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Developmental Biology

Uso de imágenes en vivo ex vivo para investigar las divisiones celulares y los movimientos durante la renovación dental del ratón

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/66020
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2, 1,3
1School of Dentistry, University of California Los Angeles, 2The Institute of Biomedical and Oral Research, Faculty of Dental Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 3Molecular Biology Institute, University of California Los Angeles
* These authors contributed equally

Summary

La imagen en vivo ex vivo es una técnica poderosa para estudiar los procesos dinámicos de los movimientos e interacciones celulares en los tejidos vivos. Aquí, presentamos un protocolo que implementa la microscopía de dos fotones para rastrear en vivo las células epiteliales dentales en incisivos de ratones adultos enteros cultivados.

Abstract

El incisivo de ratón en continuo crecimiento está emergiendo como un sistema modelo altamente manejable para investigar la regulación de las células madre epiteliales y mesenquimales adultas y la regeneración dental. Estas poblaciones progenitoras se dividen, se mueven y se diferencian activamente para mantener la homeostasis tisular y regenerar las células perdidas de manera receptiva. Sin embargo, los análisis tradicionales que utilizan secciones fijas de tejido no pudieron capturar los procesos dinámicos de los movimientos e interacciones celulares, lo que limitó nuestra capacidad para estudiar sus regulaciones. En este trabajo se describe un protocolo para mantener incisivos enteros de ratón en un sistema de cultivo de explantes y células epiteliales dentales de seguimiento vivo mediante microscopía de lapso de tiempo multifotónica. Esta técnica se suma a nuestra caja de herramientas existente para la investigación dental y permite a los investigadores adquirir información espacio-temporal sobre el comportamiento y las organizaciones celulares en un tejido vivo. Anticipamos que esta metodología ayudará a los investigadores a explorar más a fondo los mecanismos que controlan los procesos celulares dinámicos que tienen lugar tanto durante la renovación como durante la regeneración dental.

Introduction

En las últimas dos décadas, el incisivo de ratón se ha convertido en una plataforma inestimable para investigar los principios de la regulación de las células madre adultas y la regeneración dental 1,2. El incisivo del ratón crece continuamente y se renueva a lo largo de la vida del animal. Lo hace mediante el mantenimiento de células madre epiteliales y mesenquimales, que pueden autorrenovarse y diferenciarse en diferentes tipos de células del diente 1,2. Mientras que las células madre epiteliales dentales dan lugar a los ameloblastos, que secretan la matriz del esmalte, las células madre mesenquimales dentales dan lugar a odontoblastos, cementoblastos y fibroblastos, que forman la dentina, el cemento y el ligamento periodontal, respectivamente 3,4,5,6. Este suministro constante de nuevas células mantiene la homeostasis tisular y permite la reposición de células viejas que se pierden debido al desgaste masticatorio o a las lesiones 7,8. Por lo tanto, dilucidar los mecanismos celulares y moleculares que regulan el mantenimiento y la diferenciación de las células madre dentales es fundamental para comprender la regeneración dental, un área de creciente interés.

Anatómicamente, una gran parte del incisivo del ratón adulto está encerrada en la mandíbula. Mientras el borde incisal del diente está expuesto, el extremo apical del incisivo encaja dentro de un alvéolo y está firmemente unido al hueso circundante a través de los ligamentos periodontales y los tejidos conectivos (Figura 1A, B). El extremo apical del incisivo es también la región de crecimiento del diente y mantiene las células madre y progenitoras dentales tanto en la capa epitelial como en la pulpa mesenquimal 9,10,11,12,13. Específicamente, las células madre epiteliales dentales se mantienen en el extremo bulboso del epitelio, conocido como yema apical, también conocida como asa cervical labial (Figura 1C). Al igual que el epitelio intestinal y la epidermis, la renovación epitelial en el incisivo se apoya principalmente en el ciclo activo de las células madre y sus descendientes intermedios altamente proliferativos, llamados células amplificadoras de tránsito 14,15,16,17, ambas residiendo en la parte interna del asa cervical. Sin embargo, aún no se ha determinado si el epitelio incisivo contiene y utiliza células madre quiescentes durante la regeneración. Por el contrario, se han identificado células madre mesenquimales dentales activas y quiescentes en la pulpa apical, y las células madre quiescentes funcionan como una población de reserva que se activa durante la reparación de la lesión13,18.

Muchos de los descubrimientos sobre la biología de la renovación y regeneración de los incisivos del ratón han sido el resultado de investigaciones histológicas, en las que las muestras se obtienen en distintas coyunturas temporales, se fijan, se procesan y luego se seccionan en rodajas de una micra de espesor a lo largo de un plano particular. A través de un análisis detallado de secciones histológicas de diferentes modelos de ratón que permiten el rastreo de linajes o perturbaciones genéticas, los científicos han identificado los linajes celulares de diferentes poblaciones de progenitores, así como las vías genéticas y de señalización que controlan la homeostasis de los incisivos y la reparación de lesiones 19,20,21. Sin embargo, las imágenes estáticas bidimensionales (2D) de células no vitales en secciones no pueden capturar el espectro completo de comportamientos celulares y organizaciones espaciales en el tejido vivo, como los cambios en la forma de las células, los movimientos y la cinética celular. Detectar y medir estos cambios celulares rápidos, que ocurren en una escala de tiempo que no se puede resolver a través del corte de tejidos, requiere una estrategia diferente. Además, la adquisición de dicha información también es fundamental para comprender cómo las células dentales interactúan entre sí, reaccionan a diferentes estímulos de señalización y se autoorganizan para mantener las estructuras y funciones de los tejidos.

El advenimiento de la obtención de imágenes de tejidos profundos en cuatro dimensiones (4D) mediante microscopía de dos fotones22, una tecnología que integra tres dimensiones espaciales con resolución temporal, supera las limitaciones inherentes al análisis histológico al permitir el examen espaciotemporal de explantes de tejidos cultivados, organoides o incluso tejidos in situ 23,24,25,26 . Por ejemplo, las imágenes en vivo en 4D del epitelio dental en desarrollo han revelado los patrones espacio-temporales de las divisiones celulares y las migraciones que coordinan el crecimiento del tejido, la formación del centro de señalización y la morfogénesis epitelial dental 27,28,29,30,31,32. En el incisivo de ratón adulto, las imágenes 4D se han adaptado recientemente para estudiar los comportamientos celulares durante la reparación de lesiones epiteliales dentales. Las imágenes en vivo revelaron que las células del estrato intermedio en la capa suprabasal pueden convertirse directamente en ameloblastos en la capa basal para regenerar el epitelio dañado, desafiando el paradigma tradicional de reparación de lesiones epiteliales15.

Aquí, describimos la disección, el cultivo y la obtención de imágenes del incisivo de ratón adulto, centrándonos en las células epiteliales del asa cervical labial (Figura 1). Esta técnica preserva la vitalidad de las células dentales durante más de 12 h y permite el seguimiento en vivo de las células marcadas con fluorescencia a una resolución de una sola célula. Este enfoque permite investigar el movimiento y la migración celular, así como los cambios dinámicos en la forma celular y la orientación de la división en condiciones normales de cultivo, o en respuestas a perturbaciones genéticas, físicas y químicas.

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Protocol

Todos los ratones se mantuvieron en instalaciones de animales libres de patógenos en la Universidad de California en Los Ángeles (UCLA) o la Universidad Hebrea de Jerusalén (HUJI). Todos los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con las normas y protocolos aprobados por el respectivo Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) o (MD-23-17184-3; HUJI). En la Figura 2A se muestra un flujo de trabajo general de los pasos experimentales. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los instrumentos, reactivos y materiales utilizados en este protocolo.

1. Preparación de soluciones y geles

  1. Medio de disección: Preparar DMEM/F12 fresco con glucosa al 0,5% y mantenerlo caliente a 37 °C hasta que lo necesite en el paso 2.4.
    NOTA: Utilizamos DMEM/F12 sin rojo de fenol para reducir la autofluorescencia durante la obtención de imágenes en vivo.
  2. 1x Medio de cultivo: Prepare un medio fresco con 50% DMEM/F12, 50% de suero de rata, 1x sustituto de glutamina, 1x aminoácidos no esenciales MEM, 1% de glucosa, 0,1 mg/ml de ácido L-ascórbico y 0,5% de penicilina-estreptomicina. Manténgalo caliente a 37 °C hasta que lo necesite en el paso 5.5. Este medio se utiliza para el cultivo de explantes de incisivos durante la obtención de imágenes en vivo.
    NOTA: El suero de rata debe ser de alta calidad y estar especialmente preparado para el cultivo de tejidos enteros por parte de investigadores o de una fuente comercial. En particular, la sangre debe centrifugarse (durante 5 minutos a 1.200 × g a temperatura ambiente) antes de que comience a formarse la coagulación. Después de la centrifugación, el coágulo de fibrina resultante debe exprimirse y desecharse33.
  3. Gel de cultivo: El propósito del gel es inmovilizar las muestras durante la obtención de imágenes y se prepara fresco.
    1. Hacer gel al 2% en DMEM/F12 disolviendo 200 mg de agarosa de bajo punto de fusión en 10 mL de DMEM/F12 usando un microondas. Mantener el gel al 2% a 37 °C.
    2. Prepare 2 medios de cultivo (sin DMEM/F12) mezclando suero de rata al 50 %, 1 sustituto de glutamina, 1 aminoácido no esencial MEM, glucosa al 1 %, 0,1 mg/ml de ácido L-ascórbico y penicilina-estreptomicina al 0,5 %. Calentar el medio de cultivo 2x (sin DMEM/F12) a 37 °C.
    3. Haga gel de cultivo al 1% mezclando volúmenes iguales de gel al 2% y medio de cultivo 2x (sin DMEM/F12). Mantenga el gel de cultivo al 1% a 37 °C hasta que lo necesite en el paso 5.1.
      NOTA: Asegúrese de que todas las soluciones estén tibias antes de mezclarlas para evitar que se gelifiquen. Encontramos que el gel al 1% es adecuado para cultivar el incisivo de ratón adulto. El porcentaje de gel debe determinarse empíricamente si se van a cultivar otros tejidos.

2. Extracción de las mandíbulas de los ratones adultos

  1. Sacrificar ratones a la edad deseada utilizando procedimientos estándar aprobados por la IACUC.
    NOTA: Aquí utilizamos asfixia por CO2 seguida de luxación cervical. Las regulaciones para la eutanasia animal pueden variar en diferentes regiones. Los investigadores deben obtener la aprobación institucional necesaria antes de realizar experimentos y garantizar el cumplimiento de las regulaciones locales de cuidado de animales.
  2. Desinfecte el ratón con etanol al 70%.
  3. Decapita al ratón y extrae las mandíbulas izquierda y derecha.
    1. Coloque el mouse sobre su vientre, luego use una hoja de afeitar industrial de un solo filo # 9 para cortar en la región del cuello y separar la cabeza del mouse del resto del cuerpo.
      NOTA: Si también se van a recolectar tejidos de la faringe o de la región del cuello, no se debe realizar la decapitación, y se puede proceder directamente al paso 2.3.2.
    2. Dale la vuelta al ratón para que su lado ventral quede hacia arriba y las mandíbulas sean fácilmente accesibles.
    3. Asegure la cabeza del animal sosteniéndola suavemente entre el pulgar y el índice.
    4. Usa la hoja de afeitar para hacer una incisión sagital media que corte sobre la piel de la mandíbula inferior desde el labio inferior hacia el escote.
      NOTA: También se puede usar una cuchilla quirúrgica # 15 para realizar la incisión y las disecciones posteriores (pasos 2.3.6-2.3.9).
    5. A medida que se realiza la incisión, extienda la piel cortada con el pulgar y el índice para exponer los músculos y la mandíbula debajo.
    6. Use la hoja de afeitar para cortar los músculos maseteros en el lado bucal de la mandíbula inferior, de modo que el exterior de los hemimandibles izquierdo y derecho ahora esté libre de inserciones musculares.
    7. Separe los músculos milohioideos a lo largo del lado interno de la mandíbula para eliminar las inserciones musculares allí.
    8. Haga otra incisión en la sínfisis mandibular que conecta los dos hemimandibles. Una vez cortada, la mandíbula se separará en las mitades izquierda y derecha.
    9. Coloque la hoja de afeitar entre el cóndilo mandibular y la articulación mandibular temporal y diseccione cuidadosamente el hemimandible del resto de la cabeza.
      NOTA: Nos resultó útil tirar suavemente del incisivo al mismo tiempo mientras se corta. Se debe tener cuidado para evitar romper la mandíbula y dañar los tejidos blandos del interior.
  4. Transfiera inmediatamente las mandíbulas disecadas a una placa de Petri con el medio de disección precalentado (paso 1.1) y retire los tejidos musculares restantes con una cuchilla quirúrgica # 15.
    NOTA: Mantener las muestras en medios fríos ralentiza las actividades celulares, lo que resulta en recuperaciones retrasadas o incluso fallidas de ciertas actividades celulares, como la proliferación o el movimiento celular, durante la obtención de imágenes en vivo.

3. Aislamiento de todos los incisivos del ratón

NOTA: El aislamiento adicional del incisivo se realiza bajo un microscopio de disección de campo claro.

  1. Identificar visualmente la región ovalada de la mandíbula que cubre la cavidad del incisivo y alberga la porción apical del incisivo.
  2. Coloque la mandíbula de modo que la superficie interna (lingual) quede hacia arriba.
  3. Mientras sostiene la mandíbula en su lugar con un par de pinzas dentadas, genere una ventana en la región ovalada afeitando el hueso de la membrana suprayacente con una cuchilla quirúrgica # 15, en una dirección que sea desde el cóndilo hacia los molares. Esto expone el tejido blando del incisivo apical en la superficie interna.
  4. Dé la vuelta a la mandíbula de modo que la superficie externa (bucal) quede hacia arriba.
  5. Genere una ventana en la región ovalada de la mandíbula externa como se describe en el paso 3.3 y utilice la punta del bisturí para recoger los fragmentos óseos restantes en el borde. Asegúrese de que el extremo apical del diente sea visible desde ambos lados.
    NOTA: Evite la presión excesiva mientras afeita los huesos para evitar daños en los tejidos blandos subyacentes.
  6. Cortar sistemáticamente los huesos que rodean el incisivo para aislar todo el diente.
    1. Haga un corte limpio en un plano que esté inmediatamente adyacente al incisivo apical para eliminar primero la apófisis condilar.
      NOTA: Tenga cuidado de no cortar el incisivo.
    2. Hacer un segundo corte justo posterior al 3er molar, pero dorsal al incisivo sin dañar el diente. Esto elimina el hueso que incluye la apófisis coronoides.
    3. Cortar en serie desde la punta de la apófisis angular hacia el incisivo para eliminar gradualmente la mandíbula ventral de manera escalonada.
      NOTA: El epitelio dental y los tejidos periodontales asociados a menudo se adhieren al hueso y se arrancan fácilmente si se corta una gran parte del hueso ventral de una sola vez. Para separar el hueso del tejido blando del incisivo, se puede insertar el bisturí (o un par de pinzas afiladas no dentadas) entre los dos tejidos en el extremo apical del incisivo y deslizar delicadamente el instrumento hacia adelante.
    4. Corta el hueso alveolar con los molares y cualquier hueso restante que aún esté unido al incisivo.
    5. Ahora se aísla todo el incisivo. Transfiera el incisivo completamente diseccionado a una placa con medios de disección limpios y tibios (paso 1.1).
  7. Repita los pasos 3.2-3.6 para aislar los incisivos adicionales según sea necesario.
    NOTA: Los incisivos maxilares/superiores del ratón también mantienen células madre adultas y pueden utilizarse para estudiar la regeneración dental34. Los investigadores dentales suelen centrarse en los incisivos inferiores porque son más accesibles y se pueden diseccionar más fácilmente que los incisivos superiores. Las diferencias entre las células progenitoras de los incisivos mandibulares y maxilares aún no se han determinado.

4. Extirpación de tejidos periodontales para exponer el asa cervical epitelial incisivo

  1. Con todo el incisivo acostado sobre su lado lingual y mientras sostiene el diente en su lugar con un par de pinzas dentadas, use un par de pinzas finas # 5 para comenzar a meter los tejidos periodontales que cubren el incisivo apical y la región del asa cervical.
  2. Retire con cuidado el tejido periodontal de la yema apical, de modo que el lado lateral del asa cervical (u otras regiones de interés) se haga visible debajo del endoscopio.
    NOTA: Se debe tener cuidado para evitar dañar el epitelio dental o desprenderlo del mesénquima. Si el incisivo tiene señales de fluorescencia en la región de interés y se dispone de un microscopio de disección fluorescente, se pueden utilizar señales de fluorescencia para ayudar a distinguir entre los tipos de tejido y ayudar a las disecciones. Es importante llevar a cabo eficientemente las secciones 2-4 para que las muestras puedan transferirse rápidamente a los medios de cultivo y mantenerse adecuadamente mediante el cultivo de explantes (véase más adelante).

5. Inclusión de tejidos para el cultivo de explantes

  1. Agregue 500 μL de gel de cultivo tibio y sin solidificar a un pocillo en una placa de 24 pocillos y transfiera rápidamente los incisivos enteros disecados al pocillo. Agite la placa unas cuantas veces para enjuagar los incisivos.
  2. Añadir 400 μL de gel de cultivo tibio y sin solidificar a una placa de cultivo y transferir los incisivos enjuagados a la placa.
    NOTA: Utilizamos una placa de cultivo disponible comercialmente que es compatible con la configuración de perfusión. Consulte el paso 6.4 para ver las opciones alternativas.
  3. Oriente el incisivo para colocar la región del asa cervical (u otras regiones de interés) en el centro de la placa (Figura 2A, B) y ajuste la inclinación del incisivo apical para el plano de imagen deseado.
    NOTA: La orientación de los tejidos debe realizarse rápidamente antes de la gelificación completa.
  4. Después de fijar el gel, use un par de pinzas finas para quitar cualquier gel en la parte superior de la región de interés para que no quede cubierto por el gel.
  5. Agregue un volumen suficiente de medio de cultivo tibio pipeteándolo lentamente contra el borde de la placa para cubrir solo la muestra (~ 150 μL).
  6. Trasladar el cultivo de explantes a una incubadora de cultivos celulares a 37 °C para permitir la sedimentación del tejido y el ajuste a las condiciones de cultivo durante 1 h.

6. Microscopía timelapse de explantes de incisivos

NOTA: En este experimento, utilizamos un microscopio vertical equipado con un objetivo de inmersión en agua de 25x que tiene una apertura numérica de 1. En general, una lente de inmersión en agua con una apertura numérica alta es la más adecuada para la obtención de imágenes de tejidos profundos.

  1. Encienda el microscopio y el láser de dos fotones.
  2. Fije la placa de cultivo al adaptador de platina y monte el anillo adaptador de perfusión en la parte superior (Figura 2C).
  3. Conecte el adaptador de platina a un controlador de temperatura configurado para mantener el cultivo a 37 °C.
  4. Conecte la entrada y la salida del anillo adaptador a una bomba de microperfusión y comience la perfusión del medio de cultivo, con la velocidad de perfusión establecida en 20 en la bomba. Esto genera un flujo lento (~5 mL/h) del medio de cultivo sobre la parte superior de las muestras (Figura 2C).
    NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre el sistema para mantener el tejido en un entorno controlado de manera estable. También se pueden utilizar otros sistemas. También se puede utilizar una combinación de una placa calefactora a 37 °C y una placa de cultivo de perfusión casera (figura complementaria S1) con una entrada y una salida conectadas a bombas de jeringa.
  5. Coloque un anillo de barrera de control atmosférico (ACBR) en la parte superior del anillo adaptador y baje el objetivo a través del ACBR para hacer contacto con el medio de cultivo (Figura 2D).
  6. Ajuste la longitud de onda del láser a 920 nm para visualizar las señales de GFP y fluorescencia roja (por ejemplo, tdTomato).
  7. Localice las muestras a través de oculares y luego en el software del microscopio.
  8. Configure pilas Z, imágenes de múltiples posiciones e intervalos de tiempo con el software. Para seguir este protocolo, utilice un tamaño de paso z de 4 μm y un intervalo de tiempo de 5 min durante 14 h.
    NOTA: Encontramos que un intervalo de tiempo de más de 5 minutos a menudo es insuficiente para capturar movimientos y divisiones celulares suaves.
  9. Inicie las imágenes de lapso de tiempo.
    NOTA: La posición de la muestra puede cambiar durante la primera hora y es posible que se requieran ajustes adicionales.
  10. Guarde archivos para el procesamiento y análisis de datos posteriores.

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Representative Results

La región apical del incisivo del ratón adulto está encerrada dentro de la mandíbula (Figura 1) y, por lo tanto, no es directamente accesible para visualizar y rastrear en vivo las células progenitoras que residen dentro de la región de crecimiento. Por lo tanto, hemos desarrollado un método para extraer todo el incisivo de la mandíbula y mantenerlo en un sistema de cultivo de explantes para microscopía timelapse de dos fotones (Figura 2). Aquí describimos resultados representativos que capturan el proceso dinámico de proliferación y movimiento celular en la región del asa cervical labial del epitelio dental.

Para demostrar los procedimientos experimentales, hemos utilizado dos modelos de ratón diferentes que expresan fluorescencia verde en el epitelio dental. La primera línea de ratón es K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP, donde K14Cre (MGI:2680713) expresa la Cre recombinasa de un promotor de queratina 1435 y activa la expresión del transactivador controlado por tetraciclina inversa en el epitelio del alelo R26rtTA 36 (MGI:3584524). Tras la administración de doxiciclina, la rtTA induce la expresión de la histona H2B-GFP del alelo 37 de tetO-H2B-GFP (MGI:3043783) y marca los núcleos de las células epiteliales con fluorescencia verde. Esto es especialmente útil para el seguimiento celular y para detectar divisiones celulares. En este experimento, alimentamos a los animales con doxiciclina durante 24 h antes del sacrificio para activar la expresión de H2B-GFP. La segunda línea de ratón es K14Cre; R26mT/mG, en el que R26mT/mG (MGI:3803814) es un Cre-reportero38. En ausencia de actividad Cre, las células expresan tdTomato (mT) localizado en la membrana con fluorescencia roja. Tras la recombinación mediada por Cre, las células expresan GFP de membrana (mG). K14Cre; Por lo tanto, R26mT/mG marca las membranas de las células epiteliales con fluorescencia verde, dejando las células no epiteliales rojas. Esto permite una fácil visualización de las formas, divisiones y movimientos de las células.

Comenzamos el procedimiento diseccionando las mandíbulas (Figura 3A) y luego extirpamos sistemáticamente todos los huesos que rodean el incisivo (Figura 3B-G). Esto produjo incisivos enteros con epitelio intacto (Figura 3H). Confirmamos la integridad del epitelio dental mediante la inspección de la fluorescencia verde en el K14 Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP y K14Cre; Ratones R26mT/mG (Figura 4A, B, E, F). En esta etapa, los tejidos periodontales opacos todavía cubren el incisivo apical y, por lo tanto, el asa cervical aparece borrosa debido a la dispersión de la luz, lo que dificultaría de manera similar la obtención de imágenes de lapso de tiempo aguas abajo (Figura 4C, G). Por lo tanto, se extirparon cuidadosamente los tejidos periodontales, por lo que se pudo discernir el epitelio dental con el asa cervical en cada incisivo (Figura 4D, H).

Luego, los incisivos se incrustaron en agarosa de bajo punto de fusión y se cultivaron en una configuración de perfusión para obtener imágenes en vivo de dos fotones, como se muestra en la Figura 2. Para este ejercicio, nos hemos centrado en la región del bucle cervical del epitelio dental y hemos capturado imágenes de pila z a intervalos de 4 μm cada 5 minutos durante 14 h (Figura 5A). En particular, las señales de H2B-GFP se observaron principalmente en la región amplificadora de tránsito del asa cervical, donde hay divisiones celulares activas (Figura 5B). Es probable que esto se deba a que hay un mayor intercambio H2B-GFP en las cromatinas abiertas y la incorporación a los nucleosomas después de las replicaciones de ADN en estas células activas39.

Posteriormente, examinamos las imágenes de lapso de tiempo utilizando ImageJ y, en base a la separación de las señales H2B-GFP40, pudimos observar numerosas divisiones celulares a lo largo del período de imágenes (Video Suplementario S1 y Video Suplementario S2). Esto indicó que los tejidos se mantuvieron adecuadamente en el cultivo de explantes y que las células estaban activas. En concreto, pudimos observar la condensación y alineación de los cromosomas en la placa metafásica de las células mitóticas, seguida de su segregación en dos células hijas durante la anafase (Figura 5C-N, rastreada manualmente con el plugin TrackMate de ImageJ). La mayoría de estas divisiones fueron perpendiculares o en un ángulo oblicuo con respecto a la membrana basal (Figura 5C-K y Video Suplementario S1). También se pudieron detectar divisiones horizontales paralelas a la membrana basal, aunque con menos frecuencia (Figura 5L-N y Video Suplementario S2). Es importante señalar que la citocinesis en el epitelio dental a menudo ocurre rápidamente, dentro de los 5-10 minutos. Como resultado, los intervalos de lapso de tiempo de más de 5 minutos pueden pasar por alto algunas de estas divisiones.

Los eventos de división celular también fueron evidentes en K14Cre; Asas cervicales R26mT/mG, donde todas las membranas de las células epiteliales estaban marcadas en verde (Figura 6A). Pudimos identificar las células mitóticas por su redondeo celular y luego por citocinesis (Video Suplementario S3), y se observaron divisiones celulares tanto verticales como horizontales (Figura 6B-G), por lo que fueron similares a los resultados obtenidos con H2B-GFP. En conjunto, estos resultados demuestran que este protocolo puede servir como una poderosa herramienta para investigar los comportamientos celulares en los explantes de incisivos cuando se combina con modelos genéticos de ratón que etiquetan fluorescentemente distintas estructuras subcelulares.

Figure 1
Figura 1: Esquemas de la mandíbula del ratón y del asa cervical del incisivo. (A) Una parte significativa del incisivo está incrustada en la mandíbula. La región de crecimiento se encuentra en el extremo apical del diente y apoya su crecimiento continuo (flecha verde oscuro). (B) Un agrandamiento del incisivo apical, que está rodeado de tejidos periodontales. El diente está compuesto por esmalte y dentina, que son estructuras altamente mineralizadas formadas por ameloblastos y odontoblastos, respectivamente. (C) Una sección sagital del incisivo apical, que muestra que las células progenitoras epiteliales dentales y las células amplificadoras de tránsito residen en el asa cervical labial y dan lugar a ameloblastos en el epitelio más distal (flecha discontinua de color verde oscuro). En comparación con el asa cervical labial, la asa cervical lingual es de menor tamaño y normalmente no forma ameloblastos. Las células madre mesenquimales dentales están presentes en la pulpa dental (región púrpura) y dan lugar a los odontoblastos. Abreviaturas: En = esmalte; De = dentina; Am = ameloblasto; Od = odontoblasto; TAC = células amplificadoras de tránsito; laCL = asa cervical labial; liCL = asa cervical lingual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Mantenimiento del explante de incisivos de ratón para la obtención de imágenes en vivo. (A) Esquemas que representan los pasos clave del protocolo, desde la disección del incisivo hasta la inclusión del tejido en agarosa de bajo punto de fusión para obtener imágenes en vivo. Se utiliza una configuración de perfusión para proporcionar un suministro constante de nutrientes durante la obtención de imágenes y el cultivo se mantiene a 37 °C. (B-D) Una demostración paso a paso de la configuración de la placa de cultivo y la cámara de perfusión para la obtención de imágenes en vivo. La entrada y la salida de medios se muestran como flechas rosas y amarillas respectivamente. Abreviatura: ACBR = Anillo de Barrera de Control Atmosférico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Aislamiento de todo el incisivo del ratón. (A) Mandíbula intacta. (B-H) Los huesos se extrajeron gradualmente para exponer todo el incisivo. Las líneas discontinuas rojas en B y C muestran el tejido blando expuesto del incisivo apical después de raspar el hueso de la membrana que recubre los lados lingual y bucal de la cavidad del incisivo (pasos 3.3-3.5 en el protocolo). (D-G) Las puntas de flecha azules representan los cóndilos, los molares y los huesos alveolares que se han extirpado para aislar todo el diente (paso 3.6 del protocolo). Barra de escala = 2 mm (H). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Extracción de tejidos periodontales para la obtención de imágenes en vivo. (A-H) Muestras representativas de (A-D) K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP, y (E-H) K14Cre; Se utilizaron ratones R26mT/mGen nuestra demostración del protocolo. Antes de la disección, la expresión de GFP en el epitelio dental era visible a través del hueso (A, E, puntas de flecha amarillas). Líneas discontinuas blancas delinean los incisivos no disecados. E' muestra el lado lingual. En los incisivos aislados (B,C,F,G), la fluorescencia de GFP fue inicialmente difractada por los tejidos periodontales que cubren los incisivos apicales (puntas de flecha blancas y rojas). La fluorescencia roja en las células no epiteliales marcadas F y G. La extirpación de los tejidos periodontales permite una visión clara y sin obstrucciones de las asas cervicales fluorescentes verdes (D, H, puntas de flecha verdes). Barra de escala = 2 mm (A,E); 1,25 mm (B,F); y 300 μm (C,D,G,H). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Microscopía timelapse de la K14Cre; R26rtTA; tetO-H2asa cervical B-GFP. (A) Un esquema que ilustra la configuración de lapso de tiempo. (B) Un plano z representativo del K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP asa cervical labial incisiva, que muestra el marcaje nuclear por H2B-GFP principalmente en la región amplificadora del tránsito, donde las células se dividen activamente. El cuadro amarillo representa el área general de las imágenes ampliadas que se muestran a continuación. (C-K) Imágenes de lapso de tiempo que muestran divisiones celulares verticales y oblicuas en relación con el BM. (L-N) Las imágenes de lapso de tiempo muestran un ejemplo de división celular horizontal en relación con el BM. (D, G, J, M) Las células en metafase o anafase se muestran en los paneles centrales. Los esquemas de cada división rastreada se muestran a la derecha. Barra de escala en N = 36 μm (B); 5 μm (C-N). Abreviatura: BM = membrana basal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Microscopía timelapse de la K14Cre; R26mT/mG asa cervical. (A) Un plano z representativo del K14Cre; R26mT/mG asa cervical labial incisivo. Todas las células epiteliales expresan GFP de membrana. El cuadro amarillo representa el área de seguimiento celular que se muestra en las ampliaciones. (B-G) Las imágenes de lapso de tiempo capturan las divisiones celulares horizontales (B-D) y verticales (E-G), en relación con la BM. (C,F) Los paneles centrales muestran el redondeo de las células mitóticas. Los esquemas de cada división rastreada se muestran a la derecha. Barra de escala = 35 μm (A); 5 μm (B-G). Abreviatura: BM = membrana basal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria S1: Plato de perfusión de fabricación propia. (A) Se puede utilizar una placa de cultivo de 35 mm para hacer una placa de perfusión. Se puede usar un plato con fondo de vidrio si la obtención de imágenes se realiza con un microscopio invertido. (B) Calentar un clavo con una llama. (C) Se crean dos aberturas (puntas de flecha blancas) a cada lado del plato utilizando el clavo calentado. (D) Fije dos agujas de punta roma de 16 G, una como entrada de medios y la otra como salida de medios, a través de las aberturas con pegamento epoxi. Si se desea la perfusión de gases, se puede agregar una tercera abertura/aguja a la placa. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Video Suplementario S1: Imágenes en vivo de un K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP asa cervical labial incisiva, que muestra divisiones celulares verticales y oblicuas. Las celdas se rastrean manualmente y los puntos de diferentes colores representan diferentes pares de celdas madre/hija. Barra de escala = 30 μm (marco izquierdo); 7 μm (marco derecho). Haga clic aquí para descargar este video.

Video Suplementario S2: Imágenes en vivo de un K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP asa cervical labial incisiva, mostrando un ejemplo de división celular horizontal. La división horizontal tiene lugar en la marca de 10 s y se rastrea manualmente mediante puntos azules. Barra de escala = 30 μm (marco izquierdo); 7 μm (marco derecho). Haga clic aquí para descargar este video.

Video Suplementario S3: Imágenes en vivo de un K14Cre; R26mT/mG asa cervical labial incisiva, que muestra divisiones celulares verticales y horizontales. Las celdas se rastrean manualmente y los círculos de diferentes colores representan diferentes pares de celdas madre/hija. Barra de escala = 30 μm (marco izquierdo); 7 μm (marco derecho). Haga clic aquí para descargar este video.

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Discussion

La imagen de tejido vivo es una técnica importante que nos permite estudiar los procesos dinámicos y el comportamiento de las células cuando se mantienen en su entorno de nicho41. Idealmente, las imágenes en vivo se realizan in vivo con una alta resolución espacio-temporal. Sin embargo, la obtención de imágenes in vivo de órganos de mamíferos puede ser un reto debido a la inaccesibilidad de los tejidos, la opacidad óptica y la dificultad para inmovilizar al animal o al órgano durante un período prolongado42. Los explantes de tejidos evitan algunos de estos desafíos y se han adoptado con éxito en una serie de estudios para rastrear el comportamiento celular, como durante la morfogénesis dental y el desarrollo de los órganos ectodérmicos26. Aquí, demostramos un protocolo relativamente simple pero robusto para realizar imágenes de tejido profundo vivo en incisivos de ratones adultos enteros cultivados. La aplicación de esta técnica nos ayudará a comprender la regulación de los movimientos celulares, las decisiones de destino y la organización de los tejidos durante la regeneración dental.

Debido a que las divisiones celulares son eventos fácilmente observables y característicos de los tejidos en regeneración, nos hemos centrado en el seguimiento de las células en división en este estudio para resaltar un uso del protocolo. Encontramos que los progenitores epiteliales incisivos pueden sufrir divisiones tanto verticales como horizontales, por lo que son similares a otros tejidos epiteliales43. Dilucidar el mecanismo que regula los ángulos de división e investigar el papel de las orientaciones de división en las decisiones sobre el destino celular será importante en futuros estudios. La combinación de imágenes en vivo con diferentes modelos genéticos de ratón que también llevan marcadores fluorescentes del destino de las células, reporteros de la vía de señalización o el indicador del ciclo celular de Fucci44,45 ayudará a revelar cómo los patrones de división celular y la dinámica del ciclo celular contribuyen a la regulación de la homeostasis y la regeneración epitelial.

Una práctica necesaria en este protocolo es llevar a cabo la disección dental de manera expedita y cuidadosa, permitiendo una rápida transición y preservación del tejido intacto bajo las condiciones de cultivo adecuadas. Hemos encontrado que para la obtención de imágenes en vivo, la disección de tejidos en medios calientes, en lugar de medios fríos, como en experimentos destinados a extraer proteínas y ARNm46, mantiene las células en un estado funcional. Debido a que el incisivo es un órgano relativamente grande para el cultivo, un suministro constante de nutrientes a través de la perfusión de medios también es fundamental para el mantenimiento del tejido a lo largo de la obtención de imágenes47. Si las células progenitoras están presentes en la región de interés, la observación de divisiones celulares frecuentes es un buen indicador de que el tejido está sano y activo. Por el contrario, la muerte celular debería ser poco frecuente, y esto puede verificarse mediante la detección de cuerpos nucleares brillantes y condensados durante la obtención de imágenes si se utiliza un marcador nuclear o mediante la realización de la tinción TUNEL después de la obtención de imágenes y la fijación del tejido48. Además de los nutrientes, los niveles de oxígeno también pueden afectar la viabilidad del explante, ya que la tensión o la insuficiencia de oxígeno pueden alterar la supervivencia, proliferación y diferenciación celular 49,50,51. En nuestra experiencia, no hemos observado diferencias aparentes en la proliferación celular y la muerte celular cuando las muestras recibieron o sin oxígeno adicional (p. ej., 95% de carbógeno O2/5% CO2 o 5% CO2/21%O2/N2 equilibrado) durante la obtención de imágenes, lo que sugiere que una cantidad mínima de oxígeno en el sistema es suficiente para mantener los epitelios incisivos en cultivo durante la noche o que el tejido puede emplear vías alternativas para mantener las funciones celulares normales52. Sin embargo, las necesidades de oxígeno en otros procesos celulares o la expresión génica correcta deberían determinarse con más detalle en estudios futuros.

En nuestra demostración del protocolo, hemos utilizado H2B-GFP codificado genéticamente y GFP de membrana para etiquetar los núcleos y contornos celulares, respectivamente. Estos marcadores fluorescentes son brillantes y duraderos bajo microscopía de dos fotones y, por lo tanto, son ejemplos de etiquetas ideales para usar en el seguimiento de los movimientos y divisiones celulares. En teoría, los colorantes vitales fluorescentes también se pueden usar para marcar diferentes compartimentos subcelulares para imágenes en vivo ex vivo 53, pero la penetración reducida de los colorantes en las células epiteliales más profundas probablemente limita sus usos. Del mismo modo, mientras que la microscopía confocal estándar es capaz de obtener imágenes en vivo de alta resolución a una profundidad inferior a 100 μm, la microscopía de dos fotones proporciona una mayor profundidad de imagen con una reducción del fotoblanqueo y la fototoxicidad54. Por lo tanto, hemos elegido la microscopía de dos fotones como modalidad de imagen en la mayoría de nuestras aplicaciones de imágenes en vivo.

Una posible limitación de este protocolo es que los explantes de incisivos pueden no recapitular completamente el entorno y la biología in vivo. Por lo tanto, los datos representan el comportamiento de las células en condiciones de cultivo y deben interpretarse en consecuencia, así como validarse utilizando otros métodos, como la histología, cuando corresponda. También tuvimos que extirpar parcialmente los tejidos periodontales para acceder al asa cervical para la obtención de imágenes. De este modo, las interacciones de señalización entre los tejidos periodontales y el epitelio dental podrían verse interrumpidas. Por último, si bien la perfusión del medio mejora en gran medida la viabilidad de los tejidos cultivados, podría introducir un esfuerzo de cizallamiento del fluido que actúa como una señal mecánica ectópica y afecta los resultados55,56. No hemos determinado el impacto de los diferentes caudales en nuestra configuración. Sin embargo, debido a que un caudal bajo de 1-5 mL/h suele ser suficiente para mantener el suministro de nutrientes57, se puede minimizar el efecto del esfuerzo cortante. Teniendo en cuenta estas limitaciones, las imágenes en vivo ex vivo sirven como una poderosa plataforma para estudiar los cambios en el comportamiento celular cuando se incluyen los controles apropiados en los experimentos.

El incisivo de ratón en continuo crecimiento es un sistema modelo altamente manejable para estudiar la renovación de tejidos basada en células madre y la reparación de lesiones. El protocolo descrito en este documento proporciona a los investigadores los medios para mantener incisivos adultos enteros en cultivo y extraer información espacio-temporal sobre el comportamiento celular a través de la microscopía de lapso de tiempo. Esperamos que esta técnica sea ampliamente aplicable al estudio de diferentes modelos genéticos de ratón utilizados en la investigación dental y que ayude a avanzar en nuestro conocimiento en el campo de la regeneración dental.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos al Laboratorio de Microscopía Óptica/Espectroscopía Avanzada de la UCLA y al Centro de Excelencia de Leica Microsystems en el Instituto de Nanosistemas de California (RRID:SCR_022789) por proporcionar microscopía de dos fotones. AS fue apoyado por ISF 604-21 de la Fundación de Ciencias de Israel. JH contó con el apoyo de R03DE030205 y R01DE030471 de los NIH/NIDCR. AS y JH también recibieron el apoyo de 2021007 de subvenciones de la Fundación Binacional de Ciencias (BSF) de los Estados Unidos e Israel.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well, flat bottom tissue culture plate Olympus plastics 25-107
25x HC IRAPO motCORR water dipping objective Leica 11507704
Ascorbic acid (Vitamin C) Acros Organics 352685000
D-(+)-Glucose bioxtra  Sigma Aldrich G7528
Delta T system  Bioptechs 0420-4 Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup
Dissection microscope- LEICA S9E Leica LED300 SLI
DMEM/F12 Thermo Scientific 11039047 Basal media without phenol red
Feather surgical blade (#15) Feather 72044-15
Fine forceps F.S.T 11252-23
Glutamax  Thermo Scientific 35050-061 Glutamine substitute
Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective  Leica n/a
low-melting agarose NuSieve 50080
non-essential amino acids (100x) Thermo Scientific 11140-050
penicillin–streptomycin Thermo Scientific 15140122 10,000 U/mL 
Petri dish Gen Clone 32-107G 90 mm 
Rat serum Valley Biomedical AS3061SC Processed for live imaging
Razor blade #9 VWR 55411-050
Scalpel handle F.S.T 10003-12
Scissors F.S.T 37133
serrated forceps F.S.T 11000-13
spring scissors F.S.T 91500-09

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References

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Sundari Thooyamani, A., Shahin, E., Takano, S., Sharir, A., Hu, J. K. Using Ex Vivo Live Imaging to Investigate Cell Divisions and Movements During Mouse Dental Renewal. J. Vis. Exp. (200), e66020, doi:10.3791/66020 (2023).

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