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Developmental Biology

माउस दंत नवीकरण के दौरान सेल डिवीजनों और आंदोलनों की जांच करने के लिए पूर्व विवो लाइव इमेजिंग का उपयोग करना

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/66020
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2, 1,3
1School of Dentistry, University of California Los Angeles, 2The Institute of Biomedical and Oral Research, Faculty of Dental Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 3Molecular Biology Institute, University of California Los Angeles
* These authors contributed equally

Summary

पूर्व विवो लाइव इमेजिंग जीवित ऊतकों में सेलुलर आंदोलनों और बातचीत की गतिशील प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। यहां, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो सुसंस्कृत पूरे वयस्क माउस incenders में दंत उपकला कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी को लागू करता है।

Abstract

लगातार बढ़ते माउस छेदक वयस्क उपकला और मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं और दांत पुनर्जनन के नियमन की जांच करने के लिए एक अत्यधिक ट्रैक्टेबल मॉडल प्रणाली के रूप में उभर रहा है। ये पूर्वज आबादी ऊतक होमियोस्टेसिस को बनाए रखने और एक उत्तरदायी तरीके से खोई हुई कोशिकाओं को पुन: उत्पन्न करने के लिए सक्रिय रूप से विभाजित, स्थानांतरित और अंतर करती है। हालांकि, निश्चित ऊतक वर्गों का उपयोग करके पारंपरिक विश्लेषण सेलुलर आंदोलनों और इंटरैक्शन की गतिशील प्रक्रियाओं को पकड़ नहीं सके, जिससे उनके नियमों का अध्ययन करने की हमारी क्षमता सीमित हो गई। यह पत्र एक एक्सप्लांट कल्चर सिस्टम में पूरे माउस incenders को बनाए रखने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है और मल्टीफोटन टाइमलैप्स माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके डेंटल एपिथेलियल कोशिकाओं को लाइव-ट्रैक करता है। यह तकनीक दंत चिकित्सा अनुसंधान के लिए हमारे मौजूदा टूलबॉक्स में जोड़ती है और जांचकर्ताओं को एक जीवित ऊतक में सेल व्यवहार और संगठनों पर स्थानिक जानकारी प्राप्त करने की अनुमति देती है। हम आशा करते हैं कि यह पद्धति शोधकर्ताओं को उन तंत्रों का पता लगाने में मदद करेगी जो दंत नवीकरण और उत्थान दोनों के दौरान होने वाली गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं को नियंत्रित करते हैं।

Introduction

पिछले दो दशकों में, माउस छेदनी वयस्क स्टेम सेल विनियमन और दांत पुनर्जनन 1,2 के सिद्धांतों की जांच के लिए एक अमूल्य मंच के रूप में उभरा है. माउस छेनी लगातार बढ़ता है और जानवर के जीवन भर खुद को नवीनीकृत करता है। यह दोनों उपकला और मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं, जो स्वयं को नवीनीकृत और दांत 1,2 के विभिन्न सेल प्रकार में अंतर कर सकते हैं बनाए रखने के द्वारा ऐसा करता है. जबकि दंत उपकला स्टेम सेल अमेलोब्लास्ट्स को जन्म देते हैं, जो तामचीनी मैट्रिक्स का स्राव करते हैं, दंत मेसेनकाइमल स्टेम सेल ओडोंटोब्लास्ट्स, सीमेंटोब्लास्ट्स और फाइब्रोब्लास्ट्स को जन्म देते हैं, जो क्रमशःडेंटिन, सीमेंटम और पीरियडोंटल लिगामेंट बनाते हैं, क्रमशः 3,4,5,6. नई कोशिकाओं की यह निरंतर आपूर्ति ऊतक होमियोस्टेसिस को बनाए रखती है और पुरानी कोशिकाओं के प्रतिस्थापन की अनुमति देती है जो मैस्टिक पहनने या चोटों के कारण खो जाती हैं 7,8. सेलुलर और आणविक तंत्र है कि रखरखाव और दंत स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव को विनियमित इसलिए दंत उत्थान को समझने के लिए केंद्रीय है, बढ़ती ब्याज का एक क्षेत्र.

शारीरिक रूप से, वयस्क माउस छेनी का एक बड़ा हिस्सा जबड़े की हड्डी में संलग्न है। जबकि दांत के चीरा किनारे को उजागर किया जाता है, छेनी का शिखर अंत एक सॉकेट के भीतर फिट बैठता है और पीरियडोंटल स्नायुबंधन और संयोजी ऊतकों(चित्रा 1ए,बी)के माध्यम से आसपास की हड्डी से मजबूती से जुड़ा होता है। छेनी के शिखर अंत भी दांत के विकास क्षेत्र है और दोनों उपकला परत और mesenchymal लुगदी 9,10,11,12,13 में दंत स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं को बनाए रखता है. विशेष रूप से, दंत उपकला स्टेम कोशिकाओं को उपकला के बल्बनुमा अंत में बनाए रखा जाता है, जिसे एपिकल कली के रूप में जाना जाता है, जिसे लैबियल ग्रीवा पाश(चित्रा 1सी)के रूप में भी जाना जाता है। आंतों के उपकला और एपिडर्मिस के समान, छेनी में उपकला नवीकरण मुख्य रूप से सक्रिय रूप से साइकिल चालन स्टेम कोशिकाओं और उनके अत्यधिक प्रोलिफेरेटिव मध्यवर्ती वंशज, पारगमन-प्रवर्धक कोशिकाओं 14,15,16,17 कहा जाता है, दोनों गर्भाशय ग्रीवा पाश के भीतरी भाग में रहने द्वारा समर्थित है. हालांकि, क्या incisor उपकला शामिल है और उत्थान के दौरान मौन स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करता है निर्धारित किया जा करने के लिए बनी हुई है. इसके विपरीत, दोनों सक्रिय और मौन दंत मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं को शिखर लुगदी में पहचाना गया है, और मौन स्टेम सेल एक आरक्षित आबादी के रूप में कार्य करते हैं जो चोट की मरम्मत13,18 के दौरान सक्रिय हो जाता है।

माउस छेनी नवीकरण और उत्थान के जीव विज्ञान पर खोजों में से कई ऊतकीय जांच से हुई है, जिसमें नमूने अलग-अलग लौकिक जंक्शनों पर प्राप्त किए जाते हैं, तय, संसाधित, और फिर एक विशेष विमान के साथ माइक्रोन-पतली स्लाइस में खंडित होते हैं। विभिन्न माउस मॉडल से हिस्टोलॉजिकल वर्गों के विस्तृत विश्लेषण के माध्यम से जो वंश अनुरेखण या आनुवंशिक गड़बड़ी को सक्षम करते हैं, वैज्ञानिकों ने विभिन्न पूर्वज आबादी के सेल वंशावली की पहचान की है, साथ ही आनुवंशिक और सिग्नलिंग रास्ते जो छेनी होमियोस्टेसिस और चोट की मरम्मत 19,20,21 को नियंत्रित करते हैं. हालांकि, वर्गों में गैर-महत्वपूर्ण कोशिकाओं की स्थिर दो-आयामी (2 डी) छवियां जीवित ऊतक में सेलुलर व्यवहार और स्थानिक संगठनों के पूर्ण स्पेक्ट्रम पर कब्जा नहीं कर सकती हैं, जैसे सेल आकार परिवर्तन, आंदोलनों और सेलुलर कैनेटीक्स। इन तेजी से सेलुलर परिवर्तनों का पता लगाना और मापना, जो एक टाइमस्केल पर होते हैं जो ऊतक सेक्शनिंग के माध्यम से अनसुलझे होते हैं, एक अलग रणनीति की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, ऐसी जानकारी प्राप्त करना यह समझने के लिए भी महत्वपूर्ण है कि दंत कोशिकाएं एक-दूसरे के साथ कैसे बातचीत करती हैं, विभिन्न सिग्नलिंग उत्तेजनाओं पर प्रतिक्रिया करती हैं, और ऊतक संरचनाओं और कार्यों को बनाए रखने के लिए आत्म-व्यवस्थित होती हैं।

दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी22 का उपयोग करके चार-आयामी (4 डी) गहरी ऊतक इमेजिंग का आगमन, एक ऐसी तकनीक जो लौकिक संकल्प के साथ तीन स्थानिक आयामों को एकीकृत करती है, सुसंस्कृत ऊतक प्रत्यारोपण, ऑर्गेनोइड्स, या यहां तक कि ऊतकों की स्थानिक परीक्षा को सक्षम करके हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण की अंतर्निहित सीमाओं पर काबू पाती है. उदाहरण के लिए, विकासशील दांत उपकला के 4 डी लाइव इमेजिंग ने कोशिका विभाजन और माइग्रेशन के स्थानिक पैटर्न का अनावरण किया है जो ऊतक विकास, सिग्नलिंग सेंटर गठन और दंत उपकला मोर्फोजेनेसिस 27,28,29,30,31,32 का समन्वय करते हैं . वयस्क माउस छेनी में, 4 डी इमेजिंग हाल ही में दंत उपकला चोट की मरम्मत के दौरान सेलुलर व्यवहार का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया गया है. लाइव इमेजिंग suprabasal परत में स्ट्रेटम intermedium कोशिकाओं सीधे क्षतिग्रस्त उपकला पुनर्जीवित करने के लिए बेसल परत में ameloblasts में परिवर्तित किया जा सकता है, उपकला चोट की मरम्मत15 के पारंपरिक प्रतिमान को चुनौती.

यहां, हम वयस्क माउस छेनी के विच्छेदन, संवर्धन और इमेजिंग का वर्णन करते हैं, जो प्रयोगशाला ग्रीवा पाश(चित्रा 1)में उपकला कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करते हैं। यह तकनीक 12 घंटे से अधिक के लिए दंत कोशिका जीवन शक्ति को संरक्षित करती है और एकल-कोशिका संकल्प पर फ्लोरोसेंटली लेबल वाली कोशिकाओं की लाइव ट्रैकिंग की अनुमति देती है। यह दृष्टिकोण सेल गति और प्रवास की जांच के साथ-साथ सामान्य संस्कृति स्थितियों के तहत सेल आकार और विभाजन अभिविन्यास में गतिशील परिवर्तन, या आनुवंशिक, भौतिक और रासायनिक गड़बड़ी के जवाबों में अनुमति देता है।

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Protocol

सभी चूहों को कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय लॉस एंजिल्स (यूसीएलए) या हिब्रू यूनिवर्सिटी ऑफ जेरूसलम (एचयूजी) में रोगजनक मुक्त पशु सुविधाओं में बनाए रखा गया था। चूहों से जुड़े सभी प्रयोग संबंधित संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) (ARC-2019-013) द्वारा अनुमोदित नियमों और प्रोटोकॉल के अनुसार किए गए थे; यूसीएलए) या (एमडी-23-17184-3; हूजी)। प्रयोगात्मक चरणों का एक सामान्य कार्यप्रवाह चित्रा 2 ए में दिखाया गया है. इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी उपकरणों, अभिकर्मकों और सामग्रियों से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. समाधान और जैल की तैयारी

  1. विच्छेदन माध्यम: 0.5% ग्लूकोज के साथ ताजा DMEM/F12 तैयार करें और चरण 2.4 में आवश्यक होने तक इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म रखें।
    नोट: हम लाइव इमेजिंग के दौरान ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करने के लिए फिनोल लाल के बिना डीएमईएम/एफ 12 का उपयोग करते हैं।
  2. 1x कल्चर माध्यम: 50% DMEM/F12, 50% चूहा सीरम, 1x ग्लूटामाइन विकल्प, 1x MEM गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 1% ग्लूकोज, 0.1 mg/mL L-एस्कॉर्बिक एसिड और 0.5% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन का उपयोग करके ताजा माध्यम तैयार करें। चरण 5.5 में आवश्यक होने तक इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म रखें। इस माध्यम का उपयोग लाइव इमेजिंग के दौरान incisor explants की खेती के लिए किया जाता है।
    नोट: चूहा सीरम उच्च गुणवत्ता का होना चाहिए और विशेष रूप से शोधकर्ताओं द्वारा या वाणिज्यिक स्रोत से पूरे ऊतक संवर्धन के लिए तैयार किया जाना चाहिए। विशेष रूप से, थक्के बनने से पहले रक्त को सेंट्रीफ्यूज किया जाना चाहिए (कमरे के तापमान पर 1,200 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए)। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, परिणामस्वरूप फाइब्रिन थक्के को निचोड़ा जाना चाहिए और33 को त्याग दिया जाना चाहिए।
  3. संस्कृति जेल: जेल का उद्देश्य इमेजिंग के दौरान नमूनों को स्थिर करना है और ताजा तैयार किया जाता है।
    1. डीएमईएम/एफ 12 के 10 एमएल में माइक्रोवेव का उपयोग करके डीएमईएम/एफ 12 के 200 मिलीग्राम कम पिघलने बिंदु को भंग करके डीएमईएम/एफ 12 में 2% जेल बनाएं। 37 डिग्री सेल्सियस पर 2% जेल रखें.
    2. 50% चूहा सीरम, 1x ग्लूटामाइन विकल्प, 1x MEM गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 1% ग्लूकोज, 0.1 mg/mL L-एस्कॉर्बिक एसिड, और 0.5% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन मिलाकर 2x कल्चर मीडियम (DMEM/F12 के बिना) बनाएं। 37 डिग्री सेल्सियस करने के लिए 2x संस्कृति माध्यम (DMEM/F12 के बिना) वार्म.
    3. 2% जेल और 2x संस्कृति माध्यम (DMEM/F12 के बिना) के बराबर मात्रा मिश्रण द्वारा 1% संस्कृति जेल बनाओ. चरण 5.1 में आवश्यक होने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर 1% संस्कृति जेल रखें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि गेलिंग से बचने के लिए मिश्रण करने से पहले सभी समाधान गर्म हैं। हम पाया 1% जेल वयस्क माउस छेनी संवर्धन के लिए उपयुक्त होने के लिए. जेल प्रतिशत अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए यदि अन्य ऊतकों को सुसंस्कृत किया जाना है।

2. वयस्क माउस mandibles के निष्कर्षण

  1. IACUC द्वारा अनुमोदित मानक प्रक्रियाओं का उपयोग करके वांछित उम्र में चूहों को इच्छामृत्यु दें।
    नोट: यहां हम गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद सीओ2 श्वासावरोध का उपयोग करते हैं। पशु इच्छामृत्यु के लिए नियम विभिन्न क्षेत्रों में भिन्न हो सकते हैं। शोधकर्ताओं को प्रयोगों को करने से पहले आवश्यक संस्थागत अनुमोदन प्राप्त करना चाहिए और स्थानीय पशु देखभाल नियमों का अनुपालन सुनिश्चित करना चाहिए।
  2. 70% इथेनॉल का उपयोग माउस कीटाणुरहित.
  3. माउस सिर काटना और बाएँ और दाएँ mandibles निकालने.
    1. अपने पेट पर माउस रखना, तो गर्दन क्षेत्र में कटौती और शरीर के बाकी हिस्सों से माउस सिर को अलग करने के लिए एक # 9 एकल बढ़त औद्योगिक रेजर ब्लेड का उपयोग करें.
      नोट: यदि ग्रसनी या गर्दन क्षेत्र से ऊतकों को भी एकत्र किया जाना है, तो सिर काटना नहीं किया जाना चाहिए, और कोई सीधे चरण 2.3.2 पर आगे बढ़ सकता है।
    2. माउस को पलट दें ताकि उसका उदर पक्ष ऊपर का सामना कर रहा हो और मंडलियां आसानी से सुलभ हों।
    3. अंगूठे और तर्जनी के बीच धीरे से पकड़कर जानवर के सिर को सुरक्षित करें।
    4. एक मध्य-धनु चीरा बनाने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग करें जो निचले होंठ से निचले होंठ की त्वचा पर नेकलाइन की ओर कटता है।
      नोट: एक #15 सर्जिकल ब्लेड भी चीरा और बाद के विच्छेदन (कदम 2.3.6-2.3.9) बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
    5. जैसे ही चीरा लगाया जाता है, अंगूठे और तर्जनी का उपयोग करके कटी हुई त्वचा को फैलाएं ताकि नीचे की मांसपेशियों और जबड़े की हड्डी को उजागर किया जा सके।
    6. निचले जबड़े के मुख की तरफ मैसेटर की मांसपेशियों को अलग करने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग करें, जैसे कि बाएं और दाएं हेमिमैंडिबल्स के बाहर अब मांसपेशियों के अनुलग्नकों से मुक्त हैं।
    7. मांसपेशियों के संलग्नक को हटाने के लिए अनिवार्य के अंदरूनी हिस्से के साथ माइलोहाइड मांसपेशियों को अलग करें।
    8. मैंडिबुलर सिम्फिसिस पर एक और चीरा लगाएं जो दो हेमिमैंडिबल्स को जोड़ता है। एक बार कट जाने के बाद, जबड़े को बाएं और दाएं हिस्सों में अलग कर दिया जाएगा।
    9. मैंडिबुलर कंडिल और टेम्पोरल मैंडिबुलर जॉइंट के बीच रेजर ब्लेड को वेज करें और सिर के बाकी हिस्सों से हेमिमैंडिबल को ध्यान से अलग करें।
      नोट: हमने इसे काटते समय छेदक पर धीरे से खींचने में मदद की। जबड़े को तोड़ने और भीतर के नरम ऊतकों को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए।
  4. तुरंत prewarmed विच्छेदन मीडिया (1.1 कदम) के साथ एक पेट्री डिश के लिए विच्छेदित mandibles हस्तांतरण और एक # 15 सर्जिकल ब्लेड का उपयोग कर शेष मांसपेशियों के ऊतकों को हटा दें.
    नोट: ठंडे मीडिया में नमूने रखने सेल गतिविधियों को धीमा कर देता है, जिसके परिणामस्वरूप लाइव इमेजिंग के दौरान प्रसार या सेल आंदोलन जैसे कुछ सेल गतिविधियों की देरी या असफल वसूली होती है।

3. पूरे माउस incenders के अलगाव

नोट: छेनी के आगे अलगाव एक उज्ज्वल क्षेत्र विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत किया जाता है।

  1. नेत्रहीन अनिवार्य के अंडाकार क्षेत्र की पहचान करें जो छेनी सॉकेट को कवर करता है और छेनी के शिखर भाग को रखता है।
  2. जबड़े को इस तरह रखें कि आंतरिक (भाषी) सतह ऊपर की ओर हो।
  3. दाँतेदार संदंश की एक जोड़ी के साथ जगह में जबड़ा पकड़े जबकि, एक दिशा है कि दाढ़ की ओर कंडिल से है कि एक दिशा में, एक # 15 सर्जिकल ब्लेड का उपयोग overlying झिल्ली हड्डी बंद शेविंग द्वारा अंडाकार क्षेत्र में एक खिड़की उत्पन्न. यह आंतरिक सतह पर एपिक छेनी के नरम ऊतक को उजागर करता है।
  4. जबड़े को पलट दें ताकि बाहरी (मुख) सतह ऊपर की ओर हो।
  5. बाहरी जबड़े पर अंडाकार क्षेत्र में एक खिड़की उत्पन्न के रूप में कदम 3.3 में वर्णित है और दूर किनारे पर किसी भी शेष हड्डी के टुकड़े लेने के लिए स्केलपेल की नोक का उपयोग करें. सुनिश्चित करें कि दांत के शिखर अंत दोनों तरफ से दिखाई दे रहा है.
    नोट: अंतर्निहित नरम ऊतक को नुकसान को रोकने के लिए हड्डियों को शेविंग करते समय अत्यधिक दबाव से बचें।
  6. व्यवस्थित पूरे दांत को अलग करने के लिए छेदक के आसपास की हड्डियों को काट लें।
    1. एक विमान पर एक साफ कटौती करें जो पहले कंडिलर प्रक्रिया को हटाने के लिए एपिकल छेनी से तुरंत सटे हुए है।
      नोट: सावधान रहें कि छेनी में कटौती न करें।
    2. एक दूसरे कटौती सिर्फ 3 दाढ़ के पीछे बनाओ, लेकिन दांत को नुकसान पहुँचाए बिना छेदक करने के लिए पृष्ठीय. यह हड्डी को हटा देता है जिसमें कोरोनॉइड प्रक्रिया शामिल होती है।
    3. क्रमिक रूप से कोणीय प्रक्रिया की नोक से छेनी की ओर धीरे-धीरे एक चरणबद्ध तरीके से उदर अनिवार्य को हटाने के लिए।
      नोट: दंत उपकला और संबंधित periodontal ऊतकों अक्सर हड्डी के लिए अटक रहे हैं और आसानी से बंद फट अगर उदर हड्डी का एक बड़ा हिस्सा एक बार में काट दिया है. छेनी नरम ऊतक से हड्डी को अलग करने के लिए, एक छेनी के शिखर अंत में दो ऊतकों के बीच स्केलपेल (या तेज गैर दाँतेदार संदंश की एक जोड़ी) डालने और नाजुक आगे साधन स्लाइड कर सकते हैं.
    4. दाढ़ और किसी भी शेष हड्डियों के साथ वायुकोशीय हड्डी को काट लें जो अभी भी छेनी से जुड़ी हुई हैं।
    5. पूरा छेदक अब अलग है। पूरी तरह से विच्छेदित छेनी को साफ गर्म विच्छेदन मीडिया (चरण 1.1) के साथ एक डिश में स्थानांतरित करें।
  7. आवश्यकतानुसार अतिरिक्त incenders को अलग करने के लिए चरण 3.2-3.6 दोहराएं।
    नोट: माउस के मैक्सिलरी/ऊपरी incenders भी वयस्क स्टेम कोशिकाओं को बनाए रखने और दांत पुनर्जनन34 का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दंत शोधकर्ता आमतौर पर निचले incenders पर ध्यान केंद्रित करते हैं क्योंकि वे अधिक सुलभ होते हैं और ऊपरी incenders की तुलना में अधिक आसानी से विच्छेदित हो सकते हैं। मैंडिबुलर और मैक्सिलरी इंसुलर पूर्वज कोशिकाओं के बीच अंतर निर्धारित किया जाना बाकी है।

4. छेनी उपकला ग्रीवा पाश का पर्दाफाश करने के लिए periodontal ऊतकों को हटाने

  1. पूरे छेनी अपनी भाषाई पक्ष पर नीचे झूठ बोल के साथ और दाँतेदार संदंश की एक जोड़ी के साथ जगह में दांत पकड़े हुए, # 5 ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए pirontal ऊतकों शिखर छेनी और ग्रीवा पाश क्षेत्र को कवर पर tucking शुरू करने के लिए.
  2. एपिकल कली से पीरियडोंटल ऊतक को सावधानी से छील लें, जैसे कि गर्भाशय ग्रीवा लूप (या ब्याज के अन्य क्षेत्रों) का पार्श्व पक्ष दायरे के नीचे दिखाई देता है।
    नोट: दंत उपकला को नुकसान पहुंचाने या इसे मेसेनचाइम से अलग करने से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। यदि छेनी ब्याज के क्षेत्र में प्रतिदीप्ति संकेत है, और एक फ्लोरोसेंट विच्छेदन माइक्रोस्कोप उपलब्ध है, प्रतिदीप्ति संकेतों ऊतक प्रकार और सहायता विच्छेदन के बीच अंतर करने में मदद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह कुशलतापूर्वक वर्गों 2-4 बाहर ले जाने के लिए महत्वपूर्ण है तो नमूने जल्दी से संस्कृति मीडिया में स्थानांतरित किया जा सकता है और पर्याप्त रूप से explant संवर्धन (नीचे देखें) के माध्यम से बनाए रखा.

5. एक्सप्लांट कल्चर के लिए ऊतक एम्बेडिंग

  1. एक 24 अच्छी तरह से थाली में एक अच्छी तरह से करने के लिए गर्म, unsolidified संस्कृति जेल के 500 माइक्रोन जोड़ें और जल्दी से अच्छी तरह से विच्छेदित पूरे incenders हस्तांतरण. incenders कुल्ला करने के लिए थाली को कुछ बार घुमाएं।
  2. एक संस्कृति पकवान के लिए गर्म, unsolidified संस्कृति जेल के 400 μL जोड़ें और पकवान के लिए rinsed incenders हस्तांतरण.
    नोट: हम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध संस्कृति पकवान का उपयोग करते हैं जो छिड़काव सेटअप के साथ संगत है। वैकल्पिक विकल्पों के लिए चरण 6.4 देखें।
  3. पकवान (चित्रा 2 ए, बी) के केंद्र में ग्रीवा पाश क्षेत्र (या ब्याज के अन्य क्षेत्रों) की स्थिति के लिए छेनी ओरिएंट और वांछित इमेजिंग विमान के लिए शिखर छेनी के झुकाव को समायोजित करें।
    नोट: ऊतक अभिविन्यास पूर्ण जेल से पहले जल्दी से किया जाना चाहिए।
  4. जेल सेट होने के बाद, ब्याज के क्षेत्र के शीर्ष पर किसी भी जेल को हटाने के लिए ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें ताकि यह जेल द्वारा कवर नहीं किया गया हो।
  5. गर्म संस्कृति मीडिया की पर्याप्त मात्रा में जोड़ें धीरे-धीरे इसे डिश के किनारे के खिलाफ पाइप करके सिर्फ नमूना (~ 150 माइक्रोन) को कवर करने के लिए।
  6. एक्सप्लांट कल्चर को 37 डिग्री सेल्सियस सेल कल्चर इनक्यूबेटर में ले जाएं ताकि ऊतक बसने और 1 घंटे के लिए संस्कृति की स्थिति में समायोजन की अनुमति मिल सके।

6. incisor explants के टाइमलैप्स माइक्रोस्कोपी

नोट: इस प्रयोग में, हमने 25x पानी-सूई उद्देश्य से लैस एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जिसमें 1 का संख्यात्मक एपर्चर है। सामान्य तौर पर, एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर वाला पानी की सूई वाला लेंस गहरे ऊतक इमेजिंग के लिए सबसे उपयुक्त होता है।

  1. माइक्रोस्कोप और दो फोटॉन लेजर पर मुड़ें.
  2. मंच एडाप्टर के लिए संस्कृति पकवान सुरक्षित और शीर्ष पर छिड़काव एडाप्टर अंगूठी माउंट(चित्रा 2C).
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति को बनाए रखने के लिए सेट किए गए तापमान नियंत्रक के लिए स्टेज एडाप्टर कनेक्ट करें।
  4. इनलेट और एडाप्टर की अंगूठी के आउटलेट को एक माइक्रो-छिड़काव पंप से कनेक्ट करें और पंप पर 20 पर सेट छिड़काव गति के साथ, संस्कृति माध्यम का छिड़काव शुरू करें। यह नमूनों के शीर्ष पर संस्कृति माध्यम का एक धीमा प्रवाह (~ 5 एमएल/एच) उत्पन्न करता है (चित्रा 2सी)।
    नोट: ऊतक को स्थिर रूप से नियंत्रित वातावरण में बनाए रखने के लिए सिस्टम के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें। अन्य प्रणालियों का भी उपयोग किया जा सकता है। एक 37 डिग्री सेल्सियस हीटिंग प्लेट और एक इनलेट और सिरिंज पंप से जुड़े एक आउटलेट के साथ एक घर का बना छिड़काव संस्कृति पकवान (पूरक चित्रा एस 1) का संयोजन भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
  5. एडाप्टर रिंग के शीर्ष पर एक वायुमंडलीय नियंत्रण बैरियर रिंग (एसीबीआर) रखें और एसीबीआर के माध्यम से उद्देश्य को कम करें ताकि संस्कृति माध्यम (चित्रा 2डी) के साथ संपर्क बनाया जा सके।
  6. GFP और लाल प्रतिदीप्ति (जैसे, tdTomato) संकेतों दोनों कल्पना करने के लिए 920 एनएम के लिए लेजर तरंग दैर्ध्य ट्यून.
  7. ऐपिस के माध्यम से और फिर माइक्रोस्कोप के सॉफ्टवेयर पर नमूनों का पता लगाएँ।
  8. सॉफ्टवेयर का उपयोग करके जेड-स्टैक, मल्टी-पोजिशन इमेजिंग और समय अंतराल सेट करें। इस प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए, 4 माइक्रोन के जेड-स्टेप आकार और 14 घंटे के लिए 5 मिनट के समय अंतराल का उपयोग करें।
    नोट: हमने पाया कि 5 मिनट से अधिक का समय अंतराल अक्सर चिकनी सेल आंदोलनों और डिवीजनों को पकड़ने के लिए अपर्याप्त होता है।
  9. टाइमलैप्स इमेजिंग आरंभ करें।
    नोट: नमूना स्थिति पहले घंटे के दौरान बदलाव कर सकते हैं और आगे समायोजन की आवश्यकता हो सकती है।
  10. डाउनस्ट्रीम डेटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण के लिए फ़ाइलें सहेजें।

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Representative Results

वयस्क माउस छेदक के शिखर क्षेत्र अनिवार्य (चित्रा 1) के भीतर संलग्न है और इसलिए, दृश्य और विकास क्षेत्र के भीतर रहने वाले पूर्वज कोशिकाओं रहते ट्रैकिंग के लिए सीधे सुलभ नहीं है. इसलिए, हमने जबड़े की हड्डी से पूरे छेनी को निकालने और इसे दो-फोटॉन टाइमलैप्स माइक्रोस्कोपी(चित्रा 2)के लिए एक्सप्लांट कल्चर सिस्टम में बनाए रखने के लिए एक विधि विकसित की है। यहां हम प्रतिनिधि परिणामों का वर्णन करते हैं जो दंत उपकला के प्रयोगशाला ग्रीवा लूप क्षेत्र में सेल प्रसार और आंदोलन की गतिशील प्रक्रिया को पकड़ते हैं।

प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को प्रदर्शित करने के लिए, हमने दो अलग-अलग माउस मॉडल का उपयोग किया है जो दंत उपकला में हरे रंग की प्रतिदीप्ति व्यक्त करते हैं। पहली माउस लाइन K14Cre है; आर 26आरटीटीए; tetO-H2B-GFP, जहां K14Cre (MGI:2680713) केरातिन 14 प्रमोटर35 से Cre recombinase व्यक्त करता है और R26rtTA एलील36 (MGI:3584524) से उपकला में रिवर्स टेट्रासाइक्लिन-नियंत्रित ट्रांसएक्टिवेटर की अभिव्यक्ति को सक्रिय करता है। डॉक्सीसाइक्लिन के प्रशासन पर, आरटीटीए टेटओ-एच2बी-जीएफपी एलील37 (एमजीआई: 3043783) से हिस्टोन एच 2 बी-जीएफपी अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है और हरे रंग की प्रतिदीप्ति के साथ उपकला सेल नाभिक को लेबल करता है। यह सेल ट्रैकिंग के लिए और सेल डिवीजनों का पता लगाने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। इस प्रयोग में, हम एच 2 बी-जीएफपी अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के लिए बलिदान से पहले 24 घंटे के लिए डॉक्सीसाइक्लिन भोजन के साथ जानवरों को खिलाया। दूसरी माउस लाइन K14Cre है; R26mT/mG, जिसमें R26mT/mG (MGI:3803814) एक क्रे-रिपोर्टर38 है। क्रे गतिविधि की अनुपस्थिति में, कोशिकाएं लाल प्रतिदीप्ति के साथ झिल्ली-स्थानीयकृत टीडी टमाटर (एमटी) व्यक्त करती हैं। क्रे-मध्यस्थता पुनर्संयोजन पर, कोशिकाएं झिल्ली जीएफपी (एमजी) व्यक्त करती हैं। K14क्रे; R26mT/mG इस प्रकार हरे प्रतिदीप्ति के साथ उपकला कोशिका झिल्ली को लेबल करता है, जिससे गैर-उपकला कोशिकाएं लाल हो जाती हैं। यह सेल आकार, विभाजन, और आंदोलनों के आसान दृश्य की अनुमति देता है।

हमने मंडलियों (चित्रा 3ए) को विदारक करके प्रक्रिया शुरू की और फिर व्यवस्थित रूप से छेदक (चित्रा 3बी-जी) के आसपास की सभी हड्डियों को हटा दिया। यह undamaged उपकला (चित्रा 3H) के साथ पूरे incisors उपज. हमने K14Cry में हरी प्रतिदीप्ति का निरीक्षण करके दंत उपकला की अक्षुण्णता की पुष्टि की; आर 26आरटीटीए; tetO-H2B-GFP और K14Cre; आर 26एमटी / एमजी चूहों (चित्रा 4 ए, बी, ई, एफ)। इस स्तर पर, अपारदर्शी पीरियडोंटल ऊतक अभी भी शिखर छेनी को कवर करते हैं, और ग्रीवा लूप इस प्रकार प्रकाश बिखरने के कारण धुंधला दिखाई देता है, जो इसी तरह डाउनस्ट्रीम टाइमलैप्स इमेजिंग(चित्रा 4सी,जी)में बाधा डालता है। इसलिए हमने पीरियडोंटल ऊतकों को सावधानीपूर्वक हटा दिया, इसलिए ग्रीवा लूप के साथ दंत उपकला को प्रत्येक छेनी/चित्रा 4डी,एच)में देखा जा सकता है।

incisors तो कम पिघलने बिंदु agarose में एम्बेडेड थे और चित्रा 2 में दर्शाया के रूप में दो फोटॉन लाइव इमेजिंग के लिए एक छिड़काव सेटअप में सुसंस्कृत. इस अभ्यास के लिए, हमने दंत उपकला के ग्रीवा लूप क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित किया है और 14 घंटे(चित्रा 5ए)की अवधि में हर 5 मिनट में 4 माइक्रोन अंतराल पर जेड-स्टैक छवियों पर कब्जा कर लिया है। विशेष रूप से, एच 2 बी-जीएफपी संकेतों को ज्यादातर ग्रीवा लूप के पारगमन-प्रवर्धक क्षेत्र में देखा गया था, जहां सक्रिय कोशिका विभाजन(चित्रा 5बी)हैं। यह संभावना है क्योंकि खुले क्रोमैटिन में उच्च एच 2 बी-जीएफपी विनिमय है और इन सक्रिय कोशिकाओं39 में डीएनए प्रतिकृति के बाद न्यूक्लियोसोम में शामिल है।

हम बाद में ImageJ का उपयोग कर timelapse छवियों की जांच की और H2B-GFP संकेतों40 के अलग होने के आधार पर, हम इमेजिंग अवधि (पूरक वीडियो एस1 और पूरक वीडियो एस2) भर में कई सेल डिवीजनों का निरीक्षण करने में सक्षम थे. इससे संकेत मिलता है कि ऊतकों को एक्सप्लांट संस्कृति में पर्याप्त रूप से बनाए रखा गया था और कोशिकाएं सक्रिय थीं। विशेष रूप से, हम माइटोटिक कोशिकाओं में मेटाफ़ेज़ प्लेट पर गुणसूत्रों के संक्षेपण और संरेखण का निरीक्षण करने में सक्षम थे, इसके बाद एनाफ़ेज़ के दौरान दो बेटी कोशिकाओं में उनके अलगाव के बाद (चित्रा 5C-N, मैन्युअल रूप से इमेजजे प्लगइन ट्रैकमेट का उपयोग करके ट्रैक किया गया)। इन डिवीजनों के अधिकांश लंबवत या तहखाने झिल्ली (चित्रा 5 सी-कश्मीर और पूरक वीडियो एस1) के सापेक्ष एक तिरछा कोण पर थे. तहखाने झिल्ली के समानांतर क्षैतिज विभाजन भी पता लगाया जा सकता है, हालांकि कम बार होने (चित्रा 5 एल एन और पूरक वीडियो एस2). यह इंगित करना महत्वपूर्ण है कि दंत उपकला में साइटोकिन्सिस अक्सर 5-10 मिनट के भीतर जल्दी से होता है। नतीजतन, 5 मिनट से अधिक के टाइमलैप्स अंतराल इन डिवीजनों में से कुछ को याद कर सकते हैं।

K14Cry में कोशिका विभाजन की घटनाएं भी स्पष्ट थीं; आर26एमटी/एमजी ग्रीवा छोरों, जहां सभी उपकला कोशिका झिल्ली को हरा लेबल किया गया था (चित्र 6ए)। हम उनके सेल गोलाई और फिर साइटोकिन्सिस (पूरक वीडियो एस3) द्वारा माइटोटिक कोशिकाओं की पहचान कर सकते हैं, और दोनों ऊर्ध्वाधर और क्षैतिज सेल डिवीजन अवलोकन योग्य (चित्रा 6 बी-जी) थे, इस प्रकार एच 2 बी-जीएफपी का उपयोग करके प्राप्त परिणामों के समान थे। साथ में, इन परिणामों से पता चलता है कि इस प्रोटोकॉल incisor explants में सेल व्यवहार की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं जब माउस आनुवंशिक मॉडल है कि fluorescently अलग उपकोशिकीय संरचनाओं लेबल के साथ संयुक्त.

Figure 1
चित्रा 1: माउस जबड़े और incisor ग्रीवा पाश के योजनाबद्ध. (ए) छेनी का एक महत्वपूर्ण हिस्सा जबड़े की हड्डी में एम्बेडेड है। विकास क्षेत्र दांत के शिखर छोर पर स्थित है और इसकी निरंतर वृद्धि (गहरे हरे तीर) का समर्थन करता है। (बी) एपिकल छेनी का एक इज़ाफ़ा, जो पीरियडोंटल ऊतकों से घिरा हुआ है। दांत तामचीनी और डेंटिन से बना होता है, जो क्रमशः अमेलोब्लास्ट और ओडोंटोब्लास्ट द्वारा गठित अत्यधिक खनिज संरचनाएं हैं। (सी) एपिकल छेनी का एक धनु खंड, यह दर्शाता है कि दंत उपकला पूर्वज कोशिकाएं और पारगमन-प्रवर्धक कोशिकाएं प्रयोगशाला ग्रीवा लूप में रहती हैं और अधिक डिस्टल एपिथेलियम (गहरे हरे रंग की धराशायी तीर) में अमेलोब्लास्ट को जन्म देती हैं। लैबियल ग्रीवा लूप की तुलना में, लिंगुअल ग्रीवा लूप आकार में छोटा होता है और सामान्य रूप से एमेलोब्लास्ट नहीं बनाता है। दंत मेसेनकाइमल स्टेम सेल दंत लुगदी (बैंगनी क्षेत्र) में मौजूद होते हैं और ओडोंटोब्लास्ट को जन्म देते हैं। संक्षिप्ताक्षर: एन = तामचीनी; डी = डेंटिन; एम = अमेलोब्लास्ट; ओडी = ओडोंटोब्लास्ट; टीएसी = पारगमन-प्रवर्धक कोशिकाएं; laCL = प्रयोगशाला ग्रीवा लूप; liCL = भाषाई ग्रीवा पाश। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: लाइव इमेजिंग के लिए माउस छेनी explant बनाए रखने. (ए) लाइव इमेजिंग के लिए कम पिघलने बिंदु agarose में ऊतक एम्बेड करने के लिए incisor विदारक से प्रोटोकॉल के प्रमुख चरणों का चित्रण. एक छिड़काव सेटअप इमेजिंग के दौरान पोषक तत्वों की एक निरंतर आपूर्ति प्रदान करने के लिए प्रयोग किया जाता है और संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा है. (बी डी) संस्कृति पकवान और छिड़काव चैम्बर लाइव इमेजिंग के लिए स्थापना के एक कदम दर कदम प्रदर्शन. मीडिया इनलेट और आउटलेट को क्रमशः गुलाबी और पीले तीरों के रूप में दिखाया गया है। संक्षिप्त: ACBR = वायुमंडलीय नियंत्रण बाधा रिंग। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: पूरे माउस छेनी का अलगाव। (ए) बरकरार जबड़ा। (बी-एच) पूरे छेनी को बेनकाब करने के लिए हड्डियों को धीरे-धीरे हटा दिया गया। बी और सी में लाल धराशायी लाइनों झिल्ली हड्डी छेदनी बंद शेविंग के बाद शिखर छेदक के उजागर नरम ऊतक दिखाने के लिए कृन्तक सॉकेट (प्रोटोकॉल में कदम 3.3-3.5) के भाषाई और मुख पक्षों पर निर्भर है. (डीजी) नीले तीर के निशान condyles, दाढ़, और वायुकोशीय हड्डियों है कि पूरे दांत (प्रोटोकॉल में कदम 3.6) को अलग करने के लिए हटा दिया गया है का प्रतिनिधित्व करते हैं. स्केल बार = 2 मिमी (एच)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: लाइव इमेजिंग के लिए पीरियडोंटल ऊतकों को हटाना। (ए-एच) (A-D) K14Cre से प्रतिनिधि नमूने; आर 26आरटीटीए; tetO-H2B-GFP, और (E-H) K14Cre; R26एमटी/एमजीचूहों प्रोटोकॉल के हमारे प्रदर्शन में इस्तेमाल किया गया. विच्छेदन से पहले, दंत उपकला में GFP अभिव्यक्ति हड्डी (ए, ई, पीले arrowheads) के माध्यम से दिखाई दे रहा था. सफेद धराशायी रेखाएं अविच्छेदित incenders को रेखांकित करती हैं। ई' भाषाई पक्ष दिखाता है। पृथक incisors (बी, सी, एफ, जी) में, जीएफपी प्रतिदीप्ति शुरू में apical incisors (सफेद और लाल arrowheads) को कवर periodontal ऊतकों द्वारा विवर्तित किया गया था. एफ और जी लेबल गैर-उपकला कोशिकाओं में लाल प्रतिदीप्ति। पीरियडोंटल ऊतकों को हटाने से हरे फ्लोरोसेंट ग्रीवा लूप (डी, एच, हरे एरोहेड्स) का एक स्पष्ट और अबाधित दृश्य दिखाई देता है। स्केल बार = 2 मिमी (ए, ई); 1.25 मिमी (बी, एफ); और 300 माइक्रोन (सी, डी, जी, एच)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: कश्मीर 14 क्रे की टाइमलैप्स माइक्रोस्कोपी; आर26आरटीटीए; tetO-H2B-GFP ग्रीवा लूप। (ए) टाइमलैप्स सेटअप को दर्शाने वाला एक योजनाबद्ध। (बी) K14Cre का एक प्रतिनिधि z-प्लेन; आर 26आरटीटीए; tetO-H2B-GFP incisor labial cervical loop, मुख्य रूप से पारगमन-प्रवर्धक क्षेत्र में H2B-GFP द्वारा परमाणु लेबलिंग दिखा रहा है, जहां कोशिकाएं सक्रिय रूप से विभाजित होती हैं। पीला बॉक्स नीचे दिखाए गए बढ़े हुए चित्रों के सामान्य क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। (सी-के) बीएम के सापेक्ष ऊर्ध्वाधर और तिरछे सेल डिवीजनों को दिखाने वाली टाइमलैप्स छवियां (एलएन) टाइमलैप्स छवियां बीएम के सापेक्ष क्षैतिज सेल डिवीजन का एक उदाहरण दिखाती हैं। (डी, जी, जे, एम) मेटाफ़ेज़ या एनाफ़ेज़ में सेल मध्य पैनलों में प्रदर्शित होते हैं। प्रत्येक ट्रैक किए गए डिवीजन के स्कीमैटिक्स दाईं ओर दिखाए जाते हैं। एन = 36 माइक्रोन (बी) में स्केल बार; 5 माइक्रोन (सी-एन)। संक्षिप्त: बीएम = तहखाने झिल्ली। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: के 14 क्रे की टाइमलैप्स माइक्रोस्कोपी; आर26एमटी/एमजी ग्रीवा लूप। (ए) K14Cre का एक प्रतिनिधि z-प्लेन; R26mT/mG incisor labial cervical loop. सभी उपकला कोशिकाएं झिल्ली GFP को व्यक्त करती हैं। पीला बॉक्स इज़ाफ़ा में दिखाए गए सेल ट्रैकिंग के क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। (बीजी) बीएम के सापेक्ष (बी-डी) क्षैतिज और (ईजी) ऊर्ध्वाधर सेल डिवीजनों दोनों को कैप्चर करने वाली टाइमलैप्स छवियां (सी, एफ) मध्य पैनल माइटोटिक सेल गोलाई दिखाते हैं। प्रत्येक ट्रैक किए गए डिवीजन के स्कीमैटिक्स दाईं ओर दिखाए जाते हैं। स्केल बार = 35 माइक्रोन (ए); 5 माइक्रोन (बीजी)। संक्षिप्त: बीएम = तहखाने झिल्ली। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा S1: इनहाउस-निर्मित छिड़काव पकवान। (ए) एक छिड़काव पकवान बनाने के लिए एक 35 मिमी संस्कृति पकवान इस्तेमाल किया जा सकता है. एक गिलास नीचे पकवान इस्तेमाल किया जा सकता है अगर इमेजिंग एक उल्टे खुर्दबीन का उपयोग कर किया जाता है. (B) एक कील को लौ से गर्म कीजिए। (सी) गर्म नाखून का उपयोग करके डिश के दोनों ओर दो उद्घाटन (सफेद तीर) बनाए जाते हैं। (डी) दो ब्लंट-एंड 16 जी सुइयों को चिपकाएं, एक मीडिया इनलेट के रूप में और दूसरा मीडिया आउटलेट के रूप में, एपॉक्सी गोंद का उपयोग करके उद्घाटन के माध्यम से। यदि गैस छिड़काव वांछित है, तो डिश में एक तीसरा उद्घाटन / सुई जोड़ा जा सकता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो S1: K14Cry की लाइव इमेजिंग; आर 26आरटीटीए; tetO-H2B-GFP incisor labial cervical loop, ऊर्ध्वाधर और तिरछा कोशिका विभाजन दिखा रहा है. कोशिकाओं को मैन्युअल रूप से ट्रैक किया जाता है, और विभिन्न रंगीन डॉट्स मां / बेटी कोशिकाओं के विभिन्न जोड़े का प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल बार = 30 माइक्रोन (बाएं फ्रेम); 7 माइक्रोन (सही फ्रेम)। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो S2: K14Cry की लाइव इमेजिंग; आर 26आरटीटीए; tetO-H2B-GFP छेनी प्रयोगशाला ग्रीवा लूप, क्षैतिज कोशिका विभाजन का एक उदाहरण दिखा रहा है। क्षैतिज विभाजन 10 s के निशान पर होता है और नीले डॉट्स का उपयोग करके मैन्युअल रूप से ट्रैक किया जाता है। स्केल बार = 30 माइक्रोन (बाएं फ्रेम); 7 माइक्रोन (सही फ्रेम)। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो S3: K14Cry की लाइव इमेजिंग; R26mT/mG incisor labial cervical loop, ऊर्ध्वाधर और क्षैतिज दोनों कोशिका विभाजन दिखा रहा है। कोशिकाओं को मैन्युअल रूप से ट्रैक किया जाता है, और विभिन्न रंगीन सर्कल मां / बेटी कोशिकाओं के विभिन्न जोड़े का प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल बार = 30 माइक्रोन (बाएं फ्रेम); 7 माइक्रोन (सही फ्रेम)। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

लाइव ऊतक इमेजिंग एक महत्वपूर्ण तकनीक है जो हमें कोशिकाओं की गतिशील प्रक्रियाओं और व्यवहारों का अध्ययन करने की अनुमति देती है जब उन्हें उनके आला वातावरण में बनाए रखा जाता है41. आदर्श रूप से, लाइव इमेजिंग उच्च spatiotemporal संकल्प के साथ विवो में किया जाता है. हालांकि, स्तनधारी अंगों के लिए विवो इमेजिंग में ऊतक दुर्गमता, ऑप्टिकल अस्पष्टता, और एक लंबी अवधि के लिए जानवर या अंग immobilizing में कठिनाई के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है42. ऊतक explants इन चुनौतियों में से कुछ बाईपास और सफलतापूर्वक इस तरह के दांत morphogenesis और एक्टोडर्मल अंगों26 के विकास के दौरान के रूप में, सेल व्यवहार को ट्रैक करने के लिए अध्ययन की एक संख्या में अपनाया गया है. यहाँ, हम सुसंस्कृत पूरे वयस्क माउस incenders पर रहते हैं गहरी ऊतक इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल अभी तक मजबूत प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया. इस तकनीक के आवेदन से हमें दंत उत्थान के दौरान सेल आंदोलनों, भाग्य निर्णयों और ऊतक संगठनों के विनियमन को समझने में मदद मिलेगी।

क्योंकि कोशिका विभाजन आसानी से देखने योग्य घटनाएं हैं और ऊतकों को पुनर्जीवित करने की विशेषता है, हमने प्रोटोकॉल के एक उपयोग को उजागर करने के लिए इस अध्ययन में विभाजित कोशिकाओं पर नज़र रखने पर ध्यान केंद्रित किया है। हमने पाया कि छेनी उपकला पूर्वज ऊर्ध्वाधर और क्षैतिज दोनों विभाजनों से गुजर सकते हैं, इस प्रकार अन्य उपकला ऊतकोंके समान 43. विभाजन कोणों को नियंत्रित करने वाले तंत्र को स्पष्ट करना और सेल भाग्य निर्णयों में विभाजन अभिविन्यास की भूमिका की जांच करना भविष्य के अध्ययनों में महत्वपूर्ण होगा। फ्लोरोसेंट सेल भाग्य मार्करों, सिग्नलिंग मार्ग रिपोर्टरों, या फूक्की सेल चक्र रिपोर्टर44,45 ले जाने वाले विभिन्न माउस आनुवंशिक मॉडल के साथ लाइव इमेजिंग का संयोजन यह अनावरण करने में मदद करेगा कि सेल डिवीजन पैटर्न और सेल चक्र गतिशीलता उपकला होमियोस्टेसिस और पुनर्जनन के नियमन में कैसे योगदान करती है।

इस प्रोटोकॉल में एक आवश्यक अभ्यास एक त्वरित और सावधान तरीके से दांत विच्छेदन बाहर ले जाने के लिए है, करने के लिए त्वरित संक्रमण और उचित संवर्धन हालत के तहत बरकरार ऊतक के संरक्षण की अनुमति. हमने पाया है कि लाइव इमेजिंग के लिए, ठंडे मीडिया के बजाय गर्म मीडिया में ऊतकों को विदारक करना, जैसा कि प्रोटीन और एमआरएनए46 निकालने के उद्देश्य से प्रयोगों में, कोशिकाओं को एक कार्यशील स्थिति में बनाए रखता है। क्योंकि छेनी संवर्धन के लिए एक अपेक्षाकृत बड़ा अंग है, मीडिया छिड़काव के माध्यम से पोषक तत्वों की एक स्थिर आपूर्ति भी इमेजिंग47 भर में ऊतक की निरंतरता के लिए महत्वपूर्ण है. यदि पूर्वज कोशिकाएं ब्याज के क्षेत्र में मौजूद हैं, तो लगातार कोशिका विभाजन का अवलोकन एक अच्छा संकेतक है कि ऊतक स्वस्थ और सक्रिय है। इसके विपरीत, कोशिका मृत्यु दुर्लभ होना चाहिए, और यह इमेजिंग के दौरान उज्ज्वल और संघनित परमाणु निकायों का पता लगाने के द्वारा सत्यापित किया जा सकता है यदि एक परमाणु मार्कर का उपयोग किया जाता है या इमेजिंग और ऊतक निर्धारण48 के बाद ट्यूनल धुंधला प्रदर्शन करके। पोषक तत्वों के अलावा, ऑक्सीजन का स्तर भी एक्सप्लांट व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकता है, क्योंकि ऑक्सीजन तनाव या अपर्याप्तता सेल अस्तित्व, प्रसार और भेदभाव 49,50,51को बाधित कर सकती है। हमारे अनुभव में, हमने सेल प्रसार और कोशिका मृत्यु में स्पष्ट अंतर नहीं देखा है जब नमूने अतिरिक्त ऑक्सीजन के साथ या बिना प्रदान किए गए थे (उदाहरण के लिए, इमेजिंग के दौरान 95% ओ2/5% सीओ2 कार्बोजेन या 5% सीओ2/21% ओ2/संतुलित एन2) , यह सुझाव देते हुए कि सिस्टम में ऑक्सीजन की मात्रा का पता लगाना रातोंरात संस्कृति में छेनी उपकला बनाए रखने के लिए पर्याप्त है या ऊतक सामान्य सेल कार्यों को बनाए रखने के लिए वैकल्पिक मार्गों को नियोजित कर सकता है52. हालांकि, अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं या सही जीन अभिव्यक्ति में ऑक्सीजन की आवश्यकता को भविष्य के अध्ययनों में और निर्धारित किया जाना चाहिए।

प्रोटोकॉल के हमारे प्रदर्शन में, हम आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड एच 2 बी-GFP और झिल्ली GFP सेल नाभिक और आकृति लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया है, क्रमशः. ये फ्लोरोसेंट मार्कर दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के तहत उज्ज्वल और लंबे समय तक चलने वाले हैं और इस प्रकार सेल आंदोलनों और डिवीजनों पर नज़र रखने के लिए उपयोग करने के लिए आदर्श लेबल के उदाहरण हैं। सिद्धांत रूप में, फ्लोरोसेंट महत्वपूर्ण रंगों भी पूर्व विवो लाइव इमेजिंग53 के लिए विभिन्न उपकोशिकीय डिब्बों लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन गहरी उपकला कोशिकाओं में रंगों की कम पैठ संभावना उनके उपयोग को सीमित करता है. इसी तरह, जबकि मानक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी 100 माइक्रोन के तहत गहराई पर उच्च-रिज़ॉल्यूशन लाइव इमेजिंग में सक्षम है, दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी कम फोटोब्लीचिंग और फोटोटॉक्सिसिटी54 के साथ इमेजिंग गहराई में वृद्धि प्रदान करता है। इसलिए हमने अपने अधिकांश लाइव इमेजिंग अनुप्रयोगों में इमेजिंग साधन के रूप में दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी को चुना है।

इस प्रोटोकॉल की एक संभावित सीमा यह है कि incisor explants पूरी तरह से vivo पर्यावरण और जीव विज्ञान में recapitulate नहीं हो सकता है. इसलिए डेटा संस्कृति की स्थिति के तहत सेल व्यवहार का प्रतिनिधित्व करता है और तदनुसार व्याख्या की जानी चाहिए और साथ ही अन्य तरीकों, जैसे कि हिस्टोलॉजी का उपयोग करके मान्य किया जाना चाहिए, जब लागू हो। इमेजिंग के लिए ग्रीवा लूप तक पहुंच प्राप्त करने के लिए हमें पीरियडोंटल ऊतकों को आंशिक रूप से हटाना पड़ा। पीरियडोंटल ऊतकों और दंत उपकला के बीच सिग्नलिंग इंटरैक्शन इस प्रकार बाधित हो सकता है। अंत में, जबकि मीडिया छिड़काव बहुत सुसंस्कृत ऊतकों की व्यवहार्यता में सुधार करता है, यह एक अस्थानिक यांत्रिक संकेत के रूप में कार्य करता है और परिणाम55,56 को प्रभावित करता है कि द्रव कतरनी तनाव परिचय सकता है. हमने अपने सेटअप में विभिन्न प्रवाह दरों के प्रभाव को निर्धारित नहीं किया है। हालांकि, क्योंकि 1-5 एमएल / एच की कम प्रवाह दर आमतौर पर पोषक तत्वों की आपूर्ति57 को बनाए रखने के लिए पर्याप्त है, कतरनी तनाव के प्रभाव को कम किया जा सकता है। मन में इन सीमाओं के साथ, पूर्व विवो लाइव इमेजिंग सेल व्यवहार में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मंच के रूप में कार्य करता है जब उचित नियंत्रण प्रयोगों में शामिल कर रहे हैं.

लगातार बढ़ते माउस छेदनी स्टेम सेल आधारित ऊतक नवीकरण और चोट की मरम्मत का अध्ययन करने के लिए एक अत्यधिक ट्रैक्टेबल मॉडल प्रणाली है। इस के साथ वर्णित प्रोटोकॉल संस्कृति में पूरे वयस्क incenders बनाए रखने और timelapse माइक्रोस्कोपी के माध्यम से सेल व्यवहार के बारे में spatiotemporal जानकारी निकालने के साधन के साथ जांचकर्ताओं प्रदान करता है. हम उम्मीद करते हैं कि यह तकनीक दंत चिकित्सा अनुसंधान में उपयोग किए जाने वाले विभिन्न माउस आनुवंशिक मॉडल का अध्ययन करने और दंत उत्थान के क्षेत्र में हमारे ज्ञान को आगे बढ़ाने में मदद करने के लिए व्यापक रूप से लागू होगी।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी प्रदान करने के लिए कैलिफोर्निया नैनोसिस्टम्स इंस्टीट्यूट (RRID: SCR_022789) में UCLA एडवांस्ड लाइट माइक्रोस्कोपी / स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रयोगशाला और लीका माइक्रोसिस्टम्स सेंटर ऑफ एक्सीलेंस को स्वीकार करते हैं। एएस को इज़राइल साइंस फाउंडेशन से आईएसएफ 604-21 द्वारा समर्थित किया गया था। जेएच को एनआईएच/एनआईडीसीआर के R03DE030205 और R01DE030471 का समर्थन प्राप्त था। एएस और जेएच को संयुक्त राज्य अमेरिका-इज़राइल बिनेशनल साइंस फाउंडेशन (बीएसएफ) से अनुदान 2021007 द्वारा भी समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well, flat bottom tissue culture plate Olympus plastics 25-107
25x HC IRAPO motCORR water dipping objective Leica 11507704
Ascorbic acid (Vitamin C) Acros Organics 352685000
D-(+)-Glucose bioxtra  Sigma Aldrich G7528
Delta T system  Bioptechs 0420-4 Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup
Dissection microscope- LEICA S9E Leica LED300 SLI
DMEM/F12 Thermo Scientific 11039047 Basal media without phenol red
Feather surgical blade (#15) Feather 72044-15
Fine forceps F.S.T 11252-23
Glutamax  Thermo Scientific 35050-061 Glutamine substitute
Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective  Leica n/a
low-melting agarose NuSieve 50080
non-essential amino acids (100x) Thermo Scientific 11140-050
penicillin–streptomycin Thermo Scientific 15140122 10,000 U/mL 
Petri dish Gen Clone 32-107G 90 mm 
Rat serum Valley Biomedical AS3061SC Processed for live imaging
Razor blade #9 VWR 55411-050
Scalpel handle F.S.T 10003-12
Scissors F.S.T 37133
serrated forceps F.S.T 11000-13
spring scissors F.S.T 91500-09

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References

  1. Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
  2. Jing, J., et al. Rodent incisor as a model to study mesenchymal stem cells in tissue homeostasis and repair. Frontiers in Dental Medicine. 3, 1068494 (2022).
  3. Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and Fgf signaling. Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
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