Summary
이 프로토콜은 나비목 곤충 유충에 대한 식물 화학 물질의 잠재적 독성 효과를 평가하기 위한 의무 섭식 분석을 설명합니다. 이것은 확장성이 뛰어난 곤충 생물 검정으로 치사 및 치사 용량, 억제 활동 및 생리학적 효과를 쉽게 최적화할 수 있습니다. 이것은 친환경 살충제를 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
나비목 곤충인 Helicoverpa armigera는 전 세계에 분포하는 다식성 해충입니다. 이 초식성 곤충은 식물과 농업 생산성에 위협이 됩니다. 이에 대응하여 식물은 곤충의 성장과 생존에 부정적인 영향을 미치는 여러 가지 식물 화학 물질을 생산합니다. 이 프로토콜은 곤충의 성장, 발달 및 생존에 대한 식물 화학 물질(퀘르세틴)의 영향을 평가하기 위한 의무 섭식 분석 방법을 보여줍니다. 통제된 조건 하에서, 신생아들은 미리 정의된 인공 식단으로 두 번째 인스타까지 유지되었다. 이 두 번째 인스타 유충은 10일 동안 대조군과 퀘르세틴이 함유된 인공 식단을 먹도록 허용되었습니다. 곤충의 체중, 발달 단계, 프라스 체중 및 사망률은 격일로 기록되었습니다. 체중의 변화, 섭식 패턴의 차이 및 발달 표현형은 분석 시간 동안 평가되었습니다. 설명된 필수 섭식 분석은 자연적인 섭취 모드를 시뮬레이션하며 많은 수의 곤충으로 확장할 수 있습니다. 이를 통해 H. armigera의 성장 역학, 발달 전환 및 전반적인 적합성에 대한 식물 화학 물질의 영향을 분석할 수 있습니다. 또한 이 설정은 영양 매개변수 및 소화 생리학 과정의 변화를 평가하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 기사에서는 독성 연구, 살충 분자 스크리닝 및 식물-곤충 상호 작용의 화학적 영향 이해에 적용할 수 있는 사료 분석 시스템에 대한 자세한 방법론을 제공합니다.
Introduction
작물 생산성에 영향을 미치는 생물적 요인은 주로 병원체와 해충입니다. 여러 해충은 농작물 손실의 15%에서 35%를 유발하고 경제적 지속 가능성 관행에 영향을 미칩니다1. 딱정벌레목(Coleoptera), 반구목(Hemiptera), 나비목(Lepidoptera)에 속하는 곤충은 파괴적인 해충의 주요 목입니다. 환경의 고도의 적응력은 나비목이 여러 생존 메커니즘을 진화시키는 데 도움이 되었습니다. 나비목(lepidopteran) 곤충 중 헬리코베파 아미게라(Helicoverpa armigera)는 약 180종의 작물을 먹고 생식 조직에 심각한 손상을 입힐 수 있다2. 전 세계적으로 H. armigera 감염으로 인해 약 50억 달러의 손실이 발생했습니다3. 목화, 병아리콩, 비둘기 완두콩, 토마토, 해바라기 및 기타 작물은 H. armigera의 숙주입니다. 호스트 식물의 여러 부분에서 수명 주기를 완료합니다. 암컷 나방이 낳은 알은 잎에서 부화한 다음 유충 단계에서 식물 조직을 먹습니다. 유충 단계는 탐욕스럽고 적응력이 뛰어나기 때문에 가장 파괴적입니다 4,5. H. armigera는 다식성, 뛰어난 이동 능력, 높은 번식력, 강한 분열, 기존 곤충 방제 전략에 대한 저항력의 출현과 같은 놀라운 특성으로 인해 전 세계적으로 분포하고 새로운 영역에 대한 잠식을 보여줍니다6.
테르펜, 플라보노이드, 알칼로이드, 폴리페놀, 시아노겐 글루코시드 등 다양한 화학 분자가 H. armigera 감염 방제에 널리 사용된다7. 그러나 화학 분자를 자주 적용하면 잔류물이 획득되어 환경과 인체 건강에 악영향을 미칩니다. 또한 다양한 해충 포식자에게 해로운 영향을 미쳐 생태 불균형을 초래합니다 8,9. 따라서 해충 방제의 화학 분자에 대한 안전하고 친환경적인 옵션을 조사할 필요가 있습니다.
식물에서 생산되는 천연 살충 분자(파이토케미컬)는 화학 살충제의 유망한 대안으로 사용될 수 있습니다. 이러한 식물 화학 물질에는 알칼로이드, 테르 페 노이드 및 페놀 7,10 클래스에 속하는 다양한 2 차 대사 산물이 포함됩니다. 퀘르세틴은 다양한 곡물, 채소, 과일 및 잎에 존재하는 가장 풍부한 플라보노이드(페놀 화합물) 중 하나입니다. 그것은 곤충에 대한 먹이 억제 및 살충 활동을 보여줍니다. 또한 해충11,12의 천적에게 해롭지 않습니다. 따라서 이 프로토콜은 H. armigera에 대한 독성 효과를 평가하기 위해 퀘르세틴을 사용한 수유 분석을 보여줍니다.
곤충의 섭식, 성장, 발달 및 행동 패턴에 대한 천연 및 합성 분자의 영향을 평가하기 위해 다양한 생물학적 분석 방법이 개발되었습니다13. 일반적으로 사용되는 방법에는 잎 디스크 분석, 선택 공급 분석, 액적 공급 분석, 접촉 분석, 다이어트 커버링 분석 및 의무 공급 분석13,14가 포함됩니다. 이러한 방법은 살충제가 곤충에 적용되는 방식에 따라 분류됩니다. 의무 섭식 분석법은 가능한 살충제와 그 치사량을 시험하기 위해 가장 일반적으로 사용되고, 민감하고, 간단하고, 적응 가능한 방법 중 하나이다14. 의무 섭식 분석에서 관심 분자는 인공 식단과 혼합됩니다. 이것은 식단 구성에 대한 일관성과 제어를 제공하여 강력하고 재현 가능한 결과를 생성합니다. 사료 분석에 영향을 미치는 중요한 변수는 곤충의 발달 단계, 살충제 선택, 환경 요인 및 샘플 크기입니다. 분석 기간, 두 데이터 기록 사이의 간격, 먹이는 사료의 빈도 및 양, 곤충의 건강 및 작업자의 취급 기술 또한 먹이 분석의 결과에 영향을 미칠 수 있습니다14,15.
이 연구는 H. armigera 생존 및 체력에 대한 퀘르세틴의 효과를 평가하기 위한 의무 섭식 분석을 입증하는 것을 목표로 합니다. 곤충 체중, 사망률 및 발달 결함과 같은 다양한 매개변수의 평가는 퀘르세틴의 살충 효과에 대한 통찰력을 제공합니다. 한편, 섭취된 음식의 전환 효율(ECI), 소화된 음식의 전환 효율(ECD) 및 대략적인 소화율(AD)을 포함한 영양 매개변수를 측정하면 퀘르세틴의 항수유 특성이 강조됩니다.
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Protocol
H. armigera 유충은 인도 방갈로르에 있는 ICAR-National Bureau of Agricultural Insect Resources(NBAIR)에서 획득했습니다. 본 연구에는 총 21초의 인스타 유충이 사용되었다.
1. 병아리콩 기반 인공 식단 준비
참고: 인공 식단을 준비하는 데 필요한 성분 목록은 표 1에 언급되어 있습니다.
- 표 1에 나열된 대로 비커에서 모든 분획을 개별적으로 칭량하고 주걱/자석 교반기를 사용하여 균질한 혼합물을 준비합니다.
- 분획 C를 약 100°C에서 전자레인지를 사용하여 5분 동안 끓인 후 분획 A에 넣고 잘 섞습니다.
- 완전히 혼합한 후 혼합 분획을 약간 식힌 후 분획 B를 추가합니다(분획 B에는 열 불안정성 성분이 포함되어 있음).
- 투명한 폴리스티렌 150mm x 150mm 페트리 접시에 붓습니다.
2. 퀘르세틴 함유 인공 식단의 준비
- 적절한 양(1,000ppm)의 퀘르세틴 수화물( 재료 표 참조)을 칭량하고 에탄올(2mg/mL), 디메틸 설폭사이드(DMSO, 30mg/mL) 또는 디메틸 포름아미드(DMF)와 같은 최소 부피의 유기 용매에 적절하게 용해시킵니다. 여기서, DMSO는 퀘르세틴을 용해시키는 데 사용된다.
- 용해된 퀘르세틴을 분획 B에 첨가한 다음 분획 A와 C의 혼합물에 첨가합니다(분획 B에서 감소된 물의 부피는 첨가된 DMSO의 부피와 동일).
- 퀘르세틴을 용해하는 데 사용되는 동일한 양의 유기 용매를 대조 식단에 첨가하십시오.
참고: 그림 1 은 인공 및 퀘르세틴 함유 식단을 준비하는 개략도를 보여줍니다.
3. H. armigera 배양물의 사육 및 유지
알림: 곤충 사육 및 유지 관리를 위해 적절하게 세척 및 멸균된 재료를 사용하십시오. 모든 멸균 및 안전 관련 표준 운영 관행 16,17,18에 따라 곤충을 조심스럽게 다루십시오.
- H. armigera 알을 번식실(모슬린 천으로 덮인 플라스틱 병)에 3.3단계에 설명된 대로 상태를 유지하여 보관합니다. 그런 다음 갓 태어난 신생아를 갓 준비한 병아리콩 기반 인공 사료에 가는 붓을 사용하여 부드럽게 옮깁니다.
- 유충을 기르기 위해 인공 식단을 사용하고 성인 나방의 경우 20 % (w / v) 종합 비타민이 함유 된 1 % (w / v) 자당 용액 (재료 표 참조)을 사용하십시오19,20.
참고: H. armigera 의 세 번째 이상 인스타 유충은 식인 경향을 보이기 때문에 각 유충을 별도의 유리병에 보관해야 합니다. - 곤충 배양실에서 온도를 25± 1°C, 상대습도를 70%로 유지하고, 16시간 광주기:8시간 어두운 광주기21.
- 균질성을 위해 실험실에서 한 세대의 곤충을 사육한 다음 먹이 분석에 사용합니다.
- 선택적으로 곤충 배양실의 온도를 28°C로 높여 유충과 번데기22의 성장 속도를 높입니다.
4. 공급 분석을 위한 설정
- 각 세트(대조군 및 치료)에 대해 21초 인스타 유충을 수집하고 약 1-3시간 동안 식단에서 멀리 유지합니다.
- 대조군과 퀘르세틴 함유 사료를 작은 조각으로 자르고 주어진 사료의 무게와 곤충의 몸을 기록하고 곤충을 배양 바이알에 조심스럽게 옮깁니다. 곤충이 각각의 식단을 먹도록 하십시오.
알림: 이것은 수유 분석의 0일로 간주되어야 합니다. - 곤충 몸의 무게, 주어진 식단, 먹지 않은 식단 및 frass를 분석 10일째까지 격일(2, 4, 6, 8, 10일)에 기록합니다.
- 10일째 이후에는 각각의 식단을 계속 먹으면서 추가적인 발달 및 형태학적 변화를 관찰합니다.
참고 : 발달 변화 : (1) 유충 큐티클 패치가있는 번데기의 뒤쪽 반쪽 몸체, 머리 캡슐 및 흉부 다리와 같은 유충-번데기 중간체; (2) 몸이 완전히 검게 변한 번데기; (3) 몸 수축이 있는 크기가 작은 번데기; (4) 번데기 나방 중간체 - 오래된 번데기 피부를 가진 나방. 형태학적 변화에는 비정상적인 몸, 뒤틀린 날개, 관절이 있는 다리를 가진 기형 나방 성충이 포함됩니다. 그런 다음 이러한 변화를 대조 식단을 먹은 곤충과 비교합니다. - 발달 및 형태학적 결함에 대한 연구가 필요하지 않은 경우 10일째에 곤충을 동결합니다.
알림: 유충을 얼리기 전에 소화관에서 잔류 식단을 제거하기 위해 최소 3시간 동안 식단을 박탈해야 합니다.
5. 데이터 기록 및 분석
- GraphPad Prism 소프트웨어( 재료 테이블 참조)의 "시작 또는 새 테이블" 대화상자에서 XY 데이터 테이블을 선택하고 해당 하위 열에 값을 나란히 반복하는 곤충 수를 입력합니다. 그런 다음 X축에 제목 이름을 일 수로 지정하고 그룹 A와 B에서 각각 대조군 과 퀘르세틴 처리로 제목 이름을 지정합니다. 각 곤충의 체중을 통제하고 처리하여 체중 그래프를 생성합니다.
참고: GraphPad에서의 분석은 표본 크기와 처리 횟수에 따라 달라질 수 있습니다. - 학생 t-검정(α = 0.05)을 사용하여 대조군과 치료군 간의 곤충 체중을 비교합니다.
- 10일째에 살아 있는 유충과 죽은 유충과 번데기를 세어 그래프 소프트웨어를 사용하여 생존율에 대한 Kaplan-Meier 곡선을 그립니다.
- 번데기의 수를 세고 주어진 공식을 사용하여 번데기의 백분율을 계산하십시오.
- 번데기 비율(%) = (형성된 번데기 수/총 유충 수) x 100
- 다음 공식을 사용하여 영양 지수23 측면에서 유충 발달을 비교합니다. ECI (%) = (유충의 체중 증가 / 먹은 사료의 무게) x 100
ECD(%) = (유충의 체중 증가/[먹은 사료의 무게 - 배설물의 무게]) x 100
AD (%) = ([먹은 사료의 무게 - 프래스의 무게]/먹은 사료의 무게) x 100
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Representative Results
1,000ppm의 퀘르세틴을 함유한 식단을 먹은 곤충 유충은 대조군에 비해 체중이 ~57% 크게 감소했습니다(그림 2A). 체중의 감소는 퀘르세틴으로 처리된 유충의 몸 크기를 감소시키는 결과를 가져왔다(그림 2B). 대조군에 비해 퀘르세틴을 먹인 유충의 섭식 속도가 눈에 띄게 감소하는 것이 관찰되었습니다(그림 2C).
또한 퀘르세틴을 먹은 유충은 번데기 비율이 ~14% 감소하고 번데기가 지연되어 치료 시 발달 지연을 시사합니다(그림 3A,B). 또한, 생존 및 치명적인 표현형의 ~ 77.65 %가 퀘르세틴 함유 식단을 먹은 곤충 유충에서 관찰되었습니다 (그림 4A, B). 영양 매개변수는 사료의 소비 및 활용을 기반으로 대조군 및 퀘르세틴 사료 유충에 대해 계산되었습니다(보충표 1). 1,000ppm 퀘르세틴 함유 식단을 먹인 곤충에 대한 체질에 대한 ECI와 ECD는 각각 ~9% 및 ~49% 감소했습니다. ECD의 감소는 곤충체(20)에서 이용 가능한 대사 산물의 부족에 기인할 수 있다. 퀘르세틴을 먹인 곤충의 AD는 대조군에 비해 ~5% 증가했습니다(표 2). 전반적으로, 얻어진 결과는 퀘르세틴이 곤충의 성장과 H. armigera 의 발달에 상당한 부정적인 영향을 미친다는 것을 나타냅니다.
그림 1: 인공 식단 및 퀘르세틴 함유 식단 준비의 개략도. 분획 A, B, C를 혼합하여 인공 및 퀘르세틴 함유 식단을 만듭니다. 유충은 10 일 동안 각각의 식단을 먹습니다. 파란색 과정 화살표는 인공 식단을 나타내고 빨간색 과정 화살표는 퀘르세틴 함유 식단의 준비를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 퀘르세틴 공급 분석의 대표 데이터. (A) 2일, 4일, 6일, 8일, 10일에 대조군과 비교하여 1,000ppm 퀘르세틴을 먹인 후 H. armigera 유충의 체중 그래프. 유충의 체중은 밀리그램(mg) 단위입니다. (B) 유충의 평균 크기는 10일에 기록됩니다. 눈금 막대 = 1cm. (C) 2일, 4일, 6일, 8일, 10일에 기록된 평균 수유 속도. 사료의 무게는 밀리그램(mg) 단위입니다. 파란색 원과 빨간색 사각형은 각각 대조군과 퀘르세틴 처리된 곤충의 평균 데이터를 번갈아 가며 나타냅니다. 스튜던트 t-검정은 두 그룹(쌍)을 비교하는 데 사용됩니다. 데이터는 평균 ± SEM을 나타냅니다(n = 21초 인스타 유충, *p < 0.05는 통계적으로 유의함을 나타냄). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 먹이 분석에서 번데기에 대한 대표 데이터. (A) 번데기 그래프의 백분율. (B) 퀘르세틴 처리에서 번데기 발생률이 지연되고 감소한 것을 보여주는 번데기 이미지(15일차). 축척 막대 = 1cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 대조군과 비교하여 1,000ppm 퀘르세틴을 먹였을 때의 10일째 생존율에 대한 대표적인 데이터. (A) 퀘르세틴을 먹인 곤충에 대한 Kaplan-Meier 생존 그래프는 생존율 감소를 나타냅니다. 대조군 곤충은 ~96%의 생존율을 보이고 퀘르세틴 처리된 곤충은 ~77.65%의 생존율을 보입니다. (B) 10일째에 촬영한 퀘르세틴 유충의 치명적인 표현형 이미지. 축척 막대 = 1cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 분수 A | ||
| 1 | 벵골 그램 | 50 그램 |
| 2 | 효모 추출물 | 12 지 |
| 3 | 카제인 | 3.5 지 |
| 4 | 소르빈산(Sorbic Acid) | 0.5 지 |
| 5 | 메틸 파라벤 | 1 지 |
| 6 | dH2O | 150 mL |
| 분수 B | ||
| 1 | 콜린 클로라이드 | 0.35 지 |
| 2 | 스트렙토마이신 | 0.02 지 |
| 3 | 아스코르브산 | 2 지 |
| 4 | 콜레스테롤 | 0.15 지 |
| 5 | 종합 비타민 캡슐 | 1 |
| 6 | 비타민 E 캡슐 | 1 |
| 7 | dH2O | 30 mL |
| 분수 C | ||
| 1 | Agar Agar | 6.5 지 |
| 2 | dH2O | 180 mL |
표 1: 인공 식단의 구성.
| 치료(케르센틴 농도) | 영양지수 (%) | ||
| 증권 시세 표시기 | 증권 시세 표시기 | 광고 | |
| 0 페이지/분 | 73.044 | 208.148 | 35.092068 |
| 1000 페이지/분 | 64.2771 | 159.871 | 40.2056684 |
표 2: 퀘르세틴 섭취가 H. armigera 섭식 행동 및 식이 이용에 미치는 영향. 약어: ECI = 섭취한 음식의 전환 효율; ECD = 소화된 음식의 전환 효율; AD = 대략적인 소화율.
보충 표 1: 퀘르세틴 공급 분석을 위한 데이터 시트의 예. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
실험실 생물학적 분석은 합리적인 비용으로 단기간에 결과를 예측하고 여러 화합물에 대한 비교 독성 데이터를 생성하는 데 유용합니다. 먹이 생물학적 분석은 곤충-살충제와 곤충-식물-살충제 사이의 상호 작용을 해석하는 데 도움이 됩니다. 이는 치사량(50)(LD50), 치사량(50)(LC50) 또는 임의의 다른 치사량 또는 선량(24,25)을 설정하는 과정을 현저하게 단순화하는 다양한 물질의 독성을 측정하기 위한 효율적인 방법이다. 다양한 실험실 생물학적 분석은 살충 활성, 살충제 내성 및 식이 피복, 국소 도포, 의무 공급, 주입 방법, 접촉 또는 잔류 및 필름 방법을 포함하여 화합물의 독성을 결정하는 데 사용됩니다13,14. 이러한 모든 방법은 특정 연구의 목적에 따라 사용할 수 있지만, 이상적인 생물학적 검정 접근법은 빠르고 효과적이어야 한다26. 따라서 이 원고에서 논의된 의무 섭식 분석 방법은 흡전 곤충을 제외하고 여러 경우에 선택되는 생물학적 분석법이 될 수 있습니다.
이 원고에 설명된 의무 섭식 분석은 곤충 유충의 성장, 발달, 섭식 및 생존에 대한 모든 화합물의 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에 표시된 대표적인 결과에서 퀘르세틴의 살충 활성은 H. armigera 유충에 대해 조사되어 추가 탐색을 위한 근거를 제공했습니다. 퀘르세틴을 먹인 유충에서 ~57%의 체중 감소(그림 2A,B), 섭식 속도의 변화(그림 2C) 및 ~18%의 생존율 감소(그림 4A,B)가 관찰되었습니다. 또한, 퀘르세틴 식단을 먹은 곤충은 번데기가 ~14% 지연되고 감소한 것으로 나타났습니다(그림 3A,B). 대조군에 비해 ECI, ECD 및 AD를 포함한 영양 지표에서도 유의한 변화가 관찰되었습니다(표 2). 전반적으로, 이러한 결과는 퀘르세틴이 H. armigera 유충의 성장, 발달 및 생존에 해로운 영향을 미친다는 것을 나타냅니다. 이 모든 관찰은 Aedes aegypti27, Bactrocera cucurbitae Coquillett28 및 Drosophila melanogaster29에 대한 퀘르세틴의 항생물 효과를 따릅니다. 더욱이, 이러한 관찰은 면역 체계의 손상으로 인한 Bombyx mori의 치사율 증가와 일치하는 것으로 밝혀졌습니다30 Spodoptera litura31, Hyphantria cunea12 및 Eriosoma lanigerum32에서 유충 무게 감소 및 번식력.
샘플 크기의 균일성과 같은 예방 조치를 취하는 것은 실험 간의 생물학적 편차를 줄이는 데 매우 중요합니다. 재현성을 보장하기 위해 먹이 분석은 일정한 온도와 습도 수준의 곤충 배양실에서 동일한 인스타의 곤충 유충을 사용하여 수행해야 합니다. 인공 식단을 준비하는 동안 식물 화학 물질이 식단과 균일하게 혼합되어 있는지 확인해야 합니다. 시간 경과에 따른 식물 화학적 분해로 인한 오류를 최소화하려면 신선하게 준비된 식단을 분석하는 것이 좋습니다. 인공 식단을 준비하고 보관하는 동안 열민감성, 감광성, 용해도 등과 같은 식물 화학 물질의 특성을 고려해야 합니다. 시간이 지남에 따라 건조된 사료는 색이 변하고 줄어들 수 있으므로 급여 분석에 사용해서는 안 됩니다. 대조군의 사망률이 10%33를 초과하는 경우 분석 결과를 고려해서는 안 됩니다. 사료 준비 및 곤충 계량에 필요한 주걱, 비커, 페트리 접시 등과 같은 재료는 교차 오염으로 인한 오류를 방지하기 위해 대조군과 처리군에 대해 분리되어야 합니다.
곤충 먹이 생물 검정은 매우 특이적이고 재현 가능하지만 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, 곤충이 식물을 공격할 때, 식물 면역은 구조적 또는 화학적 형질을 생성하여 초식동물의 먹이를 줄임으로써 초식동물의 피해를 최소화한다34. 그러나 이러한 방어 특성과 그 효과는 이 분석 중에 관찰되지 않습니다. 또 다른 한계는 곤충이 섭취한 파이토케미컬의 정확한 농도를 결정할 수 없다는 것이다14. 식단의 영양 성분과 사용된 식물 화학 물질의 안정성은 곤충에 미치는 영향에 영향을 미칠 수 있는 주요 제한 요소입니다.
위에서 언급 한 한계에도 불구하고 의무 섭식 분석은 저렴하며 많은 수의 곤충을 동시에 테스트 할 수 있습니다. 또한 이 분석법은 다양한 종류의 곤충에 대한 항사료 및 살충 특성을 연구하기 위해 여러 분자를 스크리닝하는 데 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자들은 이해 상충이 없다고 선언했습니다.
Acknowledgments
SM, YP 및 VN은 뉴델리에 있는 인도 정부의 대학 보조금 위원회(University Grants Commission)에서 수여하는 펠로우십을 인정합니다. RJ는 프로젝트 코드 MLP036626, MLP101526 및 YSA000826에 따른 재정 지원을 위해 인도 과학 및 산업 연구 위원회(CSIR)와 인도 푸네의 CSIR-National Chemical Laboratory를 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Agar | Himedia | RM666 | Solidifying agent |
| Ascorbic acid | Himedia | CMS1014 | Vitamin C source |
| Bengal Gram | NA | NA | Protein and carbohydrate source |
| Casein | Sigma | C-5890 | Protein source |
| Cholesterol | Sisco Research Laboratories | 34811 | Fatty acid source |
| Choline Chloride | Himedia | GRM6824 | Ammonium salt |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | Solvent |
| GraphPad Prism v8.0 | https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/user-guide/using_choosing_an_analysis.htm | ||
| Methyl Paraben | Himedia | GRM1291 | Antifungal agent |
| Multivitamin capsule | GalaxoSmithKline | NA | Vitamin source |
| Quercetin | Sigma | Q4951-10G | Phytochemical |
| Sorbic Acid | Himedia | M1880 | Antimicrobail agent |
| Streptomycin | Himedia | CMS220 | Antibiotic |
| Vitamin E capsule | Nukind Healthcare | NA | Vitamin E source |
| Yeast Extract | Himedia | RM027 | Amino acid source |
References
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