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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Usando imagens ao vivo ex vivo para investigar divisões celulares e movimentos durante a renovação dentária de camundongos

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/66020
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2, 1,3
1School of Dentistry, University of California Los Angeles, 2The Institute of Biomedical and Oral Research, Faculty of Dental Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 3Molecular Biology Institute, University of California Los Angeles
* These authors contributed equally

Summary

A imagem ao vivo ex vivo é uma técnica poderosa para estudar os processos dinâmicos de movimentos celulares e interações em tecidos vivos. Aqui, apresentamos um protocolo que implementa microscopia de dois fótons para rastrear células epiteliais dentárias vivas em incisivos adultos inteiros cultivados.

Abstract

O incisivo de camundongo em crescimento contínuo está emergindo como um sistema modelo altamente tratável para investigar a regulação de células-tronco mesenquimais e epiteliais adultas e regeneração dentária. Essas populações progenitoras dividem, movem e diferenciam ativamente para manter a homeostase tecidual e regenerar as células perdidas de maneira responsiva. No entanto, as análises tradicionais usando cortes de tecido fixo não conseguiram capturar os processos dinâmicos dos movimentos e interações celulares, limitando nossa capacidade de estudar suas regulações. Este trabalho descreve um protocolo para manter incisivos inteiros de camundongos em um sistema de cultura de explantes e células epiteliais dentárias live-track usando microscopia timelapse multifóton. Esta técnica se soma à nossa caixa de ferramentas existente para pesquisa odontológica e permite que os pesquisadores adquiram informações espaço-temporais sobre comportamentos e organizações celulares em um tecido vivo. Antecipamos que esta metodologia ajudará os pesquisadores a explorar ainda mais os mecanismos que controlam os processos celulares dinâmicos que ocorrem durante a renovação e regeneração dentária.

Introduction

Nas últimas duas décadas, o incisivo de camundongo emergiu como uma plataforma inestimável para investigar os princípios da regulação de células-tronco adultas e regeneraçãodentária1,2. O incisivo de camundongo cresce continuamente e se renova ao longo da vida do animal. Para isso, mantém tanto as células-tronco epiteliais quanto as mesenquimais, que podem se auto-renovar e se diferenciar em diferentes tipos celulares do dente 1,2. Enquanto as células-tronco epiteliais dentárias dão origem aos ameloblastos, que secretam a matriz do esmalte, as células-tronco mesenquimais dentárias dão origem aos odontoblastos, cementoblastos e fibroblastos, que formam dentina, cemento e ligamento periodontal, respectivamente 3,4,5,6. Esse fornecimento constante de novas células mantém a homeostase tecidual e permite a reposição de células antigas que são perdidas devido ao desgaste mastigatório oulesões7,8. A elucidação dos mecanismos celulares e moleculares que regulam a manutenção e diferenciação das células-tronco dentárias é, portanto, fundamental para o entendimento da regeneração dentária, uma área de crescente interesse.

Anatomicamente, uma grande parte do incisivo de camundongo adulto está envolta no osso maxilar. Enquanto a borda incisal do dente é exposta, a extremidade apical do incisivo se encaixa dentro de um alvéolo e está firmemente presa ao osso circundante através de ligamentos periodontais e tecidos conjuntivos (Figura 1A,B). A extremidade apical do incisivo também é a região de crescimento do dente e mantém células-tronco e progenitoras dentárias tanto na camada epitelial quanto na polpa mesenquimal9,10,11,12,13. Especificamente, as células-tronco epiteliais dentárias são mantidas na extremidade bulbosa do epitélio, conhecida como broto apical, também chamada de alça cervical labial (Figura 1C). Assim como o epitélio intestinal e a epiderme, a renovação epitelial no incisivo é suportada principalmente por células-tronco cicladoras ativas e seus descendentes intermediários altamente proliferativos, denominadas células amplificadoras do trânsito14,15,16,17, ambas residindo na parte interna da alça cervical. No entanto, ainda não se sabe se o epitélio incisivo contém e utiliza células-tronco quiescentes durante a regeneração. Em contraste, tanto as células-tronco mesenquimais dentais ativas quanto quiescentes têm sido identificadas na polpa apical, e as células-tronco quiescentes funcionam como uma população de reserva que se torna ativada durante o reparo dalesão13,18.

Muitas das descobertas sobre a biologia da renovação e regeneração dos incisivos de camundongos resultaram de investigações histológicas, nas quais amostras são obtidas em distintas conjunturas temporais, fixadas, processadas e, em seguida, seccionadas em cortes de mícrons finos ao longo de um plano particular. Através da análise detalhada de cortes histológicos de diferentes modelos murinos que permitem o rastreamento de linhagens ou perturbações genéticas, os cientistas identificaram as linhagens celulares de diferentes populações progenitoras, bem como as vias genéticas e de sinalização que controlam a homeostase dos incisivos e o reparo de lesões 19,20,21. No entanto, as imagens bidimensionais estáticas (2D) de células não vitais em cortes não conseguem capturar todo o espectro de comportamentos celulares e organizações espaciais em tecidos vivos, como mudanças na forma celular, movimentos e cinética celular. Detectar e medir essas rápidas mudanças celulares, que ocorrem em uma escala de tempo insolúvel por meio da secção tecidual, requer uma estratégia diferente. Além disso, a aquisição dessas informações também é fundamental para a compreensão de como as células dentárias interagem entre si, reagem a diferentes estímulos de sinalização e se auto-organizam para manter as estruturas e funções teciduais.

O advento da imagem de tecidos profundos quadridimensionais (4D) utilizando microscopia de dois fótons22, uma tecnologia que integra três dimensões espaciais com resolução temporal, supera as limitações inerentes à análise histológica ao permitir o exame espaço-temporal de explantes teciduais cultivados, organoides ou mesmo tecidos in situ 23,24,25,26 . Por exemplo, imagens ao vivo em 4D do epitélio dentário em desenvolvimento revelaram os padrões espaço-temporais de divisões e migrações celulares que coordenam o crescimento tecidual, a formação do centro de sinalização e a morfogênese epitelial dentária 27,28,29,30,31,32. No incisivo adulto de camundongos, a imagem 4D foi recentemente adaptada para estudar o comportamento celular durante o reparo de lesão epitelial dentária. Imagens ao vivo revelaram que as células intermédias do estrato na camada suprabasal podem ser diretamente convertidas em ameloblastos na camada basal para regenerar o epitélio danificado, desafiando o paradigma tradicional de reparo de lesãoepitelial15.

Descrevemos a dissecção, cultivo e imagem do incisivo adulto de camundongos, com foco nas células epiteliais da alça cervical labial (Figura 1). Esta técnica preserva a vitalidade das células dentárias por mais de 12 h e permite o rastreamento ao vivo de células marcadas fluorescentemente em resolução de célula única. Esta abordagem permite a investigação do movimento e migração celular, bem como mudanças dinâmicas na forma e orientação da divisão celular sob condições normais de cultura, ou em respostas a perturbações genéticas, físicas e químicas.

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Protocol

Todos os camundongos foram mantidos em instalações para animais livres de patógenos na Universidade da Califórnia em Los Angeles (UCLA) ou na Universidade Hebraica de Jerusalém (HUJI). Todos os experimentos envolvendo camundongos foram realizados de acordo com normas e protocolos aprovados pela respectiva Comissão Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) ou (MD-23-17184-3; HUJI). Um fluxo de trabalho geral das etapas experimentais é mostrado na Figura 2A. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os instrumentos, reagentes e materiais usados neste protocolo.

1. Preparação de soluções e géis

  1. Meio de dissecção: Preparar DMEM/F12 fresco com 0,5% de glicose e mantê-lo aquecido a 37 °C até ser necessário na etapa 2.4.
    NOTA: Usamos DMEM/F12 sem vermelho de fenol para reduzir a autofluorescência durante imagens ao vivo.
  2. 1x Meio de cultura: Preparar o meio fresco usando 50% de DMEM/F12, 50% de soro de rato, 1x substituto de glutamina, 1x MEM de aminoácidos não essenciais, 1% de glicose, 0,1 mg/mL de ácido L-ascórbico e 0,5% de penicilina-estreptomicina. Manter aquecido a 37 °C até ser necessário no passo 5.5. Este meio é usado para cultivar explantes incisivos durante imagens vivas.
    NOTA: O soro de rato deve ser de alta qualidade e especialmente preparado para a cultura de tecidos inteiros por pesquisadores ou de uma fonte comercial. Em particular, o sangue deve ser centrifugado (por 5 min a 1.200 × g à temperatura ambiente) antes que a coagulação comece a se formar. Após a centrifugação, o coágulo de fibrina resultante deve ser espremido e descartado33.
  3. Gel de cultura: O objetivo do gel é imobilizar amostras durante a aquisição de imagens e é preparado fresco.
    1. Fazer 2% de gel em DMEM/F12 dissolvendo 200 mg de agarose de baixo ponto de fusão em 10 mL de DMEM/F12 usando um micro-ondas. Manter o gel a 2% a 37 °C.
    2. Produzir 2x meio de cultura (sem DMEM/F12) misturando 50% de soro de rato, 1x substituto de glutamina, 1x MEM Aminoácidos não essenciais, 1% de glicose, 0,1 mg/mL de ácido L-ascórbico e 0,5% de penicilina-estreptomicina. Aquecer o meio de cultura 2x (sem DMEM/F12) a 37 °C.
    3. Fazer 1% de gel de cultura misturando volumes iguais de 2% de gel e 2x meio de cultura (sem DMEM/F12). Manter o gel de cultura a 1% a 37 °C até ser necessário na etapa 5.1.
      NOTA: Certifique-se de que todas as soluções estão quentes antes de misturar para evitar gelificação. Encontramos gel a 1% adequado para a cultura do incisivo adulto de camundongos. A porcentagem de gel deve ser determinada empiricamente se outros tecidos forem cultivados.

2. Extração das mandíbulas de camundongos adultos

  1. Eutanasiar camundongos na idade desejada usando procedimentos padrão aprovados pela IACUC.
    OBS: Utilizamos asfixia por CO2 seguida de luxação cervical. Os regulamentos para a eutanásia animal podem variar em diferentes regiões. Os pesquisadores devem obter a aprovação institucional necessária antes de realizar experimentos e garantir o cumprimento das regulamentações locais de cuidados com os animais.
  2. Desinfetar o rato com etanol a 70%.
  3. Decapitar o rato e extrair as mandíbulas esquerda e direita.
    1. Coloque o mouse na barriga e, em seguida, use uma lâmina de barbear industrial de borda única #9 para cortar a região do pescoço e separar a cabeça do mouse do resto do corpo.
      NOTA: Se os tecidos da faringe ou da região do pescoço também forem coletados, a decapitação não deve ser realizada, podendo-se proceder diretamente ao passo 2.3.2.
    2. Vire o mouse para que seu lado ventral fique voltado para cima e as mandíbulas sejam facilmente acessíveis.
    3. Segure a cabeça do animal segurando-a suavemente entre o polegar e o indicador.
    4. Use a lâmina de barbear para fazer uma incisão sagital média que corta a pele da mandíbula inferior do lábio inferior em direção ao decote.
      NOTA: Uma lâmina cirúrgica #15 também pode ser usada para fazer a incisão e dissecções subsequentes (passos 2.3.6-2.3.9).
    5. À medida que a incisão é feita, abra a pele cortada usando o polegar e o indicador para expor os músculos e o osso maxilar por baixo.
    6. Use a lâmina de barbear para cortar os músculos masseteres no lado bucal da mandíbula inferior, de modo que a parte externa das hemimandíbulas esquerda e direita estejam agora livres de anexos musculares.
    7. Separe os músculos milo-hioideos ao longo da face interna da mandíbula para remover os anexos musculares lá.
    8. Faça outra incisão na sínfise mandibular que conecta as duas hemimandíbulas. Uma vez cortada, a mandíbula será separada nas metades esquerda e direita.
    9. Cunhar a lâmina de barbear entre o côndilo mandibular e a articulação temporal mandibular e dissecar cuidadosamente a hemimandíbula do restante da cabeça.
      NOTA: Achamos útil puxar suavemente o incisivo simultaneamente durante o corte. Deve-se tomar cuidado para evitar quebrar a mandíbula e danificar os tecidos moles internos.
  4. Transferir imediatamente as mandíbulas dissecadas para uma placa de Petri com o meio de dissecção pré-aquecido (passo 1.1) e remover os tecidos musculares remanescentes com uma lâmina cirúrgica #15.
    NOTA: Manter amostras em meios frios retarda as atividades celulares, resultando em recuperações atrasadas ou mesmo fracassadas de certas atividades celulares, como proliferação ou movimento celular, durante imagens ao vivo.

3. Isolamento de todos os incisivos de camundongos

NOTA: O isolamento adicional do incisivo é feito sob um microscópio de dissecção de campo brilhante.

  1. Identificar visualmente a região oval da mandíbula que recobre o alvéolo do incisivo e abriga a porção apical do incisivo.
  2. Posicione a mandíbula de forma que a superfície interna (lingual) fique voltada para cima.
  3. Ao segurar a mandíbula no lugar com um par de pinças serrilhadas, gere uma janela na região oval raspando o osso da membrana sobrejacente usando uma lâmina cirúrgica #15, em uma direção que é do côndilo em direção aos molares. Isso expõe o tecido mole do incisivo apical na superfície interna.
  4. Vire sobre a mandíbula para que a superfície externa (bucal) fique voltada para cima.
  5. Gere uma janela na região oval na mandíbula externa, conforme descrito no passo 3.3, e use a ponta do bisturi para retirar os fragmentos ósseos remanescentes na borda. Certifique-se de que a extremidade apical do dente é visível de ambos os lados.
    NOTA: Evite a pressão excessiva enquanto raspa os ossos para evitar danos ao tecido mole subjacente.
  6. Cortar sistematicamente os ossos ao redor do incisivo para isolar todo o dente.
    1. Faça um corte limpo em um plano imediatamente adjacente ao incisivo apical para primeiro remover o processo condilar.
      OBS: Cuidado para não cortar no incisivo.
    2. Faça um segundo corte logo posterior ao 3º molar, mas dorsal ao incisivo sem danificar o dente. Isso remove o osso que inclui o processo coronóide.
    3. Corte serialmente da ponta do processo angular em direção ao incisivo para remover gradualmente a mandíbula ventral de forma gradual.
      NOTA: O epitélio dentário e os tecidos periodontais associados são frequentemente presos ao osso e facilmente arrancados se uma grande parte do osso ventral for cortada de uma só vez. Para separar o osso do tecido mole do incisivo, pode-se inserir o bisturi (ou um par de pinças afiadas não serrilhadas) entre os dois tecidos na extremidade apical do incisivo e deslizar delicadamente o instrumento para frente.
    4. Cortar o osso alveolar com molares e quaisquer ossos remanescentes que ainda estejam aderidos ao incisivo.
    5. Todo o incisivo está agora isolado. Transferir o incisivo totalmente dissecado para uma placa com meio de dissecção limpo e quente (passo 1.1).
  7. Repita as etapas 3.2-3.6 para isolar incisivos adicionais, conforme necessário.
    OBS: Os incisivos superiores/superiores do camundongo também mantêm células-tronco adultas e podem ser utilizados no estudo da regeneração dentária34. Os pesquisadores em odontologia normalmente se concentram nos incisivos inferiores porque eles são mais acessíveis e podem ser mais facilmente dissecados do que os incisivos superiores. As diferenças entre as células progenitoras incisivos inferiores e superiores ainda precisam ser determinadas.

4. Remoção dos tecidos periodontais para exposição da alça epitelial epitelial incisiva

  1. Com todo o incisivo deitado em seu lado lingual e segurando o dente no lugar com um par de pinças serrilhadas, use um par de pinças finas #5 para começar a enfiar os tecidos periodontais que cobrem o incisivo apical e a região da alça cervical.
  2. Descascar cuidadosamente o tecido periodontal do broto apical, de modo que o lado lateral da alça cervical (ou outras regiões de interesse) se torne visível sob o escopo.
    OBS: Deve-se tomar cuidado para não danificar o epitélio dentário ou desprendê-lo do mesênquima. Se o incisivo tiver sinais de fluorescência na região de interesse, e um microscópio de dissecção fluorescente estiver disponível, sinais de fluorescência podem ser usados para ajudar a distinguir entre os tipos de tecido e auxiliar dissecções. É importante realizar eficientemente as secções 2-4 para que as amostras possam ser rapidamente transferidas para os meios de cultura e mantidas adequadamente através da cultura de explantes (ver abaixo).

5. Incorporação de tecidos para cultura de explantes

  1. Adicionar 500 μL de gel de cultura quente e não solidificado a um poço em uma placa de 24 poços e transferir rapidamente os incisivos inteiros dissecados para o poço. Rode a placa algumas vezes para enxaguar os incisivos.
  2. Adicione 400 μL de gel de cultura quente e não solidificado a uma placa de cultura e transfira os incisivos enxaguados para a placa.
    NOTA: Utilizamos uma placa de cultura disponível comercialmente que é compatível com a configuração de perfusão. Consulte a etapa 6.4 para obter opções alternativas.
  3. Orientar o incisivo para posicionar a região da alça cervical (ou outras regiões de interesse) no centro da placa (Figura 2A,B) e ajustar a inclinação do incisivo apical para o plano de imagem desejado.
    NOTA: A orientação tecidual deve ser feita rapidamente antes da gelificação completa.
  4. Depois que o gel for colocado, use um par de pinças finas para remover qualquer gel em cima da região de interesse para que ele não seja coberto por gel.
  5. Adicione um volume suficiente de meio de cultura quente, pipetando-o lentamente contra a borda do prato para cobrir apenas a amostra (~150 μL).
  6. Mover a cultura do explante para uma incubadora de cultura celular a 37 °C para permitir a fixação do tecido e o ajuste à condição de cultura durante 1 h.

6. Microscopia timelapse dos explantes dos incisivos

NOTA: Neste experimento, foi utilizado um microscópio vertical equipado com uma objetiva de imersão em água de 25x que tem uma abertura numérica de 1. Em geral, uma lente de imersão de água com uma alta abertura numérica é mais adequada para imagens de tecidos profundos.

  1. Ligue o microscópio e o laser de dois fótons.
  2. Fixe a placa de cultura no adaptador de palco e monte o anel adaptador de perfusão na parte superior (Figura 2C).
  3. Conecte o adaptador de estágio a um controlador de temperatura ajustado para manter a cultura a 37 °C.
  4. Conecte a entrada e a saída do anel adaptador a uma bomba de microperfusão e inicie a perfusão do meio de cultura, com a velocidade de perfusão fixada em 20 na bomba. Isso gera um fluxo lento (~5 mL/h) do meio de cultura sobre a parte superior das amostras (Figura 2C).
    NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre o sistema para manter o tecido em um ambiente controlado de forma estável. Outros sistemas também podem ser usados. Uma combinação de uma placa de aquecimento de 37 °C e um prato de cultura de perfusão caseiro (Figura Suplementar S1) com uma entrada e uma saída conectadas a bombas de seringa também pode ser usada.
  5. Coloque um Anel de Barreira de Controle Atmosférico (ACBR) sobre o anel adaptador e abaixe a objetiva através do ACBR para apenas fazer contato com o meio de cultura (Figura 2D).
  6. Ajuste o comprimento de onda do laser para 920 nm para visualizar sinais de fluorescência GFP e vermelha (por exemplo, tdTomato).
  7. Localize as amostras através de oculares e, em seguida, no software do microscópio.
  8. Configure pilhas Z, imagens de várias posições e intervalos de tempo usando o software. Para seguir este protocolo, use um tamanho de passo z de 4 μm e um intervalo de tempo de 5 min por 14 h.
    NOTA: Descobrimos que um intervalo de tempo superior a 5 min é frequentemente insuficiente para capturar movimentos e divisões celulares suaves.
  9. Inicie a imagem de timelapse.
    NOTA: A posição da amostra pode mudar durante a primeira hora e podem ser necessários ajustes adicionais.
  10. Salve arquivos para processamento e análises de dados a jusante.

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Representative Results

A região apical do incisivo adulto de camundongo está envolta dentro da mandíbula (Figura 1) e, portanto, não é diretamente acessível para visualização e rastreamento vivo das células progenitoras que residem na região de crescimento. Portanto, desenvolvemos um método para extrair todo o incisivo do osso maxilar e mantê-lo em um sistema de cultura de explantes para microscopia timelapse de dois fótons (Figura 2). Descrevemos resultados representativos que capturam o processo dinâmico de proliferação e movimentação celular na região da alça cervical labial do epitélio dentário.

Para demonstrar os procedimentos experimentais, utilizamos dois diferentes modelos murinos que expressam fluorescência verde no epitélio dental. A primeira linha de mouse é K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP, onde K14Cre (MGI:2680713) expressa a Cre recombinase a partir de um promotor de Queratina 1435 e ativa a expressão do transativador reverso controlado por tetraciclina no epitélio a partir do alelo R26rtTA 36 (MGI:3584524). Após a administração de doxiciclina, a rtTA induz a expressão da histona H2B-GFP a partir do alelo 37 tetO-H2B-GFP (MGI:3043783) e marca núcleos de células epiteliais com fluorescência verde. Isso é especialmente útil para rastreamento celular e para detectar divisões celulares. Neste experimento, os animais foram alimentados com ração doxiciclina por 24 h antes do sacrifício para ativar a expressão de H2B-GFP. A segunda linha de mouse é K14Cre; R26mT/mG, em que R26mT/mG (MGI:3803814) é um Cre-repórter38. Na ausência de atividade Cre, as células expressam tdTomato (mT) localizado na membrana com fluorescência vermelha. Na recombinação cremediada, as células expressam GFP de membrana (mG). K14 Cre; R26mT/mG assim marca as membranas celulares epiteliais com fluorescência verde, deixando as células não epiteliais vermelhas. Isso permite fácil visualização de formas, divisões e movimentos das células.

Iniciamos o procedimento dissecando as mandíbulas (Figura 3A) e, em seguida, retiramos sistematicamente todos os ossos ao redor do incisivo (Figura 3B-G). Isso resultou em incisivos inteiros com epitélio íntegro (Figura 3H). Confirmamos a integridade do epitélio dentário inspecionando a fluorescência verde no K14 Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP e K14Cre; Camundongos R26mT/mG (Figura 4A,B,E,F). Nesse estágio, os tecidos periodontais opacos ainda recobrem o incisivo apical, e a alça cervical parece embaçada devido ao espalhamento de luz, o que também dificultaria a obtenção de imagens por timelapse a jusante (Figura 4C,G). Portanto, removemos cuidadosamente os tecidos periodontais, para que o epitélio dentário com alça cervical pudesse ser discernido em cada incisivo (Figura 4D,H).

Os incisivos foram então incluídos em agarose de baixo ponto fundido e cultivados em um arranjo de perfusão para imagens ao vivo de dois fótons, como mostrado na Figura 2. Para este exercício, focamos na região da alça cervical do epitélio dental e capturamos imagens z-stack em intervalos de 4 μm a cada 5 min durante uma duração de 14 h (Figura 5A). Notadamente, os sinais de H2B-GFP foram observados principalmente na região de amplificação do trânsito da alça cervical, onde há divisões celulares ativas (Figura 5B). Isso provavelmente ocorre porque há maior troca H2B-GFP em cromatinas abertas e incorporação em nucleossomos após replicações de DNA nessas células ativas39.

Posteriormente, examinamos as imagens de timelapse usando ImageJ e, com base na separação dos sinais H2B-GFP40, pudemos observar numerosas divisões celulares ao longo do período de aquisição de imagens (Supplemental Video S1 e Supplemental Video S2). Isso indicou que os tecidos foram mantidos adequadamente na cultura do explante e as células estavam ativas. Especificamente, pudemos observar a condensação e o alinhamento dos cromossomos na placa metafásica em células mitóticas, seguido de sua segregação em duas células-filhas durante a anáfase (Figura 5C-N, rastreada manualmente usando o plugin TrackMate do ImageJ). A maioria dessas divisões era perpendicular ou em ângulo oblíquo em relação à membrana basal (Figura 5C-K e Vídeo SuplementarS 1). Divisões horizontais paralelas à membrana basal também puderam ser detectadas, embora ocorram com menor frequência (Figura 5L-N e Vídeo SuplementarS 2). É importante ressaltar que a citocinese no epitélio dentário geralmente ocorre rapidamente, dentro de 5-10 min. Como resultado, intervalos de timelapse de mais de 5 min podem perder algumas dessas divisões.

Eventos de divisão celular também foram aparentes em K14Cre; Alças cervicais R26mT/mG, onde todas as membranas celulares epiteliais foram marcadas como verdes (Figura 6A). Foi possível identificar células mitóticas pelo arredondamento celular e, em seguida, citocinese (Vídeo Suplementar S3), observando-se divisões celulares verticais e horizontais (Figura 6B-G), semelhantes aos resultados obtidos com H2B-GFP. Em conjunto, esses resultados demonstram que este protocolo pode servir como uma poderosa ferramenta para investigar o comportamento celular nos explantes dos incisivos quando combinado com modelos genéticos de camundongos que marcam fluorescentemente estruturas subcelulares distintas.

Figure 1
Figura 1: Esquema da mandíbula do camundongo e alça cervical do incisivo. (A) Uma porção significativa do incisivo está embutida no osso maxilar. A região de crescimento localiza-se na extremidade apical do dente e suporta seu crescimento contínuo (seta verde-escura). (B) Aumento do incisivo apical, que é circundado por tecidos periodontais. O dente é composto por esmalte e dentina, que são estruturas altamente mineralizadas formadas por ameloblastos e odontoblastos, respectivamente. (C) Corte sagital do incisivo apical, mostrando que as células progenitoras epiteliais dentárias e as células amplificadoras do trânsito residem na alça cervical labial e dão origem a ameloblastos no epitélio mais distal (seta tracejada verde-escura). Comparada à alça cervical labial, a alça cervical lingual é menor em tamanho e normalmente não forma ameloblastos. As células-tronco mesenquimais dentárias estão presentes na polpa dentária (região roxa) e dão origem aos odontoblastos. Abreviações: En = esmalte; De = dentina; Am = ameloblasto; Od = odontoblasto; TACs = células amplificadoras de trânsito; laCL = alça cervical labial; liCL = alça cervical lingual. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Manutenção do explante do incisivo do camundongo para imagens ao vivo. (A) Esquemas descrevendo as principais etapas do protocolo, desde a dissecação do incisivo até a incorporação do tecido em agarose de baixo ponto de fusão para imagens ao vivo. Um arranjo de perfusão é usado para fornecer um suprimento constante de nutrientes durante a aquisição de imagens e a cultura é mantida a 37 °C. (B-D) Uma demonstração passo a passo do ajuste da placa de cultura e da câmara de perfusão para imagens ao vivo. A entrada e a saída de mídia são mostradas como setas rosa e amarela, respectivamente. Abreviação: ACBR = Atmospheric Control Barrier Ring. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Isolamento de todo o incisivo do camundongo. (A) Mandíbula intacta. (B-H) Os ossos foram gradualmente removidos para expor todo o incisivo. Linhas tracejadas vermelhas em B e C mostram o tecido mole exposto do incisivo apical após raspagem do osso da membrana que recobre os lados lingual e bucal do alvéolo do incisivo (passos 3.3-3.5 no protocolo). (D-G) As pontas de seta azuis representam os côndilos, molares e ossos alveolares que foram removidos para isolar todo o dente (passo 3.6 do protocolo). Barra de escala = 2 mm (H). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Remoção dos tecidos periodontais para imagens ao vivo. (A-H) Amostras representativas de (A-D) K14Cre; R26rtTA; tetO-H2B-GFP e (E-H) K14Cre; Camundongos R26mT/mGforam utilizados em nossa demonstração do protocolo. Antes da dissecção, a expressão de GFP no epitélio dentário era visível através do osso (A,E, cabeças de setas amarelas). Linhas tracejadas brancas delineiam os incisivos não dissecados. E' mostra o lado lingual. Nos incisivos isolados (B,C,F,G), a fluorescência da GFP foi inicialmente difratada pelos tecidos periodontais que recobrem os incisivos apicais (cabeças de setas brancas e vermelhas). A fluorescência vermelha em F e G marca células não epiteliais. A remoção dos tecidos periodontais permite uma visão clara e desobstruída das alças cervicais fluorescentes verdes (D,H, cabeças de setas verdes). Barra de escala = 2 mm (A,E); 1,25 mm (B,F); e 300 μm (C,D,G,H). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Microscopia de timelapse do K14Cre; R26rtTA; alça cervical tetO-H2B-GFP. (A) Um esquema ilustrando a configuração do timelapse. (B) Um plano z representativo do K14Cre; R26rtTA; alça cervical incisiva do incisivo tetO-H2B-GFP, mostrando marcação nuclear por H2B-GFP principalmente na região de amplificação do trânsito, onde as células se dividem ativamente. A caixa amarela representa a área geral das imagens ampliadas mostradas abaixo. (C-K) Imagens de timelapse mostrando divisões celulares verticais e oblíquas em relação à MO (L-N) Imagens de timelapse mostram um exemplo de divisão celular horizontal em relação à MO. (D,G,J,M) As células em metáfase ou anáfase são exibidas nos painéis do meio. Os esquemas de cada divisão rastreada são mostrados à direita. Barra de escala em N = 36 μm (B); 5 μm (C-N). Abreviação: BM = membrana basal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Microscopia de timelapse do K14Cre; R26mT/mG alça cervical. A) Um plano z representativo do K14Cre; Alça labial incisiva R26mT/mG. Todas as células epiteliais expressam GFP de membrana. A caixa amarela representa a área de rastreamento de células mostrada nas ampliações. (B-G) Imagens de timelapse capturando as divisões celulares horizontais e verticais (E-G) em relação ao BM. Os esquemas de cada divisão rastreada são mostrados à direita. Barra de escala = 35 μm (A); 5 μm (B-G). Abreviação: BM = membrana basal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar S1: Placa de perfusão feita em casa. (A) Uma placa de cultura de 35 mm pode ser usada para fazer uma placa de perfusão. Uma placa de fundo de vidro pode ser usada se a imagem for realizada usando um microscópio invertido. (B) Aqueça um prego com uma chama. (C) Duas aberturas (pontas de seta brancas) são criadas em cada lado do prato usando o prego aquecido. (D) Afixar duas agulhas rombas de 16 G, uma como entrada de mídia e outra como meio de comunicação, através das aberturas com cola epóxi. Se a perfusão gasosa for desejada, uma terceira abertura/agulha pode ser adicionada ao prato. Clique aqui para baixar este arquivo.

Vídeo Suplementar S1: Imagem ao vivo de um K14Cre; R26rtTA; alça cervical incisiva tetO-H2B-GFP incisiva, mostrando divisões celulares verticais e oblíquas. As células são rastreadas manualmente e pontos coloridos diferentes representam diferentes pares de células mãe/filha. Barra de escala = 30 μm (quadro esquerdo); 7 μm (moldura direita). Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo Suplementar S2: Imagem ao vivo de um K14Cre; R26rtTA; alça cervical incisiva tetO-H2B-GFP , mostrando um exemplo de divisão celular horizontal. A divisão horizontal ocorre na marca de 10 s e é rastreada manualmente usando pontos azuis. Barra de escala = 30 μm (quadro esquerdo); 7 μm (moldura direita). Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo Suplementar S3: Imagem ao vivo de um K14Cre; Alça labial incisiva R26mT/mG , mostrando divisões celulares verticais e horizontais. As células são rastreadas manualmente e diferentes círculos coloridos representam diferentes pares de células mãe/filha. Barra de escala = 30 μm (quadro esquerdo); 7 μm (moldura direita). Clique aqui para baixar este vídeo.

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Discussion

A imagem de tecidos vivos é uma importante técnica que permite estudar os processos dinâmicos e comportamentos das células quando mantidas em seu ambiente de nicho41. Idealmente, imagens ao vivo são realizadas in vivo com alta resolução espaço-temporal. No entanto, a obtenção de imagens in vivo para órgãos de mamíferos pode ser desafiadora devido à inacessibilidade tecidual, opacidade óptica e dificuldade de imobilização do animal ou do órgão por um período prolongado42. Os explantes teciduais superam alguns desses desafios e têm sido adotados com sucesso em uma série de estudos para rastrear o comportamento celular, como durante a morfogênese dentária e o desenvolvimento de órgãos ectodérmicos26. Aqui, demonstramos um protocolo relativamente simples, mas robusto, para realizar imagens de tecidos profundos vivos em incisivos adultos inteiros cultivados. A aplicação desta técnica nos ajudará a entender a regulação dos movimentos celulares, decisões de destino e organização tecidual durante a regeneração dentária.

Como as divisões celulares são eventos facilmente observáveis e característicos de tecidos em regeneração, nos concentramos em rastrear células em divisão neste estudo para destacar um uso do protocolo. Observamos que os progenitores epiteliais incisivos podem sofrer divisões verticais e horizontais, de forma semelhante a outros tecidosepiteliais43. Elucidar o mecanismo que regula os ângulos de divisão e investigar o papel das orientações de divisão nas decisões de destino celular será de importância em estudos futuros. A combinação de imagens ao vivo com diferentes modelos genéticos de camundongos que também carregam marcadores fluorescentes de destino celular, repórteres de vias de sinalização ou o repórter de ciclo celular de Fucci44,45 ajudará a desvendar como os padrões de divisão celular e a dinâmica do ciclo celular contribuem para a regulação da homeostase e regeneração epitelial.

Uma prática necessária neste protocolo é realizar a dissecção dentária de forma célere e cuidadosa, permitindo rápida transição e preservação do tecido intacto sob a condição de cultura adequada. Descobrimos que, para imagens vivas, dissecar tecidos em meios quentes, em vez de meios frios, como em experimentos destinados a extrair proteínas e mRNAs46, mantém as células em um estado funcional. Como o incisivo é um órgão relativamente grande para cultura, um suprimento constante de nutrientes via perfusão de meios também é crítico para a sustentação do tecido ao longo da imagem47. Se as células progenitoras estão presentes na região de interesse, a observação de divisões celulares frequentes é um bom indicador de que o tecido está saudável e ativo. Em contraste, a morte celular deve ser infrequente, e isso pode ser verificado pela detecção de corpos nucleares brilhantes e condensados durante a aquisição de imagens se um marcador nuclear for usado ou pela coloração TUNEL após exames de imagem e fixação tecidual48. Além dos nutrientes, os níveis de oxigênio também podem afetar a viabilidade dos explantes, pois tanto a tensão quanto a insuficiência de oxigênio podem interromper a sobrevivência, proliferação e diferenciação celular 49,50,51. Em nossa experiência, não observamos diferenças aparentes na proliferação celular e morte celular quando as amostras receberam ou sem oxigênio adicional (por exemplo, 95% O2/5% CO2 carbogênio ou 5% CO2/21% O2/N balanceado 2) durante a aquisição de imagens, sugerindo que a quantidade traço de oxigênio no sistema é suficiente para manter o epitélio do incisivo em cultura durante a noite ou o tecido pode empregar vias alternativas para manter as funções celulares normais52. No entanto, a necessidade de oxigênio em outros processos celulares ou a expressão gênica correta devem ser mais bem determinadas em estudos futuros.

Em nossa demonstração do protocolo, usamos H2B-GFP e GFP de membrana codificadas geneticamente para marcar núcleos e contornos celulares, respectivamente. Esses marcadores fluorescentes são brilhantes e de longa duração sob microscopia de dois fótons e, portanto, são exemplos de rótulos ideais para usar para rastrear movimentos e divisões celulares. Em teoria, corantes vitais fluorescentes também podem ser usados para marcar diferentes compartimentos subcelulares para imagens vivas ex vivo 53, mas a penetração reduzida dos corantes em células epiteliais mais profundas provavelmente limita seu uso. Da mesma forma, enquanto a microscopia confocal padrão é capaz de obter imagens ao vivo de alta resolução a uma profundidade inferior a 100 μm, a microscopia de dois fótons fornece maior profundidade de imagem com redução do fotoclareamento e da fototoxicidade54. Portanto, escolhemos a microscopia de dois fótons como uma modalidade de imagem na maioria de nossas aplicações de imagem ao vivo.

Uma potencial limitação deste protocolo é que os explantes incisivos podem não recapitular completamente o ambiente in vivo e a biologia. Os dados, portanto, representam o comportamento celular sob a condição de cultura e devem ser interpretados de acordo, bem como validados usando outros métodos, como histologia, quando aplicável. Também tivemos que remover parcialmente os tecidos periodontais para ter acesso à alça cervical para exames de imagem. As interações de sinalização entre os tecidos periodontais e o epitélio dentário poderiam, assim, ser interrompidas. Por fim, embora a perfusão dos meios melhore muito a viabilidade dos tecidos cultivados, ela poderia introduzir tensões de cisalhamento fluidas que atuam como um sinal mecânico ectópico e afetam os resultados55,56. Não determinamos o impacto de diferentes vazões em nossa configuração. No entanto, como uma baixa vazão de 1-5 mL/h é tipicamente suficiente para manter o suprimento de nutrientes57, o efeito da tensão de cisalhamento pode ser minimizado. Com essas limitações em mente, a imagem ao vivo ex vivo serve como uma plataforma poderosa para estudar mudanças no comportamento celular quando os controles apropriados são incluídos em experimentos.

O incisivo de camundongo em crescimento contínuo é um sistema modelo altamente tratável para estudar a renovação tecidual baseada em células-tronco e o reparo de lesões. O protocolo aqui descrito fornece aos investigadores os meios para manter incisivos adultos inteiros em cultura e extrair informações espaço-temporais sobre o comportamento celular através da microscopia de lapso de tempo. Esperamos que esta técnica seja amplamente aplicável ao estudo de diferentes modelos genéticos de camundongos usados em pesquisas odontológicas e ajude a avançar nosso conhecimento no campo da regeneração dentária.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Acknowledgments

Agradecemos ao Laboratório de Microscopia/Espectroscopia de Luz Avançada da UCLA e ao Centro de Excelência da Leica Microsystems no California NanoSystems Institute (RRID:SCR_022789) pelo fornecimento de microscopia de dois fótons. O AS foi apoiado pelo ISF 604-21 da Israel Science Foundation. A HA foi apoiada por R03DE030205 e R01DE030471 do NIH/NIDCR. AS e JH também foram apoiados por 2021007 de subsídios da Fundação Binacional de Ciência Estados Unidos-Israel (BSF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well, flat bottom tissue culture plate Olympus plastics 25-107
25x HC IRAPO motCORR water dipping objective Leica 11507704
Ascorbic acid (Vitamin C) Acros Organics 352685000
D-(+)-Glucose bioxtra  Sigma Aldrich G7528
Delta T system  Bioptechs 0420-4 Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup
Dissection microscope- LEICA S9E Leica LED300 SLI
DMEM/F12 Thermo Scientific 11039047 Basal media without phenol red
Feather surgical blade (#15) Feather 72044-15
Fine forceps F.S.T 11252-23
Glutamax  Thermo Scientific 35050-061 Glutamine substitute
Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective  Leica n/a
low-melting agarose NuSieve 50080
non-essential amino acids (100x) Thermo Scientific 11140-050
penicillin–streptomycin Thermo Scientific 15140122 10,000 U/mL 
Petri dish Gen Clone 32-107G 90 mm 
Rat serum Valley Biomedical AS3061SC Processed for live imaging
Razor blade #9 VWR 55411-050
Scalpel handle F.S.T 10003-12
Scissors F.S.T 37133
serrated forceps F.S.T 11000-13
spring scissors F.S.T 91500-09

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References

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Usando imagens ao vivo <em>ex vivo</em> para investigar divisões celulares e movimentos durante a renovação dentária de camundongos
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Sundari Thooyamani, A., Shahin, E., Takano, S., Sharir, A., Hu, J. K. Using Ex Vivo Live Imaging to Investigate Cell Divisions and Movements During Mouse Dental Renewal. J. Vis. Exp. (200), e66020, doi:10.3791/66020 (2023).

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