה: סרום החולדות צריך להיות באיכות גבוהה ומוכן במיוחד לגידול רקמות שלמות על ידי חוקרים או ממקור מסחרי. בפרט, הדם חייב להיות צנטריפוגה (במשך 5 דקות ב 1,200 × גרם בטמפרטורת החדר) לפני קרישה מתחיל להיווצר. לאחר צנטריפוגה, קריש הפיברין שנוצר צריך להיות סחוט ולהשליך33.
  3. ג'ל תרבית: מטרת הג'ל היא לשתק דגימות במהלך ההדמיה והוא מוכן טרי.
    1. הכינו 2% ג'ל ב-DMEM/F12 על ידי המסת אגרוז ב-200 מ"ג של אגרוז ב-10 מ"ל DMEM/F12 באמצעות מיקרוגל. יש לשמור את הג'ל 2% על 37°C.
    2. הפוך 2x תרבית בינונית (ללא DMEM/F12) על ידי ערבוב 50% סרום חולדה, 1x תחליף גלוטמין, 1x MEM חומצות אמינו לא חיוניות, 1% גלוקוז, 0.1 מ"ג / מ"ל חומצה L-אסקורבית, ו 0.5% פניצילין-סטרפטומיצין. חממו את מדיום התרבית פי 2 (ללא DMEM/F12) ל-37°C.
    3. הכינו ג'ל תרבית 1% על ידי ערבוב נפחים שווים של 2% ג'ל ו-2x מדיום תרבית (ללא DMEM/F12). שמור את ג'ל התרבית 1% על 37 ° C עד הצורך בשלב 5.1.
      הערה: יש לוודא שכל התמיסות חמות לפני הערבוב כדי למנוע ג'ל. מצאנו שג'ל 1% מתאים לגידול חותך עכבר בוגר. אחוז הג'ל צריך להיקבע אמפירית אם רקמות אחרות צריכות להיות בתרבית.

2. חילוץ הלסת התחתונה של העכבר הבוגר

  1. יש להרדים עכברים בגיל הרצוי באמצעות הליכים סטנדרטיים שאושרו על ידי IACUC.
    הערה: כאן אנו משתמשים בחנק CO2 ואחריו פריקת צוואר הרחם. התקנות להמתת חסד של בעלי חיים עשויות להשתנות באזורים שונים. על החוקרים לקבל את האישור המוסדי הדרוש לפני ביצוע ניסויים ולהבטיח עמידה בתקנות הטיפול המקומיות בבעלי חיים.
  2. יש לחטא את העכבר באמצעות אתנול 70%.
  3. ערפו את ראשו של העכבר וחלצו את הלסת השמאלית והימנית.
    1. הנח את העכבר על בטנו, ולאחר מכן השתמש בסכין גילוח תעשייתית בעלת קצה יחיד #9 כדי לחתוך באזור הצוואר ולהפריד את ראש העכבר משאר הגוף.
      הערה: אם יש לאסוף גם רקמות מאזור הלוע או הצוואר, אין לבצע עריפת ראש, וניתן להמשיך ישירות לשלב 2.3.2.
    2. הפוך את העכבר כך שהצד הגחוני שלו פונה כלפי מעלה והלסת התחתונה תהיה נגישה בקלות.
    3. אבטחו את ראשו של בעל החיים על ידי החזקתו בעדינות בין האגודל לאצבע המורה.
    4. השתמש בסכין הגילוח כדי לבצע חתך באמצע הקשת שחותך את עור הלסת התחתונה מהשפה התחתונה לכיוון הצוואר.
      הערה: להב כירורגי #15 יכול לשמש גם לביצוע החתך והדיסקציות הבאות (שלבים 2.3.6-2.3.9).
    5. בעת ביצוע החתך, יש לפזר את העור החתוך באמצעות האגודל והאצבע המורה כדי לחשוף את השרירים ועצם הלסת שמתחת.
    6. השתמש בסכין הגילוח כדי לקטוע את שרירי המסה בצד הבוקאלי של הלסת התחתונה, כך שהחלק החיצוני של הלסת השמאלית והימנית נקיים כעת מחיבורי שרירים.
    7. לנתק את השרירים mylohyoid לאורך הצד הפנימי של הלסת כדי להסיר את חיבורי השרירים שם.
    8. בצע חתך נוסף בסימפיזיס המנדיבולרי המחבר בין שני hemimandibles. לאחר החיתוך, הלסת התחתונה תופרד לחצי השמאלי והימני.
    9. תקעו את סכין הגילוח בין הקונדיל המנדיבולרי לבין המפרק המנדיבולרי הרקתי ונתחו בזהירות את ההמיס משאר הראש.
      הערה: מצאנו שזה מועיל למשוך בו זמנית בעדינות על החותכת בזמן החיתוך. יש להקפיד להימנע משבירת הלסת התחתונה ומפגיעה ברקמות הרכות שבתוכו.
  4. העבירו מיד לסת לסתית מנותחת לצלחת פטרי עם אמצעי הדיסקציה שחוממו מראש (שלב 1.1) והוציאו את רקמות השריר הנותרות באמצעות להב כירורגי #15.
    הערה: שמירת דגימות במדיה קרה מאטה את פעילות התא, וכתוצאה מכך שחזור מושהה או אפילו כושל של פעילויות תאים מסוימות, כגון התרבות או תנועת תאים, במהלך הדמיה חיה.

3. בידוד של כל חותכות העכבר

הערה: בידוד נוסף של החותכת נעשה תחת מיקרוסקופ דיסקציה של שדה בהיר.

  1. זהה חזותית את האזור הסגלגל של הלסת התחתונה המכסה את שקע החותכת ומאכלס את החלק האפי של החתך.
  2. מקם את הלסת כך שהמשטח הפנימי (הלשוני) פונה כלפי מעלה.
  3. תוך כדי החזקת הלסת התחתונה במקום עם זוג מלקחיים משוננים, צור חלון באזור הסגלגל על ידי גילוח עצם הקרום שמעל באמצעות להב כירורגי #15, בכיוון שהוא מהקונדיל לכיוון הטוחנות. זה חושף את הרקמה הרכה של החותכת האפיקלית על פני השטח הפנימי.
  4. הפוך את הלסת התחתונה כך שהמשטח החיצוני (הבוקאלי) פונה כלפי מעלה.
  5. צור חלון באזור הסגלגל בלסת התחתונה החיצונית כמתואר בשלב 3.3 והשתמש בקצה האזמל כדי לאסוף את שברי העצם שנותרו בקצה. ודא שהקצה האפי של השן גלוי משני הצדדים.
    הערה: הימנע מלחץ מוגזם בעת גילוח העצמות כדי למנוע נזק לרקמה הרכה שמתחתיה.
  6. חתכו באופן שיטתי את העצמות המקיפות את החותכת כדי לבודד את השן כולה.
    1. בצע חתך נקי במישור הסמוך מיד לחותכת אפיקלית כדי להסיר תחילה את התהליך הקונדילרי.
      הערה: היזהרו לא לחתוך לתוך החתך.
    2. בצע חתך שני רק אחורי לטוחנת 3, אך גבי לחותכת מבלי לפגוע בשן. פעולה זו מסירה את העצם הכוללת את התהליך הקורונואידי.
    3. חותכים באופן סדרתי מקצה התהליך הזוויתי לכיוון החותכת כדי להסיר בהדרגה את הלסת הגחונית בצורה מדורגת.
      הערה: אפיתל השיניים ורקמות החניכיים הקשורות אליו נדבקים לעתים קרובות לעצם ונקרעים בקלות אם חלק גדול מעצם הגחון נחתך בבת אחת. כדי להפריד את העצם מהרקמה הרכה החותכת, ניתן להחדיר את האזמל (או זוג מלקחיים חדים שאינם משוננים) בין שתי הרקמות בקצה האפי של החותכת ולהחליק בעדינות את המכשיר קדימה.
    4. חותכים את עצם הנאדית עם טוחנות וכל העצמות הנותרות שעדיין מחוברות לחתך.
    5. החותכת כולה מבודדת כעת. מעבירים את החותכת המנותחת במלואה לצלחת עם מדיית דיסקציה נקייה וחמה (שלב 1.1).
  7. חזור על שלבים 3.2-3.6 כדי לבודד חותכות נוספות לפי הצורך.
    הערה: החותכות המקסילריות/עליונות של העכבר שומרות גם על תאי גזע בוגרים וניתן להשתמש בהן לחקר התחדשות שיניים34. חוקרי שיניים מתמקדים בדרך כלל בחותכות התחתונות מכיוון שהן נגישות יותר וניתן לנתח אותן בקלות רבה יותר מאשר החותכות העליונות. ההבדלים בין תאי אב חותכים מנדיבולריים ומקסילריים נותרו לקבוע.

4. הסרת רקמות חניכיים לחשיפת לולאת צוואר הרחם החותכת אפיתל

  1. כאשר כל החותכת שוכבת על הצד הלשוני שלה ותוך כדי החזקת השן במקומה עם זוג מלקחיים משוננים, השתמש בזוג מלקחיים עדינים #5 כדי להתחיל לתחוב על רקמות החניכיים המכסות את החותכת האפיקלית ואת אזור הלולאה הצווארית.
  2. מקלפים בזהירות את רקמת החניכיים מהניצן האפיקאלי, כך שהצד הצדדי של הלולאה הצווארית (או אזורי עניין אחרים) הופך גלוי מתחת להיקף.
    הערה: יש להקפיד להימנע מפגיעה באפיתל הדנטלי או ניתוקו מהמזנכימה. אם לחותכת יש אותות פלואורסצנטיים באזור העניין, ומיקרוסקופ דיסקציה פלואורסצנטית זמין, ניתן להשתמש באותות פלואורסצנטיים כדי לסייע בהבחנה בין סוגי רקמות ולסייע בנתיחות. חשוב לבצע ביעילות את סעיפים 2-4 כדי שניתן יהיה להעביר דגימות במהירות לאמצעי התרבות ולתחזק אותן כראוי באמצעות תרבית אקספלנט (ראו להלן).

5. שיבוץ רקמות לתרבית צמחים

  1. מוסיפים 500 μL של ג'ל תרבית חם ולא מוצק לבאר בצלחת של 24 בארות ומעבירים במהירות את החותכות השלמות המנותחות לבאר. מערבלים את הצלחת מספר פעמים כדי לשטוף את החותכות.
  2. מוסיפים 400 μL של ג'ל תרבית חם ולא מוצק לצלחת תרבית ומעבירים את החותכות השטופות לצלחת.
    הערה: אנו משתמשים בצלחת תרבית זמינה מסחרית התואמת למערך הזילוח. ראה שלב 6.4 לקבלת אפשרויות חלופיות.
  3. כוונו את החותכת כך שתמקם את אזור הלולאה הצווארית (או אזורי עניין אחרים) במרכז הצלחת (איור 2A,B) והתאימו את ההטיה של החותכת האפיקלית למישור ההדמיה הרצוי.
    הערה: כיוון הרקמה צריך להיעשות במהירות לפני ג'לציה מלאה.
  4. לאחר הגדרת הג'ל, השתמשו בזוג מלקחיים עדינים כדי להסיר את הג'ל מעל האזור המעניין כך שהוא לא יהיה מכוסה בג'ל.
  5. הוסף נפח מספיק של מדיה תרבותית חמה על ידי pipeting איטי על קצה המנה רק לכסות את הדגימה (~ 150 μL).
  6. העבר את תרבית הצמחים לאינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר שיקוע רקמות והתאמה למצב התרבית למשך שעה אחת.

6. מיקרוסקופ Timelapse של צמחים חותכים

הערה: בניסוי הזה השתמשנו במיקרוסקופ זקוף המצויד במטרה לטבול מים פי 25 עם צמצם מספרי של 1. באופן כללי, עדשת טבילה במים עם צמצם מספרי גבוה מתאימה ביותר להדמיית רקמות עמוקות.

  1. הפעל את המיקרוסקופ ואת הלייזר של שני פוטונים.
  2. הצמידו את צלחת התרבית למתאם הבמה והרכיבו את טבעת מתאם הזלוף מעליה (איור 2C).
  3. חבר את מתאם הבמה לבקר טמפרטורה שהוגדר כדי לשמור על התרבית ב- 37 ° C.
  4. חבר את הכניסה ואת היציאה של טבעת המתאם למשאבת מיקרו-זילוח והתחל בזילוח של מדיום התרבית, כאשר מהירות הזילוח מוגדרת על 20 במשאבה. זה יוצר זרימה איטית (~5 מ"ל/שעה) של תווך התרבית מעל החלק העליון של הדגימות (איור 2C).
    הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על המערכת לשמירה על הרקמה בסביבה מבוקרת יציבה. ניתן להשתמש גם במערכות אחרות. ניתן להשתמש גם בשילוב של פלטת חימום בטמפרטורה של 37°C וצלחת תרבית זילוח ביתית (איור משלים S1) עם פתח כניסה ושקע המחוברים למשאבות מזרק.
  5. הניחו טבעת מחסום בקרה אטמוספרי (ACBR) על גבי טבעת המתאם, והנמיכו את המטרה דרך ה-ACBR כדי ליצור מגע עם מדיום התרבית (איור 2D).
  6. כוונן את אורך גל הלייזר ל- 920 ננומטר כדי להמחיש הן את האותות GFP והן את האותות הפלואורסצנטיים האדומים (למשל, tdTomato).
  7. אתר דגימות דרך עיניות ולאחר מכן על תוכנת המיקרוסקופ.
  8. הגדר ערימות Z, הדמיה מרובת מיקומים ומרווחי זמן באמצעות התוכנה. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש בגודל z-step של 4 מיקרומטר ובמרווח זמן של 5 דקות למשך 14 שעות.
    הערה: מצאנו שמרווח זמן של יותר מ-5 דקות לעתים קרובות אינו מספיק כדי ללכוד תנועות וחלוקות חלקות של תאים.
  9. התחל את ההדמיה של קיטועי הזמן.
    הערה: מיקום הדגימה עשוי להשתנות במהלך השעה הראשונה וייתכן שיידרשו התאמות נוספות.
  10. שמור קבצים לעיבוד וניתוח נתונים במורד הזרם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

האזור האפי של חותכת העכבר הבוגר עטוף בתוך הלסת התחתונה (איור 1) ולכן אינו נגיש ישירות להדמיה ולמעקב חי אחר תאי האב השוכנים באזור הגדילה. לכן, פיתחנו שיטה לחלץ את כל החותכת מעצם הלסת ולתחזק אותה במערכת תרבית אקספלנט עבור מיקרוסקופ בהילוך מהיר של שני פוטונים (איור 2). כאן אנו מתארים תוצאות מייצגות הלוכדות את התהליך הדינמי של התפשטות תאים ותנועה באזור הלולאה הצווארית של אפיתל השיניים.

כדי להדגים את ההליכים הניסיוניים, השתמשנו בשני מודלים שונים של עכברים המבטאים פלואורסצנטיות ירוקה באפיתל הדנטלי. קו העכבר הראשון הוא K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP, כאשר K14Cre (MGI:2680713) מבטא את Cre recombinase ממקדם קרטין 1435 ומפעיל את הביטוי של טרנסאקטיבטור נשלט טטרציקלין הפוך באפיתל מאלל R26rtTA 36 (MGI:3584524). עם מתן דוקסיציקלין, rtTA משרה ביטוי היסטון H2B-GFP מאלל tetO-H2B-GFP 37 (MGI:3043783) ומתייג גרעיני תאי אפיתל עם פלואורסצנטיות ירוקה. זה שימושי במיוחד למעקב אחר תאים ולזיהוי חלוקות תאים. בניסוי הזה האכלנו בעלי חיים במזון דוקסיציקלין במשך 24 שעות לפני ההקרבה כדי להפעיל ביטוי H2B-GFP. קו העכבר השני הוא K14Cre; R26mT/mG, שבו R26mT/mG (MGI:3803814) הוא Cre-reporter38. בהיעדר פעילות Cre, תאים מבטאים tdTomato מקומי קרום (mT) עם פלואורסצנטיות אדומה. לאחר רקומבינציה בתיווך Cre, תאים מבטאים GFP ממברנה (mG). K14Cre; R26mT/mG מסמן אפוא את קרומי תאי האפיתל בפלואורסצנטיות ירוקה, ומשאיר תאים שאינם אפיתל אדומים. הדבר מאפשר הדמיה קלה של צורות תאים, חלוקות ותנועות.

התחלנו את התהליך על-ידי ניתוח הלסת התחתונה (איור 3A) ולאחר מכן הסרנו באופן שיטתי את כל העצמות המקיפות את החותכת (איור 3B-G). זה הניב חותכות שלמות עם אפיתל שלא ניזוק (איור 3H). אישרנו את שלמות אפיתל השיניים על ידי בדיקת הפלואורסצנטיות הירוקה ב- K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP ו- K14Cre; עכברי R26mT/mG (איור 4A,B,E,F). בשלב זה, רקמות החניכיים האטומות עדיין מכסות את החותך האפיקאלי, ולכן הלולאה הצווארית נראית מטושטשת עקב פיזור אור, אשר באופן דומה יעכב את הדמיית הילוך הזמן במורד הזרם (איור 4C,G). לכן הסרנו בזהירות את רקמות החניכיים, כך שניתן היה להבחין באפיתל הדנטלי עם הלולאה הצווארית בכל אחת מהחותכות (איור 4D,H).

לאחר מכן הוטמעו החותכות באגרוז בנקודת התכה נמוכה וגודלו בתרבית במערך זילוח לצורך הדמיה חיה של שני פוטונים כפי שמתואר באיור 2. עבור התרגיל הזה התמקדנו באזור הלולאה הצווארית של אפיתל השיניים וצילמנו תמונות מחסנית z במרווחים של 4 מיקרומטר כל 5 דקות במשך 14 שעות (איור 5A). יש לציין כי אותות H2B-GFP נצפו בעיקר באזור הגברת המעבר של לולאת צוואר הרחם, שם יש חלוקות תאים פעילות (איור 5B). סביר להניח שהסיבה לכך היא שיש חילופי H2B-GFP גבוהים יותר בכרומטינים פתוחים ושילוב בנוקלאוזומים בעקבות שכפול דנ"א בתאים פעילים אלה39.

לאחר מכן בחנו את התמונות בהילוך מהיר באמצעות ImageJ ובהתבסס על ההפרדה של אותות H2B-GFP40, הצלחנו לצפות בחלוקות תאים רבות לאורך תקופת ההדמיה (וידאו משלים S1 ווידאו משלים S2). זה הצביע על כך שהרקמות נשמרו כראוי בתרבית explant והתאים היו פעילים. באופן ספציפי, הצלחנו לצפות בעיבוי ויישור של כרומוזומים בלוח המטא-פאזי בתאים מיטוטיים, ולאחר מכן בהפרדה שלהם לשני תאי בת במהלך שלב הניתוח (איור 5C-N, במעקב ידני באמצעות תוסף TrackMate של ImageJ). רוב החלוקות הללו היו ניצבות או בזווית אלכסונית ביחס לקרום המרתף (איור 5C-K ווידאו משלים S1). ניתן היה לזהות גם חלוקות אופקיות מקבילות לקרום המרתף, אם כי הן מתרחשות בתדירות נמוכה יותר (איור 5L-N ווידאו משלים S2). חשוב לציין כי ציטוקינזיס באפיתל הדנטלי קורה לעתים קרובות במהירות, תוך 5-10 דקות. כתוצאה מכך, מרווחי זמן של יותר מ-5 דקות עלולים להחמיץ חלק מהחלוקות הללו.

אירועי חלוקת תאים ניכרו גם ב-K14Cre; R26mT/mG לולאות צוואר הרחם, שבהן כל קרומי תאי האפיתל סומנו בירוק (איור 6A). יכולנו לזהות תאים מיטוטיים לפי עיגול התאים שלהם ולאחר מכן ציטוקינזיס (וידאו משלים S3), וניתן היה לצפות בחלוקות תאים אנכיות ואופקיות (איור 6B-G), ובכך להיות דומות לתוצאות שהתקבלו באמצעות H2B-GFP. יחד, תוצאות אלה מראות כי פרוטוקול זה יכול לשמש ככלי רב עוצמה לחקר התנהגויות תאים בצמחים החותכים בשילוב עם מודלים גנטיים של עכברים המסמנים באופן פלואורסצנטי מבנים תת-תאיים נפרדים.

Figure 1
איור 1: סכמות של לסת העכבר ולולאת צוואר הרחם החותכת. (A) חלק ניכר מהחותכת מוטמע בעצם הלסת. אזור הצמיחה ממוקם בקצה האפי של השן ותומך בצמיחתה המתמשכת (חץ ירוק כהה). (B) הגדלה של החותך האפיקאלי, המוקף ברקמות חניכיים. השן מורכבת אמייל דנטין, שהם מבנים מינרליים מאוד שנוצרו על ידי ameloblasts ו odontoblasts, בהתאמה. (C) חתך סגיטלי של החותך האפיקאלי, המראה כי תאי אב אפיתל דנטלי ותאים מגבירי מעבר שוכנים בלולאה הצווארית האבליאלית ויוצרים אמלובלסטים באפיתל הדיסטלי יותר (חץ מקווקו ירוק כהה). בהשוואה ללולאת צוואר הרחם השפתיים, הלולאה הצווארית הלשונית קטנה יותר בגודלה ואינה יוצרת בדרך כלל אמלובלסטים. תאי גזע מזנכימליים דנטליים נמצאים במוך השן (האזור הסגול) ומעוררים אודונטובלסטים. קיצורים: En = אמייל; דה = דנטין; Am = אמלובלסט; Od = odontoblast; TACs = תאים מגבירי מעבר; laCL = לולאה צווארית שפתיים; liCL = לולאת צוואר הרחם הלשונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: שמירה על עציץ חותך עכבר עבור הדמיה חיה. (A) סכמות המתארות שלבים מרכזיים של הפרוטוקול, החל מניתוח החותכת ועד להטמעת הרקמה בנקודת התכה נמוכה לצורך הדמיה חיה. מערך זילוח משמש כדי לספק אספקה קבועה של חומרים מזינים במהלך הדמיה והתרבית נשמרת ב 37 ° C. (B-D) הדגמה שלב אחר שלב של הגדרת צלחת התרבית ואת תא הזילוח עבור הדמיה חיה. כניסת המדיה ושקע המדיה מוצגים כחצים ורודים וצהובים בהתאמה. קיצור: ACBR = טבעת מחסום בקרה אטמוספרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: בידוד של כל חותך העכבר. (A) לסת שלמה. (ב-ח) העצמות הוסרו בהדרגה כדי לחשוף את כל החתך. קווים מקווקווים אדומים ב-B ו-C מראים את הרקמה הרכה החשופה של החותכת האפיקלית לאחר גילוח עצם הממברנה שמעל הצדדים הלשוניים והבוקליים של שקע החותכת (שלבים 3.3-3.5 בפרוטוקול). (ד-ג) ראשי חץ כחולים מייצגים את הקונדילים, הטוחנות ועצמות הנאדיות שהוסרו כדי לבודד את השן כולה (שלב 3.6 בפרוטוקול). סרגל קנה מידה = 2 מ"מ (H). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הסרת רקמות חניכיים לצורך הדמיה חיה. (א-ח) דוגמאות מייצגות מ (A-D) K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP, ו- (E-H) K14Cre; עכברי R26mT/mGשימשו בהדגמה שלנו של הפרוטוקול. לפני הדיסקציה, ביטוי GFP באפיתל הדנטלי היה גלוי דרך העצם (A,E, ראשי חץ צהובים). קווים מקווקווים לבנים מתארים את החותכות שלא נותחו. E' מראה את הצד הלשוני. בחותכות מבודדות (B,C,F,G), פלואורסצנטיות GFP התפזרה בתחילה על ידי רקמות החניכיים שכיסו את החותכות האפיקליות (ראשי חץ לבנים ואדומים). פלואורסצנטיות אדומה ב- F ו- G מתייגת תאים שאינם אפיתל. הסרת רקמות חניכיים מאפשרת מבט ברור וללא הפרעה על לולאות הצוואר הפלואורסצנטיות הירוקות (D,H, ראשי חץ ירוקים). סרגל קנה מידה = 2 מ"מ (A,E); 1.25 מ"מ (B,F); ו-300 מיקרומטר (C,D,G,H). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: מיקרוסקופ Timelapse של K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP לולאה צווארית. (A) סכמה הממחישה את הגדרת קיטוע הזמן. (B) מטוס z מייצג של K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP חותכת לולאה צווארית שפתיים, מראה תיוג גרעיני על ידי H2B-GFP בעיקר באזור הגברת המעבר, שבו התאים מתחלקים באופן פעיל. התיבה הצהובה מייצגת את האזור הכללי של התמונות המוגדלות המוצגות להלן. (ג-ק) תמונות קיטועי זמן המציגות חלוקות תאים אנכיות ואלכסוניות ביחס ל- BM. (L-N) תמונות קיטועי זמן מציגות דוגמה לחלוקת תאים אופקית ביחס ל- BM. (D,G,J,M) תאים במטאפאזות או באנפאזות מוצגים בחלוניות האמצעיות. סכמות של כל חלוקה מסומנת מוצגות מימין. סרגל קנה מידה ב- N = 36 מיקרומטר (B); 5 מיקרומטר (C-N). קיצור: BM = קרום מרתף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: מיקרוסקופ Timelapse של K14Cre; R26mT / mG לולאת צוואר הרחם. (A) מטוס z מייצג של K14Cre; R26mT/mG חותך לולאת צוואר הרחם. כל תאי האפיתל מבטאים GFP של הממברנה. התיבה הצהובה מייצגת את אזור המעקב אחר תאים המוצג בהגדלות. (ב-ג) תמונות קיטועי זמן שלוכדות הן את חלוקות התאים האופקיות (B-D) והן את חלוקות התאים האנכיות (E-G), יחסית ל- BM. (C,F) לוחות אמצעיים מציגים עיגול תאים מיטוטיים. סכמות של כל חלוקה מסומנת מוצגות מימין. סרגל קנה מידה = 35 מיקרומטר (A); 5 מיקרומטר (B-G). קיצור: BM = קרום מרתף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים S1: צלחת זילוח תוצרת בית. (A) ניתן להשתמש בכלי תרבית בקוטר 35 מ"מ להכנת צלחת זילוח. ניתן להשתמש בצלחת תחתית זכוכית אם ההדמיה מתבצעת באמצעות מיקרוסקופ הפוך. (B) לחמם מסמר בלהבה. (C) שני פתחים (ראשי חץ לבנים) נוצרים משני צדי הצלחת באמצעות המסמר המחומם. (D) הדביקו שתי מחטים קהות 16 גרם, האחת ככניסת המדיה והשנייה ככלי התקשורת, דרך הפתחים באמצעות דבק אפוקסי. אם רוצים זילוח גז, ניתן להוסיף פתח/מחט שלישית לצלחת. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

וידאו משלים S1: הדמיה חיה של K14 Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP חותך לולאת צוואר הרחם, מראה חלוקות תאים אנכיות ואלכסוניות. מעקב ידני אחר תאים, ונקודות בצבעים שונים מייצגות זוגות שונים של תאי אם/בת. סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר (מסגרת שמאלית); 7 מיקרומטר (מסגרת ימנית). אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

וידאו משלים S2: הדמיה חיה של K14 Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP חותכת לולאה צווארית שפתיים, מראה דוגמה לחלוקת תאים אופקית. החלוקה האופקית מתבצעת בסימן 10 שניות ומתבצע מעקב ידני באמצעות נקודות כחולות. סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר (מסגרת שמאלית); 7 מיקרומטר (מסגרת ימנית). אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

וידאו משלים S3: הדמיה חיה של K14 Cre; R26mT/mG חותך לולאה צווארית שפתיים, המראה חלוקות תאים אנכיות ואופקיות. מעקב ידני אחר תאים, ועיגולים בצבעים שונים מייצגים זוגות שונים של תאי אם/בת. סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר (מסגרת שמאלית); 7 מיקרומטר (מסגרת ימנית). אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הדמיית רקמות חיות היא טכניקה חשובה המאפשרת לנו לחקור את התהליכים וההתנהגויות הדינמיים של תאים כאשר הם נשמרים בסביבת הנישה שלהם41. באופן אידיאלי, הדמיה חיה מבוצעת in vivo עם רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה. עם זאת, הדמיה in vivo עבור איברים יונקים יכול להיות מאתגר בשל חוסר נגישות רקמות, אטימות אופטית, וקושי לשתק את החיה או את האיבר לתקופה ממושכת42. צמחי רקמות עוקפים חלק מהאתגרים הללו ואומצו בהצלחה במספר מחקרים למעקב אחר התנהגויות תאים, כגון במהלך מורפוגנזה של השן והתפתחות איברים אקטודרמליים26. כאן, הדגמנו פרוטוקול פשוט יחסית אך חזק לביצוע הדמיה חיה של רקמות עמוקות על חותכות עכבר בוגרות שלמות בתרבית. יישום טכניקה זו יעזור לנו להבין את הוויסות של תנועות תאים, החלטות גורל, וארגון רקמות במהלך התחדשות שיניים.

מכיוון שחלוקות תאים הן אירועים קלים לצפייה ואופייניים לרקמות מתחדשות, התמקדנו במחקר זה במעקב אחר תאים מתחלקים כדי להדגיש שימוש אחד בפרוטוקול. מצאנו כי אבות אפיתל חותכים יכולים לעבור חלוקות אנכיות ואופקיות כאחד, ובכך דומים לרקמות אפיתל אחרות43. הבהרת המנגנון המווסת את זוויות החלוקה וחקירת תפקידן של כיווני החלוקה בהחלטות גורל התא יהיו בעלי חשיבות במחקרים עתידיים. שילוב הדמיה חיה עם מודלים גנטיים שונים של עכברים הנושאים גם סמני גורל תאים פלואורסצנטיים, כתבי מסלול איתות, או כתב מחזור התא של פוצ'י44,45 יעזור לחשוף כיצד דפוסי חלוקת התא ודינמיקה של מחזור התא תורמים לוויסות הומאוסטזיס אפיתל והתחדשות.

תרגול הכרחי בפרוטוקול זה הוא לבצע דיסקציה של השן באופן מהיר וזהיר, המאפשר מעבר מהיר ושימור של הרקמה השלמה במצב הטיפוח המתאים. מצאנו כי עבור הדמיה חיה, ניתוח רקמות במדיה חמה, ולא במדיה קרה, כמו בניסויים שמטרתם לחלץ חלבונים ו-mRNA46, שומר על תאים במצב תפקודי. מכיוון שהחותכת היא איבר גדול יחסית לתרבית, אספקה קבועה של חומרים מזינים באמצעות זילוח מדיה היא קריטית גם לקיום הרקמה במהלך הדמיה47. אם תאי האב נמצאים באזור המעניין, תצפית על חלוקות תאים תכופות היא אינדיקטור טוב לכך שהרקמה בריאה ופעילה. לעומת זאת, מוות תאי צריך להיות נדיר, וניתן לאמת זאת על ידי גילוי גופים גרעיניים בהירים ודחוסים במהלך הדמיה אם נעשה שימוש בסמן גרעיני או על ידי ביצוע צביעת טונל לאחר הדמיה וקיבוע רקמות48. בנוסף לחומרים מזינים, רמות החמצן עשויות להשפיע גם על יכולת הקיום של הצמחים, שכן מתח חמצן או מחסור בחמצן יכולים לשבש את הישרדות התא, שגשוגו והתמיינותו 49,50,51. מניסיוננו, לא ראינו הבדלים נראים לעין בהתפשטות תאים ובמוות תאי כאשר הדגימות סופקו עם או בלי חמצן נוסף (למשל, 95% O2/5% CO2 carbogen או 5% CO2/21% O2/balanced N2) במהלך ההדמיה, דבר המצביע על כך שכמות זעירה של חמצן במערכת מספיקה כדי לשמור על אפיתל חותך בתרבית למשך הלילה, או שהרקמה יכולה להשתמש במסלולים חלופיים כדי לשמור על תפקודי תאים תקינים52. עם זאת, הדרישה לחמצן בתהליכים תאיים אחרים או ביטוי גנים נכון צריכה להיקבע עוד יותר במחקרים עתידיים.

בהדגמה שלנו של הפרוטוקול, השתמשנו ב-H2B-GFP מקודד גנטית ובממברנה GFP כדי לסמן גרעיני תאים וקווי מתאר, בהתאמה. סמנים פלואורסצנטיים אלה בהירים ועמידים לאורך זמן תחת מיקרוסקופ של שני פוטונים, ולכן הם דוגמאות לתוויות אידיאליות לשימוש למעקב אחר תנועות תאים וחלוקות. בתיאוריה, צבעים חיוניים פלואורסצנטיים יכולים לשמש גם כדי לסמן תאים תת-תאיים שונים עבור הדמיה חיה ex vivo 53, אך חדירה מופחתת של הצבעים לתאי אפיתל עמוקים יותר עשויה להגביל את השימוש בהם. באופן דומה, בעוד שמיקרוסקופ קונפוקלי סטנדרטי מסוגל לבצע הדמיה חיה ברזולוציה גבוהה בעומק מתחת ל-100 מיקרומטר, מיקרוסקופ דו-פוטוני מספק עומק הדמיה מוגבר עם הפחתת הלבנה ופוטוטוקסיות54. לכן בחרנו במיקרוסקופ של שני פוטונים כשיטת הדמיה ברוב יישומי ההדמיה החיה שלנו.

מגבלה אפשרית אחת של פרוטוקול זה היא שצמחים חותכים עשויים שלא לשחזר באופן מלא את הסביבה in vivo ואת הביולוגיה. לפיכך, הנתונים מייצגים התנהגויות תאים בתנאי התרבית ויש לפרש אותם בהתאם, כמו גם לאמת אותם באמצעות שיטות אחרות, כגון היסטולוגיה, כאשר הדבר ישים. היינו צריכים גם להסיר חלקית רקמות חניכיים כדי לקבל גישה ללולאת צוואר הרחם להדמיה. לפיכך, אינטראקציות איתות בין רקמות חניכיים לבין אפיתל השיניים עלולות להיות משובשות. לבסוף, בעוד זילוח מדיה משפר מאוד את הכדאיות של רקמות בתרבית, זה יכול להכניס מתח גזירה נוזלי הפועל כמו אות מכני חוץ רחמי ומשפיע על התוצאות55,56. לא קבענו את ההשפעה של קצבי זרימה שונים במערך שלנו. עם זאת, מכיוון שקצב זרימה נמוך של 1-5 מ"ל/שעה בדרך כלל מספיק לשמירה על אספקת חומרים מזינים57, ניתן למזער את ההשפעה של לחץ גזירה. בהתחשב במגבלות אלה, הדמיה חיה ex vivo משמשת פלטפורמה רבת עוצמה לחקר שינויים בהתנהגויות תאים כאשר הבקרות המתאימות כלולות בניסויים.

החותכת לעכבר הגדלה ללא הרף היא מערכת מודל בעלת יכולת אחיזה גבוהה לחקר חידוש רקמות מבוססות תאי גזע ותיקון פציעות. הפרוטוקול המתואר כאן מספק לחוקרים את האמצעים לשמור על חותכות בוגרות שלמות בתרבית ולחלץ מידע מרחבי-זמני על התנהגויות תאים באמצעות מיקרוסקופ Timelapse. אנו מצפים שטכניקה זו תהיה ישימה באופן נרחב לחקר מודלים גנטיים שונים של עכברים המשמשים במחקר דנטלי ותסייע לקדם את הידע שלנו בתחום התחדשות השיניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים למעבדה המתקדמת למיקרוסקופיית אור/ספקטרוסקופיה של UCLA ולמרכז המצוינות של Leica Microsystems במכון הננו-מערכות של קליפורניה (RRID:SCR_022789) על אספקת מיקרוסקופ שני פוטונים. AS נתמך על ידי ISF 604-21 מהקרן הלאומית למדע. JH נתמך על ידי R03DE030205 R01DE030471 מה-NIH/NIDCR. AS ו-JH נתמכו גם על ידי 2021007 מענקים מהקרן הדו-לאומית למדע ארה"ב-ישראל (BSF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well, flat bottom tissue culture plate Olympus plastics 25-107
25x HC IRAPO motCORR water dipping objective Leica 11507704
Ascorbic acid (Vitamin C) Acros Organics 352685000
D-(+)-Glucose bioxtra  Sigma Aldrich G7528
Delta T system  Bioptechs 0420-4 Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup
Dissection microscope- LEICA S9E Leica LED300 SLI
DMEM/F12 Thermo Scientific 11039047 Basal media without phenol red
Feather surgical blade (#15) Feather 72044-15
Fine forceps F.S.T 11252-23
Glutamax  Thermo Scientific 35050-061 Glutamine substitute
Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective  Leica n/a
low-melting agarose NuSieve 50080
non-essential amino acids (100x) Thermo Scientific 11140-050
penicillin–streptomycin Thermo Scientific 15140122 10,000 U/mL 
Petri dish Gen Clone 32-107G 90 mm 
Rat serum Valley Biomedical AS3061SC Processed for live imaging
Razor blade #9 VWR 55411-050
Scalpel handle F.S.T 10003-12
Scissors F.S.T 37133
serrated forceps F.S.T 11000-13
spring scissors F.S.T 91500-09

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
  2. Jing, J., et al. Rodent incisor as a model to study mesenchymal stem cells in tissue homeostasis and repair. Frontiers in Dental Medicine. 3, 1068494 (2022).
  3. Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and Fgf signaling. Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
  4. Warshawsky, H., Smith, C. E. Morphological classification of rat incisor ameloblasts. The Anatomical Record. 179 (4), 423-445 (1974).
  5. Lekic, P., McCulloch, C. A. Periodontal ligament cell population: the central role of fibroblasts in creating a unique tissue. The Anatomical Record. 245 (2), 327-341 (1996).
  6. Takahashi, A., et al. Autocrine regulation of mesenchymal progenitor cell fates orchestrates tooth eruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (2), 575-580 (2019).
  7. Ness, A. R. Eruption rates of impeded and unimpeded mandibular incisors of the adult laboratory mouse. Archives of Oral Biology. 10 (3), 439-451 (1965).
  8. Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
  9. Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), Cambridge, England. 3753-3761 (2010).
  10. Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
  11. Biehs, B., et al. BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nature Cell Biology. 15, 846-852 (2013).
  12. Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
  13. Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
  14. Li, L., Clevers, H. Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals. Science. 327 (5965), 542-545 (2010).
  15. Sharir, A., et al. A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage. Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).
  16. Hu, J. K. -H., et al. An FAK-YAP-mTOR signaling axis regulates stem cell-based tissue renewal in mice. Cell Stem Cell. 21 (1), 91-106 (2017).
  17. Yu, F., Li, F., Zheng, L., Ye, L. Epigenetic controls of Sonic hedgehog guarantee fidelity of epithelial adult stem cells trajectory in regeneration. Science Advances. 8 (29), (2022).
  18. An, Z., et al. A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors. Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).
  19. Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
  20. Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development. 147 (2), (2020).
  21. Krivanek, J., Buchtova, M., Fried, K., Adameyko, I. Plasticity of dental cell types in development, regeneration, and evolution. Journal of Dental Research. 102 (6), 589-598 (2023).
  22. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  23. Cetera, M., Leybova, L., Joyce, B., Devenport, D. Counter-rotational cell flows drive morphological and cell fate asymmetries in mammalian hair follicles. Nature Cell Biology. 20 (5), 541-552 (2018).
  24. Held, M., Santeramo, I., Wilm, B., Murray, P., Lévy, R. Ex vivo live cell tracking in kidney organoids using light sheet fluorescence microscopy. PLoS ONE. 13 (7), 0199918 (2018).
  25. Mesa, K. R., et al. Homeostatic epidermal stem cell self-renewal is driven by local differentiation. Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).
  26. Mogollón, I., Ahtiainen, L. Live tissue imaging sheds light on cell level events during ectodermal organ development. Frontiers in Physiology. 11, 818 (2020).
  27. Prochazka, J., et al. Migration of founder epithelial cells drives proper molar tooth positioning and morphogenesis. Developmental Cell. 35 (6), 713-724 (2015).
  28. Morita, R., et al. Coordination of cellular dynamics contributes to tooth epithelium deformations. PLOS ONE. 11 (9), 0161336 (2016).
  29. Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
  30. Panousopoulou, E., Green, J. B. A. Invagination of ectodermal placodes is driven by cell intercalation-mediated contraction of the suprabasal tissue canopy. PLoS biology. 14 (3), 1002405 (2016).
  31. Mogollón, I., Moustakas-Verho, J. E., Niittykoski, M., Ahtiainen, L. The initiation knot is a signaling center required for molar tooth development. Development. 148 (9), (2021).
  32. Kim, R., et al. Early perturbation of Wnt signaling reveals patterning and invagination-evagination control points in molar tooth development. Development. 148 (14), 199685 (2021).
  33. Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments JoVE. (90), e51969 (2014).
  34. Katsuragi, Y., et al. Bcl11b transcription factor plays a role in the maintenance of the ameloblast-progenitors in mouse adult maxillary incisors. Mechanisms of Development. 130 (9-10), 482-492 (2013).
  35. Dassule, H. R., Lewis, P., Bei, M., Maas, R., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127 (22), 4775-4785 (2000).
  36. Belteki, G., et al. Conditional and inducible transgene expression in mice through the combinatorial use of Cre-mediated recombination and tetracycline induction. Nucleic Acids Research. 33 (5), 51 (2005).
  37. Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
  38. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  39. Kimura, H., Cook, P. R. Kinetics of core histones in living human cells. The Journal of Cell Biology. 153 (7), 1341-1354 (2001).
  40. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology: CB. 8 (7), 377-385 (1998).
  41. Huang, Q., et al. The frontier of live tissue imaging across space and time. Cell Stem Cell. 28 (4), 603-622 (2021).
  42. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).
  43. Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
  44. Li, S., et al. Overview of the reporter genes and reporter mouse models. Animal Models and Experimental. 1 (1), 29-35 (2018).
  45. Mort, R. L., et al. Fucci2a: a bicistronic cell cycle reporter that allows Cre mediated tissue specific expression in mice. Cell Cycle. 13 (17), 2681-2696 (2014).
  46. Krivanek, J., et al. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nature Communications. 11 (1), 4816 (2020).
  47. Dailey, M. E., Marrs, G. S., Kurpius, D. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harbor protocols. 2011 (4), (2011).
  48. Gorczyca, W., Bruno, S., Darzynkiewicz, R., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. DNA strand breaks occurring during apoptosis - their early insitu detection by the terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays and prevention by serine protease inhibitors. International Journal of Oncology. 1 (6), 639-648 (1992).
  49. Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
  50. Wale, P. L., Gardner, D. K. Time-lapse analysis of mouse embryo development in oxygen gradients. Reproductive Biomedicine Online. 21 (3), 402-410 (2010).
  51. Tse, H. M., Gardner, G., Dominguez-Bendala, J., Fraker, C. A. The importance of proper oxygenation in 3D culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 634403 (2021).
  52. Spinelli, J. B., et al. Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain. Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).
  53. Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex-vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current Protocols in Cytometry. , CHAPTER, Unit9.39 (2012).
  54. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
  55. McCoy, R. J., O'Brien, F. J. Influence of shear stress in perfusion bioreactor cultures for the development of three-dimensional bone tissue constructs: a review. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (6), 587-601 (2010).
  56. Chen, K. D., et al. Mechanotransduction in response to shear stress. Roles of receptor tyrosine kinases, integrins, and Shc. The Journal of Biological Chemistry. 274 (26), 18393-18400 (1999).
  57. Seddiqi, H., et al. Inlet flow rate of perfusion bioreactors affects fluid flow dynamics, but not oxygen concentration in 3D-printed scaffolds for bone tissue engineering: Computational analysis and experimental validation. Computers in Biology and Medicine. 124, 103826 (2020).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 200 תנועות תאים חידוש שיניים בעכבר חותכת עכבר תאי גזע אפיתליאליים תאי גזע מזנכימליים התחדשות שיניים הומאוסטזיס רקמות אינטראקציות תאיות מערכת תרבית אקספלנט מיקרוסקופ קיטוע זמן מולטיפוטון מידע מרחבי-זמני התנהגויות תאים רקמות חיות מחקר שיניים תהליכים תאיים דינמיים
שימוש בהדמיה חיה <em>של Ex Vivo</em> כדי לחקור חלוקות תאים ותנועות במהלך חידוש שיניים של עכבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sundari Thooyamani, A., Shahin, E.,… More

Sundari Thooyamani, A., Shahin, E., Takano, S., Sharir, A., Hu, J. K. Using Ex Vivo Live Imaging to Investigate Cell Divisions and Movements During Mouse Dental Renewal. J. Vis. Exp. (200), e66020, doi:10.3791/66020 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter