Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Brug af ex vivo live imaging til at undersøge celledelinger og bevægelser under tandfornyelse hos mus

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/66020
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2, 1,3
1School of Dentistry, University of California Los Angeles, 2The Institute of Biomedical and Oral Research, Faculty of Dental Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 3Molecular Biology Institute, University of California Los Angeles
* These authors contributed equally

Summary

Ex vivo levende billeddannelse er en kraftfuld teknik til at studere de dynamiske processer i cellulære bevægelser og interaktioner i levende væv. Her præsenterer vi en protokol, der implementerer to-fotonmikroskopi for at live spore tandepitelceller i dyrkede hele voksne musefortænder.

Abstract

Den konstant voksende musefortænder fremstår som et meget håndterbart modelsystem til at undersøge reguleringen af voksne epitel- og mesenkymale stamceller og tandregenerering. Disse stamceller populationer deler sig aktivt, bevæger sig og differentierer for at opretholde vævshomeostase og regenerere tabte celler på en lydhør måde. Imidlertid kunne traditionelle analyser ved hjælp af faste vævssektioner ikke fange de dynamiske processer i cellulære bevægelser og interaktioner, hvilket begrænsede vores evne til at studere deres regulering. Dette papir beskriver en protokol til opretholdelse af hele musefortænder i et explantkultursystem og live-track dental epitelceller ved hjælp af multiphoton timelapse mikroskopi. Denne teknik føjer sig til vores eksisterende værktøjskasse til tandforskning og giver efterforskere mulighed for at erhverve rumlig tidsmæssig information om celleadfærd og organisationer i et levende væv. Vi forventer, at denne metode vil hjælpe forskere med yderligere at udforske mekanismer, der styrer de dynamiske cellulære processer, der finder sted under både tandfornyelse og regenerering.

Introduction

I løbet af de sidste to årtier har musens fortænder vist sig som en uvurderlig platform til at undersøge principperne for regulering af voksne stamceller og tandregenerering 1,2. Musens fortænder vokser kontinuerligt og fornyer sig gennem dyrets liv. Det gør den ved at opretholde både epitel- og mesenkymale stamceller, som kan forny sig selv og differentiere sig til forskellige celletyper i tanden 1,2. Mens dental epitelstamceller giver anledning til ameloblaster, som udskiller emaljematrixen, giver dental mesenkymale stamceller anledning til odontoblaster, cementoblaster og fibroblaster, som danner henholdsvisdentin, cementum og periodontalt ledbånd 3,4,5,6. Denne konstante forsyning af nye celler opretholder vævshomeostase og tillader udskiftning af gamle celler, der går tabt på grund af tyggeslitage eller skader 7,8. Belysning af de cellulære og molekylære mekanismer, der regulerer vedligeholdelse og differentiering af dentale stamceller, er derfor centralt for at forstå dental regenerering, et område af stigende interesse.

Anatomisk er en stor del af den voksne musefortænder indkapslet i kæbebenet. Mens tandens snitkant er udsat, passer den apikale ende af fortænderne inden for en sokkel og er fastgjort til den omgivende knogle gennem periodontale ledbånd og bindevæv (figur 1A, B). Fortændernes apikale ende er også tandens vækstområde og opretholder tandstammen og stamceller i både epitellaget og mesenkymalmassen 9,10,11,12,13. Specifikt opretholdes dental epitelstamceller i den pæreformede ende af epitelet, kendt som den apikale knopp, også kaldet labial cervikal loop (figur 1C). I lighed med tarmepitelet og epidermis understøttes epitelfornyelsen i fortænderne primært af aktivt cyklende stamceller og deres stærkt proliferative mellemliggende efterkommere, kaldet transitforstærkende celler 14,15,16,17, begge bosiddende i den indre del af livmoderhalssløjfen. Men om fortandepitelet indeholder og udnytter hvilende stamceller under regenerering, er det stadig ikke bestemt. I modsætning hertil er både aktive og hvilende dental mesenkymale stamceller blevet identificeret i den apikale pulp, og de hvilende stamceller fungerer som en reservepopulation, der aktiveres under skadereparation13,18.

Mange af opdagelserne om biologien af musefortændernes fornyelse og regenerering er resultatet af histologiske undersøgelser, hvor prøver opnås på forskellige tidsmæssige tidspunkter, fikseres, behandles og derefter sektioneres i mikrontynde skiver langs et bestemt plan. Gennem detaljeret analyse af histologiske sektioner fra forskellige musemodeller, der muliggør afstamningssporing eller genetiske forstyrrelser, har forskere identificeret cellelinjer fra forskellige stampopulationer samt de genetiske og signalveje, der styrer fortænderhomeostase og skadereparation 19,20,21. Imidlertid kan de statiske todimensionelle (2D) billeder af ikke-vitale celler i sektioner ikke fange det fulde spektrum af cellulær adfærd og rumlige organisationer i levende væv, såsom celleformændringer, bevægelser og cellulær kinetik. Detektering og måling af disse hurtige cellulære ændringer, som forekommer på en tidsskala, der ikke kan løses gennem vævssektionering, kræver en anden strategi. Desuden er erhvervelse af sådanne oplysninger også afgørende for at forstå, hvordan tandceller interagerer med hinanden, reagerer på forskellige signalstimuli og selvorganiserer for at opretholde vævsstrukturer og funktioner.

Fremkomsten af firedimensionel (4D) dyb vævsbilleddannelse ved hjælp af to-fotonmikroskopi22, en teknologi, der integrerer tre rumlige dimensioner med tidsmæssig opløsning, overvinder de iboende begrænsninger ved histologisk analyse ved at muliggøre rumlig tidsmæssig undersøgelse af dyrkede vævseksplanter, organoider eller endda væv in situ 23,24,25,26 . For eksempel har 4D live imaging af det udviklende tandepitel afsløret de rumlige tidsmønstre af celledelinger og migrationer, der koordinerer vævsvækst, signalcenterdannelse og dental epitelmorfogenese 27,28,29,30,31,32 . I den voksne musefortænder er 4D-billeddannelse for nylig blevet tilpasset til at studere cellulær adfærd under reparation af tandepitelskader. Live billeddannelse afslørede, at stratum intermediumceller i suprabasallaget kan omdannes direkte til ameloblaster i basallaget for at regenerere det beskadigede epitel, hvilket udfordrer det traditionelle paradigme for reparation af epitelskader15.

Her beskriver vi dissektion, dyrkning og billeddannelse af den voksne musefortænder med fokus på epitelceller i labial cervikal loop (figur 1). Denne teknik bevarer tandcellevitalitet i mere end 12 timer og tillader live sporing af fluorescerende mærkede celler ved enkeltcelleopløsning. Denne fremgangsmåde tillader undersøgelse af cellebevægelse og migration samt dynamiske ændringer i celleform og delingsorientering under normale dyrkningsforhold eller som reaktion på genetiske, fysiske og kemiske forstyrrelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle mus blev opretholdt i patogenfrie dyrefaciliteter ved University of California Los Angeles (UCLA) eller Hebrew University of Jerusalem (HUJI). Alle forsøg med mus blev udført i henhold til regler og protokoller godkendt af den respektive Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) eller (MD-23-17184-3; HUJI). En generel arbejdsgang for de eksperimentelle trin er vist i figur 2A. Se materialefortegnelsen for detaljer vedrørende alle instrumenter, reagenser og materialer, der anvendes i denne protokol.

1. Fremstilling af opløsninger og geler

  1. Dissektionsmedium: Tilbered frisk DMEM/F12 med 0,5 % glucose og hold den varm ved 37 °C, indtil den skal bruges i trin 2.4.
    BEMÆRK: Vi bruger DMEM / F12 uden phenolrød til at reducere autofluorescens under levende billeddannelse.
  2. 1x Kulturmedium: Tilbered frisk medium ved hjælp af 50% DMEM / F12, 50% rotteserum, 1x glutaminerstatning, 1x MEM ikke-essentielle aminosyrer, 1% glucose, 0,1 mg / ml L-ascorbinsyre og 0,5% penicillin-streptomycin. Hold den varm ved 37 °C, indtil den skal bruges i trin 5.5. Dette medium bruges til dyrkning af forændereksplanter under levende billeddannelse.
    BEMÆRK: Rotteserummet skal være af høj kvalitet og specielt forberedt til dyrkning af hele væv af forskere eller fra en kommerciel kilde. Især skal blodet centrifugeres (i 5 minutter ved 1.200 × g ved stuetemperatur), før koagulation begynder at dannes. Efter centrifugering presses den resulterende fibrinkoagulation og kasseres33.
  3. Kulturgel: Formålet med gelen er at immobilisere prøver under billeddannelse og tilberedes frisk.
    1. Lav 2% gel i DMEM / F12 ved at opløse 200 mg agarose med lavt smeltepunkt i 10 ml DMEM / F12 ved hjælp af en mikrobølgeovn. Opbevar 2% gelen ved 37 °C.
    2. Lav 2x dyrkningsmedium (uden DMEM / F12) ved at blande 50% rotteserum, 1x glutaminerstatning, 1x MEM ikke-essentielle aminosyrer, 1% glucose, 0,1 mg / ml L-ascorbinsyre og 0,5% penicillin-streptomycin. 2x dyrkningsmediet (uden DMEM/F12) opvarmes til 37 °C.
    3. Lav 1% kulturgel ved at blande lige store mængder 2% gel og 2x kulturmedium (uden DMEM / F12). Opbevar 1% kulturgelen ved 37 °C, indtil den skal bruges i trin 5.1.
      BEMÆRK: Sørg for, at alle opløsninger er varme før blanding for at undgå gelering. Vi fandt, at 1% gel var egnet til dyrkning af den voksne musefortand. Gelprocent bør bestemmes empirisk, hvis andre væv skal dyrkes.

2. Ekstraktion af de voksne musemandibler

  1. Aflive mus i den ønskede alder ved hjælp af standardprocedurer godkendt af IACUC.
    BEMÆRK: Her bruger vi CO2 -kvælning efterfulgt af cervikal dislokation. Regler for eutanasi af dyr kan variere i forskellige regioner. Forskere bør indhente den nødvendige institutionelle godkendelse, inden de udfører forsøg, og sikre overholdelse af lokale dyreplejebestemmelser.
  2. Desinficer musen med 70% ethanol.
  3. Halshug musen og udtræk venstre og højre mandibler.
    1. Læg musen på maven, og brug derefter et #9 industrielt barberblad med en kant til at skære i halsregionen og adskille musehovedet fra resten af kroppen.
      BEMÆRK: Hvis væv fra svælget eller halsregionen også skal opsamles, bør halshugning ikke udføres, og man kan gå direkte videre til trin 2.3.2.
    2. Vend musen, så dens ventrale side vender opad, og underkæberne er let tilgængelige.
    3. Fastgør dyrets hoved ved at holde det forsigtigt mellem tommelfingeren og pegefingeren.
    4. Brug barberbladet til at lave et midtsagittalt snit, der skærer over huden på underkæben fra underlæben mod halsudskæringen.
      BEMÆRK: Et #15 kirurgisk blad kan også bruges til at foretage snittet og efterfølgende dissektioner (trin 2.3.6-2.3.9).
    5. Når snittet er lavet, spred den afskårne hud ved hjælp af tommelfingeren og pegefingeren for at udsætte musklerne og kæbebenet nedenunder.
    6. Brug barberbladet til at adskille tyggemusklerne på bukkalsiden af underkæben, således at ydersiden af venstre og højre hemimandibles nu er fri for muskelvedhæftninger.
    7. Afbryd mylohyoidmusklerne langs indersiden af underkæben for at fjerne muskelvedhæftninger der.
    8. Lav et andet snit ved mandibulær symfyse, der forbinder de to hemimandibler. Når underkæben er skåret, adskilles den i venstre og højre halvdel.
    9. Kil barberbladet mellem mandibularkondylen og det temporale mandibulære led og disseker forsigtigt hemimandiblen fra resten af hovedet.
      BEMÆRK: Vi fandt det nyttigt at trække forsigtigt i fortænderne, mens vi klippede. Der skal udvises forsigtighed for at undgå at bryde underkæben og beskadige blødt væv indeni.
  4. Overfør straks dissekerede mandibler til en petriskål med det forvarmede dissektionsmedie (trin 1.1) og fjern det resterende muskelvæv ved hjælp af et # 15 kirurgisk blad.
    BEMÆRK: Opbevaring af prøver i kolde medier bremser celleaktiviteter, hvilket resulterer i forsinket eller endda mislykket gendannelse af visse celleaktiviteter, såsom proliferation eller cellebevægelse, under levende billeddannelse.

3. Isolering af hele museforænderne

BEMÆRK: Yderligere isolering af snittet sker under et lyst felt dissektionsmikroskop.

  1. Identificer visuelt det ovale område af underkæben, der dækker snitstikket og huser den apikale del af snitet.
  2. Placer underkæben, så den indre (sproglige) overflade vender opad.
  3. Mens du holder underkæben på plads med et par takkede tang, skal du generere et vindue i det ovale område ved at barbere den overliggende membranknogle ved hjælp af et # 15 kirurgisk blad i en retning, der er fra kondylen mod kindtænderne. Dette udsætter blødt væv i den apikale snit på den indre overflade.
  4. Vend underkæben, så den ydre (bukkale) overflade vender opad.
  5. Generer et vindue i det ovale område på den ydre underkæbe som beskrevet i trin 3.3, og brug spidsen af skalpellen til at fjerne eventuelle resterende knoglefragmenter i kanten. Sørg for, at den apikale ende af tanden er synlig fra begge sider.
    BEMÆRK: Undgå for stort tryk, mens du barberer knoglerne for at forhindre skade på det underliggende bløde væv.
  6. Skær systematisk knoglerne omkring forænden væk for at isolere hele tanden.
    1. Lav et rent snit på et plan, der ligger umiddelbart ved siden af den apikale snit for først at fjerne kondylarprocessen.
      BEMÆRK: Pas på ikke at skære i fortænderne.
    2. Lav et andet snit lige bagved den 3. molar, men dorsal til snittet uden at beskadige tanden. Dette fjerner knoglen, der inkluderer coronoidprocessen.
    3. Serielt skåret fra spidsen af vinkelprocessen mod forænderen for gradvist at fjerne den ventrale underkæbe på en trinvis måde.
      BEMÆRK: Tandepitelet og tilhørende parodontale væv sidder ofte fast i knoglen og let rives af, hvis en stor del af den ventrale knogle skæres på én gang. For at adskille knoglen fra det forænder bløde væv kan man indsætte skalpellen (eller et par skarpe ikke-takkede tang) mellem de to væv i den apikale ende af forænden og forsigtigt glide instrumentet fremad.
    4. Skær den alveolære knogle væk med molarer og eventuelle resterende knogler, der stadig er fastgjort til snitet.
    5. Hele forænden er nu isoleret. Overfør den fuldt dissekerede fortænder til et fad med rene, varme dissektionsmedier (trin 1.1).
  7. Gentag trin 3.2-3.6 for at isolere yderligere fortænder efter behov.
    BEMÆRK: Musens maksillære/øvre fortænder opretholder også voksne stamceller og kan bruges til at studere tandregenerering34. Dentalforskere fokuserer typisk på de nedre fortænder, fordi de er mere tilgængelige og lettere kan dissekeres end de øvre fortænder. Forskelle mellem mandibulære og maksillære forænderfortænder celler mangler stadig at blive bestemt.

4. Fjernelse af periodontale væv for at udsætte den forændende epitelial cervikale sløjfe

  1. Med hele forænden liggende på sin sproglige side, og mens du holder tanden på plads med et par takkede tang, skal du bruge et par # 5 fine tang til at begynde at stikke på det periodontale væv, der dækker den apikale fortænder og livmoderhalssløjfeområdet.
  2. Skræl forsigtigt periodontalt væv fra den apikale knopp, således at den laterale side af livmoderhalssløjfen (eller andre områder af interesse) bliver synlig under omfanget.
    BEMÆRK: Der skal udvises forsigtighed for at undgå at beskadige tandepitelet eller løsne det fra mesenchymet. Hvis forænden har fluorescenssignaler i interesseområdet, og et fluorescerende dissektionsmikroskop er tilgængeligt, kan fluorescenssignaler bruges til at hjælpe med at skelne mellem vævstyper og hjælpedissektioner. Det er vigtigt effektivt at udføre afsnit 2-4, så prøver hurtigt kan overføres til kulturmediet og vedligeholdes tilstrækkeligt gennem eksplantagedyrkning (se nedenfor).

5. Indlejring af væv til eksplantatkultur

  1. Tilsæt 500 μL varm, ustørknet kulturgel til en brønd i en 24-brøndplade og overfør hurtigt de dissekerede hele fortænder til brønden. Hvirvl pladen et par gange for at skylle fortænderne.
  2. Tilsæt 400 μL varm, ustørknet kulturgel til en kulturskål og overfør de skyllede fortænder til fadet.
    BEMÆRK: Vi bruger en kommercielt tilgængelig kulturskål, der er kompatibel med perfusionsopsætningen. Se trin 6.4 for alternative indstillinger.
  3. Orienter forænden for at placere cervikal loop-regionen (eller andre områder af interesse) i midten af skålen (figur 2A, B) og juster hældningen af den apikale fortænder til det ønskede billedplan.
    BEMÆRK: Vævsorientering skal udføres hurtigt før fuldstændig gelering.
  4. Når gelen er sat, skal du bruge et par fine tang til at fjerne enhver gel oven på interesseområdet, så den ikke er dækket af gel.
  5. Tilsæt en tilstrækkelig mængde varme kulturmedier ved langsomt at pipettere det mod kanten af skålen for kun at dække prøven (~ 150 μL).
  6. Eksplantatkulturen flyttes til en cellekulturkuvøse på 37 °C for at tillade vævsbundfældning og justering til dyrkningstilstanden i 1 time.

6. Timelapse mikroskopi af fortænder eksplantater

BEMÆRK: I dette eksperiment brugte vi et opretstående mikroskop udstyret med et 25x vanddyppemål, der har en numerisk blænde på 1. Generelt er en vanddyppelinse med en høj numerisk blænde bedst egnet til dyb vævsbilleddannelse.

  1. Tænd mikroskopet og to-fotonlaseren.
  2. Fastgør kulturskålen til sceneadapteren, og monter perfusionsadapterringen ovenpå (figur 2C).
  3. Tilslut sceneadapteren til en temperaturregulator, der er indstillet til at opretholde kulturen ved 37 °C.
  4. Tilslut adapterringens indløb og udløb til en mikroperfusionspumpe, og start perfusion af kulturmediet med perfusionshastigheden indstillet til 20 på pumpen. Dette genererer en langsom strømning (~ 5 ml / h) af kulturmediet over toppen af prøverne (figur 2C).
    BEMÆRK: Se materialetabellen for detaljer om systemet til at opretholde vævet i et stabilt kontrolleret miljø. Andre systemer kan også bruges. Der kan også anvendes en kombination af en 37 °C varmeplade og en hjemmelavet perfusionskulturskål (supplerende figur S1) med et indløb og en udgang forbundet til sprøjtepumper.
  5. Placer en atmosfærisk kontrolbarrierering (ACBR) oven på adapterringen, og sænk målet gennem ACBR for blot at komme i kontakt med dyrkningsmediet (figur 2D).
  6. Indstil laserbølgelængden til 920 nm for at visualisere både GFP og røde fluorescenssignaler (f.eks. tdTomato).
  7. Find prøver gennem okularer og derefter på mikroskopets software.
  8. Opsæt Z-stakke, billedbehandling med flere positioner og tidsintervaller ved hjælp af softwaren. For at følge denne protokol skal du bruge en z-trinstørrelse på 4 μm og et tidsinterval på 5 minutter i 14 timer.
    BEMÆRK: Vi fandt ud af, at et tidsinterval på mere end 5 minutter ofte er utilstrækkeligt til at fange glatte cellebevægelser og delinger.
  9. Start timelapse-billeddannelsen.
    BEMÆRK: Prøvepositionen kan skifte i løbet af den første time, og yderligere justeringer kan være påkrævet.
  10. Gem filer til downstream-databehandling og analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den apikale region af den voksne musefortænder er indkapslet i underkæben (figur 1) og dermed ikke direkte tilgængelig til visualisering og live-sporing af stamcellerne, der er bosiddende i vækstområdet. Derfor har vi udviklet en metode til at trække hele fortænderne ud af kæbeknoglen og vedligeholde den i et eksplantatkultursystem til to-foton timelapse-mikroskopi (figur 2). Her beskriver vi repræsentative resultater, der fanger den dynamiske proces med celleproliferation og bevægelse i labial cervikal loop-regionen i tandepitelet.

For at demonstrere de eksperimentelle procedurer har vi brugt to forskellige musemodeller, der udtrykker grøn fluorescens i tandepitelet. Den første muselinje er K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP, hvor K14Cre (MGI:2680713) udtrykker Cre-rekombinasen fra en Keratin 14-promotor35 og aktiverer ekspressionen af den omvendte tetracyklinkontrollerede transaktivator i epitelet fra R26rtTA-allel 36 (MGI:3584524). Efter administration af doxycyclin inducerer rtTA histon H2B-GFP-ekspression fra tetO-H2B-GFP-allel 37 (MGI: 3043783) og mærker epitelcellekerner med grøn fluorescens. Dette er især nyttigt til cellesporing og til registrering af celledelinger. I dette eksperiment fodrede vi dyr med doxycyclinmad i 24 timer før ofring for at aktivere H2B-GFP-ekspression. Den anden muselinje er K14Cre; R26mT/mG, hvor R26mT/mG (MGI:3803814) er en Cre-reporter38. I fravær af Cre-aktivitet udtrykker celler membranlokaliseret tdTomat (mT) med rød fluorescens. Ved Cre-medieret rekombination udtrykker celler membran GFP (mG). K14Cre; R26mT/mG mærker således epitelcellemembraner med grøn fluorescens, hvilket efterlader ikke-epitelceller røde. Dette muliggør nem visualisering af celleformer, divisioner og bevægelser.

Vi begyndte proceduren med at dissekere underkæberne (figur 3A) og fjernede derefter systematisk alle knoglerne omkring fortænderne (figur 3B-G). Dette gav hele fortænder med ubeskadiget epitel (figur 3H). Vi bekræftede intaktheden af tandepitelet ved at inspicere den grønne fluorescens i K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP og K14Cre; R26mT/mG-mus (figur 4A, B, E, F). På dette stadium dækker det uigennemsigtige parodontale væv stadig den apikale fortand, og livmoderhalssløjfen ser således sløret ud på grund af lysspredning, hvilket ligeledes ville hindre nedstrøms timelapse-billeddannelse (figur 4C, G). Vi fjernede derfor omhyggeligt parodontalt væv, så tandepitelet med livmoderhalssløjfen kunne skelnes i hver fortænder (figur 4D, H).

Fortænderne blev derefter indlejret i agarose med lavt smeltepunkt og dyrket i en perfusionsopsætning til to-foton levende billeddannelse som afbildet i figur 2. Til denne øvelse har vi fokuseret på livmoderhalssløjfeområdet i tandepitelet og taget z-stack-billeder med 4 μm intervaller hvert 5. minut over en varighed på 14 timer (figur 5A). Især blev H2B-GFP-signaler for det meste observeret i det transitforstærkende område af cervikalsløjfen, hvor der er aktive celledelinger (figur 5B). Dette skyldes sandsynligvis, at der er højere H2B-GFP-udveksling ved åbne kromatiner og inkorporering i nukleosomer efter DNA-replikationer i disse aktive celler39.

Vi undersøgte efterfølgende timelapse-billederne ved hjælp af ImageJ, og baseret på adskillelsen af H2B-GFP-signalerne40 var vi i stand til at observere adskillige celledelinger gennem billeddannelsesperioden (supplerende video S1 og supplerende video S2). Dette indikerede, at vævene var tilstrækkeligt vedligeholdt i eksplantatkulturen, og cellerne var aktive. Specifikt var vi i stand til at observere kondensering og justering af kromosomer ved metafasepladen i mitotiske celler efterfulgt af deres adskillelse i to datterceller under anafase (figur 5C-N, manuelt sporet ved hjælp af ImageJ-pluginet TrackMate). De fleste af disse opdelinger var vinkelret eller skråt i forhold til kældermembranen (figur 5C-K og supplerende video S1). Vandrette opdelinger parallelt med kældermembranen kunne også detekteres, selvom de forekommer mindre hyppigt (figur 5L-N og supplerende video S2). Det er vigtigt at påpege, at cytokinese i tandepitelet ofte sker hurtigt inden for 5-10 min. Som følge heraf kan timelapse-intervaller på mere end 5 minutter gå glip af nogle af disse divisioner.

Celledelingshændelser var også tydelige i K14Cre; R26mT/mG cervikale sløjfer, hvor alle epitelcellemembraner var mærket grønne (figur 6A). Vi kunne identificere mitotiske celler ved deres celleafrunding og derefter cytokinese (supplerende video S3), og både lodrette og vandrette celledelinger kunne observeres (figur 6B-G), hvilket svarer til resultaterne opnået ved anvendelse af H2B-GFP. Sammen viser disse resultater, at denne protokol kan tjene som et kraftfuldt værktøj til at undersøge celleadfærd i fortænderne, når de kombineres med musegenetiske modeller, der fluorescerende mærker forskellige subcellulære strukturer.

Figure 1
Figur 1: Skemaer over musekæben og fortændernes cervikale sløjfe. (A) En betydelig del af fortænderne er indlejret i kæbebenet. Vækstområdet er placeret i den apikale ende af tanden og understøtter dens kontinuerlige vækst (mørkegrøn pil). (B) En udvidelse af den apikale fortand, som er omgivet af periodontale væv. Tanden består af emalje og dentin, som er stærkt mineraliserede strukturer dannet af henholdsvis ameloblaster og odontoblaster. (C) Et sagittalt afsnit af den apikale fortand, der viser, at dental epitelstamceller og transitforstærkende celler befinder sig i labial cervikal loop og giver anledning til ameloblaster i det mere distale epitel (mørkegrøn stiplede pil). Sammenlignet med den labielle cervikale sløjfe er den linguale cervikale sløjfe mindre i størrelse og danner normalt ikke ameloblaster. Dental mesenkymale stamceller er til stede i tandmasse (lilla region) og giver anledning til odontoblaster. Forkortelser: En = emalje; De = dentin; Am = ameloblast; Od = odontoblast; TAC'er = transitforstærkende celler laCL = labial cervikal sløjfe; liCL = lingual cervikal loop. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Vedligeholdelse af musefortænder eksplant til levende billeddannelse. (A) Skemaer, der viser de vigtigste trin i protokollen, fra dissekering af fortænderne til indlejring af vævet i agarose med lavt smeltepunkt til levende billeddannelse. En perfusionsopsætning bruges til at tilvejebringe en konstant tilførsel af næringsstoffer under billeddannelsen, og kulturen holdes ved 37 °C. (B-D) En trinvis demonstration af indstilling af kulturskålen og perfusionskammeret til levende billeddannelse. Medieindgangen og -udløbet vises som henholdsvis lyserøde og gule pile. Forkortelse: ACBR = Atmosfærisk kontrolbarrierering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Isolering af hele musens fortand. (A) Intakt kæbe. (B-H) Knogler blev gradvist fjernet for at udsætte hele forænden. Røde stiplede linjer i B og C viser det blottede bløde væv i den apikale fortænder efter barbering af membranknoglen, der ligger over de linguale og bukkale sider af fortænderstikket (trin 3.3-3.5 i protokollen). (D-G) Blå pilespidser repræsenterer kondyler, kindtænder og alveolære knogler, der er fjernet for at isolere hele tanden (trin 3.6 i protokollen). Skalabjælke = 2 mm (H). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Fjernelse af parodontalt væv til levende billeddannelse. (A-H) Repræsentative prøver fra (A-D) K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP og (E-H) K14Cre; R26mT/mG-musblev brugt i vores demonstration af protokollen. Før dissektion var GFP-ekspression i tandepitelet synlig gennem knoglen (A, E, gule pilespidser). Hvide stiplede linjer skitserer de ikke-dissekerede fortænder. E' viser den sproglige side. I isolerede fortænder (B, C, F, G) blev GFP-fluorescens oprindeligt diffrakteret af det parodontale væv, der dækker de apikale fortænder (hvide og røde pilespidser). Rød fluorescens i F og G mærker ikke-epitelceller. Fjernelse af parodontale væv giver et klart og uhindret udsyn til de grønne fluorescerende livmoderhalssløjfer (D, H, grønne pilespidser). Skalabjælke = 2 mm (A,E); 1,25 mm (B, F); og 300 μm (C, D, G, H). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Timelapsemikroskopi af K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP cervikal sløjfe. (A) Et skema, der illustrerer timelapse-opsætningen. B) et repræsentativt z-plan for K14Cre R26rtTA; tetO-H2B-GFP fortænder labial cervikal loop, der viser nuklear mærkning af H2B-GFP primært i transitforstærkende region, hvor celler aktivt deler sig. Den gule boks repræsenterer det generelle område af de forstørrede billeder, der er vist nedenfor. (C-K) Timelapse-billeder, der viser lodrette og skrå celledelinger i forhold til BM. (L-N) Timelapse-billeder viser et eksempel på vandret celledeling i forhold til BM. (D, G, J, M) Celler i metafase eller anafase vises i de midterste paneler. Skemaer for hver sporet division vises til højre. Skalabjælke i N = 36 μm (B); 5 μm (C-N). Forkortelse: BM = kældermembran. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Timelapsemikroskopi af K14Cre; R26mT/mG cervikal sløjfe. A) Et repræsentativt z-plan for K14Cre; R26mT/mG fortænder labial cervikal sløjfe. Alle epitelceller udtrykker membran GFP. Den gule boks repræsenterer det område med cellesporing, der vises i forstørrelserne. (B-G) Timelapse-billeder, der optager både (B-D) vandrette og (E-G) lodrette celledelinger i forhold til BM. (C, F) Midterste paneler viser mitotisk celleafrunding. Skemaer for hver sporet division vises til højre. Skalabjælke = 35 μm (A); 5 μm (B-G). Forkortelse: BM = kældermembran. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur S1: Internt fremstillet perfusionsskål. (A) En 35 mm kulturskål kan bruges til at fremstille en perfusionsskål. En glasbundskål kan bruges, hvis billeddannelse udføres ved hjælp af et omvendt mikroskop. (B) Opvarm et søm med en flamme. (C) To åbninger (hvide pilespidser) oprettes på hver side af skålen ved hjælp af det opvarmede søm. D) Der anbringes to stump 16 G-kanyler, den ene som medieindgang og den anden som medieudgang, gennem åbningerne med epoxylim. Hvis der ønskes gasperfusion, kan der tilsættes en tredje åbning/nål til fadet. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende video S1: Live billeddannelse af en K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP fortænder labial cervikal sløjfe, der viser lodrette og skrå celledelinger. Celler spores manuelt, og forskellige farvede prikker repræsenterer forskellige par mor / datterceller. Skalabjælke = 30 μm (venstre ramme); 7 μm (højre ramme). Klik her for at downloade denne video.

Supplerende video S2: Live billedbehandling af en K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP fortænder labial cervikal sløjfe, der viser et eksempel på vandret celledeling. Den vandrette opdeling finder sted ved 10 s-mærket og spores manuelt ved hjælp af blå prikker. Skalabjælke = 30 μm (venstre ramme); 7 μm (højre ramme). Klik her for at downloade denne video.

Supplerende video S3: Live billeddannelse af en K14Cre; R26mT/mG fortænder labial cervikal sløjfe, der viser både lodrette og vandrette celledelinger. Celler spores manuelt, og forskellige farvede cirkler repræsenterer forskellige par mor / datterceller. Skalabjælke = 30 μm (venstre ramme); 7 μm (højre ramme). Klik her for at downloade denne video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Levende vævsbilleddannelse er en vigtig teknik, der giver os mulighed for at studere cellernes dynamiske processer og adfærd, når de opretholdes i deres nichemiljø41. Ideelt set udføres live imaging in vivo med høj rumlig tidsmæssig opløsning. Imidlertid kan in vivo-billeddannelse for pattedyrorganer være udfordrende på grund af vævets utilgængelighed, optisk uigennemsigtighed og vanskeligheder med at immobilisere dyret eller organet i en længere periode42. Vævseksplanter omgår nogle af disse udfordringer og er med succes blevet vedtaget i en række undersøgelser for at spore celleadfærd, såsom under tandmorfogenese og udvikling af ektodermale organer26. Her demonstrerede vi en relativt enkel, men robust protokol til at udføre levende dybvævsbilleddannelse på dyrkede hele voksne musefortænder. Anvendelse af denne teknik vil hjælpe os med at forstå reguleringen af cellebevægelser, skæbnebeslutninger og vævsorganisationer under tandregenerering.

Fordi celledelinger er let observerbare begivenheder og karakteristiske for regenererende væv, har vi fokuseret på at spore delende celler i denne undersøgelse for at fremhæve en brug af protokollen. Vi konstaterede, at fortænderepitelstamfædre kan gennemgå både vertikale og vandrette opdelinger og således ligne andre epitelvæv43. At belyse den mekanisme, der regulerer delingsvinkler og undersøge divisionsorienteringers rolle i beslutninger om celleskæbne, vil være af betydning i fremtidige studier. Kombination af levende billeddannelse med forskellige musegenetiske modeller, der også bærer fluorescerende celleskæbnemarkører, signalvejsreportere eller Fucci-cellecyklusreporter44,45 hjælper med at afsløre, hvordan celledelingsmønstre og cellecyklusdynamik bidrager til reguleringen af epitelhomeostase og regenerering.

En nødvendig praksis i denne protokol er at udføre tanddissektion på en hurtig og omhyggelig måde, hvilket muliggør hurtig overgang til og bevarelse af det intakte væv under passende dyrkningstilstand. Vi har fundet ud af, at dissekering af væv i varme medier snarere end kolde medier, som i eksperimenter, der sigter mod at ekstrahere proteiner og mRNA'er46, opretholder celler i en fungerende tilstand. Fordi fortænderne er et relativt stort organ til dyrkning, er en stabil forsyning af næringsstoffer via medieperfusion også kritisk for opretholdelsen af vævet gennem billeddannelse47. Hvis stamcellerne er til stede i interesseområdet, er observation af hyppige celledelinger en god indikator for, at vævet er sundt og aktivt. I modsætning hertil bør celledød være sjælden, og dette kan verificeres ved at detektere lyse og kondenserede nukleare legemer under billeddannelse, hvis der anvendes en nuklear markør eller ved at udføre TUNEL-farvning efter billeddannelse og vævsfiksering48. Ud over næringsstoffer kan iltniveauer også påvirke eksplanteringslevedygtigheden, da enten iltspænding eller insufficiens kan forstyrre celleoverlevelse, proliferation og differentiering 49,50,51. Efter vores erfaring har vi ikke observeret tilsyneladende forskelle i celleproliferation og celledød, når prøver blev forsynet med eller uden yderligere ilt (f.eks. 95% O2/5% CO2 carbogen eller 5% CO2/21% O2 / afbalanceret N2) under billeddannelse, hvilket tyder på, at enten spormængde ilt i systemet er tilstrækkelig til at opretholde fortandepitel i kultur natten over, eller vævet kan anvende alternative veje til at opretholde normale cellefunktioner52. Behovet for ilt i andre cellulære processer eller korrekt genekspression bør imidlertid fastlægges yderligere i fremtidige undersøgelser.

I vores demonstration af protokollen har vi brugt genetisk kodet H2B-GFP og membran GFP til at mærke henholdsvis cellekerner og konturer. Disse fluorescerende markører er lyse og langvarige under to-fotonmikroskopi og er således eksempler på ideelle etiketter til brug for sporing af cellebevægelser og delinger. I teorien kan fluorescerende vitale farvestoffer også bruges til at mærke forskellige subcellulære rum til ex vivo levende billeddannelse53, men reduceret penetration af farvestofferne i dybere epitelceller begrænser sandsynligvis deres anvendelser. Tilsvarende, mens standard konfokal mikroskopi er i stand til levende billeddannelse i høj opløsning i en dybde under 100 μm, giver to-fotonmikroskopi øget billeddybde med reduceret fotoblegning og fototoksicitet54. Vi har derfor valgt to-fotonmikroskopi som billeddannelsesmodalitet i de fleste af vores live imaging applikationer.

En potentiel begrænsning ved denne protokol er, at fortænder eksplanter muligvis ikke fuldt ud rekapitulerer in vivo-miljøet og biologien. Data repræsenterer derfor celleadfærd under kulturbetingelsen og bør fortolkes i overensstemmelse hermed såvel som valideres ved hjælp af andre metoder, såsom histologi, når det er relevant. Vi var også nødt til delvist at fjerne periodontale væv for at få adgang til livmoderhalssløjfen til billeddannelse. Signalinteraktioner mellem periodontale væv og tandepitelet kan således forstyrres. Endelig, mens medieperfusion i høj grad forbedrer levedygtigheden af dyrkede væv, kan det introducere væskeforskydningsspænding, der fungerer som et ektopisk mekanisk signal og påvirker resultaterne55,56. Vi har ikke bestemt virkningen af forskellige strømningshastigheder i vores opsætning. Men fordi en lav strømningshastighed på 1-5 ml / h typisk er tilstrækkelig til at opretholde næringsstofforsyninger57, kan effekten af forskydningsspænding minimeres. Med disse begrænsninger i tankerne fungerer ex vivo live imaging som en kraftfuld platform til at studere ændringer i celleadfærd, når de relevante kontroller er inkluderet i eksperimenter.

Den kontinuerligt voksende musefortænder er et meget håndterbart modelsystem til at studere stamcellebaseret vævsfornyelse og skadereparation. Protokollen beskrevet heri giver efterforskere midlerne til at opretholde hele voksne fortænder i kultur og udtrække rumlig tidsmæssig information om celleadfærd gennem timelapse-mikroskopi. Vi forventer, at denne teknik vil være bredt anvendelig til at studere forskellige musegenetiske modeller, der anvendes i tandforskning, og til at hjælpe med at fremme vores viden inden for tandregenerering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Vi anerkender UCLA Advanced Light Microscopy/Spectroscopy Laboratory og Leica Microsystems Center of Excellence ved California NanoSystems Institute (RRID:SCR_022789) for at levere to-fotonmikroskopi. AS blev støttet af ISF 604-21 fra Israel Science Foundation. JH blev støttet af R03DE030205 og R01DE030471 fra NIH / NIDCR. AS og JH blev også støttet af tilskud 2021007 fra USA-Israel Binational Science Foundation (BSF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well, flat bottom tissue culture plate Olympus plastics 25-107
25x HC IRAPO motCORR water dipping objective Leica 11507704
Ascorbic acid (Vitamin C) Acros Organics 352685000
D-(+)-Glucose bioxtra  Sigma Aldrich G7528
Delta T system  Bioptechs 0420-4 Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup
Dissection microscope- LEICA S9E Leica LED300 SLI
DMEM/F12 Thermo Scientific 11039047 Basal media without phenol red
Feather surgical blade (#15) Feather 72044-15
Fine forceps F.S.T 11252-23
Glutamax  Thermo Scientific 35050-061 Glutamine substitute
Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective  Leica n/a
low-melting agarose NuSieve 50080
non-essential amino acids (100x) Thermo Scientific 11140-050
penicillin–streptomycin Thermo Scientific 15140122 10,000 U/mL 
Petri dish Gen Clone 32-107G 90 mm 
Rat serum Valley Biomedical AS3061SC Processed for live imaging
Razor blade #9 VWR 55411-050
Scalpel handle F.S.T 10003-12
Scissors F.S.T 37133
serrated forceps F.S.T 11000-13
spring scissors F.S.T 91500-09

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
  2. Jing, J., et al. Rodent incisor as a model to study mesenchymal stem cells in tissue homeostasis and repair. Frontiers in Dental Medicine. 3, 1068494 (2022).
  3. Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and Fgf signaling. Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
  4. Warshawsky, H., Smith, C. E. Morphological classification of rat incisor ameloblasts. The Anatomical Record. 179 (4), 423-445 (1974).
  5. Lekic, P., McCulloch, C. A. Periodontal ligament cell population: the central role of fibroblasts in creating a unique tissue. The Anatomical Record. 245 (2), 327-341 (1996).
  6. Takahashi, A., et al. Autocrine regulation of mesenchymal progenitor cell fates orchestrates tooth eruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (2), 575-580 (2019).
  7. Ness, A. R. Eruption rates of impeded and unimpeded mandibular incisors of the adult laboratory mouse. Archives of Oral Biology. 10 (3), 439-451 (1965).
  8. Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
  9. Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), Cambridge, England. 3753-3761 (2010).
  10. Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
  11. Biehs, B., et al. BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nature Cell Biology. 15, 846-852 (2013).
  12. Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
  13. Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
  14. Li, L., Clevers, H. Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals. Science. 327 (5965), 542-545 (2010).
  15. Sharir, A., et al. A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage. Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).
  16. Hu, J. K. -H., et al. An FAK-YAP-mTOR signaling axis regulates stem cell-based tissue renewal in mice. Cell Stem Cell. 21 (1), 91-106 (2017).
  17. Yu, F., Li, F., Zheng, L., Ye, L. Epigenetic controls of Sonic hedgehog guarantee fidelity of epithelial adult stem cells trajectory in regeneration. Science Advances. 8 (29), (2022).
  18. An, Z., et al. A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors. Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).
  19. Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
  20. Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development. 147 (2), (2020).
  21. Krivanek, J., Buchtova, M., Fried, K., Adameyko, I. Plasticity of dental cell types in development, regeneration, and evolution. Journal of Dental Research. 102 (6), 589-598 (2023).
  22. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  23. Cetera, M., Leybova, L., Joyce, B., Devenport, D. Counter-rotational cell flows drive morphological and cell fate asymmetries in mammalian hair follicles. Nature Cell Biology. 20 (5), 541-552 (2018).
  24. Held, M., Santeramo, I., Wilm, B., Murray, P., Lévy, R. Ex vivo live cell tracking in kidney organoids using light sheet fluorescence microscopy. PLoS ONE. 13 (7), 0199918 (2018).
  25. Mesa, K. R., et al. Homeostatic epidermal stem cell self-renewal is driven by local differentiation. Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).
  26. Mogollón, I., Ahtiainen, L. Live tissue imaging sheds light on cell level events during ectodermal organ development. Frontiers in Physiology. 11, 818 (2020).
  27. Prochazka, J., et al. Migration of founder epithelial cells drives proper molar tooth positioning and morphogenesis. Developmental Cell. 35 (6), 713-724 (2015).
  28. Morita, R., et al. Coordination of cellular dynamics contributes to tooth epithelium deformations. PLOS ONE. 11 (9), 0161336 (2016).
  29. Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
  30. Panousopoulou, E., Green, J. B. A. Invagination of ectodermal placodes is driven by cell intercalation-mediated contraction of the suprabasal tissue canopy. PLoS biology. 14 (3), 1002405 (2016).
  31. Mogollón, I., Moustakas-Verho, J. E., Niittykoski, M., Ahtiainen, L. The initiation knot is a signaling center required for molar tooth development. Development. 148 (9), (2021).
  32. Kim, R., et al. Early perturbation of Wnt signaling reveals patterning and invagination-evagination control points in molar tooth development. Development. 148 (14), 199685 (2021).
  33. Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments JoVE. (90), e51969 (2014).
  34. Katsuragi, Y., et al. Bcl11b transcription factor plays a role in the maintenance of the ameloblast-progenitors in mouse adult maxillary incisors. Mechanisms of Development. 130 (9-10), 482-492 (2013).
  35. Dassule, H. R., Lewis, P., Bei, M., Maas, R., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127 (22), 4775-4785 (2000).
  36. Belteki, G., et al. Conditional and inducible transgene expression in mice through the combinatorial use of Cre-mediated recombination and tetracycline induction. Nucleic Acids Research. 33 (5), 51 (2005).
  37. Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
  38. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  39. Kimura, H., Cook, P. R. Kinetics of core histones in living human cells. The Journal of Cell Biology. 153 (7), 1341-1354 (2001).
  40. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology: CB. 8 (7), 377-385 (1998).
  41. Huang, Q., et al. The frontier of live tissue imaging across space and time. Cell Stem Cell. 28 (4), 603-622 (2021).
  42. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).
  43. Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
  44. Li, S., et al. Overview of the reporter genes and reporter mouse models. Animal Models and Experimental. 1 (1), 29-35 (2018).
  45. Mort, R. L., et al. Fucci2a: a bicistronic cell cycle reporter that allows Cre mediated tissue specific expression in mice. Cell Cycle. 13 (17), 2681-2696 (2014).
  46. Krivanek, J., et al. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nature Communications. 11 (1), 4816 (2020).
  47. Dailey, M. E., Marrs, G. S., Kurpius, D. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harbor protocols. 2011 (4), (2011).
  48. Gorczyca, W., Bruno, S., Darzynkiewicz, R., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. DNA strand breaks occurring during apoptosis - their early insitu detection by the terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays and prevention by serine protease inhibitors. International Journal of Oncology. 1 (6), 639-648 (1992).
  49. Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
  50. Wale, P. L., Gardner, D. K. Time-lapse analysis of mouse embryo development in oxygen gradients. Reproductive Biomedicine Online. 21 (3), 402-410 (2010).
  51. Tse, H. M., Gardner, G., Dominguez-Bendala, J., Fraker, C. A. The importance of proper oxygenation in 3D culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 634403 (2021).
  52. Spinelli, J. B., et al. Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain. Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).
  53. Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex-vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current Protocols in Cytometry. , CHAPTER, Unit9.39 (2012).
  54. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
  55. McCoy, R. J., O'Brien, F. J. Influence of shear stress in perfusion bioreactor cultures for the development of three-dimensional bone tissue constructs: a review. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (6), 587-601 (2010).
  56. Chen, K. D., et al. Mechanotransduction in response to shear stress. Roles of receptor tyrosine kinases, integrins, and Shc. The Journal of Biological Chemistry. 274 (26), 18393-18400 (1999).
  57. Seddiqi, H., et al. Inlet flow rate of perfusion bioreactors affects fluid flow dynamics, but not oxygen concentration in 3D-printed scaffolds for bone tissue engineering: Computational analysis and experimental validation. Computers in Biology and Medicine. 124, 103826 (2020).

Tags

Udviklingsbiologi udgave 200 Cellebevægelser Tandfornyelse med mus Musefortænder Epitelstamceller Mesenkymale stamceller Tandregenerering Vævshomeostase Cellulære interaktioner Explant kultursystem Multifoton timelapsemikroskopi Spatiotemporal information Celleadfærd Levende væv Dentalforskning Dynamiske cellulære processer
Brug af <em>ex vivo</em> live imaging til at undersøge celledelinger og bevægelser under tandfornyelse hos mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sundari Thooyamani, A., Shahin, E.,… More

Sundari Thooyamani, A., Shahin, E., Takano, S., Sharir, A., Hu, J. K. Using Ex Vivo Live Imaging to Investigate Cell Divisions and Movements During Mouse Dental Renewal. J. Vis. Exp. (200), e66020, doi:10.3791/66020 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter