Summary
생체 외 라이브 이미징은 생체 조직에서 세포 움직임과 상호 작용의 동적 과정을 연구하기 위한 강력한 기술입니다. 여기에서는 배양된 전체 성체 마우스 앞니에서 치아 상피 세포를 실시간으로 추적하기 위해 이광자 현미경을 구현하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
지속적으로 성장하는 마우스 앞니는 성체 상피 및 중간엽 줄기 세포의 조절과 치아 재생을 조사하기 위한 다루기 쉬운 모델 시스템으로 부상하고 있습니다. 이러한 전구 세포는 활발하게 분열, 이동 및 분화하여 조직 항상성을 유지하고 손실된 세포를 반응하는 방식으로 재생합니다. 그러나 고정 조직 절편을 사용하는 기존 분석은 세포 움직임 및 상호 작용의 동적 과정을 포착할 수 없었기 때문에 해당 규정을 연구하는 능력이 제한되었습니다. 이 논문은 이식 배양 시스템에서 전체 마우스 앞니를 유지하고 다광자 타임랩스 현미경을 사용하여 치아 상피 세포를 실시간으로 추적하는 프로토콜을 설명합니다. 이 기술은 치과 연구를 위한 기존 도구 상자에 추가되며 연구자가 살아있는 조직의 세포 행동 및 조직에 대한 시공간 정보를 얻을 수 있도록 합니다. 우리는 이 방법론이 연구자들이 치아 재생과 재생 중에 발생하는 역동적인 세포 과정을 제어하는 메커니즘을 추가로 탐구하는 데 도움이 될 것으로 기대합니다.
Introduction
지난 20년 동안 마우스 앞니는 성체 줄기 세포 조절 및 치아 재생의 원리를 조사하기 위한 귀중한 플랫폼으로 부상했습니다 1,2. 쥐 앞니는 동물의 일생 동안 지속적으로 성장하고 스스로 재생됩니다. 상피 줄기세포와 중간엽 줄기세포를 모두 유지함으로써 이를 수행하며, 이 줄기세포는 치아의 다른 세포 유형으로 자가 재생되고 분화할 수 있습니다 1,2. 치아 상피 줄기세포는 법랑질 기질을 분비하는 아멜로아세포를 생성하는 반면, 치아 중간엽 줄기세포는 상아질, 시멘트 및 치주 인대를 형성하는 odontoblast, cementoblast 및 fibroblast를 각각생성합니다 3,4,5,6. 이러한 새로운 세포의 지속적인 공급은 조직의 항상성을 유지하고 저작 마모 또는 부상으로 인해 손실된 오래된 세포를 대체할 수 있도록 합니다 7,8. 따라서 치아 줄기 세포의 유지와 분화를 조절하는 세포 및 분자 메커니즘을 밝히는 것은 점점 더 관심이 높아지고 있는 분야인 치아 재생을 이해하는 데 중요합니다.
해부학적으로 성체 쥐 앞니의 상당 부분이 턱뼈에 둘러싸여 있습니다. 치아의 앞니 가장자리가 노출되어 있는 동안 앞니의 치근단 끝은 소켓 내에 맞고 치주 인대와 결합 조직을 통해 주변 뼈에 단단히 부착됩니다(그림 1A, B). 앞니의 정점 끝은 치아의 성장 영역이기도 하며 상피층과 중간엽 치수(9,10,11,12,13) 모두에서 치아 줄기 세포와 전구 세포를 유지합니다. 특히, 치아 상피 줄기 세포는 순 경부 루프라고도 하는 정점 새싹으로 알려진 상피의 구근 끝에서 유지됩니다(그림 1C). 장 상피 및 표피와 유사하게, 앞니의 상피 재생은 주로 자궁 경부 고리의 안쪽 부분에 있는 줄기 세포와 통과 증폭 세포(transit-amplifying cells)라고 불리는 고도로 증식하는 중간 자손(14,15,16,17)에 의해 주로 지원됩니다. 그러나 앞니 상피가 재생 중에 정지된 줄기세포를 포함하고 활용하는지 여부는 아직 결정되지 않았습니다. 대조적으로, 활성 및 정지 치아 중간엽 줄기 세포는 모두 정점 치수에서 확인되었으며, 정지 줄기 세포는 부상 복구 동안 활성화되는 예비 개체군으로 기능합니다13,18.
생쥐 앞니 재생 및 재생의 생물학에 대한 많은 발견은 뚜렷한 시간적 접합점에서 샘플을 획득하고 고정, 처리 한 다음 특정 평면을 따라 미크론 두께의 조각으로 절단하는 조직 학적 조사의 결과입니다. 계통 추적 또는 유전적 교란을 가능하게 하는 다양한 마우스 모델의 조직학적 단면에 대한 상세한 분석을 통해 과학자들은 서로 다른 전구 세포 집단의 세포 계통뿐만 아니라 앞니 항상성 및 손상 복구를 제어하는 유전 및 신호 전달 경로를 확인했습니다 19,20,21. 그러나 단면에서 중요하지 않은 세포의 정적 2차원(2D) 이미지는 세포 형태 변화, 움직임 및 세포 동역학과 같은 생체 조직의 세포 행동 및 공간 조직의 전체 스펙트럼을 캡처할 수 없습니다. 조직 절편을 통해 해결할 수 없는 시간 척도에서 발생하는 이러한 급격한 세포 변화를 검출하고 측정하려면 다른 전략이 필요합니다. 또한 이러한 정보를 획득하는 것은 치과 세포가 서로 상호 작용하고, 다양한 신호 자극에 반응하고, 조직 구조와 기능을 유지하기 위해 스스로 조직화하는 방법을 이해하는 데에도 중요합니다.
3차원과 시간적 해상도를 통합하는 기술인 이광자 현미경22를 사용한 4차원(4D) 심부 조직 이미징의 출현은 배양된 조직 외식, 오가노이드 또는 심지어 제자리 조직의 시공간 검사를 가능하게 함으로써 조직학적 분석의 본질적인 한계를 극복합니다 23,24,25,26 . 예를 들어, 발달하는 치아 상피의 4D 라이브 이미징은 조직 성장, 신호 중추 형성 및 치아 상피 형태 형성을 조정하는 세포 분열 및 이동의 시공간 패턴을 밝혔습니다 27,28,29,30,31,32. 성체 쥐 앞니에서 4D 이미징은 최근 치아 상피 손상 복구 중 세포 거동을 연구하는 데 적용되었습니다. 실시간 이미징을 통해 기저층의 중간층 세포가 기저층에서 아멜로아세포로 직접 전환되어 손상된 상피를 재생할 수 있으며, 이는 상피 손상 복구의 전통적인 패러다임에 도전하는 것으로 나타났다15.
여기에서는 순 경추 루프의 상피 세포에 초점을 맞춘 성체 쥐 앞니의 해부, 배양 및 이미징에 대해 설명합니다(그림 1). 이 기술은 12시간 이상 치아 세포의 활력을 보존하고 단일 세포 분해능에서 형광 표지된 세포를 실시간으로 추적할 수 있습니다. 이 접근법을 통해 정상적인 배양 조건 또는 유전적, 물리적, 화학적 섭동에 대한 반응에서 세포 형태 및 분열 방향의 동적 변화뿐만 아니라 세포 운동 및 이동을 조사할 수 있습니다.
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Protocol
모든 쥐는 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스(UCLA) 또는 예루살렘 히브리 대학교(HUJI)의 병원균이 없는 동물 시설에서 관리되었습니다. 마우스와 관련된 모든 실험은 각 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 규정 및 프로토콜에 따라 수행되었습니다(ARC-2019-013; UCLA) 또는 (MD-23-17184-3; HUJI)를 사용합니다. 실험 단계의 일반적인 워크플로우는 그림 2A에 나와 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 기기, 시약 및 재료와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 용액 및 겔의 준비
- 해부 배지: 0.5% 포도당으로 신선한 DMEM/F12를 준비하고 2.4단계에서 필요할 때까지 37°C에서 따뜻하게 유지합니다.
참고: 라이브 이미징 중 자가형광을 줄이기 위해 페놀 레드가 없는 DMEM/F12를 사용합니다. - 배양 배지 1개: 50% DMEM/F12, 50% 쥐 혈청, 1x 글루타민 대체물, 1x MEM 비필수 아미노산, 1% 포도당, 0.1mg/mL L-아스코르브산 및 0.5% 페니실린-스트렙토마이신을 사용하여 신선한 배지를 준비합니다. 37단계에서 필요할 때까지 5.5°C에서 따뜻하게 유지하십시오. 이 배지는 라이브 이미징 중에 앞니 외식을 배양하는 데 사용됩니다.
참고: 쥐 혈청은 고품질이어야 하며 연구원 또는 상업적 출처에서 전체 조직 배양을 위해 특별히 준비되어야 합니다. 특히, 혈액은 응고가 형성되기 전에 원심분리(실온에서 1,200× g 에서 5분 동안)해야 합니다. 원심분리 후, 생성된 피브린 응고를 압착하여 폐기해야 한다33. - 배양 겔: 겔의 목적은 이미징 중에 샘플을 고정시키는 것이며 신선하게 준비됩니다.
- 전자레인지를 사용하여 10mL의 DMEM/F12에 저융점 아가로스 200mg을 용해시켜 DMEM/F12의 2% 겔을 만듭니다. 2% 겔을 37°C로 유지합니다.
- 50% 쥐 혈청, 1x 글루타민 대체물, 1x MEM 비필수 아미노산, 1% 포도당, 0.1mg/mL L-아스코르브산 및 0.5% 페니실린-스트렙토마이신을 혼합하여 2x 배양 배지(DMEM/F12 제외)를 만듭니다. 2x 배양 배지(DMEM/F12 제외)를 37°C로 예열합니다.
- 2% 겔과 2x 배양 배지(DMEM/F12 제외)를 동일한 부피로 혼합하여 1% 배양 겔을 만듭니다. 5.1단계에서 필요할 때까지 1% 배양 젤을 37°C로 유지합니다.
알림: 겔화를 방지하기 위해 혼합하기 전에 모든 용액이 따뜻한지 확인하십시오. 우리는 1% 젤이 성인 쥐 앞니를 배양하는 데 적합하다는 것을 발견했습니다. 겔 비율은 다른 조직을 배양해야 하는 경우 경험적으로 결정되어야 합니다.
2. 성체 마우스 하악골 적출
- IACUC에서 승인한 표준 절차에 따라 원하는 나이에 마우스를 안락사시킵니다.
알림: 여기서는 CO2 질식 후 경추 탈구를 사용합니다. 동물 안락사에 대한 규정은 지역마다 다를 수 있습니다. 연구자는 실험을 수행하기 전에 필요한 기관 승인을 받아야 하며 현지 동물 관리 규정을 준수해야 합니다. - 70% 에탄올을 사용하여 마우스를 소독합니다.
- 쥐의 목을 베고 왼쪽과 오른쪽 하악골을 추출합니다.
- 마우스를 배에 눕힌 다음 #9 단일 모서리 산업용 면도날을 사용하여 목 부분을 자르고 마우스 머리를 몸의 나머지 부분과 분리합니다.
참고: 인두나 목 부위의 조직도 채취해야 하는 경우 참수를 수행해서는 안 되며 2.3.2단계로 바로 진행할 수 있습니다. - 마우스를 뒤집어 복부 쪽이 위를 향하고 하악골에 쉽게 접근할 수 있도록 합니다.
- 엄지와 검지 사이에 동물의 머리를 부드럽게 잡아 고정합니다.
- 면도날을 사용하여 아래턱의 피부를 아랫입술에서 목선으로 자르는 시상 중간 절개를 합니다.
알림: #15 수술용 칼날을 사용하여 절개 및 후속 절개를 할 수도 있습니다(2.3.6-2.3.9단계). - 절개할 때 엄지와 검지를 사용하여 절단된 피부를 벌려 그 아래의 근육과 턱뼈를 노출시킵니다.
- 면도날을 사용하여 아래턱 협측의 교근을 절단하여 왼쪽과 오른쪽 편근의 바깥쪽에 근육 부착물이 없도록 합니다.
- 하악골 안쪽을 따라 있는 골수설근을 절단하여 하악골의 근육 부착물을 제거합니다.
- 두 개의 반구를 연결하는 하악 대칭을 다시 절개합니다. 절단되면 하악골은 왼쪽과 오른쪽 절반으로 분리됩니다.
- 하악과두와 측두하악관절 사이에 면도날을 끼우고 머리의 나머지 부분에서 반구를 조심스럽게 해부합니다.
참고: 자르는 동안 앞니를 부드럽게 당기는 것이 도움이 된다는 것을 알았습니다. 하악골이 부러지거나 하악골의 연조직이 손상되지 않도록 주의해야 합니다.
- 마우스를 배에 눕힌 다음 #9 단일 모서리 산업용 면도날을 사용하여 목 부분을 자르고 마우스 머리를 몸의 나머지 부분과 분리합니다.
- 즉시 예열된 해부 배지를 사용하여 절개된 하악골을 페트리 접시로 옮기고(1.1단계) #15 수술용 칼날을 사용하여 나머지 근육 조직을 제거합니다.
참고: 샘플을 차가운 매체에 보관하면 세포 활동이 느려져 실시간 이미징 중에 증식 또는 세포 이동과 같은 특정 세포 활동의 복구가 지연되거나 실패할 수 있습니다.
3. 전체 마우스 앞니의 격리
참고: 앞니의 추가 분리는 명시야 해부 현미경으로 수행됩니다.
- 앞니를 덮고 앞니의 정점 부분을 수용하는 하악의 타원형 영역을 시각적으로 식별합니다.
- 안쪽(설측) 표면이 위쪽을 향하도록 하악골을 배치합니다.
- 한 쌍의 톱니 모양의 집게로 하악골을 제자리에 고정하면서 과두에서 어금니 방향으로 #15 수술용 칼날을 사용하여 위에 놓인 막 뼈를 깎아 타원형 영역에 창을 만듭니다. 이렇게 하면 치근단 앞니의 연조직이 안쪽 표면에 노출됩니다.
- 바깥쪽(협측) 표면이 위쪽을 향하도록 하악골을 뒤집습니다.
- 3.3단계에서 설명한 대로 하악골 바깥쪽의 타원형 영역에 창을 생성하고 메스 끝을 사용하여 가장자리에 남아 있는 뼈 조각을 제거합니다. 치아의 정점 끝이 양쪽에서 보이는지 확인하십시오.
알림: 뼈를 면도하는 동안 과도한 압력을 가하지 않도록 하여 밑에 있는 연조직의 손상을 방지하십시오. - 앞니 주변의 뼈를 체계적으로 잘라내어 치아 전체를 분리합니다.
- 정점 앞니에 바로 인접한 평면을 깨끗하게 절개하여 먼저 과두돌기를 제거합니다.
참고: 앞니를 자르지 않도록 주의하십시오. - 제3대구치 바로 뒤에서 두 번째 절개를 하되 치아를 손상시키지 않고 앞니에서 등쪽을 절개합니다. 이렇게 하면 코로나 돌기가 포함된 뼈가 제거됩니다.
- 각돌기의 끝에서 앞니를 향해 연속적으로 절단하여 복부 하악을 단계적으로 제거합니다.
참고: 치아 상피 및 관련 치주 조직은 종종 뼈에 달라붙어 복부 뼈의 많은 부분을 한 번에 자르면 쉽게 찢어집니다. 앞니 연조직에서 뼈를 분리하기 위해 앞니의 정점 끝에 있는 두 조직 사이에 메스(또는 톱니 모양의 날카로운 집게 한 쌍)를 삽입하고 기구를 조심스럽게 앞으로 밀어 넣을 수 있습니다. - 어금니가 있는 치조골과 앞니에 붙어 있는 나머지 뼈를 잘라냅니다.
- 이제 앞니 전체가 분리되어 있습니다. 완전히 절개된 앞니를 깨끗하고 따뜻한 해부 배지가 있는 접시에 옮깁니다(1.1단계).
- 정점 앞니에 바로 인접한 평면을 깨끗하게 절개하여 먼저 과두돌기를 제거합니다.
- 3.2-3.6단계를 반복하여 필요에 따라 추가 앞니를 분리합니다.
참고: 마우스의 상악/상악 앞니는 또한 성체 줄기세포를 유지하며, 치아 재생을 연구하는데 사용될 수 있다34. 치과 연구자들은 일반적으로 아래 앞니에 초점을 맞추는데, 그 이유는 위 앞니보다 접근이 더 쉽고 더 쉽게 절개할 수 있기 때문입니다. 하악 앞니와 상악 앞니 전구 세포의 차이는 아직 밝혀지지 않았습니다.
4. 앞니 상피 경추 루프를 노출시키기 위한 치주 조직 제거
- 앞니 전체를 설측으로 눕히고 한 쌍의 톱니 모양의 집게로 치아를 제자리에 고정하면서 #5 미세한 집게를 사용하여 정점 앞니와 경추 루프 영역을 덮는 치주 조직을 집어넣기 시작합니다.
- 정점 새싹에서 치주 조직을 조심스럽게 벗겨내어 경추 루프의 측면(또는 다른 관심 영역)이 스코프 아래에서 보이도록 합니다.
알림: 치아 상피가 손상되거나 중간엽에서 분리되지 않도록 주의해야 합니다. 앞니의 관심 영역에 형광 신호가 있고 형광 해부 현미경을 사용할 수 있는 경우 형광 신호를 사용하여 조직 유형을 구별하고 해부를 도울 수 있습니다. 샘플을 배양 배지로 신속하게 옮기고 외식물 배양을 통해 적절하게 유지할 수 있도록 섹션 2-4를 효율적으로 수행하는 것이 중요합니다(아래 참조).
5. 외식물 배양을 위한 조직 매립
- 500μL의 따뜻하고 응고되지 않은 배양 젤을 24웰 플레이트의 웰에 넣고 절개된 전체 앞니를 웰로 빠르게 옮깁니다. 접시를 몇 번 휘저어 앞니를 헹굽니다.
- 400μL의 따뜻하고 응고되지 않은 배양 젤을 배양 접시에 넣고 헹군 앞니를 접시에 옮깁니다.
알림: 우리는 관류 설정과 호환되는 시중에서 판매되는 배양 접시를 사용합니다. 대체 옵션은 6.4단계를 참조하십시오. - 앞니의 방향을 잡아 경추 루프 영역(또는 기타 관심 영역)을 접시 중앙에 배치하고(그림 2A,B) 원하는 이미징 평면에 맞게 정점 앞니의 기울기를 조정합니다.
참고: 조직 배향은 완전한 겔화 전에 신속하게 수행되어야 합니다. - 젤을 굳힌 후 미세한 집게를 사용하여 관심 영역 위에 있는 젤을 제거하여 젤로 덮이지 않도록 합니다.
- 샘플(~150μL)을 덮을 수 있도록 접시 가장자리에 천천히 피펫팅하여 충분한 양의 따뜻한 배양 배지를 추가합니다.
- 외식물 배양액을 37°C 세포 배양 인큐베이터로 옮겨 조직 침전과 배양 조건 조절을 1시간 동안 진행합니다.
6. 앞니 외식의 타임랩스 현미경 검사
참고: 이 실험에서는 개구수가 1인 25x 침지 대물렌즈가 장착된 정립 현미경을 사용했습니다. 일반적으로 개구수가 높은 water dipping lens는 deep tissue imaging에 가장 적합합니다.
- 현미경과 이광자 레이저를 켭니다.
- 배양 접시를 s에 고정tage 어댑터를 선택하고 관류 어댑터 링을 상단에 장착합니다(그림 2C).
- 단계 연결tage 배양을 37°C로 유지하도록 설정된 온도 컨트롤러에 어댑터를 연결합니다.
- 어댑터 링의 입구와 출구를 마이크로 관류 펌프에 연결하고 펌프에서 관류 속도를 20으로 설정하여 배양 배지의 관류를 시작합니다. 이렇게 하면 시료 상단에서 배양 배지의 느린 흐름(~5mL/h)이 생성됩니다(그림 2C).
알림: 안정적으로 제어되는 환경에서 조직을 유지하기 위한 시스템에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 다른 시스템도 사용할 수 있습니다. 37°C 가열판과 주사기 펌프에 연결된 입구 및 출구가 있는 수제 관류 배양 접시(보충 그림 S1)의 조합도 사용할 수 있습니다. - 어댑터 링 위에 ACBR(Atmospheric Control Barrier Ring)을 놓고 ACBR을 통해 대물렌즈를 내려 배양 배지와 접촉하도록 합니다(그림 2D).
- 레이저 파장을 920nm로 조정하여 GFP 및 적색 형광(예: tdTomato) 신호를 모두 시각화합니다.
- 접안렌즈를 통해 샘플을 찾은 다음 현미경의 소프트웨어에서 샘플을 찾습니다.
- 소프트웨어를 사용하여 Z-스택, 다중 위치 이미징 및 시간 간격을 설정합니다. 이 프로토콜을 따르려면 4μm의 z-스텝 크기와 14시간 동안 5분의 시간 간격을 사용합니다.
참고: 5분보다 긴 시간 간격은 부드러운 세포 이동과 분열을 포착하기에 충분하지 않은 경우가 많다는 것을 발견했습니다. - 타임랩스 이미징을 시작합니다.
알림: Sample 위치는 처음 1시간 동안 이동할 수 있으며 추가 조정이 필요할 수 있습니다. - 다운스트림 데이터 처리 및 분석을 위해 파일을 저장합니다.
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Representative Results
성체 쥐 앞니의 정점 영역은 하악골 내에 둘러싸여 있기 때문에(그림 1) 성장 영역 내에 있는 전구 세포를 시각화하고 실시간으로 추적하기 위해 직접 접근할 수 없습니다. 따라서 우리는 턱뼈에서 전체 앞니를 추출하고 이광자 타임랩스 현미경을 위한 외식물 배양 시스템에서 유지하는 방법을 개발했습니다(그림 2). 여기서는 치아 상피의 순 경추 루프 영역에서 세포 증식과 운동의 역동적인 과정을 포착하는 대표적인 결과를 설명합니다.
실험 절차를 시연하기 위해 치아 상피에서 녹색 형광을 발현하는 두 가지 마우스 모델을 사용했습니다. 첫 번째 마우스 라인은 K14Cre입니다. R26rtTA입니다. tetO-H2B-GFP는, 여기서 K14Cre (MGI:2680713)는 케라틴 14 프로모터(35)로부터 Cre 재조합효소를 발현하고, R26rtTA 대립유전자(36)로부터 상피에서 역 테트라사이클린-제어 트랜스액티베이터의 발현을 활성화시킨다(MGI:3584524). 독시사이클린을 투여하면 rtTA는 tetO-H2B-GFP 대립유전자37(MGI:3043783)에서 히스톤 H2B-GFP 발현을 유도하고 상피 세포핵을 녹색 형광으로 표지합니다. 이는 세포 추적 및 세포 분열 검출에 특히 유용합니다. 이 실험에서 우리는 H2B-GFP 발현을 활성화하기 위해 희생 전 24시간 동안 독시사이클린 사료를 동물에게 먹였습니다. 두 번째 마우스 라인은 K14Cre입니다. R26mT/mG, 여기서 R26mT/mG (MGI:3803814)는 Cre-reporter38입니다. Cre 활성이 없는 경우 세포는 적색 형광으로 막 국소화 tdTomato(mT)를 발현합니다. Cre 매개 재조합 시 세포는 막 GFP(mG)를 발현합니다. K14크리; 따라서 R26mT/mG 는 상피 세포막을 녹색 형광으로 표지하고 비상피 세포는 빨간색으로 남깁니다. 이를 통해 세포 모양, 분열 및 움직임을 쉽게 시각화할 수 있습니다.
우리는 하악골을 절개하는 것으로 시술을 시작했고(그림 3A) 앞니 주변의 모든 뼈를 체계적으로 제거했습니다(그림 3B-G). 그 결과 상피가 손상되지 않은 전체 앞니가 생성되었습니다(그림 3H). 우리는 K14Cre의 녹색 형광을 검사하여 치아 상피의 온전함을 확인했습니다. R26rtTA입니다. tetO-H2B-GFP 및 K14Cre; R26mT/mG 마우스(그림 4A,B,E,F). 이 단계에서 불투명한 치주 조직은 여전히 정점 앞니를 덮고 있으며, 따라서 광 산란으로 인해 자궁경부 루프가 흐릿하게 나타나 다운스트림 타임랩스 이미징을 유사하게 방해할 수 있습니다(그림 4C,G). 따라서 치주 조직을 조심스럽게 제거하여 각 앞니에서 경추 루프가 있는 치아 상피를 식별할 수 있도록 했습니다(그림 4D,H).
그런 다음 앞니를 낮은 융점 아가로스에 매립하고 그림 2에 표시된 대로 이광자 라이브 이미징을 위한 관류 설정에서 배양했습니다. 이 연습에서는 치아 상피의 경추 루프 영역에 초점을 맞추고 14시간 동안 5분마다 4μm 간격으로 z-stack 이미지를 캡처했습니다(그림 5A). 특히, H2B-GFP 신호는 주로 활발한 세포 분열이 있는 자궁경부 루프의 통과 증폭 영역에서 관찰되었습니다(그림 5B). 이것은 개방 염색질에서 더 높은 H2B-GFP 교환이 있고 이들 활성 세포에서 DNA 복제에 이어 뉴클레오솜으로 혼입되기 때문일 수있다 39.
이어서 ImageJ를 사용하여 타임랩스 이미지를 검사하고 H2B-GFP 신호(40)의 분리에 기초하여 이미징 기간 동안 수많은 세포 분열을 관찰할 수 있었습니다(보충 비디오 S1 및 보충 비디오 S2). 이는 조직이 외식물 배양에서 적절하게 유지되고 세포가 활성화되었음을 나타냅니다. 특히, 우리는 유사분열 세포의 중기 플레이트에서 염색체의 응축 및 정렬을 관찰할 수 있었고, 아나페이즈 동안 두 개의 딸 세포로 분리되는 것을 관찰할 수 있었습니다(그림 5C-N, ImageJ 플러그인 TrackMate를 사용하여 수동으로 추적). 이러한 분할의 대부분은 기저막에 대해 수직 또는 비스듬한 각도로 이루어졌습니다(그림 5C-K 및 보충 비디오 S1). 기저막과 평행한 수평 분할도 감지될 수 있지만 빈도는 낮습니다(그림 5L-N 및 보충 비디오 S2). 치아 상피의 사이토카인(cytokinesis)은 종종 5-10분 이내에 빠르게 일어난다는 점을 지적하는 것이 중요합니다. 따라서 타임랩스 간격이 5분 이상이면 이러한 구분 중 일부가 누락될 수 있습니다.
세포 분열 사건은 K14Cre에서도 명백했습니다. R26mT/mG 자궁경부 루프, 모든 상피 세포막이 녹색으로 표시되었습니다(그림 6A). 우리는 그들의 세포 둥글게 하고 그 후에 cytokinesis (보충 영상 S3)에 의하여 mitotic 세포를 확인할 수 있고, 수직기도 하고 수평한 세포 분열은 관찰가능했습니다 (그림 6B-G), 따라서 H2B-GFP를 사용하여 얻어진 결과와 유사한. 이러한 결과는 이 프로토콜이 뚜렷한 세포 내 구조를 형광으로 표지하는 마우스 유전자 모델과 결합될 때 앞니 외식의 세포 거동을 조사하는 강력한 도구 역할을 할 수 있음을 보여줍니다.
그림 1: 마우스 턱과 앞니 경추 루프의 개략도. (A) 앞니의 상당 부분이 턱뼈에 박혀 있습니다. 성장 부위는 치아의 정점 끝에 위치하며 지속적인 성장을 지원합니다(짙은 녹색 화살표). (B) 치주 조직으로 둘러싸인 정점 앞니의 확대. 치아는 법랑질과 상아질로 구성되어 있으며, 이는 각각 아멜로아세포와 오돈토아세포에 의해 형성된 고도로 미네랄화된 구조입니다. (C) 치과 상피 전구 세포와 통과 증폭 세포가 순 경부 루프에 있고 더 원위 상피에서 아멜로아세포를 발생시키는 것을 보여주는 정점 앞니의 시상 절편(짙은 녹색 점선 화살표). 순 자궁 경부 루프에 비해 설측 자궁 경부 루프는 크기가 더 작고 일반적으로 아멜로아세포를 형성하지 않습니다. 치아 중간엽 줄기 세포는 치수 (보라색 영역)에 존재하며 odontoblast를 생성합니다. 약어: En = 에나멜; De = 상아질; Am = 아멜로아세포; Od = odontoblast; TACs = 통과 증폭 셀; laCL = 순 경추 루프; liCL = 설측 경추 루프. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 실시간 이미징을 위한 마우스 앞니 이식 유지. (A) 앞니를 절개하는 것부터 실시간 이미징을 위해 낮은 융점에 조직을 매립하는 것까지 프로토콜의 주요 단계를 묘사한 회로도. 이미징 중에 영양분을 지속적으로 공급하기 위해 관류 설정이 사용되며 배양액은 37°C로 유지됩니다. (B-D) 라이브 이미징을 위해 배양 접시와 관류 챔버를 설정하는 단계별 시연. 미디어 입구와 출구는 각각 분홍색과 노란색 화살표로 표시됩니다. 약어: ACBR = 대기 제어 장벽 링. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 전체 마우스 앞니의 분리. (A) 온전한 턱. (비에이치) 뼈를 서서히 제거하여 앞니 전체를 노출시켰습니다. B와 C의 빨간색 점선은 앞니의 설측과 협측을 덮고 있는 막뼈를 깎아낸 후 정점 앞니의 노출된 연조직을 보여줍니다(프로토콜의 3.3-3.5단계). (디지) 파란색 화살촉은 전체 치아를 분리하기 위해 제거된 과두, 어금니 및 치조골을 나타냅니다(프로토콜의 3.6단계). 눈금 막대 = 2mm(H). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 실시간 이미징을 위한 치주 조직 제거. (에이치) (AD) K14Cre의 대표 샘플; R26rtTA입니다. tetO-H2B-GFP 및 (E-H) K14Cre; R26mT/mG마우스가 프로토콜 시연에 사용되었습니다. 절개 전에 치아 상피의 GFP 발현은 뼈(A,E, 노란색 화살촉)를 통해 볼 수 있었습니다. 흰색 점선은 절개되지 않은 앞니의 윤곽을 그립니다. E'는 설측을 나타냅니다. 고립된 앞니(B,C,F,G)에서, GFP 형광은 처음에 정점 앞니(흰색과 빨간색 화살촉)를 덮고 있는 치주 조직에 의해 회절되었습니다. F 및 G의 적색 형광은 비상피 세포를 표지합니다. 치주 조직을 제거하면 녹색 형광 경부 루프(D,H, 녹색 화살촉)를 선명하고 방해받지 않고 볼 수 있습니다. 눈금 막대 = 2mm(A,E); 1.25mm(B,F); 및 300μm(C,D,G,H). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: K 14 Cre의 타임랩스 현미경; R26rtTA입니다. tetO-H2B-GFP 자궁 경부 루프. (A) 타임랩스 설정을 보여주는 개략도. (B) K14Cre의 대표 z-plane; R26rtTA입니다. tetO-H2B-GFP 앞니 순 자궁 경부 루프, 세포가 활발히 분열하는 이동 증폭 영역에서 주로 H2B-GFP에 의한 핵 라벨링을 보여줍니다. 노란색 상자는 아래 표시된 확대 이미지의 일반적인 영역을 나타냅니다. (씨케이) BM을 기준으로 수직 및 비스듬한 세포 분열을 보여주는 타임랩스 이미지. (L-N) 타임랩스 이미지는 BM을 기준으로 수평 세포 분열의 예를 보여줍니다. (D,G,J,M) 중기 또는 아나페이즈의 세포는 중간 패널에 표시됩니다. 추적된 각 분할의 회로도는 오른쪽에 표시됩니다. N = 36 μm (B)의 눈금 막대; 5μm(CN)입니다. 약어: BM = basement membrane. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: K 14 Cre의 타임랩스 현미경; R26mT/mG 자궁경부 루프. (A) K14Cre의 대표적인 z-plane; R26mT/mG 앞니 순 경추 루프. 모든 상피 세포는 막 GFP를 발현합니다. 노란색 상자는 확대된 부분에 표시된 세포 추적 영역을 나타냅니다. (비지) BM을 기준으로 (B-D) 수평 및 (E-G) 수직 세포 분열을 모두 캡처하는 타임랩스 이미지. (C,F) 중간 패널은 유사분열 세포 반올림을 보여줍니다. 추적된 각 분할의 회로도는 오른쪽에 표시됩니다. 눈금 막대 = 35μm(A); 5μm(BG)입니다. 약어: BM = basement membrane. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S1: 사내 관류 접시. (A) 35mm 배양 접시를 사용하여 관류 접시를 만들 수 있습니다. 도립 현미경을 사용하여 이미징을 수행하는 경우 유리 바닥 접시를 사용할 수 있습니다. (B) 불꽃으로 못을 가열하십시오. (C) 가열된 못을 사용하여 접시의 양쪽에 두 개의 구멍(흰색 화살촉)이 만들어집니다. (D) 에폭시 접착제를 사용하여 개구부를 통해 두 개의 뭉툭한 끝 16G 바늘(하나는 미디어 입구로, 다른 하나는 미디어 출구)을 부착합니다. 가스 관류가 필요한 경우 세 번째 개구부/바늘을 접시에 추가할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 S1: K14Cre의 라이브 이미징; R26rtTA입니다. tetO-H2B-GFP 앞니 순 자궁 경부 루프, 수직 및 비스듬한 세포 분열을 보여줍니다. 세포는 수동으로 추적되며 다른 색상의 점은 서로 다른 모/딸 세포 쌍을 나타냅니다. 스케일 바 = 30μm(왼쪽 프레임); 7μm(오른쪽 프레임). 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 S2: K14Cre의 라이브 이미징; R26rtTA입니다. tetO-H2B-GFP 앞니 순 자궁 경부 루프, 수평 세포 분열의 예를 보여줍니다. 수평 분할은 10초 표시에서 발생하며 파란색 점을 사용하여 수동으로 추적됩니다. 스케일 바 = 30μm(왼쪽 프레임); 7μm(오른쪽 프레임). 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 S3: K14Cre의 라이브 이미징; R26mT/mG 앞니 순 자궁경부 루프, 수직 및 수평 세포 분열을 모두 보여줍니다. 세포는 수동으로 추적되며 다른 색상의 원은 서로 다른 어머니/딸 세포 쌍을 나타냅니다. 스케일 바 = 30μm(왼쪽 프레임); 7μm(오른쪽 프레임). 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
살아있는 조직 이미징은 세포가 틈새 환경에서 유지될 때 세포의 역동적인 과정과 행동을 연구할 수 있게 해주는 중요한 기술이다41. 이상적으로, 라이브 이미징은 높은 시공간 해상도로 생체 내에서 수행됩니다. 그러나, 포유류 장기에 대한 생체내 이미징은 조직 접근의 불가능성, 광학적 불투명도, 그리고 장기간 동안 동물 또는 장기를 고정시키는 것의 어려움으로 인해 어려울 수 있다42. 조직 외식은 이러한 문제 중 일부를 우회하며, 치아 형태 형성 및 외배엽 장기의 발달과 같은 세포 거동을 추적하기 위해 많은 연구에서 성공적으로 채택되었습니다26. 여기에서 우리는 배양된 전체 성인 마우스 앞니에서 살아있는 심부 조직 이미징을 수행하기 위한 비교적 간단하면서도 강력한 프로토콜을 시연했습니다. 이 기술을 적용하면 치아 재생 중 세포 이동, 운명 결정 및 조직 조직의 조절을 이해하는 데 도움이 됩니다.
세포 분열은 쉽게 관찰할 수 있는 사건이자 조직 재생의 특성이기 때문에 이 연구에서는 프로토콜의 한 가지 용도를 강조하기 위해 세포 분열을 추적하는 데 중점을 두었습니다. 앞니 상피 전구세포는 수직 및 수평 분할을 모두 겪을 수 있으며, 따라서 다른 상피 조직과 유사하다는 것을 발견했다43. 분열 각도를 조절하는 메커니즘을 설명하고 세포 운명 결정에서 분열 방향의 역할을 조사하는 것은 향후 연구에서 중요할 것입니다. 형광 세포 운명 마커, 신호 전달 경로 리포터 또는 Fucci 세포주기 리포터44,45를 운반하는 다양한 마우스 유전자 모델과 라이브 이미징을 결합하면 세포 분열 패턴과 세포주기 역학이 상피 항상성 및 재생 조절에 어떻게 기여하는지 밝히는 데 도움이 될 것입니다.
이 프로토콜에서 필요한 관행은 신속하고 신중한 방식으로 치아 절개를 수행하여 적절한 배양 조건에서 온전한 조직으로 빠르게 전환하고 보존할 수 있도록 하는 것입니다. 우리는 단백질과 mRNA를 추출하기 위한 실험에서와 같이 라이브 이미징의 경우, 콜드 매질이 아닌 웜 매질에서 조직을 해부하는 것이 세포를 기능적인 상태로 유지한다는 것을 발견했다46. 앞니는 배양을 위한 비교적 큰 기관이기 때문에, 배지 관류를 통한 영양분의 꾸준한 공급은 이미징 전반에 걸쳐 조직의 유지에 매우 중요하다47. 전구 세포가 관심 영역에 존재하는 경우 빈번한 세포 분열을 관찰하는 것은 조직이 건강하고 활동적이라는 좋은 지표입니다. 대조적으로, 세포 사멸은 드물어야 하며, 이는 핵 마커가 사용되는 경우 이미징 중에 밝고 응축된 핵체를 검출하거나 이미징 및 조직 고정 후 TUNEL 염색을 수행함으로써 확인할 수 있습니다48. 영양소 이외에도, 산소 농도는 식물 생존 가능성에 영향을 미칠 수 있는데, 산소 장력 또는 불충분은 세포 생존, 증식 및 분화를 방해할 수 있기 때문이다 49,50,51. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 이미징 중 샘플에 추가 산소가 있거나 없는 경우(예: 95% O2/5% CO2 카보겐 또는 5% CO2/21% O2/균형 N2) 세포 증식과 세포 사멸의 명백한 차이는 관찰되지 않았으며, 이는 시스템의 미량의 산소가 밤새 배양에서 앞니 상피를 유지하기에 충분하거나 조직이 정상적인 세포 기능을 유지하기 위해 대체 경로를 사용할 수 있음을 시사합니다52. 그러나 다른 세포 과정이나 올바른 유전자 발현에서 산소에 대한 요구량은 향후 연구에서 추가로 결정되어야 합니다.
프로토콜의 시연에서는 유전적으로 인코딩된 H2B-GFP 및 멤브레인 GFP를 사용하여 각각 세포핵과 윤곽을 표지했습니다. 이러한 형광 마커는 이광자 현미경 검사에서 밝고 오래 지속되므로 세포 이동 및 분열을 추적하는 데 사용할 수 있는 이상적인 라벨의 예입니다. 이론적으로, 형광 바이탈 염료는 또한 생체외 라이브 이미징(53)을 위한 상이한 세포내 구획을 표지하는데 사용될 수 있지만, 더 깊은 상피세포로의 염료의 침투 감소는 그들의 사용을 제한할 수 있다. 마찬가지로, 표준 컨포칼 현미경은 100μm 미만의 깊이에서 고해상도 라이브 이미징이 가능하지만, 이광자 현미경은 광표백 및 광독성을 줄이면서 이미징 깊이를 증가시킵니다54. 따라서 우리는 대부분의 라이브 이미징 응용 분야에서 이미징 방식으로 이광자 현미경을 선택했습니다.
이 프로토콜의 한 가지 잠재적인 한계는 앞니 외식이 생체 내 환경 및 생물학을 완전히 재현하지 못할 수 있다는 것입니다. 따라서 데이터는 배양 조건 하에서 세포 거동을 나타내며 그에 따라 해석되어야 할 뿐만 아니라 해당되는 경우 조직학과 같은 다른 방법을 사용하여 검증되어야 합니다. 또한 이미징을 위해 자궁 경부 루프에 접근하기 위해 치주 조직을 부분적으로 제거해야 했습니다. 따라서 치주 조직과 치아 상피 사이의 신호 상호 작용이 방해를 받을 수 있습니다. 마지막으로, 배지 관류는 배양 조직의 생존력을 크게 향상시키지만, 이소성 기계적 신호로 작용하고 결과에 영향을 미치는 유체 전단 응력을 도입할 수 있습니다55,56. 설정에서 다른 유속의 영향을 결정하지 않았습니다. 그러나, 1-5 mL/h의 낮은 유속이 통상적으로 영양분 공급을 유지시키기에 충분하기 때문에(57), 전단 응력의 영향은 최소화될 수 있다. 이러한 한계를 염두에 두고, 체외 생체 내 라이브 이미징은 실험에 적절한 대조군이 포함될 때 세포 행동의 변화를 연구할 수 있는 강력한 플랫폼 역할을 합니다.
지속적으로 성장하는 마우스 앞니는 줄기 세포 기반 조직 재생 및 부상 복구를 연구하기 위한 다루기 쉬운 모델 시스템입니다. 여기에 설명된 프로토콜은 연구자에게 전체 성인 앞니를 배양 상태로 유지하고 타임랩스 현미경을 통해 세포 거동에 대한 시공간 정보를 추출할 수 있는 수단을 제공합니다. 우리는 이 기술이 치과 연구에 사용되는 다양한 마우스 유전자 모델을 연구하는 데 광범위하게 적용되고 치과 재생 분야의 지식을 발전시키는 데 도움이 될 것으로 기대합니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 이광자 현미경을 제공한 캘리포니아 나노시스템 연구소(RRID:SCR_022789)의 UCLA Advanced Light Microscopy/Spectroscopy Laboratory 및 Leica Microsystems Center of Excellence를 인정합니다. AS는 이스라엘 과학 재단(Israel Science Foundation)의 ISF 604-21의 지원을 받았습니다. JH는 NIH/NIDCR의 R03DE030205 및 R01DE030471의 지원을 받았습니다. AS와 JH는 또한 미국-이스라엘 양국 과학 재단(BSF)의 보조금 2021007 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well, flat bottom tissue culture plate | Olympus plastics | 25-107 | |
| 25x HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | 11507704 | |
| Ascorbic acid (Vitamin C) | Acros Organics | 352685000 | |
| D-(+)-Glucose bioxtra | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Delta T system | Bioptechs | 0420-4 | Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup |
| Dissection microscope- LEICA S9E | Leica | LED300 SLI | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | 11039047 | Basal media without phenol red |
| Feather surgical blade (#15) | Feather | 72044-15 | |
| Fine forceps | F.S.T | 11252-23 | |
| Glutamax | Thermo Scientific | 35050-061 | Glutamine substitute |
| Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | n/a | |
| low-melting agarose | NuSieve | 50080 | |
| non-essential amino acids (100x) | Thermo Scientific | 11140-050 | |
| penicillin–streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Petri dish | Gen Clone | 32-107G | 90 mm |
| Rat serum | Valley Biomedical | AS3061SC | Processed for live imaging |
| Razor blade #9 | VWR | 55411-050 | |
| Scalpel handle | F.S.T | 10003-12 | |
| Scissors | F.S.T | 37133 | |
| serrated forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| spring scissors | F.S.T | 91500-09 |
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